Nghiên cứu chuyển hóa phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) chứa cellulose thành nhiên liệu sinh học bởi xúc tác sinh học trên cơ sở enzyme, vi sinh

Nghiên cứu quá trình thuỷ phân nguyên liệu dựa vào các chủng vi sinh của Việt Nam tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan...75 3.5.2.. Quy trình công nghệ sinh học sản xuất nhiên liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

o0o NGUYỄN BÁ KIÊN

N

Nghiên cứu chuyển hóa phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) chứa cellulose thành nhiên liệu sinh học bởi hệ xúc tác sinh học trên cơ sở enzyme,

vi sinh LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TSKH TRẦN ĐÌNH TOẠI

HÀ NỘI - 2010

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành tốt luận văn này, trong suốt quá trình thực hiện tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình từ nhiều cá nhân và tập thể Bằng tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn:

GS,TSKH Trần Đình Toại, người thầy đã rất tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, thường xuyên động viên và tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

TS Phạm Hồng Hải và các anh, chị cán bộ Phòng Công nghệ Khai thác chế biến Tài nguyên thiên nhiên, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ nhiệt tình và cho những lời khuyên quý báu trong suốt thời gian tôi làm nghiên cứu thực nghiệm tại phòng

Lãnh đạo Viện Thổ nhưỡng Nông hóa, TS Nguyễn Văn Chiến và các đồng nghiệp Phòng Phân tích Trung tâm nơi tôi hiện đang công tác đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được tham gia học tập trong thời gian qua tại trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và hoàn thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, giúp đỡ, cổ vũ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập vừa qua

Hà Nội, ngày 21 tháng 10 năm 2010 Học viên

Nguyễn Bá Kiên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu riêng của tôi Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 21 tháng 10 năm 2010

Nguyễn Bá Kiên

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP Adenosine triphosphate

ADP Adenosine diphosphate

BSA Bovine serum albumine (Albumin huyết thanh bò)

CMC Carboxyl methyl cellulose

DNS Axit dinitrosalicylic

FID Flame Ionization Detector (Detector ion hóa ngọn lửa)

PVA Polyvinyl alcohol

SSF Simultaneous saccharification and fermentation

(Đồng thời đường hóa và lên men)

OD Optical density (mật độ quang)

YATP Hiệu suất tế bào theo ATP

µ Tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật

µmax Tốc độ sinh trưởng cực đại của vi sinh vật

S Nồng độ cơ chất

KS Nồng độ dinh dưỡng giới hạn

KP Hằng số ức chế bởi sản phẩm

Y(p/s) Hiệu suất tế bào theo sản phẩm

Y(x/s) Hiệu suất tế bào theo cơ chất

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng ethanol trên thế giới 3

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của phụ phẩm nông nghiệp 11

Bảng 1.3 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu 12Bảng 1.4 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose (nuôi cấy được) 15

Bảng 1.5 Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật 23

Bảng 1.6 Nhiệt độ phát triển °C (°F) đối với một số vi sinh vật 26

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose 30

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật cho lên men ethanol 30

Bảng 2.3 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn Glucose theo pp Antron 38

Bảng 2.4 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn Glucose theo pp DNS 40

Bảng 3.2 Thành phần hóa học cellulose and hemicellulose của một số

giống lúa gieo trồng tại các tỉnh phía Bắc Trung Bộ

52

Bảng 3.3 Thành phần đường trong một số phụ phẩm của lúa

Thiên hương 100 trồng tại Thái Bình

Bảng 3.7 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol bởi

chủng Saccharomyces cerevisiae (Trong nước)

58

Bảng 3.8 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol bởi chủng

Candida sp (Trong nước)

59

Bảng 3.9 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol bởi chủng

Saccharomyces cerevisiae V 7028 (Nga)

59

Bảng 3.10 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol bởi chủng

Kluyveromyces sp (Trong nước)

Bảng 3.15 So sánh thông số động học lên men của các chủng nấm men của

Nga được nghiên cứu

bào nấm men cố định được sử dụng lại lần 2

74

Bảng 3.20 Nồng độ АТP nội tế bào của nấm men trước và sau khi được sử

dụng lại lần 2

74

Bảng 3.21 Ethanol thu được trong 24 giờ chuyển hóa glucose nhờ các tế

bào nấm men cố định được sử dụng lại lần 3

75

Bảng 3.22 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi một

số chủng vi sinh vật của Việt Nam

76

Bảng 3.23 Hiệu suất thủy phân Cellulose của các chủng vi sinh 77

Bảng 3.24 Các chủng vi sinh vật để nghiên cứu ảnh hưởng của pH 78Bảng 3.25 Ảnh hưởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu bằng nấm

Aspergillus terreus

78

Bảng 3.26 Ảnh hưởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu bằng vi

Bảng 3.30 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi

A terreus tại các nhiệt độ khác nhau

83

Bảng 3.31 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi vi

khuẩn C32 tại các nhiệt độ khác nhau

84

Bảng 3.32 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi vi

khuẩn T2 tại các nhiệt độ khác nhau

85

Bảng 3.33 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi xạ

khuẩn 7P tại các nhiệt độ khác nhau

Bảng 3.36 Ma trận kế hoạch thực nghiệm và kết quả 91

Bảng 3.37 Xác định giá trị tối ưu cho hàm lượng glucose nhận được 94

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Xu hướng sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới 4Hình 1.2 Cấu trúc của phân tử cellulose và hemicellulose 13

Hình 1.3 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose 14

Hình 1.4 Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose 18

Hình 1.5 Sơ đồ thiết bị thủy phân bằng phương pháp axit tại Brazil 19

Hình 1.6 Các giai đoạn sinh trưởng của vi sinh vật 20

Hình 1.7 Ảnh hưởng của pH đối với chủng vi sinh có pH tối ưu cho phát

triển là 6,2

25

Hình 1.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ sinh trưởng tương đối (%) của

chủng vi sinh có nhiệt độ phát triển tối ưu là 45-47 0C

27

Hình 1.9 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol 29

Hình 2.1 Dịch enzyme thô của chủng nấm mốc A terreus sau 48h nuôi cấy 34

Hình 2.2 Dịch enzyme thô của các chủng vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong

48 giờ

34

Hình 2.3 Dịch enzyme trong suốt của 2 chủng vi khuẩn C32, C36 34

Hình 2.4 Đồ thị đường chuẩn Glucose theo phương pháp antron 38

Hình 2.5 Đồ thị đường chuẩn Glucose theo phương pháp DNS 40

Hình 2.6 Máy UV-VIS Double Beam, Model UVD-3200 Labomed 41

Hình 2.7 Sự thay đổi màu trong quá trình chuẩn độ xác định ethanol 43

Hình 2.8 Đường chuẩn ethanol trong sắc ký khí 43

Hình 2.9 Máy sắc ký khí Hewlett Packard - 5890 GC-FID , Series II 43

Hình 2.10 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ

albumin chuẩn (BSA)

45

Hình 3.1 Các mẫu rơm, rạ của một số giống lúa 51

Hình 3.2 Cellulose tách được từ rơm 56

Hình 3.3 Hình ảnh và hoạt lực cellulase của một số chủng vi sinh vật 57

Hình 3.4 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol 60

bằng chủng Saccharomyces cerevisiae (Trong nước)

Hình 3.5 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng

chủng Candida sp (Trong nước)

60

Hình 3.6 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng

chủng Saccharomyces cerevisiae V 7028 (Nga)

