Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng trong y sinh1

Lời cam đoan Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng tro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ MỸ THỦY

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG TRONG Y SINH

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài

“Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng trong y sinh” là công trình nghiên cứu độc lập của

mình , các kết quả phân tích đ−ợc thực hiện là chính xác không sử dụng của các tác giả khác

Trong luận văn tôi có tham khảo kết quả nghiên cứu của một số tác giả đ−ợc chỉ rõ trong danh mục tài liệu tham khảo Mọi số liệu, tài liệu sử dụng trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng

Hà Nội, ngày 26 tháng 03 năm 2012

Tác giả

Nguyễn Thị Mỹ Thủy

MỤC LỤC MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

I.1 CẢM BIẾN SINH HỌC 3

I.1.1 Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học 3

I.1.2 Cấu tạo chung của cảm biến 4

I.1.3 Cảm biến theo nguyên lý điện hóa 7

I.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học 8

I.1.5 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học 9

I.2 ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL 10

I.2.1 Enzyme 10

I.2.2 Cholesterol oxidase 17

I.2.3 Phản ứng với xúc tác ChOx 17

I.3 POLYME DẪN VÀ POLYANILIN 18

I.3.1 Polyme dẫn 18

I.3.2 Polyanilin 22

I.4 HẠT NANO OXIT SẮT TỪ TÍNH 29

I.4.1 Giới thiệu chung 29

I.4.2 Tính chất của hạt nano 30

I.4.3 Phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ 32

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU 37 II.1 PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 37

II.1.1 Điện cực làm việc 37

II.1.2 Chế tạo hạt nano Fe 3 O 4 được bọc bằng copolyme poly 38

II.1.3 Trùng hợp điện hóa màng PANi và PANi- 40

II.1.4 Cố định enzyme Cholesterol 41

II.1.5 Các phân tích điện hóa 43

II.1.6 Phân tích cholesterol bằng phương pháp CHOD-PAP 44

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45

II.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 45

II.2.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét 46

II.2.3 Các phương pháp nghiên cứu điện hóa 48

II.2.4 Phương pháp trắc quang 50

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52

III.1 TỔNG HỢP ĐIỆN HÓA MÀNG NANOCOMPOSITE PANi/Fe3O4 52

III.2 HÀNH VI ĐIỆN HÓA CỦA ĐIỆN CỰC PANi VÀ PANi-Fe3O4 54

III.3 PHÂN TÍCH HÌNH THÁI HỌC QUA ẢNH FE-SEM 1

III.3.1 Ảnh FE-SEM màng PANi và PANi-Fe 3 O 4 55

III.3.2 Ảnh FE-SEM màng PANi và PANi-Fe 3 O 4 cố định ChOx 55

III.4 PHỔ HỒNG NGOẠI PANi và PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 57

III.5 CÁC PHÉP ĐÁNH GIÁ ĐIỆN HÓA ĐỐI VỚI CẢM BIẾN ChOx 58

III.5.1 Phương pháp Von-Ampe vòng (CV) 58

III.5.2 Phương pháp quét thế tuyến tính (LSV) 59

III.5 3 So sánh đáp ứng dòng của các cảm biến PANi-ChOx, PANi-Fe 3 O 4 /ChOx và PANi-Fe 3 O 4 /Fe 3 O 4 -ChOx 60

III.6 KHOẢNG TUYẾN TÍNH,GIỚI HẠN PHÁT HIỆN,GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG 62

III.6.1 Khoảng tuyến tính 62

III.6.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 66

III.7 ĐÁNH GIÁ CẢM BIẾN ChOx 66

III.7.1 Kiểm tra độ đặc hiệu của cảm biến ChOx 66

III.7.2 Độ nhạy của cảm biến 67

III.7.3 Phân tích mẫu giả lập 68

KẾT LUẬN 70

ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

p(St-co-AA) Copolyme polystyren và polyacrylic axit

EIS Phổ tổng trở điện hóa

EM Emeraldine

FT-IR Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

IDE Điện cực có cấu trúc răng lược

IUPAC Hiệp hội quốc tế về hoá học lý thuyết và hóa ứng dụng

SCE Điện cực calomen bão hòa

SEM Kính hiển vi điện tử quét

WE Điện cực làm việc

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng III 1 Chênh lệch cường độ dòng khi thêm cholesterol vào hệ điện hóa 64 Bảng III 2 Kết quả đo chênh lệch cường độ dòng của mẫu trắng 66 Bảng III 3 Độ nhạy của cảm biến 68 Bảng III 4 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi cholesterol trên mẫu giả lập theo hai

phương pháp 69

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình I 1 Mô hình cảm biến Glucose thế hệ đầu tiên [11] 3

Hình I 2 Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội 4

Hình I 3 Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học 5

Hình I 4 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học 6

Hình I 5 Một hệ cảm biến điện hóa 7

Hình I 6 (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland 12

Hình I 7 Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng 14

Hình I 8 Cholesterol Oxidase (ChOx) 17

Hình I 9 Vinylferrocene 19

Hình I 10 Một số polyme dẫn điện tử 20

Hình I 11 Polyme trao đổi ion (poly 4-Vilynpyridine với Fe(CN)63-) 20

Hình I 12 Công thức tổng quát của PANi 23

Hình I 13 Quá trình chuyển đổi cấu trúc điện tử PANi trong môi trường oxy hóa-khử 24

Hình I 14: Đường CV của PANi trong dung dịch HCl 1M và sự thay đổi màu của PANi ở các giai đoạn oxy hoá khác nhau ở tốc độ quét thế 50 mV/s [2]25 Hình I 15 Dạng bipolaron của PANi 26

Hình I 16 Cấu trúc hạt nano Fe3O4 [38] 30

Hình I 17 Cơ chế hình thành và phát triển hạt nano trong dung dịch 32

Hình I 18 Công thức phân tử của glutaraldehyde 35

Hình I 19 Phương pháp liên kết chéo (cross-linking) 35

Hình II 1 Sơ đồ chế tạo vi điện cực tích hợp 38

Hình II 2 Vi điện cực tích hợp 38

Hình II 3 Hệ điện hóa đa năng Autolab/PGSTAT12 41

Hình II 4 Hệ ủ hơi GA cố định enzyme 42

Hình II 5 Sơ đồ nguyên lý của máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 46

Hình II 6 Sơ đồ các bộ phận của kính hiển vi điện tử quét 48

Hình II 7 Phương pháp quét thế tuyến tính đa chu kỳ 49

Hình II 8 Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong phương pháp CV 49

Hình II 9 Sơ đồ nguyên lý máy trắc quang 51

Hình II 10 Đường chuẩn và cách xác định nồng độ (Cx) theo phương pháp đường chuẩn từ Ax đo được 51

Hình III 1 Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng (a) PANi và (b) PANi-Fe3O4 trên vi điện cực Pt 52

Hình III 2 So sánh cường độ dòng phổ CV (chu kỳ thứ 20) của quá trình trùng hợp màng PANi và PANi-Fe3O4 53

Hình III 3 Ảnh hệ điện cực trước và sau khi trùng hợp 54

Hình III 4 Phổ CV của điện cực Pt/PANi và Pt/PANi-Fe3O4 trong đệm PBS (KCl 0,9%) 54

Hình III 5 Ảnh FE-SEM màng (A) PANi và (B) PANi-Fe3O4 trùng hợp theo phương pháp CV trên vi điện cực Pt 55

Hình III 6 ảnh FE-SEM của (A) hạt nano Fe3O4, điện cực (B) Pt/PANi/ChOx, (C) Pt/PANi-Fe3O4/ChOx và (D) Pt/PANi-Fe3O4/ Fe3O4-ChOx 56

