Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây huyết giác (dracena cambodiana pierre ex gnagnep)

2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ ...352.4 Các phương pháp nghiên cứu áp dụng đối với cây Huyết giác... Bản luận văn thạc sỹ Ngành Hóa học với đề tài “Nghiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

(DRACAENA CAMBODIANA PIERRE EX GNAGNEP.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

ĐOÀN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY HUYẾT GIÁC

(DRACAENA CAMBODIANA PIERRE EX GNAGNEP.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Chuyên ngành Hóa học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS TRẦN THU HƯƠNG

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN………

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan chung về cây Huyết giác 3

1.1.1 Vài nét về hóa học và hoạt tính sinh học của họ Bồng bồng (Dracaenaceae) 3

1.1.2 Cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep) .7

1.2 Vài nét về steroid .10

1.2.1 Khái niệm về Steroid 10

1.2.2 Giới thiệu một số Steroid tiêu biểu 13

1.3 Vài nét về các hợp chất phenolic .20

1.3.1 Giới thiệu chung 20

1.3.2 Một vài đặc điểm của các hợp chất phenol 21

1.3.3 Các nhóm phenolic tiêu biểu 21

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Tổng quan chung về phương pháp chiết 29

2.1.1 Đặc điểm chung của chiết 29

2.1.2 Cơ sở của quá trình chiết 29

2.1.3 Quá trình chiết thực vật 30

2.2 Tổng quan chung về phương pháp sắc ký 32

2.2.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 32

2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 35

2.4 Các phương pháp nghiên cứu áp dụng đối với cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.) 39

2.4.1 Mẫu thực vật 39

2.4.2 Phương pháp chiết 39

2.4.3 Phương pháp phân lập các hợp chất 39

2.4.4 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 40

CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 42

3.1 Thu mẫu thực vật 42

3.2 Phân lập các hợp chất 42

3.3 Hằng số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất 45

3.3.1 Hợp chất DB1 45

3.3.2 Hợp chất DC2 47

3.3.3 Hợp chất DC3 48

3.3.4 Hợp chất DC4 49

3.4 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 49

CHƯƠNG IV: THẢO LUẬN 51

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất DB1 51

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất DC2 57

4.3 4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất DC3 61

4.4 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất DC4 66

4.5 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 72

4.6 Bảng tổng hợp các hợp chất đã phân lập được 73

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN 74

Bản luận văn thạc sỹ Ngành Hóa học với đề tài “Nghiên cứu thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của cây Huyết giác (Dracaena Cambodiana

Pierre ex Gnagnep.)” được hoàn thành dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Trần Thu

Hương – Bộ môn Hóa Hữu cơ – Viện kỹ thuật Hóa học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tôi xin cam đoan, luận văn không sao chép nội dung từ bất kỳ một luận văn thạc sỹ hoặc luận văn tiến sỹ nào khác

Hà Nội, ngày 20 tháng 9 năm 2011

Học viên

Đoàn Thị Hiền

Bản luận văn này được thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Trong quá trình thực hiện luận văn này, em đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô giáo, các anh chị và bạn bè Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Trần Thu Hương, Bộ môn Hóa Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo

và giúp đỡ để em hoàn thành luận văn này

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Bộ môn Công nghệ Hóa Dược & BVTV, Viện Kỹ thuật Hoá học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ và giúp đỡ

em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành bản luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 9 năm 2011

Học viên

Đoàn Thị Hiền

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy)

CC Sắc ký cột dưới trọng lực dung môi (Column Chromatography)

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimensional NMR)

DEPT Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer)

HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence )

Me Nhóm Metyl

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 1.1: Các hợp chất đã được phân lập từ một số loài thuộc chi Dracaena 5