61

Hình 3.7 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng

chủng Kluyveromyces sp (Trong nước)

61

Hình 3.8 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng

chủng Klyuveromyces marxianus (Nga)

66

Hình 3.9 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol

bằng chủng Saccharomyces cerevisiae Т2 (Nga)

67

Hình 3.10 Tế bào vi sinh cố định trên chất mang PVA 71Hình 3.11 Động học thủy phân cellulose bằng các chủng vi sinh vật 76Hình 3.12 Hiệu suất thủy phân cellulose thành glucose bằng các chủng vi

Hình 3.20 Xác định giá trị nhiệt độ tối ưu cho hoạt động thủy phân của

Hình 3.25 Đồ thị xác định giá trị tối ưu của glucose thu được từ quá trình

thủy phân cellulose

95

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học (ethanol) 3

1.1.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học và nguyên liệu chủ yếu để sản xuất 5

1.1.1.1 Nhiên liệu sinh học (ethanol) thế hệ I 5

1.1.1.2 Nhiên liệu sinh học (ethanol) thế hệ II 5

1.1.2 Nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học tại Việt Nam 6

1.2 Các giống lúa và phụ phẩm nông nghiệp của Việt Nam 7

1.2.1 Các giống lúa gieo trồng tại Việt Nam 7

1.2.1.1 Giống lúa lai ba dòng HYT-100 8

1.2.1.2 Giống lúa Japonica 8

1.2.1.3 Giống Thục Hưng 6 9

1.2.1.4 Nếp cái hoa vàng 9

1.2.2 Phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, vỏ trấu) 10

1.3 Cellulose và Hemicellulose 11

1.4 Vi sinh vật phân hủy cellulose 15

1.5 Thủy phân cellulose 16

1.5.1 Hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose 16

1.5.2 Nghiên cứu thủy phân cellulose 18

1.6 Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật 20

1.6.1 Các đặc trưng động học sinh trưởng của vi sinh vật 20

1.6.2 Hiệu suất của quá trình sinh trưởng vi sinh vật 22

1.6.2.1 Hiệu suất tế bào theo sản phẩm 22

1.6.2.2 Hiệu suất tế bào theo cơ chất 22

1.6.2.3 Tốc độ riêng tạo sản phẩm qP 22

1.6.2.4 Tốc độ riêng sử dụng cơ chất qs 22

1.6.2.5 Hiệu suất tế bào theo ATP 23

1.7 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật 23

1.7.1 Ảnh hưởng pH tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật 23

1.7.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật 25

1.8 Lên men ethanol 28

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Nguyên liệu 30

2.1.1 Các chủng vi sinh để nghiên cứu 30

2.1.2 Cellulose tách từ nguyên liệu (rơm, rạ) theo phương pháp Hypoclorit 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

2.2.1 Tách cellulose từ rơm rạ (phương pháp Hypoclorit) 31

2.2.2 Nuôi cấy vi sinh để thu enzyme 31

2.2.2.1 Môi trường để nuôi cấy các chủng vi sinh vật 31

2.2.2.2 Nuôi cấy các chủng vi sinh vật 33

2.2.2.3 Thu dịch enzyme từ các chủng vi sinh 33

2.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng của vi sinh vật phân hủy cellulose 35

2.2.3.1 Phương pháp đục lỗ thạch .35

2.2.3.2 Hoạt lực enzyme cellulase 35

2.2.4 Phương pháp thủy phân cellulose bằng dịch enzyme của vi sinh vật 36

2.2.5 Phương pháp xác định đường 36

2.2.5.1 Phương pháp xác định glucose bằng antron 36

2.2.5.2 Phương pháp xác định glucose bằng axit dinitro salicylic (DNS) 38

2.2.5.3 Phương pháp xác định đường tổng bằng axit phenol sulfonic 40

2.2.6 Phương pháp xác định ethanol 42

2.2.6.1 Xác định ethanol bằng phương pháp chuẩn độ với K2Cr2O7 42

2.2.6.2 Xác định ethanol bằng phương pháp sắc ký khí 43

2.2.7 Phương pháp xác định Protein 44

2.2.7.1 Xác định theo phương pháp lowry 44

2.2.7.2 Xác định Protein theo phương pháp đo quang phổ tử ngoại .45

2.2.8 Phương pháp kế hoạch hóa thực nghiệm 46

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50

3.1 Nghiên cứu tuyển chọn nguồn nguyên liệu (các loại sinh khối thực vật là phế thải nông nghiệp của Việt Nam) để sản xuất nhiên liệu sinh học (ethanol) 50

3.1.1 Chuẩn bị mẫu 50

3.1.2 Phân tích mẫu 50

3.2 Tách cellulose 54

3.3 Nghiên cứu lựa chọn các chủng vi sinh vật thủy phân rơm, rạ thành sản phẩm trung gian và các chủng vi sinh lên men ethanol cho hiệu quả cao 56

3.3.1 Lựa chọn các chủng vi sinh vật của Việt Nam có khả năng phân giải rơm, rạ thành sản phẩm trung gian tan 56

3.3.1.1 Kết quả lựa chọn các chủng Xạ khuẩn 56

3.3.1.2 Kết quả lựa chọn các chủng Vi khuẩn 56

3.3.2 Lựa chọn các chủng vi sinh vật của Việt Nam có khả năng lên men ethanol 58

3.3.3 Lựa chọn các chủng vi sinh vật do phía Nga chuyển giao có khả năng lên men ethanol 63

3.4 Nghiên cứu cố định các chủng nấm men tạo các chất xúc tác dị thể để lên men ethanol có hiệu quả 69

3.4.1 Chế tạo chất xúc tác sinh học để lên men ethanol (chuyển hóa glucose thành ethanol) trên cơ sở tế bào nấm men ưa nhiệt cố định trên PVA 70

3.4.2 Nghiên cứu hiệu quả của chất xúc tác sinh học để lên men ethanol (chuyển hóa glucose thành ethanol) 72

3.5 Nghiên cứu quá trình thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan 75

3.5.1 Nghiên cứu quá trình thuỷ phân nguyên liệu dựa vào các chủng vi sinh

của Việt Nam tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan 75

3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan 78

3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan 83

3.6 Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thuỷ phân cellulose (nguyên liệu) tạo thành glucose 90

KẾT LUẬN 96

TÀI LIỆU THAM KHẢO 98

PHỤ LỤC 106 CÁC CÔNG BỐ KHOA HỌC

MỞ ĐẦU

Đứng trước tình hình các nguồn năng lượng tiềm ẩn trên trái đất (dầu mỏ, khí, than đá, uran) chỉ trong khoảng 100 năm tới sẽ cạn kiệt, con người có thể sẽ lâm vào tình trạng khủng hoảng năng lượng, việc tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế đang trở thành một trong những nhiệm vụ cấp bách nhất hiện nay của nhân loại, trong đó có Việt Nam Nguồn năng lượng thay thế nhiên liệu dầu mỏ đang trở thành hiện thực chính là nhiên liệu sinh học – ethanol

Năm 2008, trên thế giới, tổng sản lượng ethanol đạt hơn 17 tỷ US gallon (1

US galon = 3,9 lít) tương đương 68 tỷ lít Dự kiến năm 2010 sẽ đạt 19 tỷ US gallon tương đương 76 tỷ lít