Hình III 7 Phổ FT-IR của (đường a) PANi và (đường b) PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 57

Hình III 8 Phổ CV của Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx với các tốc độ quét thay đổi từ 10 tới 100mV/s với bước 10mV (đường a tới j) 58

Hình III 9 Phổ CV điện cực Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx trong PBS khi không có cholesterol và khi có 0,5mM cholesterol 59

Hình III 10 Đường LSV của điện cực Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx trong đệm PBS (đường a) 0,0mM cholesterol, (đường b) khi thêm 0,15mM cholesterol và (đường c) khi thêm 0,3mM cholesterol 60

Hình III 11 So sánh khả năng đáp ứng dòng của cảm biến ChOx, PANi-Fe3O4/ChOx và PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 61

Hình III 12 Cơ chế phản ứng oxy hóa cholesterol trên điện cực PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 62

Hình III 13 Đặc tuyến đáp ứng dòng của cảm biến ChOx 63

Hình III 14 Đường chuẩn của cảm biến ChOx 65

Hình III 15 Độ đặc hiệu của cảm biến ChOx 67

Để chẩn đoán chính xác tình trạng bệnh, các bác sĩ chuyên khoa trong bệnh viện cần

có sự kết hợp của các khoa cận lâm sàng, đó là các xét nghiệm, chụp chiếu x-quang v.v Hiện nay các xét nghiệm sinh hóa và huyết học đã tiến bộ rất nhiều nhờ sự phát triển của các ngành khoa học kỹ thuật Đối với một số bệnh thường gặp hiện nay như: đái tháo đường, tăng huyết áp, rối loạn mỡ máu thì kết quả xét nghiệm cần được kiểm tra thường xuyên để có hướng điều trị kịp thời Tuy nhiên các phương pháp phân tích được sử dụng ở các bệnh viện, các trung tâm nghiên cứu thường đòi hỏi đầu tư máy móc của các hãng nước ngoài rất đắt tiền, thời gian phân tích lâu, người sử dụng phải có chuyên môn, người bệnh phải chịu chi phí cao, mất nhiều thời gian chờ đợi

Cảm biến sinh học đo tín hiệu điện hóa (electrochemical biosensor) đáp ứng được các yêu cầu của hóa học phân tích hiện đại đó là có khả năng phân tích nhanh theo thời gian thực (real-time), có độ nhạy, độ chọn lọc và độ chính xác cao; thiết bị phân tích nhỏ gọn, sử dụng đơn giản, có giá thành phù hợp Với sự phát triển của công nghệ vi điện tử, công nghệ nano và các loại vật liệu mới, khả năng chế tạo và ứng dụng cảm biến sinh học ngày một hiện thực hơn, phương pháp không đòi hỏi nhiều hóa chất, dung môi; chỉ cần lượng mẫu phân tích nhỏ đây là tiền đề của hóa học phân tích xanh là chủ đề của hóa học hiện đại đang hướng tới Do vậy việc dùng cảm biến sinh học xác định nồng độ các chất như ure, glucose, cholesterol,

amylase được coi là một phương pháp bổ sung cho các phương pháp phân tích tiêu chuẩn hiện có tại các bệnh viện

Do tính hữu ích và khả năng ứng dụng cao, luận văn “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng trong y sinh”, hướng tới chế tạo cảm biến sinh học với điều kiện công nghệ hiện có

ở trong nước, khảo sát các kết quả của cảm biến đã chế tạo, so sánh với các kết quả

đã được kiểm tra đối chứng tại khoa hóa sinh Bệnh viện Bạch mai Qua đó ứng dụng để xác định nhanh chỉ số cholesterol trong các chế phẩm sinh học

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

I.1 CẢM BIẾN SINH HỌC (BIOSENSORS)

I.1.1 Sơ lược quá trình phát triển của cảm biến sinh học

Năm 1962, các nhà khoa học là Clark và Lyons đã có công bố lần đầu tiên về cảm biến sinh học (cảm biến enzyme glucose) [1]; trong hơn 50 năm qua cảm biến sinh học đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm hoàn thiện công nghệ chế tạo, nâng cao hiệu quả phân tích, hạ giá thành sản phẩm và đưa ra thương phẩm phục vụ đời sống con người Ở Việt Nam, khái niệm “cảm biến sinh học” và polyme dẫn điện lần đầu tiên được nghiên cứu tại trường Đại học Bách Khoa Hà Nội bởi tác giả Doãn Thái Hòa vào năm 1993 [2] Từ

đó tới nay, một số nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã đi sâu nghiên cứu và thu được các kết quả tương đối khả quan như cảm biến xác định glucose [3, 4], cảm biến phát hiện sự biến đổi gen ở đậu tương [4, 5], cảm biến phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu, cảm biến phát hiện virut Herpes, virus cúm A, HIV [6-9] , cảm biến miễn dịch phát hiện ung thư cổ tử cung [10]

Hình I 1 Mô hình cảm biến Glucose thế hệ đầu tiên [11]

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì: “Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi” [12]

Nhờ có sự phát triển về khoa học và công nghệ cũng như sự đầu tư trọng điểm của nhà nước, phòng thí nghiệm công nghệ vi cơ điện tử tại trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Khoa học Vật liệu – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã có thể chế tạo đựa các vi linh kiện ở kích thước micromet với độ ổn định và chính xác cao Đây chính là cơ sở để tác giả có được các vi linh kiện là các vi điện cực tích hợp trên nền silic ứng dụng cho chế tạo cảm biến sinh học đo theo nguyên

lý điện hóa

Hình I 2 Phòng sạch tại Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội

I.1.2 Cấu tạo chung của cảm biến

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học bao gồm bốn bộ phận chính:

- Đầu thu sinh học

- Tác nhân cố định

- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu

- Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu ra

Mục đích là để dò tìm, phân tích các tác nhân cần phát hiện một cách chọn lọc

Hình I 3 Sơ đồ cấu tạo chung của cảm biến sinh học

- Tác nhân cần phát hiện : được phân loại theo cấu tạo như sau

+ Các vi khuẩn như vi khuẩn E-coli, vi khuẩn Candida

+ Các phân tử nhỏ như glucose, ure, thuốc trừ sâu,…

+ Các phân tử sinh học có kích thước lớn như phân tử ADN, RNA, protein

- Đầu thu sinh học (Biological Receptor) có tác dụng bắt cặp và phát hiện

sự có mặt của các tác nhân sinh học cần phân tích Đầu thu sinh học phản ứng trực tiếp với các tác nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học

+ Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng phổ biến nhất: đầu thu làm từ các enzyme urease, glucose oxidase,

+ Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên

+ Ngoài ra đầu thu sinh học làm từ các protein , các axit nucleic như ADN, ARN

Protein Kháng thể ADN

Hình I 4 Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học

- Tác nhân cố định: đây là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học

Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế, đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học (có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ Những tác nhân này vừa phải đảm bảo độ bền cơ học, vừa phải đảm bảo khả năng chuyền tải tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phận chuyển đổi Vì vậy việc nghiên cứu lựa chọn những tác nhân cố định thích hợp giúp nâng cao độ nhạy, độ ổn định cho cảm biến sinh học là cần thiết Việc phát minh polyme dẫn điện vào năm 1977 đã nhanh chóng trở thành tâm điểm chú ý của các nhà khoa học đặc biệt trong lĩnh vực chế tạo cảm biến [13, 14] Những nghiên cứu gần đây cho thấy pha tạp (doping) các vật liệu vô cơ có kích thước nano vào màng polyme dẫn không những làm tăng độ dẫn điện của màng mà còn tăng độ bền hơn nhiều lần so với polyme tinh khiết [15] Một số loại polyme dẫn điện đang được ứng dụng phổ biến hiện nay đó là polyanilin, polypyrrol, polythiophen

- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu giúp chuyển các biến đổi sinh học thành các tín hiệu có thể đo đạc được Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ Trong đó, chuyển đổi theo nguyên lý điện hoá có nhiều ưu điểm như chế

tạo đơn giản, có độ nhạy và độ chính xác cao phù hợp trong chế tạo cảm biến sinh học ứng dụng phân tích nhanh Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế (potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric)

- Bộ phận xử lý và đọc tín hiệu: bộ phận này có tác dụng chuyển, khuếch đại thành các tín hiệu điện để máy tính và các thiết bị hiển thị khác đưa ra kết quả cho người cần phân tích

I.1.3 Cảm biến theo nguyên lý điện hóa

Cảm biến sinh học dựa trên bộ chuyển đổi điện hóa có tính ứng dụng cao đo nguyên lý đơn giản, độ ổn định và độ nhạy cao Nhờ những phản ứng hóa học hay sinh học đều có thể gây ra các tương tác sinh điện tử một cách trực tiếp (như lai hóa của ADN, oxy hóa khử của enzyme…) nên rất thích hợp để phát hiện nhanh trong phân tích cận lâm sàng

Hình I 5 Một hệ cảm biến điện hóa

Quá trình nhận biết tín hiệu có thể thực hiện bằng các phép đo dòng, đo thế

và độ dẫn [11, 16, 17]

Phép đo dòng: Dựa trên sự thay đổi dòng điện gây ra do sự oxy hóa - khử

điện hóa của chất cần phát hiện Phương pháp này được thực hiện bằng cách áp một điện thế giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực so sánh (RE), tín hiệu dòng sẽ được đo giữa điện cực làm việc (WE) và điện cực phụ trợ (CE) Khi điện thế đạt đến một giá trị nào đó (thường là điện thế oxi hoá), thì hiện tượng oxi hoá xuất hiện

và các electron được sinh ra Dòng điện thu được liên quan trực tiếp đến nồng độ chất cần phân tích [16, 18]

Phép đo thế: Liên quan đến việc xác định sự chênh lệch thế giữa một điện

cực chỉ thị và một điện cực chuẩn hoặc hai điện cực chuẩn so sánh cách nhau bởi một lớp màng mỏng nào đó không có dòng đi qua Bộ chuyển đổi này có thể là điện cực chọn lọc ion (ISE) Hầu như các thiết bị đo thế phổ biến nhất hiện nay là các điện cực pH; hay các ion như F-, I-, CN-, Na+, K+, Ca2+, NH4+ [16]

Đo độ dẫn: Độ dẫn điện là đại lượng đặc trưng cho khả năng dẫn điện của

vật liệu Phản ứng giữa đầu dò và các phần tử đích làm thay đổi thành phần của chất dẫn điện khiến độ dẫn điện của chất đó thay đổi Các phản ứng enzyme như urê và nhiều thụ thể màng sinh học có thể được kiểm soát bởi các thiết bị đo trở kháng hay

độ dẫn ion sử dụng các vi điện cực xen kẽ nhau [16]

I.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học

Một số tiêu chí đánh giá, cũng như các yêu cầu đối với cảm biến sinh học:

- Khoảng tuyến tính (Linearity): giá trị hàm lượng lớn nhất của chất phân

tích mà tín hiệu phân tích còn tuân theo phương trình tuyến tính bậc nhất

- Độ nhạy (Sensitivity): là tính đáp ứng của cảm biến khi thay đổi nồng độ

chất phân tích hay khả năng phát hiện sự thay đổi tín hiệu khi có sự thay đổi nhỏ nhất về nồng độ chất phân tích

- Độ chọn lọc (Selectivity): chỉ mức độ ảnh hưởng của các chất nền tới phép

xác định chất phân tích

- Thời gian đáp ứng (Response time): là khoảng thời gian cần thiết để dòng

của hệ đo đạt được 90% giá trị dòng cân bằng, khi có sự tiếp xúc của điện cực nghiên cứu với dung dịch đo hoặc khi có sự thay đổi nồng độ chất trong dung dịch tiếp xúc với điện cực Đây là một trong những tiêu chuẩn của cảm biến mà các nghiên cứu đang tập trung cải tiến

Bên cạnh đó là các tiêu chuẩn khác khi thực hiện các phép phân tích định lượng như độ lặp lại (repeatability), độ nhiễu, độ chụm (precision), độ phân giải, độ chính xác (accuracy)

I.1.5 Một số ứng dụng của cảm biến sinh học

Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác Chính vì vậy nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống

- Thực phẩm và kiểm soát môi trường

Ngày nay vấn đề môi trường và vầ sinh an toàn thực phẩm là mối quan tâm của toàn xã hội Các hệ cảm biến được phát triển và ứng dụng đó là phân tích nhanh

dư lượng các loại thuốc trừ sâu, dư lượng các chất kháng sinh, các nâm mốc độc hại tồn tại trong lưới thức ăn như sabutamon, aflatoxin [19]

-An ninh Quốc phòng :

Một số báo cáo gần đây cho thấy đã chế tạo thành công mũi điện tử phát hiện thuốc nổ TNT [20], phát hiện các vụ tấn công hóa sinh và các chất phóng xạ với độ nhạy cao.

- Y học, sinh học:

Cảm biến sinh học ứng dụng phát hiện các protein ung thư và các siêu vi trùng tiềm ẩn Nhiều loại cảm biến như cảm biến đo nồng độ oxi, lượng glucose trong máu, cảm biến huyết áp, … những cảm biến giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi

tình hình bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế Ngày nay, các cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà còn được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng

Nếu như cảm biến glucose đã được thương mại hóa trên thị trường, bất cứ người nào đều có thể mua và sử dụng dễ dàng với giá thành ngày một hạ thì cảm biến xác định nhanh cholesterol toàn phần vẫn còn khá mới mẻ [21] Chính vì thế trong nội dung luận văn này đã lựa chọn cholesterol là đối tượng nghiên cứu

I.2 ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL

I.2.1 Enzyme [22]

Sự sống là mộtquá trình trao đổi chất liên tục Quá trình trao đổi chất bao gồm hang loạt các phản ứng hóa học diễn ra liên tục và liên quan chặt chẽ với nhau Trong quá trình hóa học ấy đều có vai trò xúc tác của các chất mà người ta gọi là enzyme (E) Do vậy enzyme là chất xúc tác sinh học, bản chất là protein,được tạo ra bởi cơ thể sống Nhờ có enzyme mà các quá trình hóa học trong và ngoài cơ thể xảy

ra rất nhạy với tốc độ nhanh trong điều kiện sinh lý bình thường

I.2.1.1 Cấu trúc phân tử của Enzyme

Bản chất enzyme là những protein đặc hiệu có cấu tạo phân tử rất phức tạp,

do vậy nó có tất cả các thuộc tính hóa học của protein Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn, có tính đặc hiệu rất cao Để đảm bảo cho chức năng của enzyme

là chất xúc tác sinh học, cấu trúc của enzyme phải rất tinh vi và phức tạp Enzyme

là những loại phân tử lớn, phần nhiều những enzyme đã được nghiên cứu có trọng lượng phân tử từ 10.000 đến 1.000.000 dalton

những chất hữu cơ đặc biệt, có nhiệm vụ cộng tác với enzyme trong quá trình xúc tác, phần chất hữu cơ này gọi là coenzyme (CoE)

Tính chất cơ bản của enzyme do apoenzym quyết định Đa số các enzyme có chứa kim loại Kim loại có thể là thành phần cấu tạo phân tử enzyme hoặc phức hợp enzyme - cơ chất, có thể là chất cộng tác trong hoạt động xúc tác của enzyme, hoặc cũng có thể vừa là thành phần cấu tạo, vừa là chất cộng tác của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme

- Tất cả các enzyme đều hoạt động xúc tác thông qua những bộ phận đặc hiệu của phân tử enzyme, được gọi là trung tâm hoạt động (TTHĐ)

- Trung tâm hoạt động bao gồm những nhóm chức hóa học của mạch bên (gốc R) của các axit amin (a.a) trong phân tử, phân tử H2O liên kết, các nhóm chức của CoE Các nhóm chức của a.a thường gặp trong TTHĐ là nhóm SH của Cys; nhóm – OH của Tyr; nhóm carboxyl của Glu, Asp; nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε-amin của Lys, vòng imidazol của His…Các nhóm chức trong TTHĐ của E có thể

có vai trò khác nhau :kết hợp hoặc xúc tác , các gốc khác thì có vai trò đối với tính đặc hiệu của E

- TTHĐ có cấu hình không gian xác dịnh được giữ vững nhờ mạng lưới liên kết hydrogen mạng lưới này đủ linh động để có thể thay đổi cấu hình không gian của TTHĐ dưới tác dụng của các yếu tố bên ngoài,khi tương tác với cơ chất hoặc các chất khác

- Sự tương ứng về cấu hình không gian giữa TTHĐ và cơ chất được hình thành trong quá trình E tiếp xúc với cơ chất (S)

E Fisher đề ra giả thuyết giữa E và S , theo đó sự tương ứng về cấu trúc của TTHĐ của E và S sắn có và cố định trong quá trình E kết hợp với S, thuyết này đã được thừa nhận trong nhiều năm vì giải thích được tính đặc hiệu của E , nhưng không phù hợp với đặc tính cấu trúc không gianmềm dẻo của phân tử protein Năm

1958, Koshland đã đưa ra giả thuyết “ khớp phản ứng”,theo đó quá trình E kết hợp S sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian ,tạo nên sự tương ứng về cấu trúc giữa E và S

Hình I 6 (a) Mô hình Fisher (b) Mô hình Koshland

- Tương tác giữa E và S là các tương tác yếu ,dễ dàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng E và sản phẩm tương ứng

I.2.1.2 Đặc điểm sự xúc tác của enzyme

Chất xúc tác là chất làm tăng cường phản ứng hóa học, nhưng không bị biến đổi tiêu hao và tham gia vào thành phần sản phẩm của phản ứng.Chỉ cần một lượng nhỏ xúc tác cũng đủ biến đổi một lượng lớn chất tham gia phản ứng Chất xúc tác làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng hóa học bằng cách tạo nhiều phản ứng trung gian mà các các phản ứng này chỉ đòi hỏi năng lượng hoạt hóa ít hơn nhiều so với khi không có chất xúc tác tham gia Chất xúc tác không làm thay đổi chiều phản ứng

Enzyme có đầy đủ các tính chất cơ bản của chất xúc tác, ngoài ra nó còn có đặc điểm riêng là tính chất đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lớn Enzyme làm giảm năng lượng hoạt hóa nhiều hơn so với các chất xúc tác hóa học Hoạt tính của enzyme chịu ảnh hưởng của rất nhiều yếu tố lý, hóa và sinh học như nhiệt độ, ánh sáng, tia cực tím, sóng siêu âm, pH của môi trường,bản chất hóa học và nồng độ của cơ chất, nồng

độ của enzyme, thời gian tác dụng của enzyme, tác dụng của chất ức chế, tác dụng của chất hoạt hóa, sản phẩm của phản ứng enzyme và các chất chuyển hóa khác

Những đặc tính ưu việt của E với các chất xúc tác khác

- Có hiệu quả xúc tác cao, có thể làm tăng vận tốc phản ứng lên 105 - 1012 lần

so với khi không có chất xúc tác

- Có thể hoạt động ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường (nhiệt độ

20-40oC, pH từ 5-8)

- Có tính đặc hiệu cao: chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và xúc tác cho những phản ứng nhất định do vậy ít có sản phẩm phụ tạo ra đồng thời hiệu suất thu được sản phẩm chính cao

- Nhiều E không bị mất hoạt tính trong dung môi hữu cơ

- Sử dụng E đem lại hiệu quả kinh tế lớn không gây ảnh hưởng xấu dến môi trường

Điều chỉnh các yếu tố vật lý, hóa học thích hợp cho hoạt động của E sẵn có

để chuyển hóa cơ chất sẵn có trong nguyên liệu khi không tách E khỏi nguyên liệu.Tách E khỏi nguyên liệu, sản xuất các chế phẩm E có độ sạch khác nhau để sử dụng trên nhiều đối tượng khác nhau và nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu cấu trúc phân tử;phân tích các chất, xác định chính xác hàm lượng các chất; ứng dụng trong các ngành công nghiệp;ứng dụng trong y, dược

I.2.1.3 Cơ chế xúc tác của E

Các phản ứng do E xúc tác có thể được khái quát bằng phương trình phản ứng chung dưới đây:

E + S Ù ES Ù ES* Ù E + P Trong đó E là enzyme; S là cơ chất (substrate); ES là phức chất hình thành giữa E và cơ chất; ES* là phức chất giữa E với cơ chất, trong đó cơ chất đã được biến đổi thành dạng gần như sản phẩm của phản ứng; P là sản phẩm (product) của phản ứng

Bước 1: cơ chất gắn vào trung tâm hoạt động của E tạo thành phức hợp

enzyme – cơ chất (ES)

E + S Ù ES

Bước 2: dưới tác dụng nhóm hoạt động của E ,cấu tạo điện tử của cơ chất bị

biến đổi, những liên kết chịu tác dụng của enzyme bị căng ra, độ bền vững của liên kết giảm đi,hoạt tính hóa học của cơ chất tăng lên rất nhiều, do đó chỉ cần năng lượng hoạt hóa rất nhỏ cũng làm phản ứng xảy ra rất nhanh

ES Ù ES*

Bước 3: cơ chất được biến đổi thành sản phẩm (P) và enzyme được giải

phóng ra dưới dạng tự do

Hình I 7 Xúc tác Enzyme làm giảm năng lượng của phản ứng

I.2.1.4 Tính đặc hiệu của enzyme

Mỗi E đều có tác dụng chọn lọc đối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất định đối với một loại phản ứng nhất định.Tính chất xúc tác chọn lọc này được gọi là tính đặc hiệu của E Đây là một trong những đặc tính cơ bản quan trọng nhất của E, do cấu trúc lý hóa đặc biệt của phân tử E và đặc biệt là trung tâm hoạt động

mà E có tính đặc hiệu rất cao so với những chất xúc tác thông thường khác

Tính chất đặc hiệu gắn liền với cơ chất : mỗi E chỉ xúc tác cho sự chuyển

hóa một chất nhất định(hoặc một cặp cơ chất nhất định trong phản ứng hai cơ chất) theo một phản ứng xác định tạo thành các sản phẩm xác định.Ví dụ: Urease chỉ xúc tác quá trình thủy phân ure.Các E có tính đặc hiệu tuyệt đối được sử dụng để định lượng chính xác cơ chất của chúng.Trên thực tế ,nhiều E không có tính đặc hiệu tuyệt đối,tính đặc hiệu của chúng chỉ là tương đối Chúng có tác dụng với cả một nhóm cơ chất có cấu trúc gần giống nhau hoặc có một bộ phận phân tử giống nhau.Ví dụ: một số esterase xúc tác cho phản ứng có thể tác dụng vào liên kết ester của nhiều axit béo với những alcol khác nhau