Hình 1.1 Cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.) 7

Sơ đồ 1: Sơ đồ phân đoạn dịch chiết metanol của cây Huyết giác 43

Sơ đồ 2: Sơ đồ phân lập hợp chất DB1 từ cây Huyết giác 44

Sơ đồ 3: Sơ đồ phân lập các hợp chất DC2, DC3, DC4 từ cây Huyết giác 45

Bảng 3.1 Số liệu 1H- NMR và 13C-NMR (δ, ppm) của hợp chất DB1 46

Bảng 3.2 Kết quả phổ NMR của DC2 47

Bảng 3.3 Kết quả phổ NMR, HMBC của DC 3 48

Bảng 3.4: Kết quả phổ NMR, HMBC của DC4 49

Bảng 3.5: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất 50

Hình 4.1.1 Phổ 1H-NMR của DB1 52

Hình 4.1.2 Phổ 13C-NMR và các phổ DEPT của DB1 53

Hình 4.1.3 Phổ ESI MS positive của DB1 54

Hình 4.1.4 Cấu trúc của hợp chất DB1 54

Hình 4.1.5 Phổ HSQC của hợp chất DB1 .55

Hình 4.1.6 Phổ HMBC của hợp chất DB1 56

Hình 4.1.7 Các tương tác HMBC chính của hợp chất DB1 56

Hình 4.1.8 Phổ HR ESI TOF MS của DB1 57

Hình 4.2.1 Phổ 1H-NMR của chất DC2 58

Hình 4.2.2 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DC2 59

Hình 4.3.1 Phổ 1H-NMR của chất DC3 62

Hình 4.3.2 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DC3 63

Hình 4.3.3 Phổ HSQC của hợp chất DC3 64

Hình 4.3.4 Phổ HMBC của hợp chất DC3 64

Hình 4.3.5 Phổ ESI MS của hợp chất DC3 65

Hình 4.3.6: Tương tác H-C trên phổ HMBC của hợp chất DC3 65

Hình 4.3.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất DC3 65

Hình 4.4.1 Phổ 1H-NMR của chất DC4 67

Hình 4.4.2 Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất DC4 68

Hình 4.4.3 Phổ HSQC của hợp chất DC4 69

Hình 4.4.4 Phổ HMBC của hợp chất DC 4 70

Hình 4.4.5 Phổ ESI MS của hợp chất DC4 71

Hình 4.4.6: Tương tác H-C trên phổ HMBC của hợp chất DC4 71

Hình 4.4.7: Cấu trúc hóa học của hợp chất DC4 72

Bảng 4.6 Bảng tổng hợp các hợp chất đã phân lập được 73

MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, độ ẩm cao Với điều kiện thiên nhiên thuận lợi như vậy nên hệ thực vật Việt Nam phát triển rất đa dạng và phong phú với khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể đến các loài tảo, rêu và nấm Nhiều loài trong số đó từ xa xưa đến nay đã được sử dụng trong y học cổ truyền và các mục đích khác phục vụ đời sống của nhân dân

Nghiên cứu các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao

để ứng dụng trong y học, nông nghiệp và các mục đích khác trong đời sống con người là một trong những nhiệm vụ quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước hết sức quan tâm

Với việc phát hiện ra nhiều chất có hoạt tính sinh học có giá trị từ thiên nhiên, các nhà khoa học đã có những đóng góp đáng kể trong việc tạo ra các loại thuốc điều trị những bệnh hiểm nghèo như: Penicillin; Artermisinin… một số khác được sử dụng để kéo dài tuổi thọ và nâng cao chất lượng cuộc sống của con người Thiên nhiên không chỉ là nguồn nguyên liệu dồi dào cung cấp các hoạt chất quí hiếm để tạo làm thuốc mà còn cung cấp các chất dẫn đường để tổng hợp ra các dẫn xuất mới Cũng từ những tiền chất được phân lập từ thiên nhiên, các nhà khoa học

đã chuyển hoá chúng thành những hoạt chất có khả năng trị bệnh rất cao

Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã và đang đóng một vai trò hết sức quan trọng trong đời sống con người Các hợp chất thiên nhiên được dùng làm thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật cũng như nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm, hương liệu và mỹ phẩm Đặc biệt là trong lĩnh vực làm thuốc, nguồn dược liệu phong phú và đa dạng đã cung cấp cho ngành dược cả nước một khối lượng nguyên liệu lớn để chữa bệnh cũng như xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Về lâu dài đối với sự phát triển các dược phẩm mới, các sản phẩm thiên nhiên có vai trò

Hiện nay trên Thế giới cũng như ở Việt Nam chưa có nhiều tài liệu nghiên

cứu về thành phần hóa học của cây Huyết giác (Dracaena cambodiana) Theo dân

gian người ta dùng cây này để trị một số bệnh như ỉa chảy, thuốc hạ sốt, chống chảy máu và làm cả thuốc bổ Chính vì vậy, luận văn này tập trung nghiên cứu, phân lập

một số hợp chất trong cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.) có

hoạt tính sinh học cao, nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các phương thuốc mới cũng như góp phần giải thích được tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền

Mục tiêu của luận văn:

1 Phân lập một số hợp chất từ cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep.)

2 Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất phân lập được

3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan chung về cây Huyết giác

1.1.1 Vài nét về hóa học và hoạt tính sinh học của họ Bồng bồng (Dracaenaceae)

Cây Huyết giác thuộc chi Dracaena (đồng nghĩa là Pleomele), thân gỗ hoặc cây bụi dạng mọng nước, trong họ Dracaenaceae Cây hoá gỗ, mọc cao, lá rộng,

