Nghiên cứu quy trình bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin

Từ kết quả của các khảo sát sơ bộ trong quá trình nghiên cứu tại Viện Hóa học công nghiệp, kết hợp so sánh và tham khảo các công nghệ nước ngoài, chúng tôi nhận thấy rằng với công nghệ c

-*** -

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH BÁN TỔNG HỢP VINBLASTIN TỪ VINDOLIN VÀ CATHARANTHIN

MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined

PHẦN 1 TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined

1.1 Vài nét về cây Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn và

Vinblastin Error! Bookmark not defined

1.1.1 Giới thiệu về cây Dừa cạn Error! Bookmark not defined

1.1.1.1 Mô tả cây Error! Bookmark not defined

1.1.1.2 Phân bố và thu hái Error! Bookmark not defined

1.1.1.3 Công dụng Error! Bookmark not defined

1.1.1.4 Thành phần hoá học Error! Bookmark not defined

1.1.2 Vinblastin Error! Bookmark not defined

1.1.2.1 Tên, công thức Error! Bookmark not defined

1.1.2.2 Tính chất vật lý Error! Bookmark not defined

1.1.2.3 Tác dụng dược lý Error! Bookmark not defined

1.2 Các nghiên cứu về công nghệ chiết xuất và bán tổng hợp trên thế

giới Error! Bookmark not defined

1.2.1 Một số vinca ancaloid Error! Bookmark not defined

1.2.2 Vài nét về các công nghệ phân lập Vinca ancaloidError! Bookmark not de 1.2.3 Vài nét về bán tổng hợp Vinblastin Error! Bookmark not defined

1.2.4 Vài nét về tình hình nghiên cứu và triển khai trong nướcError! Bookmark

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM Error! Bookmark not defined

2.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2.1 Mẫu thực vật Error! Bookmark not defined

2.2.2 Phương pháp chiết xuất Error! Bookmark not defined

2.2.3 Phương pháp sắc ký để nhận biết và phân lập các hợp chấtError! Bookmar 2.2.3.1 Sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not defined

2.2.3.2 Phương pháp sắc ký cột Error! Bookmark not defined

2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của chất phân lập đượcError! Bookma 2.2.4.1 Điểm nóng chảy (mp) Error! Bookmark not defined

2.2.4.2 Phổ hồng ngoại – IR .Error! Bookmark not defined

2.2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMRSError! Bookmark not defined

2.2.4.4 Phổ khối lượng – MS Error! Bookmark not defined

2.2.4.5 Một số phương pháp phân tích khác Error! Bookmark not defined

2.3 Quy trình thực nghiệm Error! Bookmark not defined

2.3.1 Dụng cụ và phương pháp nghiên cứuError! Bookmark not defined

2.3.1.1 Dụng cụ và thiết bị Error! Bookmark not defined

2.3.1.2 Phương pháp sắc ký Error! Bookmark not defined

2.3.1.3 Dung môi và hóa chất Error! Bookmark not defined

2.3.2 Chiết tách và tinh chế các hợp chất từ cây Dừa cạnError! Bookmark not d 2.3.2.1 Quy trình chiết xuất và tách các Vinca ancaloid từ lá Dừa cạnError! Bookm 2.3.2.2 Chiết “ancaloid tổng số” từ lá Dừa cạnError! Bookmark not defined 2.3.2.3 Tách các Vinca ancaloid từ “ancaloid tổng số”Error! Bookmark not defin 2.3.3 Bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthinError! Bookmark not d 2.3.3.1 Tiến hành Error! Bookmark not defined

2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng H 2 O 2 tới hiệu suất tạo vinblastinError! Boo

2.3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ cung cấp H 2 O 2 tới hiệu suất tạo

vinblastin Error! Bookmark not defined

2.3.4 Các đặc trưng hóa lý và phổ của các hợp chất đã phân lập đượcError! Book 2.3.4.1 Hợp chất V2 Error! Bookmark not defined

2.3.4.2 Hợp chất V23 Error! Bookmark not defined

2.3.4.3 Hợp chất V37 Error! Bookmark not defined

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

3.1 Hợp chất V2 Error! Bookmark not defined

3.2 Hợp chất V23 Error! Bookmark not defined

3.3 Hợp chất V37 Error! Bookmark not defined

3.4 Bán tổng hợp vinblastin Error! Bookmark not defined

vinblastin Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined

MỞ ĐẦU

Vinblastin là một ancaloid có trong cây Dừa cạn Catharanthus roseus

(L.) G Donn được Noble và cộng sự (Canada) phát hiện đầu tiên vào năm

1958 Và cấu trúc hoá học được Neuss làm sáng tỏ năm 1962 Qua hơn 50 năm nghiên cứu và thử nghiệm, vinblastin đã chứng minh nhiều tác dụng ưu việt trong điều trị ung thư như bệnh Hodgkin, u lympho không Hodgkin, u lympho mô bào, u sủi dạng nấm, ung thư tinh hoàn tiến triển, sarcooma Kaposi, bệnh mô bào huyết, ung thư nhau, ung thư vú

Hiện nay, trên thế giới, đi tiên phong trong việc triển khai sản xuất thuốc chống ung thư từ các ancaloid Dừa cạn và phải kể đến các công ty như: công ty Eli Lilly - Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VELBAN® đi từ vinblastin sunfat chỉ định điều trị các bệnh Hodgkin, ung thư máu, ung thư biểu mô tinh hoàn, u Kaposi, ung thư dạ con; công ty Pharmacia Corporation Kalamazoo -

Mỹ với sản phẩm thuốc tiêm VINCASAR PSF đi từ vinblastin sunfat và vincristin sunfat chỉ định đặc hiệu điều trị bệnh bạch cầu ác tính; công ty Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với sản phẩm thuốc tiêm và viên nén NAVELBINE® đi từ vinorelbin tartrat được bán tổng hợp từ vindolin và catharanthin, được chỉ định đặc hiệu điều trị ung thư vú và ung thư phổi, có thể sử dụng độc lập hoặc phối hợp điều trị với cisplatin; v.v

Các quốc gia và vùng lãnh thổ có thể trồng được Dừa cạn đều đã chủ động nghiên cứu và triển khai sản xuất vinblastin và các dẫn xuất như Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan, Hàn Quốc, Nhật Bản và các nước Trung Á, Bắc Phi, v.v Có thể nêu một vài con số theo thống kê vào năm 2002 của FAO làm ví dụ: Madagasca xuất khẩu 1000 tấn (khô) lá và hoa Dừa cạn hàng năm; Ở Hungari, năng suất lá và hoa Dừa cạn đạt tới 1,5 - 2 tấn lá khô/ha/năm; Ở Ấn

Độ, riêng tập đoàn Cipla hàng năm sản xuất khoảng 15 - 25 kg vinblastin sunfat và vincristin sunfat

Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng được trồng làm cảnh Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và có thời gian canh tác ngắn Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu

trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn Catharanthus

roseus L có thể phát triển tốt trên đất cát khô hạn ven biển các tỉnh miền

Trung, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng ancaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu

Từ kết quả của các khảo sát sơ bộ trong quá trình nghiên cứu tại Viện Hóa học công nghiệp, kết hợp so sánh và tham khảo các công nghệ nước ngoài, chúng tôi nhận thấy rằng với công nghệ chiết xuất hiện đại, trên giống Dừa cạn tốt nhất (có hàm lượng vinblastin 0,01 % trên lá khô - tương đương với Madagasca), chi phí tối thiểu để phân lập 1 g vinblastin vẫn còn lớn hơn

200 USD, trong khi đó, giá xuất xưởng của Eli Lilly, Geoden Richer và của Cipla chỉ dao động trong khoảng 120 - 135 USD/1 g vinblastin (FAO/UNDP - 2002) Như vậy, nếu thuần túy chỉ dựa vào chiết tách, các thuốc chống ung thư máu từ lá và hoa Dừa cạn của Việt Nam sẽ không cạnh tranh được ngay ở thị trường trong nước Trong khi đó lại không tận dụng được các tiền chất có sẵn trong Dừa cạn để bán tổng hợp các thuốc này