Nhưng cần chú ý rằng đây là ethanol sinh học Thế hệ I, được sản xuất từ

lương thực như ngô, sắn, mía đường, củ cải đường…

Ở Việt Nam, ngày 21/6/09, tại Phú Thọ, Công ty cổ phần Hóa dầu và Nhiên liệu Sinh học Dầu khí (PVB) đã khởi công xây dựng dự án nhà máy sản xuất cồn nhiên liệu sinh học (bio-ethanol) đầu tiên ở khu vực phía Bắc, với công suất thiết kế 100.000 m3 ethanol/năm Nhà máy sẽ sản xuất cồn ethanol dựa trên nguyên liệu chính là sắn và mía đường, đi vào sản xuất vào tháng 12 năm 2010

Ngày 6-9-2009, tại xã Bình Thuận, huyện Bình Sơn, Quảng Ngãi, Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam đã tổ chức khởi công và xây dựng Nhà máy sản xuất nhiên liệu sinh học (bio-ethanol) Dung Quất, sử dụng nguyên liệu sắn lát để sản xuất ethanol với công suất 100.000 m3 ethanol/năm

Nhưng một điều cần chú ý: Các nhà máy trên sản xuất ethanol sinh học Thế

hệ I từ lương thực (sắn, mía đường) Điều này không những lạc hậu về mặt khoa

học công nghệ mà còn tác động xấu tới chiến lược an ninh lương thực quốc gia

Nước ta có diện tích hơn 5 triệu ha đất cây trồng lúa Trong những năm gần đây, hàng năm, sản lượng nông nghiệp quy ra thóc đạt gần 40 triệu tấn Với sản lượng lớn như vậy, phế thải nông nghiệp ước chừng hơn 80 - 100 triệu tấn

Hiện nay, phế thải nông nghiệp không chỉ làm ô nhiễm môi trường sinh thái

mà còn làm mất đi cảnh quan văn hoá đô thị và nông nghiệp nông thôn Song, phế thải nông nghiệp thực sự là một nguồn tài nguyên có giá trị kinh tế vô cùng lớn

Sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải nông nghiệp (rơm, rạ), trước hết góp phần giải quyết vấn đề năng lượng, sau đó giải quyết xử lý ô nhiễm môi trường tại các vùng nông thôn cũng là thúc đẩy phát triển sản xuất lương thực (lúa) và còn có ý nghĩa tái sử dụng tài nguyên (là phế thải )

Như vậy, sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) là con đường tối ưu để giải quyết nhiệm vụ năng lượng trong tình hình hiện nay

Quy trình công nghệ sinh học sản xuất nhiên liệu sinh học từ phế thải nông nghiệp (rơm, rạ), ngoài các khâu cơ học tiền xử lý nguyên liệu, chia làm 2 giai đoạn chính:

1- Thủy phân nguyên liệu thành các sản phẩm trung gian tan như các oligosaccharide, các đường chủ yếu là glucose, xylose

2- Chuyển hoá các sản phẩm trung gian tan (glucose) thành nhiên liệu – ethanol, còn gọi là “Lên men ethanol”

Để góp phần thực hiện chương trình nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học

ethanol Thế hệ II từ phế thải nông nghiệp (rơm, rạ), trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi tập trung vào nghiên cứu giai đoạn 1 nêu trên với Mục đích :

Nghiên cứu thuỷ phân “Đường hóa” rơm, rạ thành các sản phẩm trung gian tan

Để đạt mục đích này, chúng tôi chọn phương pháp sử dụng enzyme, vi sinh

để thủy phân với Nội dung tóm tắt như sau:

1- Tuyển chọn nguồn nguyên liệu (rơm, rạ - phế thải nông nghiệp của Việt Nam) để nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (ethanol)

2- Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi sinh để thủy phân nguyên liệu và các chủng vi sinh để lên men ethanol cho hiệu quả cao

3- Nghiên cứu quá trình thuỷ phân nguyên liệu để tạo thành sản phẩm trung gian hòa tan

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tình hình sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học (ethanol)

Trên thế giới, chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học (ethanol) đang được

thực hiện mạnh mẽ, tổng sản lượng ethanol từ những năm 2004 tới nay đều vượt 10

tỷ US gallon (40 tỷ lít), trong đó các nước sản xuất nhiều là Mỹ, Brazil, EU, Trung

Quốc, Ấn Độ Dự kiến năm 2010, tổng sản lượng ethanol của thế giới đạt 19 tỷ US

gallon (76 tỷ lít) (Bảng 1.1, Hình 1.1) [22]

Bảng 1.1 Sản lượng ethanol trên thế giới

( Đơn vị: triệu US gallon, 1US gallon = 3,9 lít )

Thứ

tự

Quốc gia 2006 2005 Thứ

tự Quốc gia 2008 2007

12 Anh 74 92 12 Pakistan - 9,2

Việc sử dụng ethanol cũng dần dần phát triển mạnh trên Thế giới

Cho tới nay, ở Brazil, ethanol đã chiếm tới 30% nhiên liệu cho các động cơ,

đã có 33.000 (100% các trạm) trạm bán xăng pha ethanol Ở Mỹ có tới 1522 trạm như thế này Ở châu Âu, Thụy Điển là nước đã có tới 792 trạm bán xăng pha ethanol

Hiện nay, nhiên liệu cho các xe ở Brazil đều pha ít nhất là 25% ethanol Phần lớn các xe ở Mỹ chạy bằng nhiên liệu chứa 10% ethanol (gọi là ethanol blend – hỗn hợp ethanol) Người ta đang nâng dần hàm lượng ethanol trong nhiên liệu Năm

2007, Portland, Oregon là hai thành phố đầu tiên của Mỹ chỉ bán xăng pha ít nhất

10% ethanol Tháng giêng năm 2008, ba bang Missouri, Minnesota, và Hawaii đòi hỏi nhiên liệu - xăng cho xe phải pha ethanol

Nhu cầu sử dụng bioethanol đang tăng dần ở châu Âu, nhất là ở Đức, Thụy Điển, Pháp, Tây Ban Nha Trong năm 2006, các nhà sản xuất đã đáp ứng được 90% nhu cầu này

1.1.1 Các thế hệ nhiên liệu sinh học và nguyên liệu chủ yếu để sản xuất

Nhiên liệu sinh học (ethanol), dựa vào nguyên liệu sản xuất được chia làm 2 thế hệ

1.1.1.1 Nhiên liệu sinh học (ethanol) thế hệ I

Nhiên liệu sinh học (ethanol) thế hệ I được sản xuất từ lương thực như ngô, sắn, mía đường trong đó chủ yếu là tinh bột chứa amylose và một phần nhỏ là

amylopectin

Tinh bột (Starch ) gồm amylose (10-20%) và amylopectin (80-90%)

Thí dụ: Sản xuất ethanol thế hệ I đang được thực hiện tại các vùng khí hậu nóng ẩm như ở Brazil và một số nước khác dùng nguyên liệu mía đường (sugarcane) [10] Ở Mỹ, nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nhiên liệu sinh học là ngô, đường [8, 40] Ở một số nước châu Á như Trung Quốc, Thái Lan dùng sắn (cassava) Kê (Pearl millet) cũng hứa hẹn nhiều triển vọng là nguyên liệu quan trọng để sản xuất ethanol tại phía nam nước Mỹ [54]

Tại các nước có khí hậu ôn hoà như châu Âu, nguyên liệu chủ yếu để sản xuất nhiên liệu sinh học là củ cải đường (sugar beet), lúa mì (wheat), hạt cải dầu

(rapeseed) [50]