đôi khi có dạng dải và không có cuống rõ, nhiều khi có đốm hay rạch có màu Hoa nhiều, thường lớn, xếp thành chuỳ, thành bông dài hoặc thành đầu sít chặt với 3 lá bắc ở gốc Bao hoa dạng đĩa hay dạng chuông với 6 thuỳ trải ra hoặc cong, 6 nhị thò Quả mọng, 3 ô thường chỉ chứa một hạt [2], [3]

Chi Dracaena gồm khoảng 40 loài ở các vùng nhiệt đới, cựu lục địa tới đảo

Canari Ở nước ta có 12 loài với phần nhiều là cây cảnh được nhập trồng [3]

Dracaena theo tiếng Latinh có nghĩa là con rồng cái, vì vậy Huyết giác cũng

như nhiều loài thuộc chi này thường có tên gọi là cây “máu rồng” Đã có rất nhiều

nghiên cứu về các loài cây thuộc chi Dracaena, thành phần hoá học chính chứa

trong chi này là: các saponin steroit, các hợp chất phenolic, các flavonoit [14], [20], [25], [29], [30], [31], [44], [47], [48], [49], [50]

Từ dịch chiết MeOH của rễ và thân Dracaena angustifolia, người ta đã phân

lập được 9 hợp chất spirostanol steroit mới cùng với 8 saponin steroit đã biết Trong

đó có ba sapogenin spirostanol là: namogenin A, B, C (1-3), bốn saponin spirostanol namonin A, B, C, D (4-7), một saponin furostanol namonin E (8), và một glycoside pregnan namonin F (9) [35] Đáng chú ý là các hợp chất phân lập

được thể hiện hoạt tính chống các khối u ung thư 26-L5, khối u ác tính HT-1080 và

B-16, BL6 mạnh Đặc biệt, các hợp chất (4), (5) có khả năng chống lại các tế bào xơ

Từ một loài thuộc chi Dracaena là Dracaena cinnabari, một nhóm nghiên

cứu người Đức đã phân lập được các hợp chất thuộc các nhóm flavonoit, steroit,

tritecpenoit, trong đó 7-hydroxy-3-(3-hydroxy-4-methoxybenzyl)chroman (10), (2S)-7,3’-dihydroxy-4’-methoxyflavan(11),4-hydroxy-2-methoxydihydro chalcon (12) là các flavonoit mới [33], [34]

Gần đây, từ phần dịch chiết MeOH của thân cây Dracaena concinna, người

ta đã phân lập được tất cả 13 saponin steroit, trong đó có 4 saponin furostanol Đặc

biệt hai hợp chất: 26-O-β-D-glucopyranosyl-22-O-methyl-5α

-furost-25(27)-ene-1β,3α,4α, 22ξ, 26-pentrol 1-O-{O- α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)- O- β-D-

fucopyranoside} (13), và 26-O-β - D - glucopyranosyl - 22-O-methyl - 5α - 25(27)-ene-1β,3β,4α,22ξ,26-pentrol-1-O-{O-α-L- rhamnopyranosyl-(1→2)-O-β-

furost-D-fucopyranoside} (14) có cấu trúc duy nhất chứa nhóm 4α-hydroxyl trên khung

furostanol [42]

Ngoài ra, người ta đã phân lập được các hợp chất phenolic từ Dracaena

draco, gồm: 1phenylpropanoid, 4 chalcone, 6 flavonoit, 9 homoizoflavonoit,

3,4,5-trimethoxy-cinnamyl ancol [15] Bên cạnh đó, từ các phần dịch chiết khác nhau của

Dracaena draco, người ta cũng phát hiện được 12 saponin steroit [40] Trong đó có

8 saponin mới thể hiện hoạt tính độc tế bào rất ấn tượng đối với các dòng tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [27], [43] Các hợp chất phenolic và saponin steroit cũng được

phát hiện từ các loài khác thuộc chi Dracaena như các chalcon từ Dracaena

loureiri [20], các saponin từ Dracaena sarculosa [16], [17]

Đặc biệt là loài Dracaena cochinchininensis có nhựa cây cũng được dùng làm

thuốc như nhựa Huyết giác (Dracaena cambodiana), phân bố ở Nam Trung quốc,

các thành phần hóa học điển hình của loài này [23], [39], [45] Các hợp chất điển

hình được phân lập gần đây từ D cochinchinensis là Dracaenogenin A, B (15, 16) [39], Dracaenoside C, D (17, 18) [36], meta-homoisoflavane 10,11-

dihydroxydracaenon (19) [38], dimer chalcone cochinchinenin

1-[5-(2,4,4’-trihydroxy dihydrochalconyl )]

