Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp thuốc điều trị ung thư ALTRETAMIN

Von Brachel và cộng sự 9 1.6 Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin của Antonio Herrera 10 1.7 Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo phương pháp của Kapril Arya 11 1.8 Sơ đồ phản ứng tổng

chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tác giả

Trần Thái Ngọc

Nôi đã tạo điều kiên hết sức cho tôi hoàn thành khoá học 2014-2016

Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS TSKH Phan Đình Châu người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong nghiên cứu và thục hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn PGS TS Vũ Bình Dương , Trung tâm nghiên cứu sản xuất thuốc thực nghiệm – Học Viện Quân Y, thầy đã tận tình chỉ bảo cho tôi cả trong lý luân và thưc nghiệm của bản luận văn này; cũng các thầy

cô, các anh chị kỹ thuật viên của Trung tâm nghiên cứu sản xuất thuốc thực nghiệm, Trung tâm Đào tạo – Nghiên cứu Dược , Trung tâm kiểm nghiệm thuốc quân đội đã nhiệt tình giúp đơc tôi hoàn thành luân văn này

Và cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã luôn quan tâm, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện hết sức cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Hà Nôi, Ngày 16 tháng 9 năm 2016

Trần Thái Ngọc

1 13C- NMR Carbon nuclear magnetic resonance

(phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C)

2 1H- NMR Proton nuclear magnetic resonance

(phổ cộng hưởng từ proton)

(cục quản lý dược phẩm và thực phẩm Mỹ)

8 HPLC Hight- performance liquid chromatography

(sắc ký lỏng hiệu năng cao)

10 IR Infared spectrometry (phổ hồng ngoại)

17 USP United State Pharmacopiea (Dược điển Mỹ)

18 WHO World health organization (Tổ chức y tế thế

giới)

1.2 Một số biệt dược đang lưu hành trên thị trường 2

1.3 Chu trình tế bào và vị trí tác động của altretamin 5 1.4 Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Donal W Kaiser 8 1.5 Sơ đồ phản ứng tổng hợp của H Von Brachel và cộng sự 9 1.6 Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin của Antonio Herrera 10 1.7 Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo phương pháp của

Kapril Arya

11

1.8 Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Perter Dornan 12 2.1 Sơ đồ phản ứng tổng hợp Altretamin theo Donal W.Kaiser 21 3.1 Hình ảnh mặt đáp về ảnh hưởng của các yếu tố đầu vào đến hiệu

3.6 Ảnh SKLM của altretamin chuẩn và altretamin tổng hợp được

với hệ dung môi Toluen: AcOEt: CHCl3: MeOH (6: 1: 4: 3)

53

1.1 Chỉ tiêu chất lượng Altretamin theo Dược điển Mỹ USP

37

4

3.1 Kết quả khảo sát của chất hấp thụ acid 33 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của DMA đến hiệu suất

phản ứng

34

3.4 Kết quả khảo sát dung môi phản ứng tỷ lệ 1: 3,6: 3,3 37 3.5 Kết quả khảo sát tỷ lệ CYC: DMA: KOH thực hiện phản

ứng trong dung môi 1,4- dioxan

3.16 Kết quả hàm lượng nước trong mẫu altretamin 56

3.17 Kết quả thử giới hạn cắn sau nung của mẫu altretamin 57

3.18 Kết quả định lượng của mẫu altretamin 57

3.19 Kết quả đánh giá các chỉ tiêu của altretamin tổng hợp được

theo USP 37

Danh mục chữa viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ………1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN……… 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ ALTRETAMIN 2

1.1.1 Tên khoa học, công thức 2

1.1.2 Tính chất vật lý 3

1.1.3 Tính chất hoá học 3

1.1.4 Tiêu chuẩn dược điển 4

1.1.5 Dược động học 4

1.1.6 Tác dụng dược lý……….5

1.1.7 Chỉ định, dạng bào chế, liều dùng, cách dùng 7

1.1.8 Tác dụng không mong muốn 7

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ALTRETAMIN 8

1.2.1 Phương pháp tổng hợp altretamin của Donald W Kaiser và cộng sự 8 1.2.2 Phương pháp tổng hợp altretamin của H Von Brachel và cộng sự 9

1.2.3 Phương pháp tổng hợp altretamin của Antonio Herrera và cộng sự 10

1.2.4 Phương pháp tổng hợp altretamin của Kapril Arya và cộng sự 11

1.2.5 Phương pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự 11

1.3 LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP 12

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ DÙNG TRONG XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC VÀ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ 13

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng 13

1.4.2 Đo nhiệt độ nóng chảy 13

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 14

1.4.4 Phương pháp phổ hồng ngoại (Ifrared spectrometry – IR) 14

1.4.5 Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry- MS) 16

1.4.6 Phương pháp Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 16

1.5 MÔ HÌNH THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM VÀ TOÁN TỐI ƯU 17

1.5.1 Quy trình thực nghiệm………17

1.5.2 Quy trình tối ưu hoá 18

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ DUNG MÔI 19

2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 20

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

DMA: BASE = 1: 3,6: 3,3 24

2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của DMA đến hiệu suất phản ứng tổng hợp altretamin, sử dụng chất hấp thu acid là KOH (chất hấp thụ acid tốt nhất) 25

2.3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của KOH đến hiệu suất phản ứng tổng hợp altretamin 25

2.3.1.5 Khảo sát dung môi thực hiện phản ứng tổng hợp Altretamin 25

2.3.1.6 Khảo sát các chất phản ứng trong dung môi được chọn 25

2.3.1.7 Khảo sát lượng dung môi 1,4- dioxan thực hiện phản ứng tổng hợp altretamin 26

2.3.1.8 Khảo sát nhiệt độ phản ứng tổng hợp altretamin 26

2.3.1.9 Tối ưu hoá quy trình tổng hợp bằng phần mềm tin học 26

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học và kiểm nghiệm sản phẩm tổng hợp được theo USP 38 29

2.3.3 Phương pháp tính hiệu suất quá trình phản ứng 31

2.4 Phương pháp xử lý kết quả nghiên cứu 31

CHƯƠNGIII KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP ALTRETAMIN QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 32

3.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất hấp thu acid đến quá trình tổng hợp altretamin 32

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của DMA đến hiệu suất phản ứng tổng hợp altreatamin 34

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của KOH đến hiệu suất phản ứng tổng hợp altretamin 35

3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi đến hiệu suất và thời gian phản ứng 36

3.1.5 Khảo sát tỷ lệ mol CYC: DMA: KOH thực hiện phản ứng trong dung môi 1,4- dioxan 37

3.1.6 Khảo sát lượng dung môi 1,4- dioxan thực hiện phản ứng tổng hợp altretamin 39

3.1.7 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến hiệu suất quá trình phản ứng 40

3.1.8 Kết quả tối ưu hoá quy trình tổng hợp altretamin bằng phần mềm tin học 42

3.1.8.1 Kết quả thiết kế thí nghiệm tối ưu 42

3.1.8.2 Kết quả tiến hành thí nghiệm theo thiết kế phần mềm 44

3.1.8.3 Phân tích ảnh hưởng của yếu tố đầu vào đến hiệu suất phản ứng 45

3.2.2.1 Kết quả đo phổ hồng ngoại 53

3.2.2.2 Kết quả đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 54

3.2.2.3 Kết quả đo phổ khối 55

3.2.3 Kết quả kiểm nghiệm altretamin theo tiêu chuẩn dược điển Mỹ (USP 38) 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong khoảng 50 năm trở lại đây, ung thư là bệnh gây tử vong xếp thứ hai sau các bệnh về tim mạch Hơn 70% tử vong do ung thư là ở các nước có thu nhập thấp và trung bình, nơi các nguồn lực dành cho phòng chống, chẩn đoán, điều trị ung thư còn nhiều hạn chế thiếu thốn [13], [16] Theo thống kê của WHO, năm 2008 thế giới có khoảng hơn 12,6 triệu người mắc bệnh ung thư và hơn 7,6 triệu người tử vong vì căn bệnh này Ở Việt Nam, năm 2008 có 111.581

ca mắc mới bệnh ung thư và con số này đang ngày một tăng cao [7], [8], [46]