1.1.1.2 Nhiên liệu sinh học (ethanol) thế hệ II

Nhiên liệu sinh học (ethanol) thế hệ II được sản xuất từ sinh khối thực vật như các phế thải nông nghiệp của các loại thân cây lúa, ngô, lúa mỳ Lignocellulose

là thành phần chính cấu tạo nên sinh khối thực vật, chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin Thí dụ, trong sinh khối của thực vật như gỗ, cellulose có từ 30-50%, hemicellulose – 23-32% và lignin – 15-25% Hemicellulose gồm có Xylan (hemicellulose A), Arabinoxylan (hemicellulose B), glucuronoxylan

So sánh: qua các dữ liệu trên cho thấy:

- Nguyên liệu được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ I là các polysaccharide được tạo bởi liên kết α(1→4) -glucosid: Amylose, amylopectin

- Nguyên liệu được sử dụng để sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ II các

polysaccharide được tạo bởi liên kết β (1→4) - glucosid: Cellulose, hemicellulose Trong đó, glucose là monomer chính tạo nên cellulose, xylose là monomer

chính tạo nên hemicellulose (tới 60 %) Tất nhiên còn các đường khác nhưng lượng không lớn như mannose, galactose, rhamnose, arabinose

Do đó, khi nghiên cứu chuyển hoá phế thải nông nghiệp như rơm rạ thì giai đoạn trung gian chính là thuỷ phân các polysaccharide: cellulose, hemicellulose thành các oligosaccharide tan trong nước hoặc các đường chủ yếu là glucose, xylose

Sản xuất ethanol thế hệ II đang được thực hiện tại một số nước như ở Đông Nam Á dùng nguyên liệu là dầu dừa (palm oil), cây sậy (miscanthus), ở Trung Quốc dùng cây lúa miến (sorghum), ở Ấn Độ dùng cây gai dầu (Hemp), cây chà mè (jatropha) Tại Nhật Bản sử dụng gỗ thông (cedar Cryptomeria japonica) làm nguyên liệu lên men ethanol và cũng hứa hẹn nhiều nguyên liệu khác [58] Người ta còn sử dụng nguyên liệu khác như cỏ lông (switchgrass)

Ngoài ra, người ta còn cho rằng nhiên liệu sinh học thế hệ III được sản xuất

từ rong tảo, nhưng về bản chất nguồn nguyên liệu vẫn thuộc thế hệ II

1.1.2 Nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học tại Việt Nam

Ngày 20-11-2007, Thủ tướng Chính phủ đã ban hành Quyết định số 177/2007/QĐ-TTg phê duyệt “Đề án phát triển nhiên liệu sinh học (NLSH) đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025” Đây là định hướng đúng đắn trong việc tìm kiếm và sử dụng nguồn năng lượng sạch mới trong tương lai ở nước ta Dựa trên cơ

sở phân tích các mối quan hệ giữa nguyên liệu và quy luật thị trường cũng như giá thành sản phẩm Nguyên liệu cho sản xuất cồn cần phải nhanh chóng chuyển hướng sang sử dụng biomass (các dạng cành cây, mùn cưa, lá, rơm rạ…) Các loại cây cho bột nên tập trung cho mục tiêu lương thực

Hiện nay, tại Việt Nam cũng xuất hiện một vài công trình về nghiên cứu sử dụng nguồn phế thải nông nghiệp (rơm rạ) thành nhiên liệu sinh học theo 2 hướng:

- Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất ethanol sinh học

- Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất diezen sinh học

Nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học (Thế hệ II) từ sinh khối được tiến hành từ cuối thế kỷ trước Sang thế kỷ này, việc nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học từ sinh khối càng được đẩy mạnh hơn Sinh khối được lựa chọn là phế thải của nông nghiệp như thân cây ngô, sắn, lúa mì [38, 57, 63]

Ngoài các khâu xử lý nguyên liệu, Quá trình thu ethanol từ sinh khối, chia làm 2 giai đoạn chính:

1- Thuỷ phân sinh khối chứa cellulose, hemicellulose thành các sản phẩm trung gian tan (hydrolizat): các oligosaccharide các đường chủ yếu là glucose, xylose, còn gọi là “Đường hóa”

2- Chuyển hoá các sản phẩm trung gian tan (hydrolizat) trên thành nhiên liệu

- ethanol, còn gọi là “Lên men ethanol”

Giai đoạn 1 có thể tiến hành bằng 2 cách: phương pháp hoá học thuỷ phân bằng axit hoặc thuỷ phân bằng enzyme

Mỗi phương pháp đều có ưu, nhược điểm của mình

1.2 Các giống lúa và phụ phẩm nông nghiệp của Việt Nam

1.2.1 Các giống lúa gieo trồng tại Việt Nam

Qua hàng nghìn năm lịch sử, lúa đã là cây lương thực chủ yếu nuôi sống các thế hệ người Việt cho đến nay

Tại Việt Nam vào cuối thế kỷ 19 và thế kỷ 20 được trồng các giống lúa truyền thống như các loại lúa tẻ, chiêm, hè, tám, dự, các loại lúa nếp như hoa vàng, nếp cái, nếp cẩm v.v Các giống lúa truyền thống cho chất lượng gạo rất cao, thơm, ngon, dẻo…

Hiện nay, theo số liệu từ Bộ NN&PTNT, 70% lượng giống mà nông dân Việt Nam đang gieo trồng hiện nay là nguồn giống không chính thống (cả dòng bố

mẹ hoặc dòng bố hay dòng mẹ được sản xuất ở nước ngoài)

Năm 2003, Bộ NN&PTNT cho biết, 50% giống lúa sử dụng tại Việt Nam là

của Viện Nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), đã có 88 giống lúa của IRRI được các nhà

khoa học Việt Nam chọn lọc để phát triển sản xuất Hiện nay, trên 50% diện tích trồng lúa của Việt Nam sử dụng giống lúa của IRRI, hoặc có nguồn gốc từ IRRI Con số này được đưa ra tại Hội nghị Kế hoạch hợp tác của Bộ NN-PTNT Việt Nam

và IRRI, diễn ra trong hai ngày 18-19/9, tại Hà Nội

Do đó, việc lai tạo những giống lúa để tăng năng suất lúa đồng thời đáp ứng nhu cầu dân số ngày càng tăng cao phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu Việt Nam

Cuối thế kỷ 20 sang đầu thế kỷ 21, Việt Nam đã có nhiều chương trình cải tạo giống lúa, hoặc sử dụng các giống lúa là thành tựu nghiên cứu của Thế giới để đạt năng suất cao Các giống lúa mới này ngày càng nhiều và thay thế mạnh mẽ các giống truyền thống

Hiện nay, trên miền Bắc được phổ biến một số giống lúa như sau:

1.2.1.1 Giống lúa lai ba dòng HYT-100

Là giống đã được đăng ký thương hiệu độc quyền "Thiên Hương HYT-100" Giống lúa HYT-100 do Trung tâm Nghiên cứu và phát triển lúa lai thuộc Viện Cây lương thực và cây thực phẩm - Viện Khoa học nông nghiệp Việt Nam đã chọn tạo thành công Đây là một công trình nghiên cứu nằm trong “Chương trình giống cây trồng, vật nuôi và giống cây lâm nghiệp” do Thủ tướng Chính phủ ký quyết định và được triển khai từ năm 2000 [5]

Giống lúa HYT-100 có năng suất bình quân đạt 6.000 – 7.500 kg một ha, cho gạo chất lượng cao, thơm, ngon Từ năm 2005 đến nay, giống lúa này được tiến hành trồng khảo nghiệm ở một số địa phương Đồng bằng sông Hồng như: Thanh Hoá, Thái Bình, Hưng Yên, Hà Nội, Yên Bái, Hải Dương… Trong tương lai sẽ nghiên cứu thổ nhưỡng của các vùng miền khác để đưa vào gieo trồng

1.2.1.2 Giống lúa Japonica

Japonica là giống lúa có nguồn gốc Nhật Bản Hạt gạo của lúa Japonica tròn, cơm dẻo do có hàm lượng amylose thấp hơn và có chứa amylopectin Những năm

qua, Viện Di truyền Nông Nghiệp phối hợp với các địa phương khảo nghiệm khoảng 50 giống lúa Japonica khác nhau ở các tỉnh phía Bắc Trong đó, giống lúa Japonica ĐS1 được chọn tạo và nhân giống từ năm 2001, cho năng suất cao, chất lượng tốt, đã được Bộ NN & PTNT công nhận là giống tạm thời Hiện tại giống ĐS1 đang được mở rộng sản xuất tại các tỉnh đồng bằng sông Hồng và miền núi phía Bắc Giống ĐS1 trồng được cả hai vụ, thời gian sinh trưởng trung bình, năng suất vụ xuân đạt trung bình 7-8 tấn/ha, và có nhiều ưu điểm như cứng cây, chịu rét tốt, ít bị sâu bệnh Lúa ĐS1 càng lên vùng cao lạnh hơn càng biểu hiện năng suất cao hơn, một số HTX đạt trên 10 tấn/ha Theo thông báo của Đại học Nông lâm Thái Nguyên, tại Định Hóa - Thái Nguyên, năng suất lúa ĐS1 đạt trung bình 7,2 tấn/ha; tại Sơn Dương, Tuyên Quang đạt 7,8 tấn/ha; tại Chi Lăng, Lạng Sơn đạt 7,3 tấn/ha Tại Hưng Yên và Thái Bình trong vụ xuân giống lúa Japonica ĐS1 đã đạt năng suất 3 tạ/sào (8,1 tấn/ha)

1.2.1.3 Giống Thục Hưng 6

Là giống lúa lai 3 dòng do công ty TNHH Giống nghiệp Thục Hưng, Tứ Xuyên, Trung Quốc chọn tạo từ tổ hợp lai Việt Thái A và SH6 (Việt Thái A x SH6) Đây là giống lúa lai chất lượng cao, đã được Bộ NN-PTNT công nhận giống chính thức vào tháng 11/2008 Ở miền Bắc, Thục Hưng 6 có thời gian sinh trưởng vụ xuân 128-130 ngày, vụ mùa 105-110 ngày, chiều cao cây trung bình, khả năng đẻ nhánh khá, quần thể đồng ruộng khá, cây cứng trung bình, chịu rét khá Năng suất trung bình vụ xuân 70-75 tạ/ha, vụ mùa 65-67 tạ/ha, nơi thâm canh vụ xuân đạt 80-

85 tạ/ha Khả năng thích ứng rộng, thích hợp chân vàn, vàn trũng

1.2.1.4 Nếp cái hoa vàng

Là loại lúa nếp đặc sản trồng nhiều ở Hải Dương gần đây đã bị mai một, gạo không còn thơm, dẻo và ngon như trước nữa Hai năm qua, Trung tâm NC và phát triển hệ thống nông nghiệp (Viện CLT-CTP) được sự hỗ trợ của Viện NC Phát triển nông nghiệp (Pháp) đã bảo tồn, phục tráng thành công, đồng thời đưa nó trở thành một ngành hàng mang lại thu nhập cao cho nông dân khi nếp cái hoa vàng được tiêu

thụ mạnh tại các siêu thị lớn

Trong các vùng Thanh hóa, Nghệ An còn được phổ biến nhiều giống QU của Trung Quốc Đây là Giống lúa lai ba dòng có năng suất bình quân cao đạt 10 tấn /ha /vụ

Với các giống lúa có năng suất bình quân cao như nêu trên là điều kiện để đạt được sản lượng lương thực cao và cũng từ đó khối lượng phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ) thu được cũng rất lớn

1.2.2 Phụ phẩm nông nghiệp (rơm, rạ, vỏ trấu)

Năm 1977, tại Ấn Độ có 38,6 triệu ha đất trồng lúa đã thu hoạch 42,8 triệu tấn lúa và 81 triệu tấn phụ phẩm nông nghiệp, bao gồm 66 triệu tấn rơm, rạ và 15 triệu tấn trấu (husks-vỏ hạt lúa) [35]

Qua số liệu này, có thể suy luận như sau:

Khối lượng phụ phẩm nông nghiệp sẽ gấp gần 2 lần sản lượng lúa

Trước đây, Ấn Độ cũng như Việt Nam là những nước không có kỹ thuật canh tác tiên tiến cùng với các điều kiện không thuận lợi, (thiếu phân, thiếu giống lúa mới có năng suất cao) nên năng suất lúa thấp Vì vậy, sản lượng thấp như Ấn

Độ nêu trên, hoặc tại Việt Nam vào năm 1977, có 5 triệu ha đất trồng lúa cũng chỉ thu hoạch 10 triệu tấn lúa

Ngày nay, nhờ có kỹ thuật canh tác tiên tiến cùng với nhiều điều kiện thuận lợi hơn nên năng suất và sản lượng lúa tăng lên nhiều Ở Ấn Độ cũng diện tích đất trồng lúa như cũ, nhưng sản lượng lúa tăng gấp 3 lần năm 1977 và đạt 141 triệu tấn lúa Tình hình ở Việt Nam cũng tương tự: diện tích đất trồng lúa năm 2007 là 7,3 triệu ha, tăng 20 % so với năm 1977 nhưng sản lượng lúa tăng gấp hơn 3 lần năm

1977 và đạt 35,5 triệu tấn lúa

Với sản lượng lúa như vậy, theo kinh nghiệm nêu trên của Ấn Độ “ khối

lượng phụ phẩm nông nghiệp sẽ gấp gần 2 lần sản lượng lúa” thì lượng phụ phẩm

nông nghiệp ước tính sẽ thu được khoảng 70 - 80 triệu tấn Con số này cũng phù hợp với tính toán cho rằng, cứ 1m2 đất trồng lúa sẽ cho 2 kg phụ phẩm

Như vậy, một cách tương đối có thể cho rằng khối lượng phụ phẩm nông nghiệp (rơm rạ) tăng tuyến tính với sản lượng lúa

Thành phần của các phụ phẩm nông nghiệp chứa chủ yếu là cellulose, hemicellulose và số ít các hợp phần khác [12] (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của phụ phẩm nông nghiệp (%) [12]

Thành phần hóa học Rơm, rạ Trấu

1.3 Cellulose và Hemicellulose [6, 18, 36, 46, 68, 70]

Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật và có lẽ là hợp chất sinh học phong phú nhất trên trái đất, hàng năm được tạo thành với khối lượng lớn đến mức vượt tất cả các sản phẩm tự nhiên khác Theo dự tính, sinh khối thực vật của trái đất là 1,8.1012 tấn trong đó cellulose chiếm 40% Do vậy, tổng lượng cellulose của toàn thế giới là 7,4.1011 tấn, còn lượng cellulose tạo thành hàng năm là 4.1010 tấn

Trong vách tế bào thực vật cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với các polysaccarit khác: hemicellulose, pectin, lignin tạo thành những phức hợp bền vững Hàm lượng cellulose trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50 - 80%, trong giấy là 61%, trong trấu là 31%, bã mía là 46% (tính theo trọng lượng khô), trong sợi bông hàm lượng này vượt trên 90% (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu [15]

Nguyên liệu % Cellulose tinh khiết

Cỏ 33

Cellulose có công thức: (C6H10O5)n là polymer mạch thẳng của α-D-glucose

với liên kết β-(1→4) (gọi là polysaccharide), bao gồm 100-20.000 gốc glucose, nối

với nhau bằng liên kết β-1,4-glucosid Kiểu liên kết này đối lập với liên kết

α-1,4-glucosid có trong tinh bột, glycogen và các carbohydrate khác Cellobiose là đơn vị

cấu trúc lặp lại của cellulose gồm có 2 gốc glucose

Hemicellulose bao gồm chủ yếu Xylan (gọi là Hemicellulose A) và

Arabinoxylan (gọi là Hemicellulose B) Xylan là polymer mạch thẳng của D-xylose

với liên kết β-(1→4) Arabinoxylan gồm mạch chính là xylan gắn với mạch nhánh

là L-arabinofuranose bởi các liên kết α(1→2) Như vậy, đơn vị thành phần tạo nên

cấu trúc Hemicellulose chính là D-xylose và một ít L-arabinofuranose (Hình 1.2)

Cellulose

Xylan - Hemicellulose A

Arabinoxylan - Hemicellulose B

Hình 1.2 Cấu trúc của phân tử cellulose và hemicellulose

Phân tử cellulose chứa 3 dạng anhydroglucose Dạng thứ nhất có đầu khử với nhóm bán acetal tự do (hoặc aldehyde) ở C-1 Dạng thứ hai có đầu không khử với nhóm hydroxyl tự do ở C-4 và dạng thứ 3 có vòng nối giữa C-1 và C-4 Không giống như các alcohol đơn giản, phản ứng thủy phân cellulose bị kiểm soát nhiều

bởi yếu tố không gian hơn so với khả năng phản ứng được dự tính theo tính chất vốn có của các nhóm hydroxyl trong vòng anhydroglucose

Các nhóm hydroxyl của gốc glucose ở mạch này tạo liên kết hydro với nguyên tử oxy của mạch khác giữ cho các mạch ở bên cạnh nhau một cách vững chắc, hình thành nên các vi sợi (microfibril) với độ bền cao

Đặc điểm quan trọng và đặc trưng của cellulose tự nhiên đó là cấu trúc không đồng nhất, gồm hai phần Phần cellulose có cấu trúc tinh thể với trật tự cao rất bền vững và phần có cấu trúc vô định hình không chặt chẽ kém bền vững (Hình1.3):

- Vùng kết tinh có trật tự cao và rất bền vững với các tác động bên ngoài

- Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ do đó kém bền vững hơn

Hình 1.3 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose

Cellulose có cấu trúc tinh thể là cellulose chỉ tạo nên từ monomer glucose Cellulose có cấu trúc tinh thể (Cellulose microcrystalline) còn gọi là α cellulose hoặc “cellulose thực” Khi cho tác động với dung dịch 17.5% sodium hydroxide ở 20°C, cellulose tinh thể (α cellulose) có đặc trưng là không tan, phần tan trong dung dịch này là β cellulose và γ cellulose β cellulose kết tủa khi cho thêm axit, phần còn lại không kết tủa với axit là γ cellulose

Cellulose của bông có trật tự cao nhất, tuy vậy, trong cấu trúc lượng đường glucose chỉ đạt 90%, còn lại là các đường xylose, arabinose và rất ít rhamnose

Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinh mạng

lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này

Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của cellulose có cấu trúc dạng sợi Mỗi đơn

vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có đường kính 10 - 40 nm, dài 100 - 40000 nm và bao gồm đến 40 chuỗi cellulose

vùng kết tinh vùng vô định hình vùng kết tinh

Những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học

Toàn bộ bó sợi có một lớp vỏ Hemicellulose và Lignin rắn chắc bao bọc bên ngoài

làm cho sự xâm nhập của enzyme vào cấu trúc bên trong hết sức khó khăn Điều

này làm tăng thêm độ bền vững của cellulose nói chung

Cellulose kết tinh là hợp chất bền vững, nếu như nấu ở 60-70 0C, tinh bột đã

từ trạng thái kết tinh chuyển sang vô định hình, đối với Cellulose nấu ở 320 °C mới

xảy ra chuyển trạng thái như vậy

Cellulose không tan trong nước, trong nhiều dung môi hữu cơ và các dung

dịch kiềm loãng Cellulose có thể bị phân hủy thành glucose khi đun nóng với axit

hoặc kiềm Liên kết glucosit không bền với axít, dưới tác dụng của axít, cellulose

tạo thành các sản phẩm thủy phân, có độ bền cơ học kém hơn, cellulose khi bị thủy

phân hoàn toàn sẽ thu được sản phẩm cuối cùng là đường hòa tan D-glucose

1.4 Vi sinh vật phân hủy cellulose [21, 27, 55, 63, 66]

Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân huỷ bởi vi sinh vật cả trong điều

kiện hiếu khí và kị khí Các loài vi sinh vật có thể có tác động hiệp lực hoặc thay

phiên nhau phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose Số lượng các

loài vi sinh vật tham gia phân huỷ cellulose rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ

khuẩn, vi khuẩn, thậm chí cả nấm men Hiện nay, người ta đã biết được một số vi

sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose (Bảng 1.4)

Bảng 1.4 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose (nuôi cấy được)

Xạ khuẩn Nấm Vi khuẩn

Actinomyces Aspergillus Bacillus

Actinomyces diastaticus A oryzae B amylogenas

Actinomyces thermofucus A syndovii B megaterium

Actinomyces diastaticus A flarus B menssenteroides

Streptomyces Trichoderman Clotridium

Str rectus T reseii Clos Butyricum

Str thermofuscus T viridae Clos Lochehesdii

Str thermonitrificans T lignorum Acetobacter xylinum

Str thermoviolaceus T hazianum Pseudomonas fluorescens

Str thermovulgaris Pen Notatum

Str violaceus Cephalosporium Ruminococcus albus

Str diastaticus Mucor pusilus Ruminobacter parum

Thermomonospora curvata Neurospora Bacteroides amylophilus

Thermomonospora vulgaris AaBasii diomycetes amylophillus sp

1.5 Thủy phân cellulose

1.5.1 Hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose [17, 19, 23, 43, 48, 51]

Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose là do chúng có thể tiết ra các

enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase Tuy nhiên, trong thiên nhiên

không có một vi sinh vật nào có khả năng cùng một lúc sinh tổng hợp tất cả các loại

enzyme có trong hệ cellulase Các loài này có khả năng sinh tổng hợp mạnh loại

enzyme này, loài khác lại tổng hợp mạnh loại enzyme khác Chính vì thế, sự phân

giải cellulose trong điều kiện tự nhiên thường rất chậm và không triệt để

Các enzyme hệ cellulase này xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn mạch

cellulose

Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính sau đây:

- Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase (Cx) Enzyme này

tác động thuỷ phân lên các liên kết phía trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm

trương phồng cellulose, dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các

nhóm khử Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động

yếu ở vùng kết tinh của cellulose

- Exo-1,4- glucanase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase (C1) Enzyme này giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose Enzyme này tác động yếu lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng tác động mạnh lên mạch bên ngoài của cellulose kết tinh hoặc cellulose đã bị phân giải một phần Hai enzyme Exo và Endo- glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ rệt