Với một nguồn nguyên liệu Dừa cạn đạt và vượt tiêu chuẩn của châu

Âu đã được tổ chức canh tác rất quy mô, sản lượng xuất khẩu sang thị trường Pháp và châu Âu đạt hàng trăm tấn một năm, mà các bệnh nhân ung thư máu vẫn phải sử dụng vinblastin sunfat nhập khẩu từ các hãng Eli Lilly - Mỹ, Geoden Richer - Hungari, Pierre Fabre - Cộng hòa Pháp với giá 1.080.000 VND 1 lọ 10 mg Theo số liệu của Vimedimex II và BV Pharma, hàng năm các công ty này phải nhập khẩu khoảng 2 triệu USD các thuốc tiêm vinblastin sunfat, vincristin sunfat để cung cấp cho thị trường các tỉnh phía Nam

Với tính cấp thiết trong vấn đề chủ động nguồn nguyên liệu và giá cả của các sản phẩm thuốc chứa vinblastin, việc nghiên cứu và ứng dụng triển khai quy trình bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin có trong cây Dừa cạn là hết sức cần thiết Thực hiện được điều này không những tận dụng hiệu quả các hoạt chất, giảm giá thành các thuốc ung thư máu chiết suất

từ lá Dừa cạn mà còn góp phần thực hiện mục tiêu chung của chương trình

Hóa Dược: “Nghiên cứu khai thác và sử dụng có hiệu quả các hoạt chất thiên

nhiên chiết tách, tổng hợp hoặc bán tổng hợp được từ các nguồn dược liệu và tài nguyên thiên nhiên quý giá và thế mạnh của nước ta, phục vụ tốt công nghiệp bào chế một số loại thuốc đặc thù của Việt Nam, đáp ứng nhu cầu chữa bệnh trong nước và xuất khẩu”

Nội dung của luận văn bao gồm:

- Chiết tách và phân lập vindolin, catharanthin từ cây Dừa cạn

Catharanthus roseus (L.) G Donn

- Nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về cây Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn và

Vinblastin

1.1.1 Giới thiệu về cây Dừa cạn [1,2]

Tên khoa học: Catharanthus roseus (L.) G Donn (còn gọi là Vinca

rosea L.; Lochera Rosea Reich.)

Thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae)

Tên thường gọi: Trường xuân hoa, cây bông dừa, cây dương giác (sừng dê), cây hoa hải đăng, cây pervenche de Madayascar

1.1.1.1 Mô tả cây

Cây nhỏ cao 0,4 – 0,8m, có bộ rễ rất phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên Mọc thành bụi dầy, có cành đứng, lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, phía cuống hẹp nhọn, dài 3 – 8cm, rộng 1- 2,5cm Hoa mọc trắng hoặc hồng, mùi thơm, mọc riêng lẻ ở các kẽ lá phía trên, quả gồm 2 đại, dài 2 – 4cm, rộng 2 – 3mm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 – 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi, thành đường chạy dọc Mùa hoa quả gần như quanh năm

1.1.1.2 Phân bố và thu hái

Cây Dừa cạn vốn có nguồn gốc xuất xứ từ đảo Madagasca (Châu phi) Mọc hoang dại và được trồng ở nhiều nước nhiệt đới như Việt Nam, Ấn độ, Inđônêxia, Philipin, châu Phi, châu Úc, Braxin,… Tại châu Âu và châu Mỹ ở những vùng nóng cũng trồng được quanh năm, nhưng ở những vùng lạnh cây được trồng theo mùa vì không chịu được lạnh

Ở Việt Nam gặp nhiều nhất tại các tỉnh gần biển, nhưng khắp nơi đều trồng được, trước đây chỉ được trồng làm cảnh, gần đây đã được trồng để thu hoạch lấy cây, lá và rễ chế thuốc

1.1.1.3 Công dụng

Chưa thấy tài liệu cổ của YHCTDT đề cập đến cây này

Theo kinh nhiệm sử dụng trong y học dân tộc của một số nước khác có cây Dừa cạn mọc hoang, rễ Dừa cạn có tác dụng tẩy giun, chữa sốt Thân và

lá có tính chất săn da (astringent), lọc máu (dépuratif) dùng chữa một số bệnh ngoài da và nhất là chữa đái tháo đường

Kinh nhiệm dùng dừa cạn chữa bệnh đái tháo đường được ghi nhận ở

Ấn độ, châu Úc, nam châu Phi quần đảo Antilles nhưng chứng minh bằng thực tế khoa học thì chưa có Những thí nghiệm trên thỏ (gây đường huyết thực nghiệm) và trên chuột (diabète alloxan) cho những kết luận không rõ Và như trên đã nói, chính nhờ thực nghiệm trên chuột mà các nhà khoa học đã phát hiện tác dụng làm giảm bạch cầu của một số chất tách được từ Dừa cạn

và dẫn tới việc phát hiện ra chất vincaleucoblastin và 3 ancaloid khác cũng có tác dụng chống u là leurosin, leurocristin và leurosidin Ngoài ra người ta còn phát hiện tác dụng tẩy giun khá mạnh, tác dụng lợi tiểu của catharanthin, vindolinin và vindolidin, nhưng ajmalicin lại có tác dụng ngược lại Những thí nghiệm dùng trên người bệnh được bắt đầu vào năm 1962 ở Mỹ, Pháp và một

số nước khác Tuy nhiên còn rất nhiều ý kiến khác nhau Hiện nay chưa có

loại thuốc nào tốt hơn nên nhu cầu về Dừa cạn vẫn cứ tăng lên Cũng vì mục đích dùng chữa các khối u cho nên khi mua Dừa cạn người ta đăc biệt chú ý tới hàm lượng ancaloid toàn phần, trong số ancaloid toàn phần ấy có bao nhiêu hàm lượng vincaleucoblastin

Trên thị trường thuốc thế giới thường có bán vincaleucoblastin (hay vinblastin) dưới dạng muối sunfat Dung dịch nước 0,1% không bền vững, đựng trong ống tiêm gắn kín (mỗi ống 10mg) và bảo quản trong tủ lạnh Dùng tiêm mạch máu với liều lượng 0,1 – 0,15mg/kg thể trọng Dùng chủ yếu chống bệnh Hodgkin Trong quá trình dùng thuốc này phải theo dõi bạch cầu Thuốc được dùng cho cả trẻ em

Loại thuốc thứ hai là leucocristin (hay vincristin) cũng dưới dạng muối sunfat, tiêm mạch máu với liều lượng 0,03 – 0,1mg/kg cơ thể trong các bệnh

về máu (hemopathie), bệnh bạch huyết leucemie limphoblistique

Ở nước ta, nhân dân còn dùng dưới dạng thuốc sắc làm thuốc lợi tiểu, chữa huyết áp, tiểu đường Ngày dùng 10-16g

1.1.1.4 Thành phần hoá học

Từ cây Dừa cạn người ta đã chiết được các chất sau đây: Axit pyrocatechic, sắc tố flavonic (glucozit của quercetol và campferol) và

anthocyanic từ thân và lá Dừa cạn hoa đỏ ( theo Forsyth và Simmonds, 1957)

Ngoài ra từ lá người ta còn chiết được axit ursolic và từ rễ chiết được cholin Năm 1969, Battersby và cộng sự còn chiết được chất vicosid, một glucoalcaloid tiền thân để sinh tổng hợp các ancaloid