Ở Việt Nam thuốc điều trị ung thư phần lớn phải nhập ngoại từ các công

ty dược nước ngoài với giá cả đắt đỏ, kể cả một số thuốc có phương pháp tổng hợp hoá học không quá phức tạp Hiện các nghiên cứu trong nước về tổng hợp thuốc điều trị ung thư còn khá nhiều hạn chế nên chưa thể ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất được [19]

Altretamine là thuốc được sử dụng khá phổ biến trong điều trị ung thư vú, ung thư phổi và ung thư buồng trứng Loại thuốc này hiện đang được sử dụng điều trị ung thư với biệt dược như: Hexastat (Pháp), Hexinawas (Tây Ban Nha), Altretamin (Mỹ)… Hiện nay nhu cầu sử dụng thuốc điều trị ung thư rất lớn và hầu hết phải nhập ngoại khiến giá thành và chi phí điều trị rất cao Do đó việc nghiên cứu tổng hợp các thuốc điều trị ung thư nói chung và altretamin nói riêng

để tiến tới có thể chủ động sản xuất được trong nước là rất cần thiết

Với mong muốn góp phần đưa ra phương pháp tổng hợp thuốc điều trị ung thư phù hợp với điều kiện trang thiết bị thực tế Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp Altretamin làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị ung thư” được tiến hành với 2 mục tiêu:

1 Nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp altretamin quy mô phòng thí nghiệm

2 Xác định cấu trúc hoá học và kiểm nghiệm sản phẩm thu được theo USP 38

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ ALTRETAMIN

1.1.1 Tên khoa học, công thức

Altretamin tên khoa học là N,N,N’,N’N”,N” – hexamethyl – [1,3,5]- triazin-2,4,6

– triamin và có công thức cấu tạo nhƣ hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Altretamin

- Bột kết tinh màu trắng, khô tơi [21]

- Độ tan:

+ Tan tốt trong chloroform, aceton, ethylacetat, dimethylsulfosid, dimethylfonamid, ethanol nóng, methanol nóng

+ Tan một phần trong ethanol lạnh, methanol lạnh

+ Không tan trong nước

+ Phổ 1H-NMR : 3,09 (s, 18H, 6-CH3) + Phổ 13C-NMR : 165,814 (s, 3C, Ctriazin) ; 35,788 (s, 6C, 6-CH3)

1.1.4 Tiêu chuẩn dược điển

Dược điển Mỹ USP 38 (2015) [45] quy định chỉ tiêu chất lượng của

altretamin về tính chất, định tính, hàm lượng nước, tro, kim loại nặng, và định

lượng như trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Chỉ tiêu chất lượng của altretamin theo dược điển Mỹ USP 38

B Định tính

Phổ IR: Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với

phổ hồng ngoại của altretamin chuẩn

Phương pháp HPLC: Trên sắc ký đồ, dung dịch thử phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic chính trên sắc kí đồ dung dich altretamin chuẩn

Kim loại nặng Không được quá 0,004% (40 g/g)

Tmax khoảng 0,5-3 giờ; Cmax = 0,2 – 20,8 mg/L

 Phân bố: Không liên kết với protein huyết tương

Altretamin được phân bố nhiều đến các mô có thành phần chất béo (ví dụ: mạc nối và các mô dưới da)

 Chuyển hoá: Altretamin trải qua oxy hoá với sự hình thành của

các chất trung gian dẫn xuất hydroxymethyl Các chất chuyển hoá chính là

pentamethylmelamine và tetramethylmelamine

 Thải trừ: T1/2 khoảng 4,7- 10,2 giờ

90% được bài tiết qua nước tiểu trong 72 giờ [22], [48]

1.1.6 Tác dụng dược lý

 Năm 1976, Sewat và cộng sự [44] đã nghiên cứu tìm ra tác dụng sinh học của altretamin có tác dụng chủ yếu trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vú và ung thư phổi

Nhiều nghiên cứu tiếp sau đó về tác dụng sinh học của altretamin cũng Xác định điều này [26], [30], [38], [41], [43] Đặc biệt altretamin được sử dụng điều trị ung thư buồng trứng tiến triển sau khi phương pháp trị liệu đầu tiên thất bại [23], [31], [32], [39]

 Tác dụng điều trị ung thư:

 Chu trình tế bào và tác động của Altretamin:

Tế bào ung thư cũng như tế bào thường đều phải đi qua 4 pha của chu trình tế bào, bao gồm [8], [9]:

 Pha G1 là pha hoạt động cơ năng của tế bào, tế bào trao đổi chất chuẩn bị cho quá trình tổng hợp DNA Ở pha G1 tế bào có 2n NST

 Pha S là pha của quá trình tổng hợp DNA

 Pha G2 là pha chuẩn bị phân bào (tiền nguyên phân), tế bào

có 4n NST

 Pha M là pha phân bào (nguyên phân)

Hình 1.3: Chu trình tế bào và vị trí tác động của Altretamin

Altretamin

Ngoài ra tế bào còn có thể đi vào trạng thái nghỉ ngơi, gọi là pha G0, từ pha G1 (Chủ yếu) hoặc pha G2 Các tế bào này có thể quay lại chu trình tế bào theo một cơ chế chưa xác định

Tuỳ theo cơ chế của từng loại hoạt chất chữa ung thư mà thời điểm tác động của nó vào chu trình tế bào là khác nhau Altretamin thuộc nhóm tác nhân chống ung thư alkyl hoá [12], tác động vào pha G1 sớm của chu trình tế bào [27], [33], [40]

 Cơ chế tác dụng kháng tế bào ung thư của Altretamin

Từ các nghiên cứu của Ames và cộng sự (1981) [24], Jackson và Harley (1991) [24] và một số nghiên cứu khác [33], [39], altretamin được xếp vào nhóm điều trị ung thư kìm tế bào nhóm alkyl hoá

Một số tài liệu đã công bố cho rằng cơ chế tác dụng chống ung thư của altretamin có liên quan tới sự oxy hoá bởi enzim cytocrom P450, cụ thể là cytocrom P450 3A4 [33]

Cơ chế quá trình hoạt hoá altretamin và tác dụng akyl hoá DNA của tế bào ung thư có thể được mô tả như sau:

 Đầu tiên một nhóm methyl –CH3/ -N(CH3)2 bị oxy hoá thành alcol bậc nhất – CH2OH bới enzyme cytocrom P450 3A4

 Tiếp theo là bước dehydrat hoá tạo ra ion methylenniminium, một tác nhân ái điện tử Ion methyleniminium mang điện tích dương là tác nhân rất hoạt động có nhiệm vụ alkyl hoá DNA