- β - 1,6 - glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase Enzyme này thuỷ

phân cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của mạch cellulose tăng lên Tuỳ theo vị trí mà β - glucosidase được coi là nội bào, ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào Chức năng của β - glucosidase có

lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase

Người ta cho rằng tính đa hình của cellulase là nhằm phù hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử cellulose, gồm nhiều vùng có hoạt tính thủy phân khác nhau Tuỳ thuộc vào các chủng vi sinh vật cũng như các điều kiện môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các thành phần trong hệ enzyme, hiệu lực phân giải cellulose của các hệ cellulase là khác nhau, nhưng để phân giải hoàn toàn cellulose, cần có sự tác dụng hiệp đồng của cả ba enzyme trong hệ cellulase

- Cơ chế thủy phân cellulose được giả thiết có ít nhất hai bước (Hình1.4): Bước 1: Endoglucanase (ký hiệu C1) sẽ làm trương hoặc hydrat hóa các liên kết trong mạch cellulose

Bước 2: Exoglucanase (ký hiệu Cx) và β - glucosidase (cellubiase) thủy phân các liên kết mạch phía ngoài giải phóng glucose

Mô hình thủy phân cellulose

Hình 1.4 Giả thiết cơ chế thủy phân cellulose

1.5.2 Nghiên cứu thủy phân cellulose [30, 31, 34, 49, 61, 64]

Việc thủy phân cellulose để tạo nên các mảnh oligocellulose ngắn hơn và cho tới glucose có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế Việc sử dụng các cơ chất cellulose sau thủy phân sẽ trở nên đơn giản hơn và thuận lợi hơn rất nhiều Việc tìm ra biện pháp thích hợp và rẻ tiền là rất quan trọng, tính chất phức tạp và chi phí cao cho các cách xử lý này đang là một trong những yếu tố cơ bản đối với vấn đề khai thác

cellulose cũng như sử dụng cellulose ở quy mô công nghiệp

Phương pháp hoá học ít có hiệu quả đối với các phần cellulose có cấu trúc tinh thể hoặc cấu trúc trật tự bậc cao với liên kết β (1 - 4), song lại thích hợp để phá

vỡ các phần lignin của cellulose

Trong phương pháp hóa học, người ta hay dùng axit với nồng độ loãng, thí dụ

H2SO4 5% hoặc sulfuric acid 5% với hydrochloric acid 5% Để tránh bị phá hủy glucose, sản phẩm của thủy phân, người ta còn dùng hỗn hợp dung dịch HCl 0.5% cùng ZnCl 2 (65% -74%) (pH = 4.8, 100°C, 4 giờ) Sau 4 giờ thủy phân, 80% của cellulose chuyển thành dextrin hòa tan

Phương pháp hóa học đòi hỏi những trang thiết bị rất tốn kém mà lại khó thu được sản phẩm tinh khiết, vì vậy hiệu quả kinh tế thấp (Sơ đồ Hình1.5) Trong khi

đó, phương pháp sinh học sử dụng vi vật sinh enzyme có tính đặc hiệu cao nên có thể thu được sản phẩm tinh khiết, dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất thường

Hình 1.5 Sơ đồ thiết bị thủy phân bằng phương pháp axit tại Brazil ,

công ty “Usina Nova América S/A (Tarumã/SP Brazil)” [49]

Phương pháp công nghệ sinh học sử dụng enzyme, vi sinh có phần ưu điểm hơn Các liên kết β (1-4), có trật tự cao của cellulose rất dễ bị phá vỡ bởi các vi sinh

có chứa enzyme cellulase, hemicellulase Phần amylopectin với liên kết α(1-6) có thể phá vỡ được bằng các vi sinh có chứa α (1-6) glucosidase

Các thí nghiệm thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase thường được tiến hành trong tủ ấm với các điều kiện tối ưu để enzyme có hoạt tính cao nhất (40-

45°C, pH = 4,0-4,5) Đã có nhiều chế phẩm Enzyme công nghiệp trên thị trường có hiệu lực thủy phân cellulose như Novozymes 188 (thương phẩm của hãng Sigma-Aldrich, St Louis, MO)

Mới đây (năm 2010), người ta xây dựng hệ enzyme cellulase công nghiệp bao gồm chế phẩm Cytolase CL (Genencor, Menlo Park, CA) và β-glucosidase (Novozyme 188) có hoạt tính thủy phân cao ở pH = 4,8 [34]

Như vậy, giai đoạn thủy phân, phân hủy cellulose, hemicellulose hết sức

quan trọng Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình thuỷ phân nguyên liệu

dựa vào các chủng vi sinh của Việt Nam tạo thành các sản phẩm trung gian hòa tan

1.6 Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật [4,14,73]

1.6.1 Các đặc trưng động học sinh trưởng của vi sinh vật

Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trong nuôi cấy Gián đoạn) có thể chia thành các giai đoạn, được mô tả như sau (Hình1.6): Giai đoạn cảm ứng chậm phát

triển (Lag phase), Giai đoạn phát triển tuyến tính theo hàm số mũ (Log phase), Giai đoạn ổn định (Stationary phase) và Giai đoạn chết (Death phase)

Hình 1.6 Các giai đoạn sinh trưởng của vi sinh vật

Cần chú ý điều quan trọng là trong giai đoạn phát triển theo hàm số mũ, tế bào vi sinh thích nghi với điều kiện mới và phát triển Trong suốt giai đoạn này, tốc

độ phát triển là hằng số không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất cho tới khi nồng độ

cơ chất bắt đầu nhỏ dần

* Tốc độ sinh trưởng riêng µ

Cho X(g/l) là nồng độ vi sinh vật, thì phương trình để mô tả quá trình sinh trưởng của vi sinh vật có dạng như sau: X = X0eµt

(µ gọi là tốc độ sinh trưởng riêng vi sinh vật, có thứ nguyên t–1)

Trong nhiều quá trình lên men gián đoạn, tốc độ sinh trưởng riêng của vi sinh vật thường phụ thuộc vào nồng độ cơ chất cho tới một giới hạn nào đấy Sự phụ thuộc này được mô tả bởi phương trình, tương tự như phương trình phụ thuộc tốc

độ phản ứng enzyme vào nồng độ cơ chất (phụ thuộc Michaelis Meten), gọi là phương trình Monod

S K

S µ µs

max+

=

Trong đó, µ = Tốc độ sinh trưởng ; µmax = Tốc độ sinh trưởng cực đại

S = Nồng độ cơ chất (g/L); KS = Nồng độ dinh dưỡng giới hạn, (g/L)

Khi S → ∞; µ → µM

KS đặc trưng cho độ sử dụng cơ chất của vi sinh vật, thường có giá trị nhỏ, nằm trong khoảng 1.10–5mol

Về ý nghĩa, KS càng nhỏ, vi sinh vật càng có ái lực lớn với cơ chất Như vậy

KS là đại lượng tỷ lệ nghịch với ái lực của vi sinh vật đối với cơ chất

Trong nuôi cấy gián đoạn, rất khó xác định KS, vì tới một thời gian nào đấy, khi bắt đầu quá trình lớn và phát triển tế bào thì nồng độ cơ chất giảm rõ rệt Phương pháp nuôi cấy liên tục luôn luôn bù lại lượng cơ chất bị mất đi cho phép khắc phục khó khăn trong xác định KS

Tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào (µ) còn bị giới hạn bởi lượng sản phẩm được tích lũy lại trong hệ – coi như chất ức chế, lúc ấy tốc độ sinh trưởng riêng của

tế bào được mô tả bởi phương trình Mono với dạng:

µ = µM

] P [ K

K P P

KP - hằng số ức chế bởi sản phẩm, được tính bằng nồng độ sản phẩm KP = [P] khi µ = µM/2 Trong trường hợp tổng quát, nếu tính cả ảnh hưởng của nồng độ cơ chất và nồng độ sản phẩm thì tốc độ sinh trưởng riêng của tế bào được mô tả bởi phương trình Monod với dạng:

µ = µM

] S [ K

] S [

S K [ P ]

K P P

1.6.2 Hiệu suất của quá trình sinh trưởng vi sinh vật

1.6.2.1 Hiệu suất tế bào theo sản phẩm

Hiệu suất tế bào theo sản phẩm (còn gọi là hệ số hiệu suất sản phẩm) là đại

lượng biểu thị lượng sản phẩm tạo thành đối với một đơn vị cơ chất: Y(p/s) =

S

P

∆

∆

1.6.2.2 Hiệu suất tế bào theo cơ chất

Hiệu suất tế bào theo cơ chất là đại lượng biểu thị khối lượng tế bào tạo thành

đối với một đơn vị cơ chất: Y(x/s) =

Là đại lượng biểu thị lượng sản phẩm được tạo thành tính cho 1 đơn vị khối

lượng hoặc số lượng tế bào vi sinh vật:

1.6.2.4 Tốc độ riêng sử dụng cơ chất q s

Tốc độ riêng sử dụng cơ chất là đại lượng biểu thị lượng cơ chất tiêu tốn cho 1

đơn vị khối lượng hoặc số lượng tế bào vi sinh vật được tạo thành: qS =

X

) S / P (

p Y

X q

– mX

Thành phần thứ nhất của phương trình biểu thị lượng cơ chất tiêu tốn cho quá

trình lớn của vi sinh vật Thành phần thứ hai - lượng cơ chất bảo đảm cho tổng hợp

sản phẩm Thành phần thứ ba - lượng cơ chất bảo đảm cho sự sống của tế bào

) S / P (

p Y

– m Y(P/s)

Trong đó, m là hệ số của lượng cơ chất bảo đảm cho sự sống của tế bào

1.6.2.5 Hiệu suất tế bào theo ATP

Vi sinh vật cần năng lượng cho quá trình lớn và phát triển Đây cũng chính là năng lượng cần cho quá trình tích luỹ (phosphat)n được xúc tác bởi polyphosphatkinase:

ATP + (phosphat)n → ADP + (phosphat) n + 1 Năng lượng cho quá trình tích luỹ polyphosphat mà vi sinh vật cần thiết lấy chính là năng lượng giải phóng khi thuỷ phân ATP thành ADP (7 - 9 Kcal/mol) Đây chính là năng lượng giải phóng khi tách phosphat (thuỷ phân) từ liên kết thẳng phosphoanhydrid Năng lượng giải phóng ra khi thuỷ phân điểm phân nhánh lớn hơn nhiều ~28 Kcal/mol Như vậy, mức độ tích luỹ polyphosphat trong tế bào liên quan chặt chẽ với sự sử dụng lượng ATP trong quá trình lớn và phát triển

Hiệu suất tế bào theo ATP (YATP) là đại lượng biểu thị khối lượng tế bào được tạo thành khi vi sinh vật sử dụng 1 mol ATP để lấy năng lượng cho quá trình tích luỹ polyphosphat Đối với các vi sinh vật khác nhau, (YATP) có giá trị rất khác nhau Ngay đối với một giống, (YATP) cũng có thể có giá trị khác nhau, phụ thuộc vào tốc độ lớn của tế bào, trong khi đó hiệu suất tế bào theo cơ chất ít thay đổi hơn

1.7 Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

1.7.1 Ảnh hưởng pH tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật

Phần lớn các vi sinh vật phát triển thuận lợi trong môi trường có pH trong

khoảng pH 5,5 - pH 7,5 Rất ít các vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH nhỏ

hơn 4,0 hoặc cao hơn 9,0 Tuy vậy, vẫn tồn tại các vi sinh vật phát triển trong môi trường thậm chí nhỏ hơn 2,0 hoặc cao hơn 10,0 (Bảng 1.5)

Bảng 1.5 Giá trị pH đối với sự phát triển của một số vi sinh vật [25]

Vi sinh vật Cực tiểu Tối ưu Cực đại

Clostridium perfringens 5.5 - 5.8 7.2 8.0 - 9.0

Bacillus cereus 4.9 6.0 -7.0 8.8

Clostridium botulinum toxin 4.6 8.5

Clostridium botulinum growth 4.6 8.5

Staphylococcus aureus growth 4.0 6.0 - 7.0 10.0

Staphylococcus aureus toxin 4.5 7.0 - 8.0 9.6

Enterohemorrhagic Escherichia coli 4.4 6.0 - 7.0 9.0

Thí dụ: Chủng Trichoderma reesei có thể sinh ra hệ enzyme cellulase có hoạt

tính cao để thủy phân cellulose trong môi trường axit có pH = 4,8 [25]

Mới đây (năm 2010), người ta xây dựng hệ enzyme cellulase công nghiệp bao gồm chế phẩm Cytolase CL (Genencor, Menlo Park, CA) và β-glucosidase (Novozyme 188) thương phẩm của hãng (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), có hoạt tính thủy phân cao ở pH = 4,8 [11]

Có chủng đặc biệt như chủng ưa axit cổ đại (thermoacidophilic archaeon)

Sulfolobus solfataricus A chịu được axit rất cao pH = 1,8, bền nhiệt, đồng thời sinh

ra endo-b-glucanase bền nhiệt và có hoạt tính cao Ở pH = 1,8 và 80 0C enzyme này chỉ mất 50 % hoạt tính sau 8 giờ bảo quản [37,69]

Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH trung tính (quanh vùng 7) gọi là obligate (acidophile) Đối với chúng, cần môi trường có nồng độ ion

H+ để bảo đảm độ bền cho màng nguyên sinh chất [47]

Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH cao (tính kiềm cao) gọi là Ưa kiềm (alkaliphile) Đối với các chủng quá ưa kiềm (extreme alkaliphile),

có thể phát triển trong môi trường có pH cao tới 9,5 như các loài Geoalkalibacter

ferrihydriticus, Alkalibacterium iburiense, Bacillus okhensis [44, 45]

Đồ thị hoạt tính hủy phân cellulose của các chủng vi sinh thụ thuộc vào pH thường có dạng quả chuông với cực đại ở pH tối ưu Vị trí cực đại đồ thị thụ thuộc vào pH tối ưu của các chủng vi sinh

Đối với chủng vi sinh có pH tối ưu cho phát triển là 6,2 thì tốc độ sinh trưởng tương đối (%) có thể thay đổi như đồ thị trên hình 1.7

Hình 1.7 Ảnh hưởng của pH đối với chủng vi sinh có pH tối ưu

cho phát triển là 6,2

1.7.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật [26, 56, 62]

Dựa vào khả năng thích ứng với nhiệt độ, vi sinh vật có thể chia thành 3 nhóm với các nhiệt độ thích hợp:

2 4 6 8 10 pH

A,%

100- 80- 60- 40- 20-

1- Chịu lạnh (psychrophilic) ( 0oC ⎯→ 25oC) 2- Ưa ấm (mesophilic) (25oC ⎯→ 40oC) 3- Ưa nóng (thermophilic) (35oC ⎯→ 60oC)

Kết quả theo dõi nhiệt độ đối với sự phát triển của một số vi sinh vật được ghi trong Bảng 1.6

Bảng 1.6 Nhiệt độ phát triển °C (°F) đối với một số vi sinh vật [26]