Hiện nay người ta đã xác định được hoạt chất của Dừa cạn là những ancaloid có nhân indol có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất trong

rễ và lá

Tùy theo nơi thu hái, hàm lượng các ancaloid này thay đổi từ 0,2 – 1%

Và có thể có những giống có hàm lượng cao hơn

Việc xác định sự có mặt của các ancaloid trong cây được bắt đầu vào cuối thế kỷ 19 Nhưng phải đợi tới sau năm 1950 mới được nghiên cứu kỹ hơn và có thể chia làm hai giai đoạn:

Giai đoạn đầu là tách được các ancaloid có tinh thể: Năm 1953, Paris

và Moyse chiết được vincein, sau này được Chatterjee đặt tên là vincaine (1955) Nhưng vincein hay vincaine cũng chỉ là chất d-yohimbin hay ajmalicine đã được phát hiện trong cây Ba gạc

Giai đoạn hai đánh dấu bằng việc tách được các ancaloid dime có tác dụng phân bào (mitoclasique): Một số nhà khoa học Canada gồm Noble, Beer

và Cutts trong khi nghiên cứu tìm cách chiết riêng các phần của cây Dừa cạn đối với bệnh đái tháo đường (vì cây Dừa cạn được y học cổ truyền nhiều nước dùng chữa đái đường) tình cờ tách được một ancaloid có tinh thể gọi là vincaleucoblastin có tác dụng làm giảm bạch cầu trong máu chuột thí nghiệm (1958) Tin này đã được các nhà khoa học Mỹ, Canada đi sâu nghiên cứu thêm Tính đến năm 1964, Svoboda (Laboratoires Lilly) và cộng sự đã tách ra hơn 55 chất khác nhau chia làm 2 nhóm:

Nhóm ancaloid monomer có nhân indol hay indolinic (dihydroindol như ajmalicin, chủ yếu trong rễ, serpentin, alstonin, akuammin, lochnerin, catharanthin, reserpin và vindolin (chất này chủ yếu thấy trong lá)

Nhóm ancaloid dime không đối xứng gần như đặc thù của loài Dừa cạn

Catharanthus roseus

Tiêu biểu là vincaleucoblastin còn gọi là vinblastin thường được viết tắt

là VLB cấu trúc hoá học được Neuss làm sáng tỏ năm 1962 Công thức thô là

C46H58N4O9 với 2 nhóm COOCH3, một nhóm OCH3, 2 nhóm OH, được cấu tạo bởi một phân tử catharanthin (nhân indol) và một phân tử vindolin (nhân indolinin)

Cùng thuộc nhóm này còn có các ancaloid sau đây:

Leurosin (còn gọi là vindoleurosin) đồng phân của vincaleucoblastin Leurocristin (còn gọi là vincristin) phát hiện năm 1961, rất gần với VLB với một nhóm N-formyl thay cho N-metyl

Leurosidin (vinrosidin), leurovisin, rovidin

Những ancaloid thuộc nhóm này đóng vai trò quan trọng nhất vì có tác dụng chống u (antitumoral)

Nhưng hàm lượng của những ancaloid ấy chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ trong tổng lượng ancaloid toàn phần chứa trong Dừa cạn (dưới 1/10.000) vả lại việc tách riêng từng ancaloid có tác dụng cũng rất công phu và tốn kém (theo Claus, 1965, phải từ 500kg Dừa cạn mới chiết được 1g leucocristin) Những loại ancaloid chống u này có nhiều trong lá hơn trong rễ, hạt không chứa ancaloid, hàm lượng còn thay đổi tuỳ theo giống và điều kiện trồng hái

1.1.2 Vinblastin

1.1.2.1 Tên, công thức

- Tên riêng: Vinblastin

- Tên khoa học (theo danh pháp UIPAC): methyl (3aR, 4R, 5S, 5aR, 10bR, 13aR) – 4 – acetoxy – 3a – ethyl – 9 – [(5S, 7R, 9S) – 5 – ethyl – 5- hydroxy – 9 (methoxycarbonyl) – 1, 4, 5, 6, 7, 9, 10 – octahydro – 2H – 3, 7 methanoazacyclo-undecino [5, 4 – b] indol – 9 - yl] – 5 – hydroxy – 8 –

methoxy – 6 – methyl – 3a, 4, 5, 5a, 6, 11, 12, 13a – octahydro – 1H –

indolizino [8, 1 – cd]carbazol – 5 – caboxylic

N N

O

CH3H

CH3

- Các biệt dược: VELBAN®, VINCASAR SPF, NAVELBINE®

1.1.2.2 Tính chất vật lý

- Góc quay cực: [α]D23 -32° (c = 0.88 trong metanol)

- pKa: pKa1 5.4; pKa2 7.4

- Nhiệt độ nóng chảy: 211 – 2160C

- Hấp phụ UV cực đại tại các bước sóng: 214 nm, 259 nm

- Độ tan: Tan trong cồn, axeton, etyl axetat, clorofoc, không tan trong nước

1.1.2.3 Tác dụng dược lý

a) Dược lực

Vinblastin là một ancaloid chiết xuất từ cây Dừa cạn Catharanthus

roseus (L.) G Donn có tác dụng chống ung thư

b) Dược động học

- Hấp thu: Vinblastin hấp thu nhanh chóng theo đường tiêm tĩnh mạch

- Phân bố: Thuốc phân bố nhanh vào các mô của cơ thể, thuốc liên kết với protein huyết tương khoảng 75% Vinblastin ít qua hàng rào máu não và không đạt nồng độ điều trị trong dịch não tủy

- Chuyển hóa: Vinblastin được chuyển hóa nhiều, chủ yếu ở gan để thành desacetyl vinblastin là chất có hoạt tính mạnh hơn vinblastin, tính trên

cơ sở cùng khối lượng

- Thải trừ: Thuốc thải trừ qua mật vào phân và vào nước tiểu, một số đào thải dưới dạng thuốc không biến đổi

c) Tác dụng

Vinblastin có cơ chế tác dụng chưa rõ ràng, nhưng có lẽ vinblastin thể hiện tác dụng độc tế bào bằng cách ức chế sự tạo thành các vi ống trên thời gian phân chia tế bào ở pha giữa (pha M) Ở nồng độ cao, vinblastin còn thể hiện nhiều tác dụng phức tạp trên tổng hợp axít nucleic và protein

d) Chỉ định

Bệnh Hodgkin, u limpho không Hodgkin, u limpho mô bào, u sùi dạng nấm, ung thư tinh hoàn tiến triển, sarcôma Kaposi, bệnh mô bào huyết, ung thư nhau, ung thư vú

Phenytoin dùng cùng với vinblastin thì nồng độ phenytoin trong huyết thanh giảm, có lẽ do giảm hấp thu và tăng chuyển hóa của phenytoin Do đó cần điều chỉnh liều phenytoin

Vinblastin được chuyển hóa bởi isoenzym CYP3A của cytocrom P450 Dùng vinblastin cùng với thuốc ức chế mạnh enzym này, chuyển hóa của vinblastin có thể bị ức chế, dẫn đến xuất hiện sớm hoặc tăng mức độ nặng của các tác dụng phụ của thuốc

Tiêm quá liều vinblastin có thể bị phản ứng không mong muốn

Không có thuốc giải độc đặc hiệu

Vì vinblastin bài xuất chủ yếu qua gan, mật, nên độc tính của thuốc có thể tăng khi bị suy gan Việc chăm sóc hỗ trợ quá liều bao gồm: theo dõi tim mạch, dùng thuốc chống co giật, phòng ngừa tắc ruột, xét nghiệm đếm máu hàng ngày để xác định yêu cầu truyền máu và để đánh giá nguy cơ nhiễm khuẩn

Tác dụng chủ yếu của quá liều vinblastin là suy tủy xương có thể đe dọa tính mạng