 Theo Garcia và cộng sự, ion methyleniminium tạo thành là chất trung gian

có ái lực electrophil lớn đối với các trung tâm giàu điện tử trên phân tử DNA

 Tác dụng trị liệu và gây độc tế bào của tác nhân alkyl hoá chống ung thư liên quan trực tiếp và mật thiết với việc alkyl hoá DNA Nguyên tử N ở vị trí số 1

và vị trí số 3 của hợp phần adenin, nguyên tử N ở vị trí số 7 và nguyên tử O của hợp phần guanin, nguyên tử N ở vị trí số 3 của hợp phần cytosin đều dễ dàng tạo

ra liên kết với các tác nhân electrophil (ion methylenniminium) Tương tự như vậy, các nhóm –CH3 sẽ tiếp tục được hoạt hoá

 Nghiên cứu của Jacson và cộng sự [33] cũng chỉ ra cơ chế tác dụng của altretamin là do sự tạo thành liên kết cầu nối (cross linking) liên kết cầu nối tạo thành bởi tác dụng của forrmaldehyd được tạo ra bởi quá trình deformyl hoá của altretamin với các nguyên tử N ở vị trí số 6 của vòng purin trong hợp phần deoxyadenosin

1.1.7 Chỉ định, dạng bào chế, liều dùng, cách dùng

Ngày 26/12/1990 Altretamin với biệt dược Hexalen (US Biosience) đã được cục quản lý dược và thực phẩm Mỹ (FDA) cấp phép lưu hành đưa vào sử dụng trong điều trị ung thư trên người Ngày 5/7/1995 Hexalen chính thức được cấp phép lưu hành tại Châu Âu Từ đó đến nay Hexalen và nhiều biệt dược khác của altretamin vẫn được lưu hành rộng rãi để sử dụng và điều trị ung thư [48]

 Chỉ định: Altretamin được chỉ định cho điều trị các khối u ở phổi, buồng trứng và vú Đặc biệt altretamin được sử dụng điều trị ung thư buồng trứng tiến triển sau khi phương pháp trị liệu đầu tiên thất bại [28], [48]

 Dạng bào chế: Viên nang 50mg, 100mg

 Liều dùng, cách dùng: Liều hằng ngày, chia 3,5 lần, uống xa bữa ăn Liều dùng phải được điều chỉnh để đáp ứng từng bệnh nhân, trên cơ sở đáp ứng lâm sàng và mức độ tác dụng phụ, đặc biệt theo dõi tác dụng phụ trên thần kinh và huyết học

- U buồng trứng: 150-250 mg/m2/ngày, trong 21 ngày/tháng

- U phổi: 150-250 mg/m2/ngày, đợt dùng 5 ngày

Nghỉ 5 ngày lại dùng đợt khác, phối hợp với thuốc kìm tế bào khác

- U vú: 150-250 mg/m2/ngày, trong 15 ngày/ tháng

1.1.8 Tác dụng không mong muốn

Áp dụng cho viên nang uống [47]

- Tác dụng phụ trên hệ tiêu hoá: Buồn nôn và nôn (33%), tăng phosphatase kiềm (90%)

- Tác dụng phụ trên hệ thần kinh bao gồm; Bệnh thần kinh ngoại biên cảm giác (31%), chán ăn và mệt mỏi (1%), và động kinh (14%)

- Tác dụng phụ về huyết học bao gồm: Thiếu máu (33%), giảm tiểu cầu (9%), và giảm bạch cầu (5%)

- Tác dụng phụ trên thận: Nồng độ creatin máu 1,6-3,75 mg/dl (7%) và mức

độ nito ure máu tăng (9%)

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP ALTRETAMIN

Có nhiều phương pháp tổng hợp altretamin được công bố từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau

1.2.1 Phương pháp tổng hợp altretamin của Donald W Kaiser và cộng sự

Qui trình tổng hợp altretamin của Donald W.Kaiser và cộng sự [29] công

bố lần đầu tiên năm 1951 đi từ nguyên liệu ban đầu là cyanuaric clorid và dimethylamin với sự có mặt của natri hydroxyd trong dung môi aceton

Hình 1.4: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Donal W Kaiser

Phản ứng gồm 2 bước:

- Bước 1: Hoà tan 1 mol cyanuric clorid vào 800 ml dung môi

aceton, thêm 3,3 mol dimethylamin, rồi thêm vào 1 mol natri hydroxyd, đun hồi lưu ở 50oC trong 1 giờ Cất loại dung môi Phần cắn khô thu được thêm xylen, lắc đều rồi cất đẳng phí để loại hoàn toàn nước

- Bước 2: Thêm vào hỗn hợp phản ứng 2 mol natri hydroxyd khan

rồi đun nóng 3 giờ ở 100oC Xử lý hỗn hợp phản ứng, thu được sản phẩm thô Kết tinh lại bằng methanol, thu được sản phẩm kết tinh màu trắng Hiệu suất quá trình tổng hợp đạt 37,00%

Các thông số chính của phương pháp:

 Tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng: cyanuric clorid/ dimethylamin/ NaOH là 1:3,3:3

TS Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự đã nghiên cứu cải tiến quy trình này [9] nhằm hạn chế dùng dung môi ethanol độc hại để kết tinh và đạt hiệu suất cao hơn (đạt hơn 70,00% sau khi cải tiến) Quy trình được cải tiến như sau:

- Tiến hành phản ứng trong hai lần cho NaOH không qua giai đoạn cất quay loai dung môi aceton và nước

- Xử lý hỗn hợp sau phản ứng bằng cách cất loại dung môi, dùng hỗn hợp ethylacetat- nước chiết lấy sản phẩm, rửa với dung dịch NaCl bão hoà, làm khan bằng Na2SO4 khan, lọc, cất quay loại dung môi, thu sản phẩm thô

- Thay thế dung môi kết tinh MeOH bằng dung môi EtOH tuyệt đối

1.2.2 Phương pháp tổng hợp altretamin của H Von Brachel và cộng sự

H Von Brachel và cộng sự (1965) [36] công bố phát minh sang chế về điều chế altretamin đi từ melamin và formalin theo sơ đồ sau:

Hình 1.5: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo H.Von Brachel

1.2.3 Phương pháp tổng hợp altretamin của Antonio Herrera và cộng sự

Năm 2014, Antonio Herrera và cộng sự [25] tiến hành tổng hợp

altretamin từ nguyên liệu ban đầu là N, N- dimethylcyanamid

Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Antonio Herrera

Quy trình tổng hợp altretamin theo phương pháp của Antonio Herrera:

Bước 1: Khuấy đều hỗn hợp N, N- dimethylcyanamid và triflic anhydride trong dicloromethan, ở nhiệt độ thường trong 12 giờ, altretamin sẽ từ

từ tạo thành

Bước 2: Xử lý hỗn hợp phản ứng: Trung hoà phản ứng bằng dung dịch NaHCO3 bão hoà rồi chiết dicloromethan (3 lần), gộp các dịch chiết và rửa bằng dung dịch NaCl bão hoà, sau đó làm khan bằng MgSO4, cất thu hồi dung môi thu được cắn khô

Bước 3: Tinh chế altretamin: Cắn khô được kết tinh lại 2 lần từ EtOH tuyệt đối, thu được altretamin là chất kết tinh trắng, nhiệt độ nóng chảy 174oC-

175oC

ThS Lò Văn Thanh cùng cộng sự [18] đã nghiên cứu tổng hợp altretamin theo phương pháp của Antonio Herrera và cải tiến như sau:

- Tỷ lệ N, N-dimethylcyanamid: trislic anhydride là 1: 0,35

- Xử lý hỗn hợp phản ứng: Thay dung môi chiết dicloromethan bằng dung môi ethylacetat