-1-(p-hydroxyphenyl)-3-(2-methoxy-4-hydroxy-phenyl)-propane (20) [46], và cochinchin là một chất có chứa khung mới

(2,3-trans)-6-allyl-2-(3,5-dimethoxyphenyl)-3-(4-hydroxyphenyl)-2,3-dihydrobenzol

(1,4)dioxin (21) [23]

Bảng 1.1: Các hợp chất đã được phân lập từ một số loài thuộc chi Dracaena

O O

OH H OH

OH H OH

HO

OH 1

3

O O

H H O

HO

H O

HO O

O-Glc

OH HO

H O

9 Glc: β−D-Glucopyranosyl

O

H HO

OH OMe

10

O HO

OH OMe

H HO

HO

16

O O

OH HO

19

O O

1.1.2 Cây Huyết giác (Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep) [2], [11]

Huyết giác, còn gọi là cây xó nhà, cây dứa dại, cây giáng ông

Tên khoa học: Dracaena cambodiana Pierre ex Gagnep

Thuộc họ Bồng Bồng: Dracaenaeae

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật

• Mô tả cây [2], [4], [11]

Huyết giác là một loại cây nhỏ, cao chừng 1-1,5m, có thể cao tới 2-3m, thân thẳng, sống lâu năm Thân phân thành nhiều nhánh Cây nhỏ có đường kính chừng 1,6-2cm, cây to có đường kính tới 20-25cm Lá hình lưỡi kiếm, trung bình dài 25-80cm, rộng 3-4cm tới 6-7cm, cứng, màu xanh tươi, mọc cách, không có cuống Lá rộng để lại trên thân một vết sẹo Thường thì chỉ có một bó lá tụ tập trên ngọn Cụm hoa mọc thành chùm dài tới 1m, đường kính phía cuống tới 1,5-2cm trên có lá nhỏ, dài 15cm, rộng 2cm, phân cành nhỏ dài tới 30cm Hoa nhỏ màu vàng lục, tụ từng 2-

4 hoa gần nhau, đường kính chừng 1cm, khi khô có màu đen, hạt hình cầu, đường kính 6-7cm Quả mọng, hình cầu, khi chín màu đỏ, chứa một hạt

• Phân bố, thu hái và chế biến

Huyết giác phân bố ở Nam Trung Quốc (Quảng Tây), Việt Nam, Campuchia

Ở nước ta, loài này thường mọc hoang tại các vùng núi đá vôi trong đất liền và hải

đảo từ Bắc chí Nam, như các tỉnh Quảng Ninh, Nam Hà, Hà Tây, Hoà Bình, Nghệ

An, Hà Tĩnh Núi đất không thấy có Huyết giác Phải những cây già, đã chết và đổ

nát mới có gỗ Những cây đã thành Huyết giác có màu đỏ hoặc có nhiều đám màu

đỏ, mùi vị không có gì đặc biệt Trong những chỗ màu đỏ có cảm tưởng như do một loài nào đục khoét gây ra Hiện nay chưa rõ nguyên nhân do sâu hay do loại nấm

nào gây ra huyết giác và từ khi cây chết đến khi có huyết giác là bao năm Thu hái

vào mùa đông, bóc vỏ ngoài, lấy lõi đỏ, chẻ nhỏ, phơi khô

1.1.2.2 Tính vị và tác dụng [8], [9], [11]

Huyết giác có vị đắng chát, tính bình, có tác dụng chỉ huyết, hoạt huyết, sinh

Dịch chiết cồn Huyết giác với liều 8g/kg, có tác dụng chống viêm cấp ở thời điểm 5h sau khi gây viêm bằng carragenin 1%, tác dụng này yếu hơn so với indomethacin 5 mg/kg

Dịch chiết nước và dịch cồn Huyết giác với liều 8g/kg, có tác dụng chống

viêm ở thời điểm 3h và 5h sau khi viêm bằng chấn thương thực nghiệm, tác dụng của Huyết giác với liều 8g/kg tương đương với indomethacin 5mg/kg

- Tác dụng chống viêm mạn:

Dịch chiết nước Huyết giác với liều 8g/kg, thể hiện tác dụng chống viêm

mạn tính ở thời điểm ngày thứ 16-21 trên mô hình gây viêm đa khớp bằng S

1.1.2.3 Thành phần hoá học

Hiện nay, trên thế giới và trong nước đều chưa có nhiều tài liệu nghiên cứu

Theo Võ Văn Chi [2], chất màu đỏ trong Huyết giác có khả năng tan trong cồn, axit, không tan trong ete, cloroform và benzen