Tính chất đặc hiệu gắn liền với phản ứng: phần lớn mỗi E đều có tính đặc

hiệu với mỗi loại phản ứng nhất định.Những chất có khả năng xảy ra nhiều loại phản ứng hóa học thì mỗi loại phản ứng phải có một E đặc hiệu xúc tác Ví dụ: a.a

có khả năng xảy ra phản ứng khử cacboxyl, phản ứng oxy hóa khử amin và phản ứng trao đổi nhóm amin, vì vậy mỗi loại phản ứng trên cần có một E đặc hiệu tương ứng xúc tác là decacboxylase,axit amin oxydase,aminotransferase Ngược lại, có những E có khả năng xúc tác nhiều loại phản ứng Nhiều enzyme protease như trypsin, chymotrypsin ngoài xúc tác đặc hiệu phản ứng thủy phân liên kết peptid,

còn xúc tác phản ứng liên kết este

I.2.1.5 Đơn vị đo hoạt độ chế phẩm Enzyme

Hoạt độ của enzym là đơn vị dùng để đo khả năng xúc tác của enzym Đơn

vị hoạt độ là lượng cơ chất mà emzym xúc tác chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian và các điều kiện như nhiệt độ, pH, xác định

Hoạt độ riêng (specific activity): Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng

số đơn vị hoạt độ enzyme trên một đơn vị khối lượng (miligam hay gam) protein

Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính Một đơn

vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp

Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hóa sinh Quốc

tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của

enzyme (1U) là lượng enzyme xúc tác sự biến đổi 1 µmol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện nhất định

1 U = = 1 µmol cơ chất (10-6mol)/phút

Đơn vị Katal(kat): Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo

nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme Một Katal là lượng enzyme xúc tác sự biến đổi 1 mol cơ chất trong 1 giây và trong những điều kiện nhất định

1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây 1µKat/l = 60 U/l

U/l = 16,67 nKat/l (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI)

I.2.1.6 Enzyme không tan và điện cực enzyme

E không tan là các E bị giữ hoặc được cố định trong một vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường,vẫn giữ được hoạt động xúc tác,có thể sử dụng liên tục và lặp lại nhiều lần Do đặc tính không bị hòa tan mà vẫn giữ được hoạt độ xúc tác ,nên ưu điểm của E không tan là : có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng E xác định,do đó làm giảm đáng kể giá thành chế phẩm E Ngoài ra nó còn có độ bền với các yếu tố hóa lý hơn khi ở dạng hòa tan Một số E xúc tác cho quá trình oxi hóa khử cũng là dạng E không tan

Biosensor điện cực enzyme, cũng gọi là điện cực E không tan có thành phần cấu tạo sinh học của điện cực này là E, được cố định trên bề mặt của điện cực, đáp ứng với nồng độ của một trong các cơ chất, hoặc các sản phẩm của phản ứng do E xúc tác.Điện cực E được sử dụng để xác định nồng độ nhiều chất khác nhau như: glucose, ure, một số axit hữu cơ, amino axit, alcol….Những thành tựu trong nghiên cứu E không tan,chế tạo các E-biosensor đã làm tăng hiệu quả và mở rộng phạm vi ứng dụng của E trong thực tế ở qui mô ngày càng lớn

I.2.2 Cholesterol oxidase [23-25]

Cholesterol oxidase còn có các tên gọi khác như Cholesterol-O2 oxidoreductase; beta-hydroxy steroid oxidoreductase; beta-hydroxysteroid: oxygen oxidoreductase

Hình I 8 Cholesterol Oxidase (ChOx)

Cholesterol oxidase thuộc nhóm 1 (Oxydoreductase) (EC 1.1.3.6) có tác dụng xúc tác cho phản ứng oxy hóa-khử Cholesterol oxidase thường được thu từ Streptomyces, Pseudomonas, Brevibacterium

Enzyme này có tính đặc hiệu cao đối với cholesterol trong khoảng pH thích hợp từ 4,0 đến 7,0 (tính đặc hiệu cao nhất tại pH=7,0)

Đặc tính: enzyme là chất đặc hiệu để phát hiện và định lượng cholesterol

I.2.3 Phản ứng với xúc tác ChOx

Phản ứng oxy hóa cholesterol dưới tác dụng của ChOx tạo ra H2O2:

ChOx

Cholesterol + O ⎯⎯⎯→ cholest-4-en-3-one + H O

o O

I.3 POLYME DẪN VÀ POLYANILIN

I.3.1 Polyme dẫn [15]

I.3.1.1 Giới thiệu sơ lược về polyme dẫn

Từ những năm 70 khi phát hiện ra tính dẫn điện của polyaxetylen, sau đó

là một số polyme khác như polypyrrole, polyanilin polyme dẫn đã là đối tượng nghiên cứu chuyên sâu của các nhà khoa học Ghi nhận những người đã có công khám phá và phát triển polyme dẫn, Viện Hàn lâm Quốc gia Thụy Điển đã trao giải Nobel Hóa học (năm 2000) cho các giáo sư A.G MacDiarmid, A.J Heeger

và H Shirakawa [26-30] đã có những bước đột phá trong quá trình tổng hợp, nghiên cứu các đặc tính điện hoá, hóa học và vật lý của vật liệu này và trong những năm qua số lượng các nghiên cứu về polyme dẫn điện đã gia tăng nhanh chóng và đây vẫn đang là tâm điểm thu hút sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới

Khả năng dẫn điện của các polyme là do trong chuỗi polyme có hệ liên kết π liên hợp nằm dọc theo toàn bộ chuỗi polyme nó tạo ra đám mây điện tử π linh động nên điện tử có thể chuyển động từ đầu chuỗi đến cuối chuỗi polyme dễ dàng Nhưng các polyme đơn thuần có độ dẫn điện không lớn và để tạo ra vật liệu có độ

dẫn điện cao (hight-conductive polymer) từ các polyme người ta cài các tạp (dopant)

vào màng để tạo ra vật liệu có độ dẫn điện cao hơn

Một phương pháp để làm tăng độ dẫn điện của các polyme dẫn điện mà hiện nay đang được nghiên cứu, ứng dụng là phương pháp cài các phân tử có kích thước nanomet của kim loại hay oxít của kim loại vào màng polyme dẫn để tạo ra vật liệu mới có độ dẫn điện vượt trội Các hạt nano được cài vào trong màng polyme thường

là kim loại chuyển tiếp hoặc oxít của kim loại chuyển tiếp, khi đó nó có chức năng như những cầu nối để dẫn điện tử từ chuỗi polyme này sang chuỗi polyme khác

I.3.1.2 Phân loại một số polyme dẫn điện

Polyme oxy hoá khử (Redox polyme): Polyme oxy hoá khử là loại polyme

dẫn điện có chứa các nhóm có hoạt tính oxy hóa - khử liên kết với mạch polyme không hoạt động điện hoá

Hình I 9 Vinylferrocene

Điện tử dịch chuyển từ tâm oxy hoá khử này sang tâm oxy hoá khử khác theo cơ chế chuyển electron theo bước nhảy (electron hoping)

Polyme dẫn điện tử (electronically conducting polyme): Polyme dẫn điện tử

tồn tại mạch các bon có các nối đôi liên hợp( các polyme mạch thẳng, polyme vòng thơm và polyme dị vòng), nằm dọc theo chuỗi polyme và quá trình dẫn điện

ở đây là điện tử có thể chuyển động dọc theo chuỗi polyme nhờ tính linh động của điện tử π, hoặc điện tử có thể chuyển từ chuỗi polyme này sang chuỗi polyme khác theo cơ chế electron hopping Các polyme dẫn điện tử thể hiện tính dẫn gần giống kim loại và duy trì tính dẫn trên một vùng điện thế rộng Vùng dẫn này bị khống chế mạnh bởi bản chất hoá học của polyme và hơn thế nữa nó có thể bị khống chế bởi cả điều kiện tổng hợp