- Thời gian tiến hành phản ứng: 12h

- Hiệu suất: 77,00%

1.2.4 Phương pháp tổng hợp altretamin của Kapril Arya và cộng sự

Cũng từ nguồn nguyên liệu ban đầu là cyanuric clorid và dimethylamin, năm 2007 Kapril Arya và cộng sự đưa ra phương pháp vi sóng và xúc tác zeolite vào áp dụng điều chế altretamin [37]

Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo pp của Kapril Arya

TS Đinh Thị Thanh Hải và cộng sự cũng có nghiên cứu tổng hợp Altretamin theo quy trình tổng hợp của Kapril Arya và cải tiến, khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng đến hiệu suất Phản ứng tiến hành qua 1 giai đoạn, sử dụng xúc tác

HY zeolit Quy trình phản ứng đơn giản, cho lần lượt cyanuric clorid, HYzeolite, dimethylamin, nước vào lọ thuỷ tinh pyex, đặt trong lò vi song 6 phút, sau đó xử

lý hỗn hợp phản ứng: Thêm ethanol rồi lọc bỏ loại lớp xúc tác rắn, cất quay loại dung môi, thu sản phẩm thô, kết tinh trong cồn tuyệt đối, lọc, hút, sấy, kết quả được altretamin với hiệu suất 88,00% [12]

1.2.5 Phương pháp tổng hợp altretamin của Peter Dornan và cộng sự

Năm 2008, cũng đi từ nguyên liệu ban đầu là N,N –dimethylcynamid nhưng với xúc tác tris(dimethylamido)- aluminium trong n- hexan Peter Dornan tổng hợp altretamin theo sơ đồ sau [42]:

- Bước 2: Xử lý hỗn hợp phản ứng, và kết tinh lại trong ethanol, thu được altretamin là chất kết tinh trắng, nhiệt độ nóng chảy 1740

 Dùng dung môi mesitylen thay cho n- hexan

 Thời gian tiến hành phản ứng: 24h

 Hiệu suất: 82,00%

1.3 Lựa chọn phương pháp

Trong các phương pháp trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp của Donald W.Kaiser [29], để tiến hành thực nghiệm tổng hợp altretamin vì có các ưu điểm nổi bật sau:

- Hiệu suất của quá trình thấp (37,00%)

- Các nguyên liệu chính và hoá chất, dung môi cần thiết cho quá trình tổng hợp: aceton, NaOH…là những hoá chất, dung môi thông dụng, có sẵn trên thị trường Việt Nam với giá thành hợp lý

- Các giai đoạn phản ứng có thể được thực hiện trên thiết bị, dụng cụ đơn giản, điều kiện phản ứng không khắc nghiệt, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm cũng như dễ dàng khi triển khai sản xuất ở quy mô lớn hơn

- Hiệu suất phản ứng qua nghiên cứu sơ bộ cho thấy có thể cải tiến để tăng được hiệu suất phản ứng [3], [6]

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP HOÁ LÝ DÙNG TRONG XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC VÀ ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) [1], [2] là một kỹ thuật sắc ký trong đó pha tĩnh chứa chất hấp phụ được trải đều thành lớp mỏng, mịn, và đồng nhất, được cố định trên phiến kính hoặc phiến kim loại, nhựa; pha động là một hệ dung môi

Hệ số lưu giữ Rf là đại lượng đặc trưng cho mức độ chuyển dịch của các chất, được tính bằng tỷ lệ khoảng cách dịch chuyển của pha động Việc ổn định giá trị Rf thường phụ thuộc nhiều yếu tố và gặp nhiều khó khăn về mặt kỹ thuật nên quá trình phân tích thường tiến hành song song với chất chuẩn trong cùng điều kiện sắc ký

1.4.2 Đo nhiệt độ nóng chảy

Đối với chất rắn kết tinh, điểm nóng chảy là một tiêu chuẩn vật lý học rất quan trọng Thông thường việc phân tích định tính đầu tiên sau khi thu được một sản phẩm kết tinh là việc xác định điểm nóng chảy của nó (hay còn gọi là điểm chảy, có ký hiệu Đc; Mp) [1]

Điểm chảy là một tiêu chuẩn quan trọng để kiểm tra mức độ tinh khiết của hợp chất, vì điểm chảy của một chất tinh khiết là một hằng số, là tính chất vật lý

đặc trưng của chất đó Nếu điểm chảy của tinh thể thu được qua 2 hoặc nhiều lần kết tinh chỉ chênh nhau không quá 0,5oC thì có thể xem sản phẩm kết tinh đó tương đối tinh khiết

Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa so với điểm chảy lý thuyết, chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết nên còn phải tiếp tục tinh chế

và kết tinh lại để có được sản phẩm tinh khiết (do tính chất đặc trưng của điểm

euteclic – điểm chảy của hỗn hợp luôn thấp hơn điểm chảy của bất cứ thành phần

nào có trong hỗn hợp đó)

Trong nhiều trường hợp, dựa trên điểm chảy xác định được, đối chiếu so sánh với tài liệu tham khảo đã có thể đưa đến kết luận sơ bộ, hoặc nhận định sơ

bộ về chất lượng các hợp chất đang nghiên cứu [20]

1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- high performance liquid

chromatography) ra đời năm 1967- 1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động

là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lí do: có độ nhạy cao, khả nặng định lượng tốt Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường… [20], [21]

1.4.4 Phương pháp phổ hồng ngoại (Ifrared spectrometry – IR)

Phổ hồng ngoại (Ifrared spectrometry – IR), hay phổ IR là một kỹ thuật

dựa vào sự dao động và quay của các nguyên tử trong phân tử Nói chung, phổ

IR nhận được bằng cách cho tia bức xạ IR đi qua mẫu và xác định phần tia tới bị hấp thụ với năng lượng nhất định Năng lượng tại pic bất kỳ trong phổ hấp thu xuất hiện tương ứng với tần số dao động của một phần phân tử mẫu

Do mỗi dạng liên kết có tần số dao động khác nhau ở trong môi trường xung quanh khác nhau và do hai dạng liên kết như nhau trong hai hợp chất khác nhau ở trong môi trường xung quanh khác nhau, nên không có hai phân tử với cấu trúc khác nhau có các hấp thụ IR, hay phổ IR, giống nhau Do đó phổ IR có thể được sủ dụng để phân biệt hai hay nhiều hợp chất khác nhau về cấu trúc phân

tử Nếu phổ IR của chúng trùng nhau về các pic, nhất là trong vùng 1500 – 600

cm-1 (Được gọi là vùng vân tay) thì trong hầu hết các trường hợp hai chất là đồng nhất [20]

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa trên cơ sở sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử một hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại Như vậy phổ hồng ngoại là phổ hấp thụ của hai dạng năng lượng là năng lượng dao động ( ) và năng lượng quay ( )

Các hấp thụ của mỗi dạng liên kết chỉ xuất hiện ở một vùng nhỏ của phổ

IR Mỗi vùng phổ IR có thể xác định cho một dạng liên kết, ngoài vùng này, hấp thụ thường thuộc về một số dạng liên kết khác Tần số hay độ dài sóng hấp thụ của mỗi chất phụ thuộc vào khối lượng tương đối của nguyên tử, vào liên kết và vào cấu trúc hình học của chúng Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại có thể xác định (nhận biết) được các nhóm chức đặc trưng có trong một hợp chất Ví dụ như các dao động hoá trị ( ) đặc trưng của một số liên kết như sau:

- Bất kỳ hấp thụ trong vùng 3000+/- 150cm-1 luôn thuộc về dao động hoá trị ( ) của liên kết C-H trong phân tử