Theo một số tài liệu mới nghiên cứu trong nước, về thành phần hoá học, nhựa trong gỗ Huyết giác gồm hỗn hợp C6H5-CO-CH2-CO-OC8H9O và dracoresen 14%, nhựa không tan 3%, phlobaphen 0,03% Cụ thể là trong Huyết giác có glycozit tim, saponin, đường khử, phytosterol [9]

Người ta cho rằng tác dụng chống viêm, giảm đau của Huyết giác có thể là

do thành phần saponin có trong Huyết giác gây nên [9]

1.2 Vài nét về steroid [6], [7], [18], [30]

1.2.1 Khái niệm về Steroid

Steroid có nhiều trong thiên nhiên như sterol, axit mật, nội tiết tố sinh dục, hormon tuyến thượng thận, glycozit trợ tim, nhựa độc của con cóc và các sapogenin, chúng có chứa hệ vòng xyclopentanoperhydro phenanthren hoặc trong trường hợp rất hiếm, dạng biến đổi của hệ vòng đó

Steroid chia thành các nhóm:

- Sterol

Hóa lập thể của các khung steroid

7 8

9 10 1 2 3

16 17

Các hệ này luôn tuân theo quy luật:

- Vòng A/B gắn với nhau theo kiểu cis, trans

- Vòng B/C gắn với nhau theo kiểu trans

- Vòng C/D gắn với nhau theo kiểu trans

Xét cholesterol:

7 8

9 10

1 2 3

11 13

16 17

25 26

27

nguyên tử β và được biểu diễn bằng đường liên tục Ngược lại tất cả nhóm thế và nguyên tử H sắp xếp ngược lại gọi là α

Cả α và β đều có B/C và C/D gắn kết theo trans

9 10

1 2 3

16 17

27 H

9 10

1 2 3

16 17

27 H

H

H

B

α− cholesterol

1.2.2 Giới thiệu một số Steroid tiêu biểu [5], [6], [10], [18], [26]

1.2.2.1 Sterol

Sterol là lipit cấu trúc, tham gia cấu tạo màng của hầu hết các tế bào eukaryote Vi khuẩn không thể tổng hợp sterol, tuy vậy một số vi khuẩn có thể kết hợp sterol từ môi trường ngoài vào màng của chúng Ngoài vai trò tham gia cấu tạo màng, sterol còn đóng vai trò là tiền chất để tổng hợp nên nhiều chất có vai trò sinh học quan trọng khác, ví dụ: các steroid hormon là những tín hiệu sinh học điều khiển sự biểu hiện gen, các axit mật là các dẫn xuất phân cực của cholesterol hoạt động như là những chất tẩy (detergent) trong ruột và nhũ tương hóa mỡ của thức ăn,

từ đó làm cho chúng có thể tiếp cận được với enzym lipase của đường tiêu hóa

Sterol phân bố rộng - chúng thường có mặt song song với các ancaloit hoặc saponin steroit - có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng nhiều nhất ở các hạt

có dầu dưới dạng tự do hoặc các este, một số ít ở dạng glicozit

Các sterol là ancol bậc 2 nhiều vòng có nhân xiclopentano pehidro phenandren: Người ta gặp chúng ở dưới dạng este hoặc kết hợp với các đường ở dạng heterozit

Nhân steroit:

• Xiclopentano

pehidrophenandren

• A, B, C: Nhân của phenandren đã

được hidro hóa

• D: xiclopentan

1 2 3

8 9 10

11

12 13

16 17

Các sterol có một nhóm hidroxi ở C-3, nhóm này có thể là α hoặc β đối với

nhóm metyl góc ở C-10, do đó có các công thức cấu hình sau:

5β-Cholestan-3α-ol

• Một số sterol quan trọng

Các sterol có cấu trúc từ 27 - 29 nguyên tử C, thuộc nguồn gốc động vật

(cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, β - sitosterol, ergosterol, stigmasterol)

a Cholesterol

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

11

12 13

14 15

16 17 18

19

HO

27 20

22 23

24 25

Cholesterol là sterol được biết đến đầu tiên Nó là thành phần chính của sỏi mật và đã được phân lập từ nguồn này bởi Conradi vào năm 1775 Tên gọi cũng có nguồn gốc từ nguồn này (Tên Hy lạp cholesterin = mật rắn) (Sơvron, 1815) Cholesterol là thành phần quan trọng của màng tế bào, nó giúp tính lỏng của màng