C C

H

C C H

C H

C H

C C H

C

H H Polyacetylen

Polyanilin

Hình I 10 Một số polyme dẫn điện tử

Polyme trao đổi ion (ion - exchange polyme): Polyme trao đổi ion là polyme

chứa các cấu tử có hoạt tính oxy hoá khử liên kết tĩnh điện với màng polyme dẫn ion, trong trường hợp này cấu tử có hoạt tính oxy hóa khử có điện tích trái dấu với màng polyme

I.3.1.3 Cơ chế dẫn điện của polyme dẫn

Theo cơ chế dẫn điện của Roth và cơ chế dẫn điện của Kaoki

- Roth và cộng sự cho rằng quá trình chuyển điện tích vĩ mô trong các mạng polyme dẫn là sự tập hợp các cơ chế vận chuyển cục bộ Đó là sự vận chuyển các

dạng mang điện trên các mạch sợi có liên kết liên hợp và từ sợi này sang sợi khác Nếu coi polyme là tập hợp các bó sợi thì còn có sự vận chuyển các dạng mang điện

tử từ bó sợi này sang bó sợi khác

- Theo Kaoki trong pha của polyme có những chuỗi có khả năng dẫn điện và những chuỗi không có khả năng dẫn điện hay nó tạo ra vùng dẫn và vùng không dẫn

Khi chuỗi polyme ở trạng thái oxy hoá, khi đó thì nó dư các obital trống do

đó nó có thể nhận hoặc cho điện tử Thông thường nó được phân bố ngẫu nhiên trong màng polyme Dưới tác dụng của điện trường áp vào thì các chuỗi này có xu hướng duỗi ra theo một chiều nhất định Khi điện thế áp vào đủ lớn thì xảy ra hiện tượng lan truyền pha có nghĩa là các pha không dẫn trở nên dẫn điện

I.3.1.4 Ứng dụng của polyme dẫn

Polyme dẫn có liên kết π liên hợp trong hệ cho thấy những tính chất đặc trưng như năng lượng chuyển điện tử thấp, điện thế ion hoá thấp và có ái lực điện tử cao Nhiều kết quả nghiên cứu tính chất cấu hình của của điện tử cho thấy các cấu hình này có thể bị oxy hoá hoặc khử dễ dàng, một vài polyme dẫn đã được phát triển để có thể ứng dụng vào trong thương mại ví dụ như làm nguyên liệu cho pin, thiết bị mắt điện tử, các cảm biến sinh học …

Ta thấy rằng một số polyme dẫn tồn tại ở nhiều dạng khác nhau tuỳ thuộc vào mức độ oxy hoá của chúng và loại vật liệu dopant và ở điện áp ngoài nhất định

Do đó nó có thể tồn tại ở dạng oxy cao nhất và nếu nó tồn tại bền vững ở trạng thái này thì ta có thể chọn nó làm vật liệu cho ắc qui

Một số loại polyme dẫn có tính chất điện rất đặc biệt nó có độ dẫn tăng rất nhanh khi áp thế vào do đó nó có thể được ứng dụng trong điều khiển logic và tạo ra tín hiệu ở dạng số…

Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các phản ứng đặc hiệu để phát hiện trực tiếp các hợp chất hoá học Trong cảm biến sinh học quá trình thực hiện theo trình tự: chất cần phân tích trong môi trường khuếch tán vào trong,tương tác với các

thành phân f sinh học của cảm biến, bị chuyển hóa thành sản phẩm, tạo ra một tín hiệu, tín hiệu sẽ được khuếch đại và được một thiết bị xử lý và ghi lại Ứng dụng của cảm biến sinh học rất đa dạng như được dùng để phân tích định lượng nhanh đường glucose, cholesterol, urea, các chất bảo vệ thực vật, các độc tố sinh học có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ con người Để phát hiện và định lượng những phần tử này người ta sử dụng các loại enzyme đặc hiệu và kết hợp với mạch polyme dẫn điện (enzyme có thể kết hợp với polyme dẫn điện ở dạng dopant, hay được phủ lên bề mặt của polyme) Enzyme sẽ phản ứng chọn lọc với chất phân tích cho ra những chất hoặc hợp chất làm thay đổi điện trở trên bề mặt cảm biến, sự thay đổi tín hiệu điện hóa đó là một hàm phụ thuộc nồng độ chất phân tích Hiện nay, polypyrol (PPy), polyanilin (PANi) và poly(3, 4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) là ba loại polyme dẫn đã và đang được nghiên cứu rộng rãi trong chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa Trong khuôn khổ của luận văn này, tập trung nghiên cứu, chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở vật liệu polyme dẫn điện là polyanilin có pha tạp

hạt nano Fe3O4 bọc copolyme p(St-co-AA)

I.3.2 Polyanilin

I.3.2.1 Giới thiệu chung

Monome anilin (Ani) [31]: Anilin là hợp chất hữu cơ có công thức phân tử

C6H5NH2, M= 93,13 g/mol Là chất hữu cơ lỏng không màu nhưng sẽ chuyển thành màu nâu khi gặp không khí và/hoặc ánh sáng

Các đại lượng vật lý quan trọng:

Nhiệt độ sôi ở 101,3 KPa: 184oC

Nhiệt độ nóng chảy: -6oC

Tính chất hóa học của anilin là chất vừa thể hiện ở vòng thơm vừa thể hiện ở nhóm −NH2 do cặp electron chưa chia Tuy nhiên tính bazơ của anilin khá yếu (kb=5,30.10-10) vì cặp electron chưa chia này tham gia liên hợp với hệ thống electron π của vòng benzen

Polyanilin (PANi): Polyanilin có thể được tạo ra trong dung môi nước hoặc

dung môi không nước, cấu trúc của nó ngày nay vẫn còn là vấn đề cần nghiên cứu Cũng như polyme dẫn điện khác nó cũng có trạng thái oxy hoá khử, tuy nhiên trạng thái oxy hoá của nó bền hơn polypynide và có độ dẫn điện lớn hơn polyacetylen

I.4.2.2 Cấu trúc phân tử của PANi và các trạng thái oxy hóa-khử [2]

Green và Woodhead đã mô tả PANi như là mạch chính của cặp phân tử anilin đầu cuối ở vị trí para của vòng thơm PANi là sản phẩm cộng hợp của nhiều

phân tử anilin trong điều kiện có mặt của tác nhân oxi hóa làm xúc tác [32]

Trạng thái tổng quát của polyanilin:

Hình I 12 Công thức tổng quát của PANi

Do quá trình trên đều xảy ra thuận nghịch nên tương tự quá trình oxi hóa, quá trình khử cũng xảy ra từng phần hoặc toàn phần Trong quá trình tổng hợp PANi người ta còn quan sát được các màu sắc khác nhau tương ứng với cấu trúc khác nhau của PANi

Khác với các loại polyme dẫn khác, PANi có 3 trạng thái oxi hoá:

- Trạng thái khử cao nhất (n = y= 1) là leucoemeraldine (LE) - màu trắng

- Trạng thái oxi hoá một nửa (n = y =0.5) là emeraldine (EM) - màu xanh lá cây Là hình thức chủ yếu của polyanilin, ở 1 trong 2 dạng trung tính hay pha tạp với liên kết imine các nitrogen của một axit

- Trạng thái oxi hoá hoàn toàn (n = y =0) là pernigraniline (PE) - màu xanh tím

Vì độ hoạt hoá cao nên PANi có thể bị oxi hoá ngay trong không khí hoặc trong dung dịch nước và do bám dính trên điện cực, có độ dẫn điện như kim loại, màng PANi mới tạo thành chính là bề mặt điện cực nơi diễn ra các phản ứng điện hoá tiếp theo

Quá trình khử ngược lại cũng có thể xảy ra từng phần hoặc toàn phần Các phản ứng oxi hoá khử như các quá trình trên đây là thuận nghịch, các dạng có thể dễ dàng chuyển đổi cho nhau (hình I.16) [26] PANi thường tạo muối với các axit thành dạng muối Emeraldine (ES) có tính chất dẫn điện tốt

Hình I 13 Quá trình chuyển đổi cấu trúc điện tử PANi trong môi trường oxy

hóa-khử

I.4.2.3 Đặc tính dẫn điện và cơ chế dẫn điện

PANi có thể tồn tại cả ở trạng thái cách điện và cả ở trạng thái dẫn điện Trong đó trạng thái muối emeraldine có độ dẫn điện cao nhất và ổn định nhất Điều kiện tổng hợp cũng ảnh hưởng đến việc hình thành sai lệch hình thái cấu trúc polyme, vì vậy làm thay đổi tính dẫn điện của vật liệu

Hình I 14: Đường CV của PANi trong dung dịch HCl 1M và sự thay đổi màu của PANi ở các giai đoạn oxy hoá khác nhau ở tốc độ quét thế 50 mV/s [2]

Quá trình oxy hoá PANi bằng cách quét thế tuần hoàn trong dung dịch axit cho thấy rõ hai pic: sóng Oxh bắt đầu ở thế khoảng 0V, đạt pic khoảng 0,2V và không nhạy với pH; pic thứ hai nằm trong khoảng 0,2 ÷ 0,8V và phụ thuộc mạnh vào pH Pic Red1 nằm trong khoảng thế 0,2 ÷ 0,8V, phụ thuộc vào pH giống như Ox2; pic Red2 diễn ra ở khoảng thế 0,1V và không phụ thuộc vào pH

Đặc tính điện hoá của PANi phụ thuộc vào pH Ở pH cao không có quá trình proton hoá xảy ra và PANi ở trạng thái cách điện Nếu chất điện ly đủ tính axit thì xảy ra quá trình proton hoá tạo thành dạng nigraniline và PANi có độ dẫn điện nhất định Sau đó một phần của PANi gắn với bề mặt điện cực sẽ tham gia vào phản ứng oxy hóa khử điện hoá và đóng vai trò vật dẫn electron đến phần còn lại của PANi

PANi là một hợp chất hữu cơ dẫn điện do hệ thống nối đôi liên hợp dọc toàn

E(V)/SCE

mạch phân tử hoặc trên những đoạn lớn của mạch Sự bất định xứ của một số lớn electron π dọc theo mạch polyme trong hệ thống nối đôi liên hợp mang lại thuận lợi lớn về mặt năng lượng Đó chính là điều kiện để polyme có thể dẫn điện Bề rộng vùng cấm trong polyme dẫn cỡ khoảng 1,5eV, nên có thể coi polyme dẫn tương đương với chất bán dẫn Khi pha tạp các tâm cho e (donor) hay các tâm nhận e (acceptor) và đặt trong điều kiện thích hợp thì các polyme có thể trở thành chất dẫn điện Quá trình pha tạp sẽ tạo ra các mức năng lượng mới có vị trí phụ thuộc vào quá trình oxy hóa khử của polyme

Đầu tiên, một electron được tách ra từ chuỗi polyme tạo ra một gốc tự do và một hạt tải dương Gốc tự do và cation liên kết với phần còn lại của chuỗi nhờ điều kiện cộng hưởng địa phương của điện tích và gốc Liên kết giữa một cation được định xứ trong chuỗi và một gốc được gọi là polaron Trạng thái polaron của PANi nằm chính giữa hai bờ vùng năng lượng Trong quá trình oxy hóa tiếp theo gốc tự

do của polaron tách ra khỏi liên kết tạo ra một trạng thái mới là bipolaron Cuối cùng, với việc pha tạp, dạng vùng năng lượng chuyển thành vùng bipolaron [26, 32]

Hình I 15 Dạng bipolaron của PANi

Đặc tính dẫn điện của polyme được quyết định bởi hai yếu tố quan trọng là: trạng thái oxi hóa của polyme, mức độ proton hóa của nguyên tử nitơ trong mạch và phần lớn ứng dụng của nó dựa trên đặc tính này

Cơ chế dẫn điện của PANi có thể được mô tả

Hình 1.16: Cơ chế dẫn điện của PANi

Các polyme dẫn điện, quá trình dẫn điện xảy ra hơi khác một chút Đám mây điện tử di chuyển trong một tiểu phân Giữa các tiểu phân có một đường hầm lượng

tử từ tiểu phân này tới tiểu phân khác Trong phân tử có sự liên hợp giữa các liên kết π trong vòng benzoid và quinoid với electron trên nhóm NH khi được pha tạp Quá trình pha tạp tạo nên sự khác biệt về độ dẫn điện giữa dạng emeraldine và muối emeraldin

Những tiểu phân PANi được tạo thành từ những phân tử có kích thước cơ bản khoảng 3,5 nm Do cấu tạo của các tiểu phân có kích thước 10 nm có chứa lõi 8 nm được tạo thành theo tập hợp từ 15 đến 20 phân tử có kích thước 3,5 nm Chính lõi này có tính chất “kim loại”, là cơ sở để PANi dẫn điện Những phần tử có kích thước 10 nm tập hợp lại để thành phần tử lớn hơn có kích thước khoảng 30 nm Những phần tử có kích thước 30 nm hợp lại thành phần tử lớn hơn 50÷100 nm Ở dạng muối emeraldin, nhờ có sự tạo muối của axit với nhóm -NH- trong mạch phân

tử PANi làm cho nó có khả năng định hình (tạo tinh thể)

I.4.2.5 Tổng hợp polyanilin (PANi)

Có hai phương pháp tổng hợp PANi đó là phương pháp điện hóa và phương pháp hóa học [32-35]

Phương pháp hóa học tuy có thể sản xuất một lượng lớn PANi nhưng nó có nhược điểm độ tinh khiết không cao, thời gian tiến hành phản ứng lâu và khó khăn

khi tạo màng cũng như khống chế chiều dày màng trên bề mặt điện cực kim loại

Với mục tiêu tạo màng PANi trên bề mặt điện cực ứng dụng làm thành phần chuyển đổi trong chế tạo cảm biến sinh học thì phương pháp điện hóa tỏ ra là một

phương pháp hiệu quả và phù hợp [35]

Các giai đoạn xảy ra trên bề mặt điện cực:

+ Khuếch tán và hấp phụ anilin

+ Hình thành polyme trên bề mặt điện cực

+ Ổn định màng polyme

+ Oxy hóa khử bản thân màng polyme

Trong thực tế, có thể sử dụng hệ điện hóa với cấu hình 2 hoặc 3 điện cực Hệ điện hóa 2 điện cực bao gồm điện cực làm việc (Working Electrode viết tắt là WE)

và điện cực phụ trợ (Counter Electrode viết tắt là CE) Hệ điện hóa hai điện cực thường được sử dụng để tổng hợp vật liệu

Trong hệ điện hóa 3 điện cực, cấu hình gồm điện cực làm việc (WE), điện cực phụ trợ (CE) và điện cực so sánh (Reference Electrode viết tắt là RE) Hệ điện hóa ba điện cực bên cạnh sử dụng để tổng hợp vật liệu còn thường được sử dụng để nghiên cứu các quá trình điện hóa

Về mặt phương pháp tổng hợp điện hóa polyme dẫn điện, người ta thường sử dụng ba phương pháp sau để tổng hợp đó là: phương pháp phân cực vòng (Cyclic Voltammetry viết tắt là CV), phương pháp phân cực dòng tĩnh (gavanostatic viết tắt

là GS) và phương pháp phân cực thế tĩnh (potentiostatic viết tắt là PS)

- Phương pháp phân cực vòng (CV): Điện thế phân cực được quét tuyến tính

một cách tuần hoàn từ điện thế E1 đến điện thế E2 và quay lại theo thời gian với vận tốc quét không đổi Dòng điện phản hồi I được ghi lại Từ dòng I và thế quét thu được, người ta xây dựng đồ thị I – E Khi quan sát các đường phân cực ta thấy: trong một số chu kỳ đầu, dòng tăng nhanh tương ứng với việc bắt đầu có polyme kết tủa trên bề mặt anot Khi tăng chu kỳ phân cực, dòng thụ động giảm dần Sau một số chu kỳ, các đường phân cực vòng trùng khít lên nhau, khi đó màng polyme lắng đọng trên bề mặt điện cực

- Phương pháp phân cực dòng tĩnh (GS): Tiến hành áp dòng điện không đổi lên

bình điện phân và đo hiệu điện thế phân cực E theo thời gian và thiết lập đồ thị E – t

- Phương pháp phân cực thế tĩnh (PS): là phương pháp áp điện thế phân cực

không đổi và đo dòng phản hồi I theo thời gian Từ những dữ kiện thu được ta xây dựng đồ thị I – t

Sơ đồ tổng quát của quá trình trùng hợp màng PANi bằng phương pháp điện hóa được đưa ra tại hình I 17 dưới đây

N H H

N H

H H

H H

-e

H H

-e t¹i +1V

H

N H H

N H

-2H +

khö proton

N

-2e N

H H

Hình I.17 Sơ đồ tổng quát về sự hình thành polyanilin bằng con đường điện hóa [36]

I.4 HẠT NANO OXIT SẮT TỪ TÍNH [37]

I.4.1 Giới thiệu chung:

Vật liệu nano đang đi vào đời sống hiện đại và dần dần chiếm một ý nghĩa lớn đối với đời sống của con người nhờ vào các tính chất rất đặc biệt của chúng mà các vật liệu truyền thống trước đó không có được Tính đặc biệt của vật liệu nano có được là nhờ kích thước nhỏ bé của chúng

Trong tự nhiên, sắt (Fe) là vật liệu có từ độ bão hòa lớn nhất tại nhiệt độ phòng, sắt không độc đối với cơ thể người và tính ổn định khi làm việc trong môi trường không khí nên các vật liệu như ô-xít sắt Fe3O4 được nghiên cứu rất nhiều để làm hạt nanô từ tính.Hạt nano oxit sắt từ có nhiều ứng dụng quan trọng trong

y sinh học như làm tác nhân tăng độ tương phản trong ảnh cộng hưởng từ hạt nhân,phân tách và chọn lọc tế bào,hiệu ứng đốt nhiệt và phân phát thuốc…Việc ứng dụng các hạt nano vào lĩnh vực y sinh đã thu được nhiều thành quả do đó ngày càng thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học

I.4.2 Tính chất của hạt nano

Hạt oxit sắt từ có cấu trúc spinen đảo thuộc nhóm đối xứng , hằng số mạng a=b=c=0.8396nm,số phân tử trong một ô cơ sở là 8.Trong mạng tinh thể spinen , các ion và được phân bố trong các bát diện Các bát

diện này tiếp xúc với nhau theo một cạnh chung, do đó cation sắt có mức oxi hoá

khác nhau mà ở gần nhau nên trao đổi điện tích dễ dàng, lỗ trống dương có thể

Hạt nano kim loại có hai tính chất khác biệt so với vật liệu khối đó là hiệu

ứng bề mặt và hiệu ứng kích thước

-Với hiệu ứng lượng tử do giảm kích thước và tăng diện tích bề mặt của các hạt nano đã biểu hiện rõ tính chất siêu thuận từ mở ra tiềm năng lớn cho ứng dụng y sinh nhờ những đặc tính lý, hóa, nhiệt học và cơ học

Hạt nanô từ tính dùng trong y sinh học cần phải thỏa mãn ba điều kiện sau: tính đồng nhất của các hạt cao, từ độ bão hòa lớn và vật liệu không có độc tính

-Các hạt nanô từ tính có kích thước tương ứng với kích thước của các phân

tử nhỏ (1-10 nm) hoặc kích thước của các vi rút (10-100 nm) Do vậy hạt nanô có thể thâm nhập vào hầu hết các cơ quan trong cơ thể và giúp cho chúng ta có thể thao tác ở qui mô phân tử và tế bào

-Diện tích bề mặt lớn trong một thể tích nhỏ của các hạt nanô giúp cho các hiệu ứng xảy ra bên trên bề mặt diễn ra rất mạnh mẽ,làm tăng khả năng liên kết giữa chúng với các thực thể sinh học

-Tính dẫn điện của kim loại rất tốt, hay điện trở của kim loại nhỏ nhờ vào mật độ điện tử tự do cao trong đó Khi kích thước của vật liệu giảm dần, hiệu ứng lượng tử do giam hãm làm rời rạc hóa cấu trúc vùng năng lượng Hệ quả của quá trình lượng tử hóa này đối với hạt nano là I-U không còn tuyến tính nữa mà xuất hiện một hiệu ứng gọi là hiệu ứng chắn Coulomb (Coulomb blockade) làm cho đường I-U bị nhảy bậc với giá trị mỗi bậc sai khác nhau một lượng e/2C cho U và e/RC cho I, với e là điện tích của điện tử, C và R là điện dung và điện trở khoảng nối hạt nano với điện cực.Tính chất này làm cho chúng phù hợp với yêu cầu của cảm biến

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của vật liệu phụ thuộc vào mức độ liên kết giữa các nguyên tử trong mạng tinh thể Nếu kích thước của hạt nano giảm, nhiệt độ nóng chảy sẽ giảm Ví dụ, hạt vàng 2 nm có Tm = 500°C, kích thước 6 nm có Tm

= 950°C

Với các tính chất trên việc sử dụng vật liệu nano để gắn chúng lên những

cảm biến sẽ làm tăng độ nhạy, độ chọn lọc , và tốc độ đáp ứng của thiết bị

I.4.3 Phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ [31, 38]

Phương pháp nghiền được phát triển từ rất sớm để chế tạo hạt nano từ tính dùng cho các ứng dụng vật lý như truyền động từ môi trường không khí vào buồng chân không, làm chất dẫn nhiệt trong các loa công suất cao, Phương pháp này có

ưu điểm là đơn giản và chế tạo được vật liệu với khối lượng lớn Nhược điểm của phương pháp là tính đồng nhất của các hạt nano không cao vì khó có thể khống chế quá trình hình thành hạt nano Hạt nano từ tính chế tạo bằng phương pháp này thường được dùng cho các ứng dụng vật lý

Phương pháp kết tủa từ dung dịch: Trong phương pháp kết tủa từ dung dịch, khi nồng độ của chất đạt đến một trạng thái bão hòa tới hạn, trong dung dịch sẽ xuất hiện đột ngột những mầm kết tụ Các mầm kết tụ đó sẽ phát triển thông qua quá trình khuyếch tán của vật chất từ dung dịch lên bề mặt của các mầm cho đến khi mầm trở thành hạt nano (hình I.17) Để thu được hạt có độ đồng nhất cao, người ta cần phân tách hai giai đoạn hình thành mầm và phát triển mầm Trong quá trình phát triển mầm, cần hạn chế sự hình thành của những mầm mới

Hình I 17 Cơ chế hình thành và phát triển hạt nano trong dung dịch

Các phương pháp sau đây là những phương pháp kết tủa từ dung dịch: đồng