- Hấp thụ trong vùng 1715+/- 100 cm-1 là do sự có mặt của liên kết C=O trong phân tử

- Hấp thụ trong vùng1715+/- 1000 cm-1 là liên kết ( ) của C-O

- Liên kết C=N có hấp thụ trong vùng 1690-1640 cm-1 và C N ở vùng 2260-2240 cm-1

- Dao động hoá trị ( ) của liên kết C=C alken trong vùng 1680-1600 cm-1

trong khi của aren hấp thụ ở vùng 1600 và 1450 cm-1

- Hấp thu của nhóm OH tự do trong nhóm hydroxyl và NH là 3300-3600

cm-1

- Phổ IR thường đo trong vùng 400-4000 cm-1

1.4.5 Phương pháp phổ khối lượng (Mass Spectrometry- MS)

Trong phương pháp phổ khối lượng, các phân tử của chất mẫu được ion hoá và được phân mảnh Các ion xuất hiện được phân tách theo số khối của chúng và được ghi nhận dưới dạng các tín hiệu trên phổ Vị trí của tín hiệu cho biết số khối và cường độ tín hiệu cho biết hàm lượng tương đối của ion tương ứng [20]

Phổ khối lượng có hai ứng dụng chính:

- Nhận biết các chất cùng với công thức cấu trúc của chúng

- Xác định công thức cấu trúc của hợp chất chưa biết

 Ứng dụng phân tích phổ khối lượng trong xác định cấu trúc phân tử

Để xác định cấu trúc, những mảnh phổ có khối lượng lớn có ý nghĩa hơn những mảnh nhỏ Những pic có cường độ lớn là những pic ứng với các ion tạo thành với xác suất cao khi phân mảnh, cho nên cần được xem xét đầy đủ Xác định công thức cấu tạo của hợp chất hữu cơ dựa vào phổ khối theo các bước

1.4.6 Phương pháp Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonace – NMR) là một phương pháp phổ quan trọng đối với hoá học hữu cơ trong việc xác định cấu trúc hợp chất Phương pháp phổ NMR nghiên cứu cấu trúc phân tử bằng sự tương tác bức xạ điện từ tần số radio với tập hợp hạt nhân được đặt trong từ trường mạnh

Do vậy, phổ NMR là phương tiện duy nhất có thể cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc phân tử mà khó có thể nhận được bằng bất kỳ phương pháp nào khác [20]

Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài Sự cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học

Phổ proton NMR hay còn gọi là phổ 1H (1H- NMR) không chỉ phân biệt một phân tử có bao nhiêu dạng proton, mà còn cho biết trong phân tử đó có bao nhiêu proton của mỗi dạng

Phổ 13C-NMR là một kỹ thuật quan trọng để xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ Khi sử dụng cùng với phổ proton 1H –NMR và phổ IR thì ta có thể xác định được cấu trúc hoàn thiện của một hợp chất chưa biết cấu trúc Các máy phổ FT-NMR làm cho phổ 13C – NMR nhận được dễ dàng Phổ 13C- NMR có thể được sử dụng để xác định số carbon không tương đương và nhận biết các dạng nguyên tử carbon (methyl, methylene, thơm, carbonyl…) có thể có mặt trong hợp chất Do đó phổ 13C-NMR cung cấp thông tin trực tiếp về bộ khung carbon của phân tử

Ứng dụng trong xác định cấu tạo hợp chất hữu cơ Thông thường người ta hay kết hợp phương pháp này với phương pháp phổ hồng ngoại

1.5 MÔ HÌNH THIẾT KẾ THỰC NGHIỆM VÀ TOÁN TỐI ƯU

Người đi tiên phong trong việc sử dụng mô hình thiết kế thực nghiệm và toán tối ưu là Fisher (1926) [15]

- Lựa chọn được công thức/ quy trình tối ưu

Nhược điểm: Thuật toán rất phức tạp, gây khó khăn cho các nhà nghiên cứu

ngành y dược nên phạm vi ứng dụng chưa rộng rãi

Thời gian gần đây, sự bùng nổ của công nghệ thông tin đã hỗ trợ rất nhiều cho công việc của con người và có nhiều phần mềm về thiết kế thực nghiệm, tối ưu hoá sử dụng trong ngành y- dược [15]

1.5.1 Quy trình thực nghiệm

Bước 1: Phân tích thực nghiệm Lựa chọn biến độc lập – biến phụ thuộc,

bản chất biến công thức – quy trình

Bước 2: Lựa chọn mô hình thực nghiệm, thiết kế số thí nghiệm

Bước 3: Tiến hành thực nghiệm, ghi kết quả thực nghiệm

1.5.2 Quy trình tối ưu hoá

Bước 1: Nhập dữ liệu từ excel và khai báo dữ liệu: Không tính ( not use )

nguyên liệu (ingredient), điều kiện pha chế ( processing condition), tính chất ( property) Có thể có giá trị tối đa, tối thiểu

- Tiến hành tối ưu hoá: Dùng các giá trị của biến X (use givens)

Bước 6: Đánh giá công thức tối ưu

- Tiến hành làm thử với công thức tối ưu (lặp lại 2-3 lần)

- So sánh các giá trị dự đoán (lý thuyết) với thực tế bằng cách phân tích phương sai 2 yếu tố

Các ứng dụng: Trong dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm, sản phẩm tiêu dùng

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ DUNG MÔI

Bảng2.1: Nguyên liệu, hoá chất và dung môi

chuẩn

Nguồn gốc

HPLC

Merck- Đức

4 Altretamin chuẩn 96%

Pcode 1001485750 Lot # MKBL 3528V

Chuẩn phân tích

Sigma Aldrich (USA)

8 Cyanuric clorid 99% Tinh khiết Sigma Aldrich

(USA)

12 Natrisulfat khan 99% Tinh khiết Trung Quốc

13 Natri hydroxyd Tinh khiết Trung Quốc

14 Tetrahydrofuran Tinh khiết Trung Quốc

16 Kali Hydroxyd 82-85% Tinh khiết Trung Quốc

17 Một số hoá chất dung môi khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết

2.2 THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

- Phễu lọc hút chân không Bucher

- Cân điện tử Electronic Balance WT-CF (Trung Quốc)

- Cân phân tích Metller, độ chính xác 0,1 mg (Đức)

- Tủ sấy Medda (Việt Nam)

- Mấy khuấy từ gia nhiệt IKA RH Basic 2 (Đức)

- Máy cất quay Rotavapror R.200 (Đức)

- Đèn soi tử ngoại 2 bước sóng 254nm và 364nm

- Bình cầu phản ứng thuỷ tinh các loại dung tích 250ml, 500ml, 1000ml

- Bản mỏng silicagel F254 (Merk – Đức)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart, SMP- 10 (Đức)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân GX- Perkin Elmer- Mỹ

- Máy đo khối phổ HP-5989B- MS (Mỹ)

- Máy quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker AV-500 (500MHz, CDCL3)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp khảo sát xây dựng quy trình tổng hợp Altretamin

2.3.1.1 Luận giải về lựa chọn phương pháp nghiên cứu

Như trong mục 1.3 đã đề cập, trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn

phương pháp tổng hợp altretamin của Donal W Kaiser [29] làm cơ sở nghiên cứu khảo sát bới vì ưu điểm theo phương pháp này là các hoá chất nguyên liệu sử dụng trong quy trình tổng hợp đều là loại thông thường, dễ kiếm, hiệu suất của quá trình tổng hợp đạt được của tác giả còn khá thấp (37,00%) [29] với khả năng phản ứng đạt được của nó, dự đoán có thể cải tiến để nâng hiệu suất cao hơn Theo công bố của Donal W Kaiser [29] altretamin được tổng hợp theo

sơ đồ phản ứng sau:

Cyanuric clorid Altretamin

Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng tổng hợp altretamin theo Donal W.Kaiser

Trong công bố này, tỉ lệ mol các chất tham gia phản ứng:

Cyanuric clorid: dimethylamin: NaOH là 1: 3,3: 3 Cyanuric clorid cho vào một lần từ đầu nhưng NaOH được cho vào làm 2 lần trong khi thực hiện phản ứng, và giữa 2 lần đó có cất quay loại dung môi Điều này có thể khiến cho dimethylamin bị bay hơi theo, dẫn đến nguyên liệu thiếu để tham gia phản ứng,

và giai đoạn dùng xylen, cất đẳng phí, thêm NaOH vào sau và đun tiếp ở 100oC trong 3 giờ có thể cũng là nguyên nhân dẫn đến quá trình thực hiện phản ứng không hiệu quả Dẫn đến hiệu suất của toàn bộ quá trình thấp

Trên cơ sở phương pháp này của D.W.Kaiser, Đ.T.T Hải và cộng sự [10], [11] nghiên cứu cải tiến quy trình đưa hiệu suất tổng hợp altretamin lên 70.00% Những cải tiến đó bao gồm:

- Tiến hành phản ứng trong hai lần cho NaOH không qua giai đoạn cất quay loại dung môi aceton và nước

- Xử lý hỗn hợp sau phản ứng bằng cách cất loại dung môi, cắn thu được dùng hỗn hợp ethylacetat – nước chiết lấy sản phẩm, rửa dịch chiết sản phẩm với dung dịch NaCl bão hoà, làm khan bằng Na2SO4 khan, lọc, cất quay loại dung môi, thu sản phẩm thô, đây cũng là quá trình thao tác phức tạp

- Thay thế dung môi kết tinh MeOH bằng dung môi EtOH tuyệt đối

Theo chúng tôi, quy trình cải tiến này vẫn còn những hạn chế ở một số điểm sau:

- Vẫn sử dụng tỷ lệ mol CYC: DMA: NaOH là 1: 3,3: 3 mà D.W.Kaiser đã dùng dẫn đến vẫn còn thiếu DMA và NaOH cho phản ứng

- Vẫn cho NaOH vào làm 2 lần trong khi thực hiện phản ứng

- Vẫn cất loại aceton trước khi xử lý hỗn hợp phản ứng

- Dùng EtOAc và nước tỷ lệ 1:1 để chiết altretamin từ hỗn hợp phản ứng;

mà EtOAc hoà tan trong nước tương đối (1ml EtOAc trong 10ml nước) nên lúc chiết sẽ mất 5%- 7% altretamin theo đó

- Chính những hạn chế đó đã làm cho hiệu suất chỉ dừng ở 70,00%

 Trên cơ sở những ưu nhược điểm của hai công bố [29], [10] nêu trên, nhóm nghiên cứu của GS.TSKH Phan Đình Châu và cộng sự đã đưa ra được quy trình tổng hợp Altretamin với hiệu suất đạt được 89,40% [12] Với nhiều cải tiến đáng kể về cách thức thực hiện phản ứng và xử lý hỗn hợp sau phản ứng, quá trình được thực hiện như sau:

- Về phần tiến hành phản ứng, cho đồng thời một lần 6g (0,15 mol) NaOH khan khuấy đều cho đến khi tan hoàn toàn chứ không chia làm 2 hoặc 3 lần như

2 phương pháp [29] và [10] nêu trên Điều này đảm bảo cho nồng độ các chất phản ứng luôn đạt tối đa, DMA không bị mất mát trong quá trình tiến hành phản ứng, nâng cao hiệu suất phản ứng, ít thao tác hơn trong quá trình thực hiện phản ứng

- Về phần xử lý, tách và tinh chế sản phẩm, hỗn hợp thu được sau phản ứng được thêm 120ml nước cất, làm lạnh trong 30 phút, tủa tạo ra được lọc hút thu được kết tủa thô Kết tinh trong ethanol 96o

thu sản phẩm tinh màu trắng Cách

xử lý này đơn giản hơn, nhanh hơn ít tốn kém dung môi hơn và cho hiệu suất cao hơn (Aceton là dung môi phân cực có khà năng hoà lẫn vào với nước, sau phản ứng việc tách ra đơn giản là cho vào nước, sản phẩm dạng tủa tạo ra được lọc mà không tiến hành xử lý tinh chế nhiều bước như: cất loại dung môi, cũng như không cần thiết chiết sản phẩm bằng dung môi hữu cơ như các tài liệu đã công bố) Sau đó sử dụng ethanol 96o để tinh chế sản phẩm thu được Altretamin tinh khiết Dùng ethanol 96o vừa đảm bảo hiệu suất phản ứng, độ tinh khiết cao kinh

tế và ít độc hại với người sản xuất) Hiệu suất đạt được là 86,00%-89,00%

- Về việc khắc phục thiếu hụt các tác nhân trong phản ứng: Do trong tài liệu [29], [10] sử dụng không đủ lượng DMA, NaOH mà ảnh hưởng đến hiệu suất

phản ứng (hiệu suất phản ứng thấp) nên nhóm nghiên cứu đã chú ý đến sự bổ sung thiếu hụt này Sử dụng tỷ lệ CYC: DMA: NaOH: 1:3,6:3,3; là tỷ lệ phù hợp cho phản ứng nhờ thế phản ứng đạt hiệu suất khá cao (89,14%) (DMA là chất có điểm sôi thấp dễ bay hơi nếu không thừa nhiều thì có thể đã bị bay hơi một phần trong quá trình thực hiện phản ứng làm DMA không đủ để phản ứng hết với CYA Do vậy trong quá trình tổng hợp Altretamin phải cho thừa DMA)

- Nhiệt độ thực hiện phản ứng suốt cả quá trình phản ứng được duy trì ổn định ở nhiệt độ sôi aceton 55o

C- 58oC, thời gian phản ứng được rút ngắn nhanh còn 2,0 giờ

 Dù rằng quy trình cải tiến trên đã thu được hiệu suất khá là cao nhưng trong công trình trên vẫn còn sử dụng chất hấp thu acid là NaOH và dung môi sử dụng là aceton như trong công trình nghiên cứu của D.W Kaiser mà chưa nghiên cứu cải tiến một cách triệt để Trong công trình này chúng tôi muốn tiến hành những khảo sát mới về các chất hấp thu acid, về ảnh hưởng của các loại dung môi phản ứng, về nhiệt độ phản ứng, lượng dung môi phản ứng để từ đó tìm được quy trình cải tiến triệt để hơn, hoàn thiện hơn cho phản ứng tổng hợp Altretamin Các khảo sát mà chúng tôi sẽ thực hiện trong nghiên cứu này bao gồm:

- Khảo sát ảnh hưởng của một số chất hấp thu acid NaOH, KOH, NaH, NaOCH3, KHCO3, K2CO3, Na2CO3, NaHCO3, C6H5N (pyridin), triethylamin, trong quá trình tổng hợp altretamin, trong dung môi aceton ở tỷ lệ các tác nhân CYC: DMA: Base = 1:3,6:3,3 Để từ đó chọn ra chất hấp thu acid tốt nhất Đồng thời chúng tôi sẽ thực hiện một phản ứng không dùng đến chất hấp thu acid để xác định tầm ảnh hưởng của các chất hấp thu acid và tìm ra tác nhân hấp thu acid tốt nhất

- Khảo sát ảnh hưởng của tác nhân hấp thu acid tốt nhất đến hiệu suất phản

ứng tạo altretamin trong dung môi aceton ở các tỷ lệ khác nhau

+ Khảo sát ảnh hưởng của DMA trong tỷ lệ mol giữa CYC: DMA: Base (tốt nhất được lựa chọn) với các tỷ lệ sau: 1:3:3; 1:3,3:3; 1:3,6:3; 1:3,9:3; 1:4,2:3

1,4 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ các chất phản ứng đươc chọn để tìm ra tỷ lê tối ưu nhất Tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng CYA: DMA: KOH: 1:3,6:3,3; 1:3,6:3,6; 1:3,6:3,9; 1:3,5:4,2; 1:3,9:3,3; 1:4,2:3,3; 1:3,9:3,6; 1:4,2:3,6; 1:3,9:3,9

Từ đó chọn ra tỷ lệ CYC: DMA: KOH phù hợp trong phản ứng

- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chọn được đến hiệu suất phản ứng

- Khảo sát nhiệt độ và thời gian phản ứng (theo dõi trong hệ sắc ký lớp mỏng) khi sử dụng dung môi được chọn: Ở 20oC- 25oC (mùa đông), 30o

C- 35oC (mùa hè), 55oC- 58oC, 82oC-84oC (đun cách thuỷ) và 101oC - 103oC (hồi lưu)

2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của các chất hấp thu acid trong quá trình tổng hợp Altretamin, trong dung môi aceton ở tỷ lệ các tác nhân CYC: DMA: BASE

= 1: 3,6: 3,3

Để khảo sát ảnh hưởng của các chất hấp thu acid đến sự hình thành sản phẩm và hiệu suất phản ứng chúng tôi lần lượt tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin trên cơ sở là công bố của Phan Đình Châu và cộng sự [5] Với lần lượt các base là NaOH, KOH, NaOCH3, KHCO3, K2CO3, Na2CO3, NaHCO3, pyridin

và triethylamin với tỷ lệ các tác nhân là: CYC: DMA: Bazo = 1:3,6:3,3 Đồng

thời tiến hành phản ứng khảo sát không dùng tác nhân hấp thu acid, theo dõi tiến trình phản ứng.Tìm ra chất hấp thu acid tốt nhất (KOH)

 Đánh giá: Hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hiệu suất Từ đó lựa chọn ra chất hấp thu acid tốt nhất sử dụng cho các khảo sát tiếp theo

2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của DMA đến hiệu suất phản ứng tổng hợp altretamin, sử dụng chất hấp thu acid là KOH (chất hấp thu acid tốt nhất)

Để khảo sát ảnh hưởng của DMA đến hiệu suất phản ứng, chúng tôi lần lượt tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin trên cơ sở tài liệu [5] Chỉ thay NaOH bằng KOH với tỷ lệ mol CYA: DMA: KOH theo các tỷ lệ sau: 1:3,3:3,3; 1:3,6:3,3; 1:3,9:3; 1:4,2:3,3; Từ đó chọn ra tỷ lệ DMA phù hợp trong phản ứng

 Đánh giá: Hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hiệu suất

2.3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng của KOH đến hiệu suất phản ứng tổng hợp altretamin

Để khảo sát ảnh hưởng của KOH đến hiệu suất phản ứng chúng tôi lần lượt tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin trên cơ sở tài liệu [5], chỉ thay NaOH bằng KOH với tỷ lệ mol CYA: DMA: KOH theo các tỷ lệ sau: 1:3,6:3,3; 1:3,6:3,6; 1:3,6:3,9; 1:3,6:4,2 Từ đó chọn ra tỷ lệ KOH phù hợp trong phản ứng

 Đánh giá: Hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hiệu suất

2.3.1.5 Khảo sát dung môi thực hiện phản ứng tổng hợp altretamin

Dung môi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu suất của phản ứng Để khảo sát ảnh hưởng của dung môi phản ứng, tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin theo các điều kiện tối ưu đã tìm được trong những khảo sát trước đó, nhưng tiến hành ở các dung môi khác nhau: Aceton, tetrahydrofuran, 1,4-dioxan,

CH3CN Xác định hiệu suất, thời gian kết thúc phản ứng từ đó lựa chọn được dung môi phù hợp cho phản ứng tổng hợp altretamin

2.3.1.6 Khảo sát các chất phản ứng trong dung môi được chọn

Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ các chất phản ứng trong dung môi được chọn để

tìm ra tỷ lệ tối ưu nhất, chúng tôi lần lượt tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin trên cơ sở tài liệu [5]; thay NaOH bằng KOH, thay aceton bằng dung môi được

chọn với tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng CYA: DMA: KOH: 1:3,6:3,3; 1:3,6:3,6; 1:3,6:3,9; 1:3,6:4,2; 1:3,9:3,3; 1:4,2:3,3; 1:3,9:3,6; 1:4,2:3,6; 1:3,9:3,9

Từ đó chọn ra tỷ lệ CYC: DMA: KOH phù hợp trong phản ứng

 Đánh giá: Hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hiệu suất

2.3.1.7 Khảo sát lượng dung môi 1,4- dioxan thực hiện phản ứng tổng hợp altretamin

Để khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi được chọn (1,4- dioxan) phản ứng Tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin theo các điều kiện tối ưu đã tìm được trong những khảo sát trước đó, nhưng tiến hành với lượng dung môi 1,4-dioxan tham gia phản ứng khác nhau, lần lượt là: 44ml, 40ml, 36ml, 32ml, 28 ml Xác định hiệu suất phản ứng từ đó lựa chọn được lượng dung môi phù hợp cho phản ứng tổng hợp altretamin

2.3.1.8 Khảo sát nhiệt độ phản ứng tổng hợp altretamin

Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian thực hiện và hiệu suất phản ứng Tiến hành phản ứng tổng hợp altretamin theo các điều kiện tối ưu đã tìm được trong những khảo sát trước đó, nhưng khảo sát nhiệt độ phản ứng duy trì lần lượt tại nhiệt độ phòng trong các thời điểm khác nhau: (mùa đông) 20oC-

25oC, (mùa hè) 30oC-35oC, (nhiệt độ sôi của dung môi aceton) 55oC- 58oC, (nhiệt độ đun cách thuỷ của 1,4-dioxan) 82oC- 84oC và đun hồi lưu của (1,4-dioxan) 101oC- 103oC Theo dõi điểm kết thúc phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng

Từ đó chọn ra nhiệt độ phù hợp trong phản ứng

 Đánh giá: Hình thức cảm quan, nhiệt độ nóng chảy, hiệu suất

2.3.1.9 Tối ưu hoá quy trình tổng hợp bằng phần mềm tin học

Sau khi đã khảo sát một số các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và cách thức thực hiện phản ứng, tiến hành tối ưu hoá các điều kiện phản ứng tổng hợp altretamin bằng phần mềm tin học thông minh nhằm đánh giá ảnh hưởng đồng thời các yếu tố tới hiệu suất phản ứng, từ đó lựa chọn được các điều kiện tối ưu cho phản ứng tổng hợp có hiệu suất cao nhất Sử dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm và tối ưu Để thực hiện được tối ưu hoá, trước hết phải lựa

chọn các yếu tố ảnh hưởng (biến đầu vào hay biến độc lập hoặc tham số) tới hiệu suất phản ứng (biến đầu ra hay biến phụ thuộc hoặc hàm số) Quá trình khảo sát trước đó, chúng tôi nhận thấy nhiệt độ phản ứng, tỷ lệ mol DMA, tỷ lệ mol KOH

và lượng dung môi 1,4 dioxan là những yếu tố ảnh hưởng khá lớn tới hiệu suất phản ứng Vì vậy chúng tôi lựa chọn 3 yếu tố này làm biến đầu vào gồm:

- Nhiệt độ phản ứng: (X1 – oC)

- Tỷ lệ mol DMA: CYA (X2 – mol)

- Tỷ lệ mol KOH: CYA (X3 – mol)

- Lượng dung môi 1,4- dioxan (X4 – ml)

Biến đầu ra là hiệu suất của phản ứng (Y%)

Từ đó phần mềm Modde 5.0 đưa bố trí theo mô hình mặt hợp tử tại tâm (Central Composite Face – CCF), tiến hành thí nghiệm theo thiết kế, phân tích ảnh hưởng và đưa ra điều kiện tối ưu Tiến hành cụ thể như sau :

a Bước 1: Xác định biến đầu vào và biến đầu ra

- Biến đầu vào: Biến đầu vào (các biến độc lập hay tham số) là những yếu

tố ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng Trong thiết kế nghiên cứu ày chúng tôi xác định các đầu vào là: nhiệt độ phản ứng (X1 – o

C), tỷ lệ mol DMA: CYA (X2 – mol), tỷ lệ mol KOH: CYA (X3 - mol), lượng dung môi 1,4- dioxan (X4- ml)

- Biến đầu ra: Biến đầu ra (biến phụ thuộc hay hàm số) là yếu tố phản ảnh hiệu suất phản ứng tổng hợp (Y%)

b Bước 2: Lựa chọn các giá trị của biến đầu vào

Từ các khảo sát trước đó về khoảng ảnh hưởng của các biến độc lập, lựa chọn

vùng giá trị của các biến đầu vào với mức khảo sát như trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Kí hiệu và mức của các biến đầu vào

Biến đầu vào Kí hiệu

Các mức Mức dưới -1

Mức cơ sở

0

Mức trên +1

c Bước 3: Tiến hành thí nghiệm

Thực hiện các thí nghiệm theo thiết kế của mô hình tối ưu mà phần mềm đưa ra

d Bước 4: Xác định giá trị biến đầu ra của thực nghiệm

Xác định giá trị biến đầu ra của các thí nghiệm theo thiết kế là hiệu suất phản ứng (Y)

e Bước 5: Phân tích ảnh hưởng của các biến đầu ra

Sau khi có số liệu thực nghiệm của biến đầu ra Sử dụng phần mềm Modde để phân tích, đánh giá ảnh hưởng của các biến đầu vào và các biến đầu

ra Từ đó đưa ra phương trình quan tuyến tính bậc 2 giữa các yếu tố đầu ra (biến phụ thuộc - hàm số) và biến đầu vào (biến độc lập – tham số) theo dạng phương trình như sau :

Y= bo + b1X1+ b2X2+ b3X3+ b4X4 + b11(X1)2+ b22(X2)2+ b44(X4)2 + b33(X3)2 +

b1,2X1X2+ b1,3X1X3 + b1,4X1X4+ b2,3X2X3 + b2,4X2X4 + b3,4X3X4

f Bước 6: Lựa chọn điều kiện tối ưu

Nghiên cứu này có mục đích là lựa chọn được điều kiện tối ưu để hiệu suất phản ứng đạt cao nhất Vì vậy, phần mềm Mode sẽ đưa ra các điều kiện tối

ưu của biến đầu vào đồng thời dự đoán kết quả biến đầu ra (hiệu suất phản ứng)

g Bước 7: Kiểm chứng các điều kiện tối ưu

Sau khi phần mềm đã lựa chọn được các điều kiện tối ưu, tiến hành làm lại các thí nghiệm tổng hợp, tính hiệu suất của phản ứng để kiểm chứng So sánh kết quả với dự đoán ban đầu của phần mềm tối ưu

2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học và kiểm nghiệm sản phẩm tổng hợp được theo USP 38

 Kiểm tra độ tinh khiết: Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của Altretamin

tổng hợp được bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy và phương pháp SKLM

so với chất chuẩn Định tính Altretamin bằng phương pháp HPLC (USP 38)

 Xác định cấu trúc của Altretamin tổng hợp được: Dựa trên kết quả

phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H – NMR và 13C – NMR) so sánh với các số liệu đã công bố [9], [22],

[29]

 Kiểm nghiệm sản phẩm theo phương pháp dược điển Mỹ USP 38

a Tính chất: Kiểm tra bằng cảm quan Lấy một lượng bột trải đều lên trên

một tờ giấy trắng, dàn thành lớp mỏng Quan sát bằng mắt dưới ánh sáng thường

Yêu cầu: Màu của ống thử phải nhạt hơn màu của ống chứng

ro sulfat: Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 37 (phụ lục 281)

e Nước: Định lượng nước bằng thuốc thử Karl Fischer (USP 38)

Nguyên tắc: Phương pháp định lượng nước dựa trên phản ứng toàn lượng của nước với lưu huỳnh dioxyd và iod trong dung môi khan chứa một chất base hữu

cơ thích hợp Tiến hành theo chỉ dẫn của USP 38 (phụ lục 921, phương pháp 1)

f Định lượng:

Hoá chất thuốc thử theo USP 38

Điều kiện sắc ký: Cột: Rp 18 (10 m, 150 x 4,6 mm ) Tốc độ dòng: 2ml/ phút

Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 25 mg altretamin, cho vào bình định mức 50ml Hoà tan trong 35 ml methanol, pha loãng với nước đến vừa đủ thể tích, lắc đều Hút 5,0 ml dung dịch này vào bình định mức 50 ml, pha loãng với dung môi đến vừa đủ thể tích, lắc đều

Kiểm tra khả năng thích hợp của hệ thống sắc ký theo sắc ký đồ của chất chuẩn, ghi lại pick đáp ứng theo hướng dẫn cho quy trình: Hệ số đối xứng của pick không được lớn hơn 1,5 và độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pick phải nhỏ hơn 2,0%

Kết quả: Hàm lượng altretamin trong chế phẩm, tính theo chế phẩm khan được tính theo công thức:

X (%) =

St x Cc x CA

x 100%

Sc x Ct

St: Diện tích pic altretamin trên sắc đồ dung dịch (mAU x s)

Sc: Diện tích pic altretamin trên sắc đồ dung dịch chuẩn (mAU x s)

CA: Là hàm lượng chất chuẩn USP Altretamin RS (mg/ml)

Cc: Là nồng độ dung dịch chuẩn (mg/ml)

Ct: Là nồng độ của dung dịch thử (mg/ml)

2.3.3 Phương pháp tính hiệu suất quá trình phản ứng

Altretamin được tổng hợp theo phương trình phản ứng sau:

MCYA = 184,5 đvc, MDMA= 45 đvc và MAltretamin = 210 đvc

Từ phản ứng trên, hiệu suất của phản ứng tổng hợp Altretamin tính theo công thức sau:

H(%) =

Khối lượng sản phẩm thu được thực tế (g)

x 100%

Khối lượng sản phẩm thu được lý thuyết (g)

Khối lượng sản phẩm tính theo lý thuyết = nA x MAltretamin (g)

Trong đó: nA: số mol altretamin thu được theo lý thuyết

MAltretamin : là khối lượng phân tử của Altretamin (210 đvc)

2.4 Phương pháp xử lý kết quả nghiên cứu

Các số liệu thống kê được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2007 [14], [17]