ổn định trong khoảng dao động nhiệt độ rộng hơn Nhóm hydroxyl trên phân tử tương tác với đầu phosphat của màng còn gốc steroid và chuỗi hydrocarbon gắn sâu vào màng Nó là tiền chất chính để tổng hợp vitamin D, nhiều loại hormon steroid, bao gồm cortisol, cortison, và aldosteron ở tuyến thượng thận, và các hormon sinh dục progesteron, estrogen, và testosteron Các nghiên cứu gần đây cho thấy cholesterol có vai trò quan trọng đối với các synapse ở não cũng như hệ miễn dịch, bao gồm việc chống ung thư

b β – Sitosterol

HO

CH2

H3C

β-Sitosterol còn gọi là: 3β-stigmast-5-en-3-ol, α-dihydrofucosterol, cinchol,

cupreol, rhamnol, quebrachol và sitosterin

β-Sitosterol là dẫn xuất dihidro của stigmasterol, có một mạch nhánh no Nó

được thu nhận, cùng với các phytosterol khác, với lượng lớn dưới dạng sản phẩm phụ từ sự xà phòng hóa dầu đậu nành, một phần được sử dụng làm nguyên liệu đầu

để điều chế các steroit hocmon như oestron Sitosterol được dùng để điều trị chứng phì đại (phình to) tuyến tiền liệt

Ngày nay người ta dùng β-stitosterol của ngũ cốc là chất phòng xơ cứng

động mạch, làm chất mềm thành mạch, một mặt nó phòng sự hấp thụ cholesterol ở ruột bằng cách tạo ra một phức chất không tan, mặt khác nó còn có tác dụng trị xơ

mỡ động mạch nhờ có đặc tính chống ôxy hóa

Ergosterol còn gọi là (22E)-(24R)-24-metylcholesta-5,7,22-trien-3β-ol, được

Tanret tìm ra vào năm 1889 trong cựa lõa mạch, lại được tìm thấy ở men bia và nhiều mốc - nó tạo thành các tinh thể hình kim bóng, điểm nóng chảy 1680C (4410K) và là quang hoạt Nó có ba nối đôi, hai trong số đó ở trong vòng B là liên hợp, và nối đôi thứ ba ở mạch nhánh giữa các nguyên tử cacbon 22 và 23 Có một nhóm metyl gắn với C-24 Cấu tạo của mạch nhánh đã được xác định bởi sự thủy phân ozonit, mà isopropyl-metylaxetandehit (2,3-dimetylbutanal) đã được phân lập như là một sản phẩm phân cắt Bằng cách chiếu tia tử ngoại, nó biến thành canxiferol hoặc vitamin D2 có tác dụng trị còi xương

d Sigmasterol

Sigmasterol còn gọi là (22)-24(S)-24-etylcholesta-5,22-dien-3β-ol,

C29H47OH, xuất hiện trong đậu nành và chỉ phân biệt với cholesterol bởi mạch nhánh của nó Giống như ergosterol nó có một nối đôi giữa các nguyên tử cacbon

22 và 23 Trong khi ergosterol có một nhóm thế metyl ở C-24, ở stigmasterol có một nhóm etyl Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol có một nhóm etyl Điều đó dẫn đến sản phẩm phân cắt ozonit từ stigmasterol là etyl-isopropyl-axetandehit (2-etyl-3-metylbutanal)

Stigmasterol là nguồn nguyên liệu để tổng hợp hocmon và chúng ta đã nói đến việc sử dụng với khối lượng lớn Vài genin của saponozit có nhân sterol (hecogenin, diosgeni) được dùng để bán tổng hợp các hocmon sinh dục và vỏ thượng thận

trong nước như carotin, mỡ… Tính chất đặc biệt quan trọng này của axit mật là đóng vai trò hấp thu mỡ của cơ thể Có lẽ là các axit béo được giữ lại trong cơ thể dưới dạng phức với axit mật Những phức này trong thành ruột sẽ phân giải, axit mật được giải phóng sẽ lại tiếp tục tham gia vào phản ứng với các axit hữu cơ trong các mô ở thành ruột Do vậy chỉ cần một lượng nhỏ axit mật là có thể chuyển hóa một lượng lớn axit hữu cơ

Axit quan trọng nhất của axit mật là Cholic Đó là axit 3α, 7α, 12α - trioxy cholanoic, nó nằm trong mật dưới dạng amit của glycocol và taurin

1.3 Vài nét về các hợp chất phenolic [24], [37]

1.3.1 Giới thiệu chung

Phenolic là nhóm các hợp chất trong cây mà chứa ít nhất một vòng thơm bị thế ít nhất một nhóm hydroxyl, nhóm này tự do hay liên kết với các nhóm chức khác như: ete, ester, hoặc glycosid Các hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên nên có thể lợi dụng màu sắc của chúng để theo dõi quá trình chiết xuất và phân lập