Không có thông tin về hiệu quả thẩm phân hoặc của cholestyramin trong điều trị

p) Bảo quản

Thuốc độc bảng A

Bảo quản ở nhiệt độ 4 – 80C, tránh ánh sáng

1.2 Các nghiên cứu về công nghệ chiết xuất và bán tổng hợp trên thế giới

1.2.1 Một số vinca ancaloid

Như đã nói ở trên, năm 1952, khi nghiên cứu tác dụng của các ancaloid

từ lá Dừa cạn lên chuột , R Noble và C Noble đã phát hiện ra các hợp chất này có khả năng làm giảm số lượng bạch cầu trong máu chuột Từ đó, theo định hướng nghiên cứu các chất gây độc tế bào hoặc gây ức chế phân bào

bạch cầu ác tính, các Vinca ancaloid có hoạt tính như vinblastin, vincristin,

vindesin và vinorelbin đã được phân lập hoặc bán tổng hợp để ứng dụng trong điều trị ung thư, đặc biệt là các bệnh Hodgkin và các bệnh ung thư máu

Năm 1958, lần đầu tiên Noble và Beer đã phân lập được vinblastin – còn gọi là vincaleukoblastin từ lá cây Dừa cạn; trong các năm 1959 đến 1962, Johnson và Svoboda đã tìm ra vincristin – một ancaloid hàm lượng thấp trong cây Dừa cạn Hợp chất muối sunfat của vinblastin và vincristin đã được áp dụng rộng rãi trong các trị liệu hóa học chữa ung thư máu, ung thư mô bào bạch huyết, ung thư tinh hoàn và ung thư vú [12, 13]

Các nghiên cứu tổng hợp vinblastin và chuyển hoá thành các dẫn xuất

áp dụng trong hoá trị liệu ung thư cũng được đẩy mạnh: Năm 1978, Barnett

và cộng sự bằng các phản ứng hydrazin và hydro hoá đã chuyển hoá vinblastin thành vindesin, ngay lập tức chất này đã được áp dụng trong hoa trị liệu các bệnh ung thư vú và ung thư phổi dưới dạng biệt dược là Endisine®; nhưng dấu mốc quan trọng nhất mở ra hướng mới cho việc sản xuất vinblastin

và các dẫn xuất từ cây Dừa cạn là thành công của Mangeney và cộng sự vào

năm 1979, khi họ cải tiến phản ứng Polonovski để tổng hợp vinblastin và

vincristin từ các ancaloid chủ yếu của Vinca rosea L là vindolin và

catharanthin [1, 2, 13, 14]

Cấu trúc của một số Vinca ancaloid đã được ứng dụng để điều chế

thuốc chống ung thư và một số bệnh khác như sau:

O

CH3H

H3C

N N

CH3

Vincristine

Cho đến nay, vinblastin và các dẫn xuất sử dụng làm thuốc chống ung

thư trên thế giới đã được sản xuất theo hai con đường: 1- Chiết xuất từ lá Dừa

cạn, 2- Bán tổng hợp từ vindolin và catharanthin theo phương pháp hoá học hoặc phương pháp sử dụng xúc tác enzym [15]

Với các kết quả nghiên cứu về cơ chế gây bệnh ung thư và điều trị trong y học lâm sàng hiện đại và trong lĩnh vực sinh học phân tử, vinblastin, vincristin và các dẫn xuất lại đã được khẳng định một lần nữa là các hoạt chất

có tác dụng chống ung thư thực thụ, không chỉ với vai trò là các tác nhân gây độc tế bào (cytotoxicity) như đã biết, mà còn đóng vai trò là các chất ức chế hoạt tính của NF-κB (nuclear factor κB) – tác nhân chủ yếu trong quá trình gây ra các bệnh viêm và phát sinh tế bào ung thư [13, 16 – 23]

1.2.2 Vài nét về các công nghệ phân lập Vinca ancaloid

Vinblastin và vincristin là các ancaloid dime indol-indolin có trong lá

và hoa của cây Dừa cạn với hàm luợng thấp (10-5 – 10-4 %), do đó việc phân lập tinh khiết các chất này thường rất phức tạp và đòi hỏi kỹ thuật chiết tách ở trình độ cao Mặc dù vậy, hiện nay các quy trình chiết Dừa cạn vẫn được xây dựng dựa theo phương pháp chung chiết xuất ancaloid, sử dụng kỹ thuật chiết phân bố bằng các dung môi hữu cơ khác nhau cùng với việc thay đổi pH phù hợp với từng giai đoạn cụ thể

Sau đây là sơ đồ tóm tắt một số phương pháp chiết tách truyền thống và

hiện đại đang được áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất các Vinca ancaloid

[13, 14, 20 – 26]

Sơ đồ 1.2.2: Tóm tắt các quy trình chiết và phân lập ancaloid

NGUYÊN LIỆU DỪA CẠN

Chiết xuất Ajmalicine & dẫn xuất

Chiết xuất Indole-Indolo alkaloids

+ Ancol; H 2 O;

+ Acid, Base

Hydro hóa và phân tách

NPLC &PRLC

Theo Noble và cộng sự, lá Vinca rosea L được chiết bằng hỗn hợp

etanol và axít axetic theo tỷ lệ thích hợp Cao dịch chiết thu được sau khi cất loại dung môi được hoà vào dung dịch HCl 2% và lọc loại sạch tạp chất không tan Dịch lọc được điều chỉnh tới pH 4 và chiết rửa bằng benzen để loại

bỏ các tạp chất màu và các chất màu và các chất ít phân cực không có tính kiềm Dịch nước axít còn lại được trung hoà bằng NH4OH rồi đem chiết lấy hỗn hợp “ancaloid tổng số” (Total ankaloids) bằng benzen và clorofoc [12]

“Ancaloid tổng số” được phân tách bằng sắc kí cột trên chất hấp phụ là nhôm ôxit hoạt độ 4 – 5 (Woehlem Al2O3 grade IV-V) với hệ dung môi benzen – diclometan rửa giải theo cách gradient Các phân đoạn sắc ký được sàng lọc bằng cách kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào và được xác định thành phần vinblastin bằng sắc kí lớp mỏng Các phân đoạn sắc kí chứa vinblastin được cô kiệt, sau đó hoà vào dung dịch axít sunfuric/etanol để kết tinh vinblastin sunfat [12, 13, 14]

Svoboda và cộng sự (1959) đã đóng góp vào quy trình của Noble một

số cải tiến có ý nghĩa Ở giai đoạn đầu, nguyên liệu thực vật được chiết trực tiếp với dung môi ít phân cực như n-hexan để rửa các chât màu và ancol béo mạch dài trước khi chiết với dung môi axít tartric/etanol Ở giai đoạn sau, các dung môi độc hại như benzen đã được thay thế bằng clorofoc, diclometan, dicloetan “Ancaloid tổng số” vẫn được phân tách bằng sắc kí cột trên oxit nhôm Phương pháp này đã được áp dụng từ những năm 1960 để sản xuất vinblastin sunfat và vincristin sunfat tại công ty Eli Lylli, Mỹ [13, 14, 22]

Trong dung môi ancol/nước phối hợp với đệm axít, các Vinca ancaloid

có các giá trị pKa khác nhau, đây chính là một lý do để phân tách các hợp chất này bằng sắc kí phân bố lỏng – lỏng với các pha dung môi có pH khác nhau Năm 1999, Tại CNRS – Pháp, Renaul và cộng sự đã công bố kết quả

nghiên cứu phân lập Vinca ancaloid bằng sắc kí phân bố ly tâm (CPC) với hai

pha dung môi có pH biến đổi dần dần (gradient) “Ancaloid tổng số” của lá

Dừa cạn được phân tách trên cột tách HPCPC Sanki series 1000 với pH của một pha gradient từ 2 – 9; pha còn lại có pH gradient từ 10 – 4 Độ tinh khiết của các ancaloid vindolin, catharanthin, vinblastin và vidolinin phân tách được từ hỗn hợp đạt 80 – 90% Tuy nhiên, do quy mô phân tách thấp hơn so với các phương pháp sắc ký khác nên kỹ thuật CPC chỉ được áp dụng hạn chế

ở các nghiên cứu thí nghiệm [23]

Cũng dựa vào sự khác biệt hằng số pKa của các Vinca ancaloid trong

dung dịch nước/axit, Guanasekera và cộng sự đã phát triển phương pháp chiết phân bố bằng các dung môi dẫn xuất clo ở các pH khác nhau Theo đó, dịch chiết nước/axit của lá Dừa cạn được điều chỉnh môi trường bằng NH4OH tới từng giá trị pH xác định rồi chiết với diclometan, dicloetan hoặc clorofoc để thu nhận từng phần chiết ancaloid tương ứng Với phương pháp chiết này, tuy tổng cộng lượng ancaloid trong các phần chiết thu được thấp hơn so với

phương pháp truyền thống, nhưng có thể tập chung từng nhóm Vinca ancaloid

vào những phần chiết xác định và từ đó tiết kiệm được chi phí phân lập tinh khiết những ancaloid mong muốn [24, 25, 26]

Nhìn chung, các phương pháp chiết xuất và phân tách ancaloid đang được áp dụng để nghiên cứu phân lập các ancaloid từ cây Dừa cạn đều có thể thực hiện được trong các pilot và các phòng thí nghiệm Hóa dược, Hóa Hữu

cơ và Hóa Hợp chất thiên nhiên Nhưng các phương pháp này đều có nhược điểm chung là phân chia thành nhiều giai đoạn thực hiện phức tạp, khó kiểm soát, dễ gây thất thoát sản phẩm, điều này mang ý nghĩa tiêu cực đối với triển khai ở quy mô công nghiệp chiết xuất các hợp chất có hàm lượng thấp như

các Vinca ancaloid [13 – 26]

Do vậy, để có thể đưa công nghệ ra sản xuất, các quy trình chiết và phân tách nên được xây dựng thành các quy trình công nghệ hoàn chỉnh khép kín; thay thế các dung môi độc hại như benzen bằng các dung môi tương

đương ít độc và ít ảnh hưởng môi trường; tối ưu hóa và hiện đại hóa các phép

đo kiểm soát quá trình chiết và tách sắc ký

1.2.3 Vài nét về bán tổng hợp Vinblastin

Vinblastin và các dẫn xuất là các ancaloid dimeric có hàm lượng thấp (~ 0,01 % trong lá Dừa cạn khô), trong khi ancaloid chủ yếu của Dừa cạn là vindolin – một trong hai phần monomer cấu thành vinblastin – có hàm lượng trong lá Dừa cạn lớn hơn 4 đến 5 lần so với vinblastin Trong quá trình phân tách “ancaloid tổng số” của Dừa cạn bằng sắc ký hấp phụ, thông thường vindolin và catharanthin được rửa giải ra trước so với vinblastin Để hạ giá

thành thuốc, tận dụng phụ phẩm vindolin, catharanthin cũng như các Vinca

ancaloid khác, các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin và các dẫn xuất từ vindolin và catharanthin đã được phát triển mạnh mẽ và đưa vào áp dụng trên thế giới từ cuối những năm 1970 [27 – 34]

Năm 1978, Barnett và cộng sự bằng các phản ứng hidrazin hóa và hidro hóa đã chuyển hóa vinblastin thành vindesin, ngay lập tức chất này đã được

áp dụng trong hóa trị liệu các bệnh ung thư vú và ung thư phổi dưới tên biệt dược là Eldisine® ; nhưng dấu mốc quan trọng nhất mở ra hướng mới cho việc sản xuất vinblastin và các dẫn xuất từ cây Dừa cạn là thành công của Mangeney và cộng sự vào năm 1979, khi cải tiến phản ứng Potier – Polonovski để bán tổng hợp vinblastin và vincristin từ các ancaloid chủ yếu

của C roseus là vindolin và catharanthin [27, 28, 30]

Năm 1974, tại CNRS – Pháp, Potier cùng các cộng sự đã nghiên cứu điều chế các dimeric ancaloid kiểu vinblastin dựa trên cơ sở ôxy hóa

catharanthin thành N b-oxid-catharanthin và ghép đôi với vindolin theo phản ứng Potier – Polonovski Theo hướng này, Mageney cùng với nhóm nghiên

cứu của Potier đã điều chế thành công 5’-nor-anhydovinblastin (vinorelbin),

vinblastin, leurosidin, leurosin và vincristin Các chất này đều có hoạt tính tốt

và các quy trình bán tổng hợp được áp dụng tại công ty Pierre Fabre để sản

xuất thuốc chống ung thư vào năm 1979 Theo quy trình sử dụng vào thời kỳ

đó, hiệu suất tạo thành vinblastin và đồng phân 20’-epimer của nó là

leurosidin khá thấp (~ 2 %), chi phí các chất phản ứng cao, do đó công ty

Pierre Fabre chỉ điều chế đến 5’-nor-anhydrovinblastin để sản xuất vinorelbin

tartrat và đăng ký độc quyền sản phẩm này làm thuốc tiêm và viên nén NAVELBINE® Từ phát kiến của Potier và Mageney, các nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất điều chế vinblastin, tổng hợp chọn lọc lập thể vinblastin và các dẫn xuất được đẩy mạnh ở CNRS cũng như các nhóm nghiên cứu khác trên thế giới (Xem Sơ đồ 1.2.3)

Năm 1979, Langlois và cộng sự đã nghiên cứu các phản ứng sử dụng ôxy không khí làm tác nhân ôxy hóa Dạng enamin được khử bằng hydro với xúc tác Pd/C hoặc bằng NaBH4 Sau này, Kutney (1988) đã công bố quy trình one-pot điều chế vinblastin và leurosidin với phản ứng ôxy hóa sử dụng peroxid, ôxy không khí hoặc FeCl3; tác nhân khử là các dẫn xuất dihydronicotinamid Với tỷ lệ nồng độ các chất phản ứng phù hợp, hiệu suất vinblastin có thể đạt tới hơn 40 % (Sơ đồ 1 ) [29]

3’,4’-Anhydrovinblastin (AVLB) được tạo ra với hiệu suất 18 % trong quá trình one-pot tổng hợp vinblastin từ catharanthin và vindolin Trong khi

đó, nếu chọn lọc thực hiện phản ứng khử - 1,2 hợp chất trung gian hoạt động iminium bằng tác nhân NaBH4, hiệu suất tạo thành 3’,4’-anhydrovinblastin đạt tới trên 80 % (Sơ đồ 1.2.3) Do đó các nghiên cứu bán tổng hợp vinblastin

từ AVLB cũng được đẩy mạnh nhằm tận dụng sản phẩm này và nâng cao năng suất VLB [32]

Sakamoto và các cộng sự (1990) đã phát triển phương pháp ôxy hóa AVLB bằng FeCl3/amoni oxalat và phương pháp này đã được áp dụng tại Công ty Công nghệ Hóa dầu Mitsui để sản xuất vinblastin Hiệu suất chuyển hóa AVLB ~ 90 %, hiệu suất tạo thành vinblastin đạt tới hơn 40 % [32]

Sơ đồ 1.2.3: Các phương pháp điều chế vinblastin từ vindolin và

catharanthin

Theo hướng sử dụng xúc tác nguồn gốc sinh học làm tác nhân chiral, năm 2006, Tatsuya và các cộng sự đã công bố kết quả sử dụng kháng thể monoclon anti-vinblastin Mab-10-A9 làm xúc tác, oxy không khí và NaBH3CN được sử dụng làm các tác nhân oxy hóa – khử hóa; sau 24 giờ, hiệu suất chuyển hóa 3’,4’- anhydrovinblastin tạo thành vinblastin đạt tới 82,2

%, trong sản phẩm hoàn toàn không có mặt 20’-epi-vinblastin (leurosidin)

Tuy nhiên, việc tổ hợp Mab-10-A9 trên động vật hiện vẫn còn đang ở trong giai đoạn nghiên cứu và phát triển cho tương lai [19]

Sơ đồ 1.2.3 tóm tắt các phương pháp ôxy hóa ghép đôi vindolin và catharanthin điều chế vinblastin theo các tác giả Potier và các cộng sự, Kutney và các cộng sự, Sakamoto và các cộng sự

1.2.4 Vài nét về tình hình nghiên cứu và triển khai trong nước

Ở Việt Nam, cây Dừa cạn mọc tự nhiên suốt từ Bắc vào Nam và cũng được trồng làm cảnh Đây là một giống cây có khả năng chịu hạn cao và có thời gian canh tác ngắn Các kết quả thử nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu

trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt cho thấy cây Dừa cạn C roseus có thể

phát triển tốt trên đất cát khô hạn, chỉ sau 5 tháng cây đã trưởng thành và tích lũy đủ hàm lượng ancaloid đạt tiêu chuẩn xuất khẩu Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt – Công ty Vimedimex II đã thử nghiệm canh tác cây Dừa cạn trên các vùng đất cát ven biển các tỉnh miền Trung để thu hoạch rễ và lá phục vụ xuất khẩu với sản lượng hàng trăm tấn một năm

Từ những năm 1980 – 1990, Đại học Dược Hà Nội, Viện Dược liệu và

Xí nghiệp Dược phẩm Trung Ương II thuộc Bộ Y tế đã thực hiện các đề tài nghiên cứu chiết xuất vinblastin và các ancaloid khác từ Dừa cạn Việt Nam

để phục vụ sản xuất thuốc chống ung thư và thuốc hỗ trợ tuần hoàn não Các tác giả đã nghiên cứu chiết ancaloid mô phỏng theo các quy trình của Noble

và Svoboda Cụ thể như sau: Nguyên liệu được chiết bằng cồn 90o, cao dịch

chiết sau khi loại dung môi được chuyển sang dạng muối ancaloid bằng cách hòa vào dung dịch axít sunfuric 2 % cho tan tối đa, pH được điều chỉnh giữ ở khoảng pH 2, sau đó lọc loại sạch cặn không tan Dịch lọc được chiết rửa nhiều lần với tricloetylen để loại các chất lipophin Dịch axít còn lại được kiềm hóa bằng NH4OH tới khoảng pH 9,5 – 10, sau đó chiết lấy “ancaloid tổng số” từ dung dịch kiềm này bằng tricloetylen “Ancaloid tổng số” được phân tách trên cột sắc ký nhôm ôxit với hệ dung môi rửa giải là benzen và một số dung môi hữu cơ khác Các phân đoạn sắc ký được kiểm tra định tính bằng sắc ký lớp mỏng Sản phẩm được kết tinh trực tiếp từ các phân đoạn sắc

ký dưới dạng muối sunfat sau khi đã cô loại bớt dung môi Ngoài vinblastin sunfat, các tác giả cũng thu được các ancaloid chủ yếu của Dừa cạn như vindolin, catharanthin và ajmalicin Nhược điểm của phương pháp này là các vinca ancaloid sẽ không được trích ly một cách triệt để ra khỏi các mô thực vật do chúng khá khó tan trong dung môi cồn nước Một nét cải tiến trong quá trình chiết so với Noble là sử dụng axít sunfuric để đưa các vinca ancaloid trong cao dịch chiết thành dạng muối sunfat tan trong nước Đây là dạng muối khá bền và không tan ngay cả trong cồn tuyệt đối, do đó có thể dễ dàng chiết rửa loại tạp chất lipophin trong dịch chiết bằng tricloetylen Tuy vậy

“ancaloid tổng số” cũng sẽ có mặt cả các muối sunfat của ancaloid, các anion sunfat nếu không được loại bỏ trước bằng sắc ký trao đổi ion sẽ ảnh hưởng mạnh tới độ chọn lọc của quá trình tách ancaloid trên cột sắc ký nhôm ôxit

Do đó sản phẩm vinblastin và vinblastin sunfat sẽ không được làm giàu tới mức độ cần thiết để kết tinh mà buộc phải điều chế ở dạng đông khô, rất dễ hút ẩm và bị phân hủy

Trong nỗ lực tổng hợp toàn phần các Vinca ancaloid, năm 1990, các tác

giả Phan Đình Châu (Đại học Dược Hà Nội), Csaba Szántay (Đại học kỹ thuật

Budapest – Hungary) và các cộng sự đã điều chế được các dẫn xuất Vinca

ancaloid monomeric như vincadifformin, (+/-)-3-oxominovin và tabersonin

Tuy nhiên, ngoài tabersonin thể hiện hoạt tính làm giảm nhẹ huyết áp (khoảng

25 % khi so sánh với reserpin), các chất này đều chưa tìm được ứng dụng trong điều trị lâm sàng [36]

Cũng trong những năm 1990, các tác giả Mai Ngọc Tâm (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), Bogomil Pyuskyulev (Viện Hàn lâm khoa học Bungari) và các cộng sự đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu lực cao phân tích xác định sự biến đổi hàm lượng vindolin, catharanthin và vinblastin trong lá Dừa cạn vào các thời kỳ sinh trưởng khác nhau Đóng góp vào các hiểu biết về bán

tổng hợp, chuyển hóa và cấu trúc của các Vinca ancaloid kiểu vinblastin, tác giả Mai Ngọc Tâm cùng các cộng sự cũng đã thực hiện những biến cải hóa học ở các vị trí C-16, C-17 và C-20’ của vinblastin tạo ra dẫn xuất ∆15(16)-17-deaxetoxy-20’-deoxy-vinblastin và dẫn xuất mới tri-O-axetylguanosin ở C-17 của hợp chất này [37, 39]

Cho tới nay, việc tiếp thu các kỹ thuật phân lập hiện đại và nghiên cứu

hoàn thiện công nghệ điều chế vinblastin từ Dừa cạn C roseus ở Việt Nam

còn chưa được quan tâm đúng mức và chưa được tổ chức triển khai nghiêm túc Với một nguồn nguyên liệu Dừa cạn đạt và vượt tiêu chuẩn của châu Âu

đã được tổ chức canh tác rất quy mô, sản lượng xuất khẩu sang thị trường Pháp và châu Âu đạt hàng trăm tấn một năm, mà chúng ta vẫn phải nhập khẩu vinblastin sunfat từ các hãng Eli Lilly – Mỹ, Geoden Richer – Hungary,

Pierre Fabre – Cộng hòa Pháp với giá 60 USD/50 mg Từ đó thấy rằng, việc

nghiên cứu hoàn thiện công nghệ bán tổng hợp vinblastin từ vindolin và catharanthin, bao gồm cả công nghệ chiết, tách vindolin, vatharanthin, và vinblastin là hết sức cần thiết

PHẦN 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là Lá và Hoa cây Dừa cạn hoa đỏ được

trồng tại Hà Nội Cây Dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G Donn (Vinca

rosea L.) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) Nguyên liệu Dừa cạn sau khi thu

hái, tách lấy riêng phần lá, hoa và cành non (tính từ ngọn có hoa xuống đến vòng lá thứ 6 – 7) và gọi chung là “Nguyên liệu” hoặc “Lá” Phơi khô nguyên liệu dưới bóng mát, sau đó sấy ở 50-600C và xay thành bột trong cỡ dây 0,5-1,5 mm Độ ẩm của bột nguyên liệu là 9%

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Mẫu thực vật

Cây Dừa cạn hoa đỏ được thu hái tại Hà Nội Mẫu cây được Ts Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh Vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định

2.2.2 Phương pháp chiết xuất [11]

Phương pháp chiết xuất bao gồm cả việc chọn dung môi, dụng cụ chiết

và cách chiết Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác nhau trong từng loại dung môi nên phải áp dụng các phương pháp chiết khác nhau đối với mỗi loại chất

đó Có hai cách chiết là chiết lạnh và chiết nóng Ở đây chỉ sử dụng phương pháp chiết lạnh

Nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các loại dung môi thích hợp để hòa tan các chất có trong nguyên liệu thực vật ở nhiệt độ thường Phương pháp này thường được chọn vì có những ưu điểm sau:

- Nhiệt độ chiết thấp (bằng nhiệt độ phòng) nên không ảnh hưởng đến hợp chất dễ bị biến đổi tính chất hóa học, sinh học bởi nhiệt độ cao

- Có thể thu được phần lớn các hợp chất có trong thực vật bằng cách thay đổi dung môi thích hợp, không cần thay đổi dụng cụ hay phương pháp khác

- Phương pháp này đảm bảo tính kinh tế vì phần lớn dung môi có thể thu hồi lại bằng thiết bị cất quay dưới áp suất thấp để chiết tiếp lần sau nên thực thực tế lượng dung môi tiêu tốn không nhiều Phương pháp này thích hợp khi phải dùng một lượng lớn dung môi cho một lần chiết

Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải có các điều kiện đảm bảo an toàn lao động tốt vì các dung môi đều dễ bay hơi, dễ cháy nổ và độc hại với sức khỏe con người Mặc khác cần có thời gian ngâm để dung môi hòa tan tốt các hoạt chất trong thực vật

2.2.3 Phương pháp sắc ký để nhận biết và phân lập các hợp chất [9]

2.2.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

a) Cơ sở của phương pháp sắc ký lớp mỏng

Chất cần phân tích được cho tương tác với hai pha tĩnh và pha động Pha động ở đây là chất lỏng, chuyển mẫu qua vùng chứa pha tĩnh hấp phụ Tại đây, chất cần phân tích sẽ tương tác với chất hấp phụ nhờ tính phân cực của chúng Do sự tương tác này mà chất cần phân tích sẽ chuyển động chậm hơn trong hệ sắc ký Chất phân tích có ái lực yếu hơn với pha tĩnh sẽ chuyển động nhanh hơn và đạt tới khoảng cách dịch chuyển lớn hơn so với chất có ái lực mạnh hơn Nhờ vậy mà các chất được phân tách trong quá trình chạy sắc

ký ở các vị trí khác nhau

b) Chuẩn bị bản mỏng

Chọn bản mỏng hình vuông hoặc hình chữ nhật Các chất hấp phụ có thể là silicagel, nhôm oxyt, thạch cao, xenluloza, chất hấp phụ ngược pha (RP-8) Thông thường hay sử dụng là silicagel

c) Đưa mẫu lên bản mỏng

Vết chấm càng nhỏ thì khả năng phân tách càng cao, thường dùng capila Khoảng cách từ đường chấm mẫu đến mép bản mỏng là 15 mm khoảng cách giữa hai mẫu chấm không được dưới 10 mm Sau đó phải đợi cho dung môi bay hết thì mới được chấm tiếp

d) Quá trình phân tách các chất trên bản mỏng

Đổ vào hộp chạy sắc ký một lượng dung môi đủ để khi bản mỏng đặt thẳng đứng sẽ nhúng vào dung môi tới 5 mm Cặp một mảnh giấy thấm tẩm dung môi lên thành sau của hộp sắc ký, mảnh giấy dài tới đáy hộp để bão hòa dung môi lớp khí quyển ở trong Dung môi không được chạy lên lớp chất hấp phụ quá 10 – 11 cm, vì chạy xa sự dịch chuyển sẽ chậm lại, các chấm bị khuyếch tán, kết quả là giá trị Rf (tỷ lệ giữa chiều dài di chuyển của chất phân tích và chiều dài di chuyển của dung môi) chênh lệch nhau quá nhiều

Khi dung môi đã lên tới chiều cao đã định, lấy bản mỏng ra đem sấy ngoài không khí hoặc trên bếp điện

e) Phát hiện các chất trên sắc ký đồ

- Phương pháp quang học: Dùng đèn tử ngoại, khi chiếu ánh sáng tử ngoại, các chất hấp thụ ánh sáng ở vùng quang phổ đó sẽ hiện dưới dạng các vệt thẫm màu Nguồn sáng phát quang có bước sóng trong vùng từ 254 – 365

nm Có thể dùng máy ultrachimiscope (254 nm), đèn tử ngoại để bàn KP-IN (365 nm)

- Phương pháp hóa học: Với từng lớp chất có thể dùng những thuốc thử đặc hiệu để hiện mầu, với ancaloid thì dùng thuốc thử Von’s hoặc thuốc thử Dragendorff – Munier

f) Điều kiện chuẩn để chạy sắc ký bản mỏng

- Bản mỏng silicagel Merck 60F254 tráng sẵn trên đế nhôm dày 0,2 mm

- Bảo quản các bản mỏng trong hộp đậy kín có silicagel hút ẩm

- Khoảng cách từ đường chấm mẫu tới mép bản mỏng là 15 mm

- Khoảng cách chạy dung môi là 100 mm

- Hộp sắc ký được bão hòa dung môi

- Nhúng bản mỏng ngập xuống dung môi 5 mm

- Dung môi phải tinh khiết

8 – 10 là đủ, kích cỡ hạt thường dùng là 100 – 160 µm vì các dịch chiết từ thực vật thường có thành phần phức tạp, khác nhau nhiều về tính chất lý, hóa,

độ phân cực, độ hấp phụ, … Dùng hạt quá nhỏ sẽ cản trở tốc độ dòng pha động, do đó tách chậm, có thể còn tắc cột Quan trọng là với lượng silicagel cho trước, phải chọn được cột có kích thước thích hợp, nếu chọn cột dài thì dù

đủ khả năng tách tốt nhưng thời gian tách lại lâu Thực tế một cột có kích thước h/d (chiều dài/đường kính) từ 10 -15 là được

c) Nhồi cột

Có 2 cách nhồi cột: Nhồi ướt và nhồi khô

- Nhồi ướt: Cân silicagel cho vào một cốc miệng rộng có dung tích thích hợp, đổ dung môi vào, khuấy đều tay để đuổi hết bọt khí và làm

silicagel phân tán đều trong dung môi Giai đoạn này ảnh hưởng lớn đến khả năng tách của cột sau này vì nếu có bọt khí hoặc silicagel bị vón cục thì sự phân tách sẽ kém nhiều

Cột được kẹp vào giá ở vị trí thẳng đứng, đáy cột được lót một lớp bông xốp Đổ từ từ silicagel đã được trộn đều với dung môi vào cột Chú ý bổ xung dung môi vào cốc nếu thấy silicagel khô, khó chảy, khi bổ sung phải khuấy đều liên tục Sau khi silicagel đã được đưa vào cột, phải đảm bảo cột luôn được ngâm trong dung môi vì nếu để khô hay nứt cột thì khả năng tách

sẽ kém nhiều

- Nhồi khô: Cân silicagel vào một cốc có dung tích thích hợp, đổ từ từ silicagel, sau khi đã đổ hết silicagel vào cột thì tiến hành dội dung môi vài lần qua cột để nén chặt silicagel, đảm bảo độ đồng đều, tránh hiện tượng vón cục hay tạo thành bọt khí

d) Đưa chất lên đầu cột

Tùy thuộc vào dạng chất ban đầu mà ta có thể có các cách tẩm silicagel khác nhau Nếu chất ban đầu ở dạng rắn hay keo thì ta phải hòa tan hoàn toàn trong một lượng dung môi vừa đủ Tiếp đó ta trộn silicagel vào (lượng silicagel dùng hấp phụ chất không quá 3 lần so với lượng chất), trộn đều để bay hơi hết dung môi Nếu dạng chất ban đầu là chất lỏng thì ta chỉ việc chộn silicagel vào để cho khô Chất sau khi được tẩm silicagel đưa lên cột, chú ý khi đưa chất tẩm silicagel lên cột nên để lượng dung môi trên cột sao cho tương đương với lượng silicagel dính chất Tức là lượng dung môi vừa đủ ngập lượng chất dính silicagel cho vào

thường nâng dần độ phân cực của dung môi cho phù hợp với từng phân đoạn hỗn hợp, bởi vì mỗi hỗn hợp khi đem chạy cột sẽ bị tách thành các phân đoạn khác nhau do silicagel có độ hấp phụ khác nhau đối với từng chất, những chất

di chuyển nhanh hơn là những chất bị hấp phụ kém hơn và ứng với những dung môi ít phân cực

Nếu chỉ dùng một dung môi trong suốt quá trình chạy sắc ký, khoảng cách giữa các phân đoạn đầu và cuối càng xa, tuy có thể tách sạch nhưng mất nhiều thời gian do phải chờ giữa hai giai đoạn, hơn nữa những phân đoạn cùng bị hấp phụ mạnh sẽ không di chuyển được hoặc di chuyển chậm Vì vậy với mỗi đoạn ta tăng dần độ phân cực của dung môi nghĩa là giảm dần độ hấp phụ của silicagel, các phân đoạn sẽ di chuyển liên tục vẫn đảm bảo phân tách tốt

2.2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc của chất phân lập được

Cấu trúc các chất phân lập ra được xác định bằng sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng chất mà người ta sử dụng các phương pháp khác nhau Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp càng cao Dưới đây là một số phương pháp chúng tôi dùng để xác định cấu trúc của chất phân lập được

2.2.4.1 Điểm nóng chảy (mp) [11]

Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng Thông thường việc phân tích đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm chảy

Điểm chảy là tiêu chuẩn kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất mà chỉ cần lượng mẫu thử rất ít Nếu điểm chảy của hai loại tinh thể thu được qua hai lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau không quá 0,50C thì có thể xem là sản phẩm kết tinh tinh khiết Khi điểm chảy xác định được, đối chiếu với tài liệu tham khảo có thể đưa ra kết luận sơ bộ về hợp chất đang nghiên cứu

a) Đo điểm chảy bằng ống mao quản

Phương pháp này dùng mẫu thử từ 1 – 2 mg Quan trọng ở đây là tạo ra môi trường nhiệt độ đồng đều tại vùng tiếp xúc với bầu thủy ngân của nhiệt

kế và chất thử trong ống nghiệm mao quản

b) Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp

Các dụng cụ này có ưu điểm là dùng rất ít chất thử (vài tinh thể) vì có

bộ phận phóng đại nên quan sát quá trình nóng chảy của tinh thể được rõ ràng Nhiệt độ được cung cấp qua một bộ phận điều nhiệt, nhờ thế nhiệt độ được điều chỉnh một cách chủ động và từ từ Khi các góc tinh thể bắt đầu biến dạng là lúc bắt đầu chảy và khi các tinh thể đã biến thành hạt dầu hình cầu hoặc hình trứng là quá trình chảy đã kết thúc

2.2.4.2 Phổ hồng ngoại – IR ( infrared spectroscopy) [10]

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Mỗi kiểu liên kết sẽ đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Chính vì vậy, dựa vào kết quả phổ hồng ngoại, người ta có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng Đặc biệt, vùng dưới 700cm-1 được gọi là vùng vân tay được

sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp Hiện nay thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mặc

dù vậy lượng chất cần để thực hiện phép đo phổ hồng ngoại lại cần từ 2 – 3

mg và khó thu hồi lại Chính vì vậy, thông thường với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác như phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối

2.2.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – NMRS (nuclear magnetic resonance spectroscopy) [10]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay được dùng để xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu

cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng Với việc sử dụng kết hợp các

kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và phổ cacbon)

là sự cộng hưởng của các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H, 13C) dưới tác dụng của từ trường Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học Ngoài ra đặc trưng của phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau

a) Phổ 1H-NMR

Trong phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hóa học (δ) của các proton được xác định trong thang từ 0 đến 14 ppm tùy thuộc vào mức độ lai hóa của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử Mỗi loại proton cộng hưởng ở một trường khác nhau vì vậy chúng được biểu diễn bằng một độ dịch chuyển khác nhau Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác spin giữa các hạt nhân từ với nhau mà người ta có thể xác định được cấu trúc hóa học của hợp chất

b) Phổ 13C-NMR

Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon, mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau Thang đo phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0 đến 240 ppm)

c) Phổ DEPT(distortinonless enhanccement by polarisation transfer)

Phổ này cho những tín hiệu phổ phân loại các loại cacbon khác nhau Trên các phổ DEPT, tín hiệu của cacbon bậc 4 biến mất Tín hiệu phổ của CH

và CH3 nằm về một phía và của CH2 thì nằm về phía đối diện trên phổ DEPT

1350 Còn trên phổ DEPT 900 thì chỉ xuất hiện tín hiệu phổ của các CH

c) Phổ 2D-NMR

Đây là các kỹ thuật phổ hai chiều, cho phép xác định các tương tác của các hạt nhân từ của phân tử trong không gian hai chiều Một số kỹ thuật thường được dùng chủ yếu như sau:

- Phổ HMQC (heteronuclear multiple quantum coherence): Các tương tác trực tiếp C-H được xác định nhờ vào các peak giao nhau trên trên phổ HNQC Trên phổ này, một trục là phổ 1H-NMR còn trục kia là 13C-NMR

- Phổ 1H-1H COSY (1H-1H chemical shift correlation spectroscopy): Phổ này biểu diễn các tương tác H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền

kề nhau Chính nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau

- Phổ HMBC (heteronuclear multiple bond connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của C và H trong phân tử Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định

2.2.4.4 Phổ khối lượng – MS (mass spectroscopy) [10]

Phổ khối lượng được dùng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Ngoài ion phân tử, phổ MS còn có các peak ion mảnh khác, dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại cấu trúc hóa học các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng Các phương pháp chủ yếu là:

a) Phổ EI-MS (electron impact ionization mass spectroscopy)

Dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá với năng lượng khác nhau, phổ biến là 70 eV

b) Phổ ESI-MS (electron spray ionization mass spectroscopy)

Còn được gọi là phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu

là peak ion phân tử và các peak đặc trưng cho sự phá vỡ cá liên kết có mức năng lượng thấp, dễ phá vỡ

c) Phổ FAB-MS (fast atom bombardment spectroscopy)

Là loại phổ bắn phá nguyên tử nhanh ở mức năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được peak ion phân tử

Ngoài ra còn có phương pháp phổ khối khác như Phổ khối lượng phân giải cao (HMR) cho phép xác định peak ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao Hay là phương pháp kết hợp sắc ký với phổ khối như Sắc ký khí khối phổ (GC-MS), Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để phân tích thành phần của hỗn hợp chất

2.2.4.5 Một số phương pháp phân tích khác [10]

Ngoài các phương pháp phổ nêu trên, hiện nay người ta còn sử dụng phổ X-Ray (nhiễu xạ Rơngen) để xác định cấu trúc không gian của toàn bộ phân tử Tuy nhiên phạm vi sử dụng của phổ này rất hạn chế, bởi vì yêu cầu tiên quyết là cần phải có tinh thể đủ lớn (≥ 0,5mm) Đây là điều kiện không phổ biến đối với các hợp chất hữu cơ vì các tinh thể không đủ lớn

Ngoài việc sử dụng các loại phổ, người ta còn phải sử dụng kết hợp với các chuyển hóa hóa học cũng như các phương pháp phân tích so sánh kết hợp Đặc biệt đối với các phân tử nhiều mạch nhánh dài, tín hiệu phổ NMR bị chồng lấp nhiều, khó xác định được chính xác được chiều dài các mạch, cũng như đối với các phân tử có các đơn vị đường thì việc xác định chính xác loại