Có hai đường hướng chính thơm hoá để sinh ra các phenolic thực vật:

- Đường hướng phổ biến nhất là đi qua shikimate (axit shikimic), từ các monosaccarit tạo thành các amino axit (phenylamin và tyrosine), sau đó loại nhóm amin cho các axit cinnamic và các dẫn xuất của chúng gồm: axit benzoic, acetophenon, lignan, lignin và coumarin

- Con đường thứ hai là đi từ acetat và dẫn đến tạo thành các poly-β-ketoester

của các polyketit dài bằng phản ứng đóng vòng (phản ứng ngưng tụ Claisen hoặc andol) Các sản phẩm thường là polycyclic gồm: chromen, isocoumarin, orcinol, depside, depsidoen, xanthon, quinon

1.3.2 Một vài đặc điểm của các hợp chất phenol

Một vài hợp chất phenol có thể dễ dàng nhận biết bằng mắt thường như các anthocyanin từ hoa, các hợp chất khác có thể được nhận biết dưới ánh sáng đèn UV hoặc bởi các phản ứng màu đặc trưng Các phản ứng màu này thường được sử dụng trong quá trình sắc ký, phân lập các hợp chất phenolic Tuy nhiên, việc sử dụng các phản ứng mầu trên các dịch chiết thường khó phát hiện và không nhạy bởi tương tác của các yếu tố gây nhiễu đến kết quả thử nghiệm Các hóa chất thường được sử dụng để phát hiện các chất phenol đó là: Clorit sắt, vanillin, phosphomolybdate-phosphotungstat Đối với một vài hóa chất, việc xác định các chất có cấu trúc phenol được thực hiện theo tính đặc hiệu như thời gian phản ứng, sự chuyển màu, những điều này góp phần làm tăng khả năng nhận biết các hợp chất phenol

Trong số hàng nghìn hợp chất phenol thì flavonoit là nhóm hợp chất quan trọng hơn cả Ngoài ra các hợp chất phenol một vòng, các phenylpropanoit, quinon cũng chiếm một vị trí đáng kể Các polyphenol thì có lignin, melanin, tanin Nhóm chức phenol còn thấy trong một số protein thực vật, trong ankaloit và tecpenoit

1.3.3 Các nhóm phenolic tiêu biểu

1 Phenol và axít phenolic

1.3.3.1 Phenol và axit phenolic[6], [7],[14]

Các phenol tự do và axit phenolic thường được xem xét chung trong phân tích hóa thực vật bởi vì trong cây chúng thường tồn tại với nhau

Công thức một số phenol và axit phenol phổ biến

OH

OH Hydroquinon

Các axit phenol tồn tại dưới dạng kết hợp hoặc với lignin thành các este hoặc

với oza dưới dạng glycozit Các axit phổ biến trong thực vật là axit p-

hydrozybenzoic, axit protocatechic, axit vanilic và axit syringic Các axit ít gặp là

axit salixylic và o- protocatechic Axit galic gặp nhiều trong thực vật có gỗ dưới

dạng kết hợp galotanin nhưng hợp chất này rất không bền nên thường gặp trong dịch thủy phân axit các dịch chiết của cây là axit elagic, một sản phẩm ngưng tụ dime của axit galic

Ngược lại với axit phenol, các phenol tự do rất hiếm thấy trong cây Hydroquinon là chất gặp nhiều hơn cả, tiếp đến là Catechol, Ocxinol, Phlorogluxinol, Pyrogalol

3 2

2' 3'4' 5' 6'

Flavan (2- phenyl chroman )

Sự biến đổi trạng thái oxy hoá của phần C3 sẽ xác định các phân lớp trong đó

Có các nhóm: flavon, flavonol, flavanon, flavanonol, isoflavonoit, chalcol,

dihydrochalcon, auron, anthocyanidin, catechin, leucoanthocyanidin, rotenoit,

neoflavonoit

Một số nhóm flavonoit tiêu biểu

Nhóm flavon và flavonol chỉ khác nhau ở vị trí cacbon số 3 Công thức cấu tạo của hợp chất như sau:

O

O

O

O OH

Flavon FlavonolFlavon và flavonol rất phổ biến trong tự nhiên, vị trí và số lượng các nhóm hydroxi liên kết với các nguyên tử cacbon của khung tạo nên các chất khác nhau

Trong thực vật, các flavon và flavonol thường không tồn tại dưới dạng tự do

mà thường dưới dạng glycozit

* Flavanon

Cho đến nay người ta chưa tìm thấy flavanon ở trong thiên nhiên Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcol do vòng dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcol

Các flavanonol còn gọi là flavanon-3-ol hay dihydroflavonol, flavanonol có cấu trúc giống như flavanon chỉ khác nhóm thế hydroxi ở vị trí cacbon số 3 (C3)

4' 5' 6'

O

O

2

3 4 5 6 7 8

2' 3'

4' 5' 6'

O 2 3

4 5 6 7 8

2' 3'

4' 5' 6'

2' 3' 4'

5' 6'

Chalcol

1.3.3.3 Lignin [6], [37]

Lignin là các phenol polyme khu trú ở các vách tế bào thực vật, có vai trò cùng với xenluloza làm cho thân và cành cây trở nên cứng rắn và là chất đặc trưng của các cây có gỗ

Khi oxy hóa với nitrobenzen, lignin cho ra 3 andehyt phenolic, tương ứng

với 3 axit phenol phổ biến trong cây là axit p-hydroxybenzoic, axit vanilic và axit

syringic

Điều đáng chú ý là sự khác biệt giữa lignin của thực vật hạt kín và thực vật hạt trần Trong thực vật hạt kín có chứa lignin thuộc nhóm syringic còn trong thực vật hạt trần thì không có Ngược lại về axit phenol tự do thì ở thực vật hạt kín chỉ có

axit p – hydroxybenzoic và axit vanilic mà không thấy có mặt axit syringic, trong

khi ở thực vật hạt trần có cả 3 loại axit nói trên

1.3.3.4 Lignan [6], [37]

Lignan là các hợp chất phenol tự nhiên có cấu trúc C6 – C3 hoặc các dẫn xuất polyme của chúng Hợp chất lignan đóng vai trò chủ yếu tạo nên lignin là Coniferin, glycozit của Coniferyl ancol

Những nhựa phenolic thiên nhiên rất gần với lignin Chúng là các dime của những đơn vị C6 – C3 liên kết ở vị trí β của C3 Có rất nhiều dạng lignan đã được biết rõ cấu trúc Sau đây là một vài dạng phổ biến

- Dạng axit guaiaretic, dẫn xuất của Diarylbutan 1,4

Cumarin là nhóm hợp chất tự nhiên được xem là dẫn xuất lacton của axit

o- hydroxyxinamic (22) Hầu hết cumarin đã biết đến nay tồn tại trong cây chủ yếu

dưới dạng tự do Một số ít chất tồn tại dưới dạng glycozit như các glycozit của

Psonolen (23) Cumarin phổ biến nhất trong cây là chất Umbeliferin (24)

Đặc tính của Cumarin là chúng phát quang mạnh và rất nhạy với ánh sáng

Về cấu trúc một số có khung Isopren như Suberosin (25), Colombia- netin

(26) Một số có cấu trúc vòng furan như Psonolen

Nhiều Cumarin có nhóm o – metyl như Xanthiletin (27) Ngoài ra có thể có

thêm nhóm phenyl ở vị trí 4 như Dalbergin (28) Loại này có người xem nó là

Neoflavonoit

số Cumarin có tác dụng làm giãn động mạch vành và mạch ngoại vi và có tác dụng chống co thắt Một số Cumarin có tác dụng làm tăng Cholesterol trong máu Một số chất có tác dụng ức chế sinh trưởng thực vật, tác dụng kháng khuẩn, diệt nấm, chống viêm

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Tổng quan chung về phương pháp chiết [1], [13]

2.1.1 Đặc điểm chung của chiết

Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà lẫn với nó

Mục đích của chiết là nhằm chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Ngoài ra phương pháp chiết pha rắn còn được dùng để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp Thường dùng trong phân ly các hợp chất thiên nhiên

2.1.2 Cơ sở của quá trình chiết

Dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất trong hai chất lỏng không hoà lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong các pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật Nerst

KA=CA/CB Trong đó KA là hằng số phân bố, CA, CB lần lượt là nồng độ của các chất hoà tan trong chất lỏng A, chất lỏng B không hoà tan lẫn vào nhau

2.1.3 Quá trình chiết thực vật

2.1.3.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hóa thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận Nó cần hoà tan những chất chuyển hoá thứ cấp các chất đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy Những dung môi này nên được chưng cất để được dạng sạch trước khi sử dụng, nếu chúng có lẫn các chất khác có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankylphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrat và tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong quá trình bảo quản (dung môi đưng trong các thùng chứa nhựa) Metanol và cloroform thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl) phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật Chất này còn thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Cloroform, metylen clorit và metanol

là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một bộ phận của cây như lá, thân, rễ, hoa…

Metanol và etanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào