Chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (reverse hybridization)

Phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh.. Đột biến này phá vỡ các vùng không mã hóa làm phân tử ARN thông tin tạo t

Lời đầu tiên, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Quản lý đào tạo sau Đại học, các Thầy giáo, Cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo, các bạn đồng nghiệp Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện phụ sản Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và quá trình thu thập số liệu

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hoàng Thị Ngọc Lan và TS Lương Thị Lan Anh, những người thầy đã tận tình, trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành khóa học

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Lê Phương Thảo

Tôi xin cam đoan đề tài: “Chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng

kỹ thuật lai phân tử (Reverse hybridization)” là đề tài do tôi thực hiện, tất cả các số liệu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa từng được công

bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác Nếu sai, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày 16 tháng 11 năm 2015

Tác giả luận văn

Lê Phương Thảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC SƠ ĐỒ, HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Bệnh Thalassemia 4

1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2.1 Đối tượng nghiên cứu 36

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 37

2.4 Cách thức tiến hành nghiên cứu 39

2.5 Hạn chế sai số trong nghiên cứu 47

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 47

2.7 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 47

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 48

3.2 Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng phương pháp Reverse hybridization 49

3.3 Đánh giá giá trị của phương pháp 56

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 65

4.1 Đặc điểm của đối tượng tham gia chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 65

4.2 Phát hiện đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization và tỷ lệ các loại đột biến 70

4.3 Đánh giá giá trị kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia 76

KẾT LUẬN 82

KIẾN NGHỊ 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DNA Deoxyribo Nucleotid Acid PCR Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng khuếch đại chuỗi) SEA South East Asia

THAI Thailand FIL Filipino MED Mediterranean

Hb Hemoglobin

(Huyết sắc tố)

Α alpha

Β beta HBA Hemoglobin alpha HBB Hemoglobin beta ARMS-PCR Amplification Refractory Mutation

System Polymera Chain Reaction MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe

Amplification NOR Normal (Bình thường) HET Heterozygous (Dị hợp tử) HOM Homozygous (Đồng hợp tử) ĐCTN Đình chỉ thai nghén

MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Lượng hemoglobin trung bình hồng cầu

Bảng 1.1 Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình

thường 5

Bảng 1.2 Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường 11

Bảng 1.3 Kiểu gen và các thể bệnh -thalassemia 13

Bảng 1.4 Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam 18 Bảng 1.5 Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gap-PCR 23

Bảng 1.6 Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu 26

Bảng 1.7 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin StripAssaySEA 30

Bảng 1.8 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay 31

Bảng 2.1 Các chỉ số nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Chỉ dẫn cách đánh giá đột biến trên Teststrip 44

Bảng 2.3 Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen α globin 46

Bảng 2.4 Các bước sàng lọc đột biến trên vùng gen β globin 46

Bảng 3.1 Đặc điểm về dân tộc của thai phụ 48

Bảng 3.2 Tuổi thai ở thời điểm chọc hút dịch ối của đối tượng nghiên cứu 48

Bảng 3.3 Tiền sử đẻ con Thalassemia 48

Bảng 3.4 Tiền sử phù thai 49

Bảng 3.5 Tỷ lệ phát hiện đột biến 49

Bảng 3.6 Phân bố loại đột biến 50

Bảng 3.7 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh α -thalassemia 51

Bảng 3.8 Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β-thalassemia 52

Bảng 3.9 Kiểu gen các thai được chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia 53

Bảng 3.11 Kết quả chẩn đoán trước sinh cho 11 gia đình có con đầu mắc

HbH hoặc β-thalassemia thể nặng 54

Bảng 3.12 Đối chiếu kết quả về phân bố kiểu gen của thai từ 2 phương

pháp ARMS-PCR/gap-PCR và Reverse hybridization 56

Bảng 3.13 Đối chiếu về kết quả xác định các dạng đột biến cụ thể 56 Bảng 3.14 So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc α-

thalassemia) 58

Bảng 3.15 So sánh với đặc điểm lâm sàng (các trường hợp sàng lọc

β-thalassemia) 59

Bảng 4.1 So sánh đặc diểm của 2 phương pháp ARMS-PCR/gap-PCR

và Reverse hybridization trong chẩn đoán Thalassemia 79

Biểu đồ 3.1 Các loại đột biến gây bệnh α-thalassemia 50 Biểu đồ 3.2 Các loại đột biến gây bệnh β-thalassemia 51

Hình 1.1 Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb 5

Hình 1.2 Vị trí gen α globin trên NST 16 6

Hình 1.3 Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α 7

Hình 1.4 Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α 9

Hình 1.5 Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin 10

Hình 1.6 Vị trí gen β globin trên NST 11 14

Hình 1.7 Năm đột biến xẩy ra (đóng khung) ở vị trí đầu của intron thứ nhất của gen  globin 17

Hình 1.8 Chẩn đoán đột biến mất đoạn α+-thalassemia bằng multiplex gap-PCR 24

Hình 1.9 Chẩn đoán đột biến mất đoạn α0-thalassemia bằng multiplex gap-PCR 24

Hình 1.10 Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR 25

Hình 1.11 Các vị trí đột biến trên Teststrip của β-Globin StripAssay SEA 32 Hình 1.12 Các vị trí đột biến trên Teststrip của α-Globin StripAssay 33

Hình 2.1 Quy trình nghiên cứu 39

Hình 2.2 Cách xác định đột biến trên Teststrip 45

Hình 3.1 Đồng hợp tử đột biến SEA 60

Hình 3.2 Dị hợp tử đột biến SEA 61

Hình 3.3 Không phát hiện đột biến gen 62

Hình 3.4 Dị hợp tử đột biến CD17 63

Hình 3.5 Dị hợp tử đột biến kép CD41/42 / HbE 64

Hình 4.1 Sơ đồ sàng lọc trước sinh bệnh Thalassemia 68

Hình 4.2 Sơ đồ xác định loại Thalassemia bằng xét nghiệm huyết học và sinh hóa 69

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thalassemia là một dạng bệnh của huyết sắc tố - hemoglobin (HST - Hb) phổ biến trên thế giới Bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, nguyên nhân là do đột biến gen gây giảm hoặc không tổng hợp protein globin tham gia cấu tạo Hb, dẫn đến thiếu hụt Hb trong hồng cầu Trên thế giới, ước tính 7% dân số mang gen bệnh và mỗi năm có khoảng 300.000 ÷ 500.000 trẻ được sinh ra với thể đồng hợp tử nặng của bệnh này [1] Tại Việt Nam, có khoảng hơn 5 triệu người mang gen và bị bệnh Thalassemia, hàng năm có thêm 100.000 trẻ mang gen bệnh và 1.700 trẻ mắc bệnh nặng do đột biến cả 2 gen được sinh ra [2]

Bệnh được chia làm 2 loại chính là alpha thalassemia (α-thalassemia)

và beta thalassemia (β-thalassemia) tùy thuộc vào loại đột biến xảy ra ở gen α (quy định tổng hợp chuỗi alpha globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 16) hay gen

β (quy định tổng hợp chuỗi beta globin, nằm trên nhiễm sắc thể số 11) Theo thống kê, có trên 300 đột biến gen α và trên 200 đột biến gen β có liên quan đến bệnh Thalasemia [3], [4] Cá thể đồng hợp tử mang 2 alen đột biến α-thalassemia loại SEA/ SEA gây bệnh Hb Bart’s, đây là thể nặng nhất của bệnh α-thalassemia Thai nhi mắc Hb Bart’s thường bị phù rau thai, thai chết lưu trong tử cung hoặc chết sớm sau sinh Thể này đặc biệt phổ biến ở các nước Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines [5] Bệnh nhân β-thalassemia thể nặng hay còn gọi là thể Cooley, đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép 2 đột biến khác nhau, thường có biểu hiện thiếu máu nặng dần sau 3 ÷ 6 tháng tuổi, phụ thuộc vào truyền máu và thải sắt suốt đời [5] Người bệnh Thalassemia thể ẩn là người có kiểu gen dị hợp tử mang 1 alen đột biến, có thiếu máu nhược sắc trên huyết đồ nhưng lại không có biểu hiện trên lâm sàng Phương pháp điều trị chủ yếu hiện nay đối với bệnh Thalassemia vẫn là truyền máu, thải sắt, cắt lách và điều trị các biến chứng khi cần [6], [7], [8]

Quá trình này rất tốn kém mà hiệu quả không cao Vì thế, bệnh trở thành gánh nặng không chỉ cho bệnh nhân và gia đình mà cho toàn xã hội [9] Đối với các trường hợp gia đình có bố mẹ là người mang gen bệnh hoặc tiền sử sinh con Thalassemia thì biện pháp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia

có ý nghĩa quan trọng và là phương pháp phòng ngừa hiệu quả nhất [10]

Ở Việt Nam, để chẩn đoán bệnh Thalassemia chúng ta đang sử dụng phương pháp multiplex PCR (PCR đa mồi) để sàng lọc các đột biến: 5 đột biến mất đoạn lớn của gen α globin như: SEA (South East Asia), THAI(Thailand), FIL (Philippin), -α4.2, -α3.7 và các đột biến điểm HbQs, HbCs và 8 đột biến phổ biến của gen β globin gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia bao gồm: CD17 (AAG>TAG), CD41/42 (-TCTT), -28 (A>G), CD71/72 (+A), IVS 1.1 (G>T), IVS 1.5 (G>C), IVS 2.654 (C>T) và CD26 (GAG>AAG) [11], xác định kiểu gen bằng kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain Reaction) và giải trình tự vùng gen globin Các phương pháp này dễ dàng áp dụng cho việc phát hiện các đột biến đơn lẻ đã biết, nhưng lại không có khả năng xác định cùng lúc nhiều đột biến Hiện nay, kỹ thuật lai phân tử là một trong những kỹ thuật được dùng để chẩn đoán thay thế các phương pháp trên Kỹ thuật Reverse hybridization (lai phân tử ngược) được cải tiến trên cơ sở của kỹ thuật lai phân tử có thể phát hiện cùng lúc được nhiều đột biến khác nhau trên cùng một gen Kỹ thuật Reverse hybridization đã được ứng dụng hiệu quả trong xác định đồng nhiễm genotype virus sinh u nhú ở người (HPV) Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này chưa được áp dụng trong chẩn đoán bệnh Thalassemia Đây là một quy trình mới, có nhiều ưu điểm so với các phương pháp hiện đang được áp dụng,

vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Chẩn đoán trước sinh bệnh

Thalassemia bằng kỹ thuật lai phân tử ngược (Reverse hybridization)”, với

mục tiêu:

1 Phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia bằng kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh

2 Đánh giá giá trị của kỹ thuật Reverse hybridization trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN

1.1 Bệnh Thalassemia

1.1.1 Cấu tạo của Hemoglobin (Hb) và các gen tổng hợp chuỗi globin

Phân tử Hb cấu tạo bởi 4 chuỗi globin và 4 phân tử Hem, mỗi chuỗi globin gắn với một phân tử Hem Tùy theo các giai đoạn phát triển cá thể mà globin gồm các chuỗi polypeptid khác nhau Các chuỗi polypeptid đều có cấu trúc từ các acid amin và được sắp xếp theo một thứ tự chặt chẽ Ngoài ra cấu trúc không gian của các chuỗi polypeptid này cũng rất quan trọng trong vai trò đảm bảo chức năng vận chuyển khí của phân tử Hb [12]

Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptid ra các loại: Zeta (ζ), epsilon (), gamma (), alpha (), beta (), delta () [13] Các gen chi phối sự hình thành chuỗi , , ,  nằm trên nhiễm sắc thể (NST)

số 11; các gen chi phối sự hình thành chuỗi ζ,  nằm trên NST số 16 Trong giai đoạn phôi, Hb chủ yếu là Hb Gower I (ζ2ε2), Hb Gower II (22) và Hb Portland (ζ22) Trong giai đoạn thai, loại Hb chủ yếu là HbF (22) Trong giai đoạn trưởng thành, loại Hb chủ yếu là HbA1 (22) và một ít HbA2

(22) Người trưởng thành có 97,5% HbA1, khoảng 2% HbA2 và khoảng 0,5% HbF

Bảng 1.1 Thành phần globin và thời kỳ xuất hiện của các Hb bình thường

Loại Hb Thành phần

Hb A1 α2 β2 Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường

Hb A2 α2 δ2 Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường

Hb F α2 γ2 Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi

Hb Gower 1 ζ2 ε2 Phôi thai 2 ÷ 3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai

Hb Gower 2 α2 ε2 Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1

Hb Portland ζ2 γ2 Phôi thai 2 ÷ 3 tuần đầu

Số lượng acid amin trong chuỗi polypeptid đặc trưng cho từng loại chuỗi, ví dụ: chuỗi α có 141 acid amin, chuỗi β gồm 146 acid amin Trình tự các acid amin trong chuỗi rất nghiêm ngặt, sự thay thế của acid amin này bằng acid amin khác trong nhiều trường hợp thể hiện thành những bệnh của

Hb [14]

Hình 1.1 Sự phân bố của các gen globin trên NST và các sản phẩm Hb

Ở người bình thường, số lượng chuỗi  globin và chuỗi  globin được sản xuất cân bằng để tham gia cấu tạo phức hợp 22, tế bào máu của người bình thường có thể tích tế bào khoảng 100 m3

Thalassemia là một dạng bệnh của Hb, trong đó chuỗi  globin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh α-thalassemia, chuỗi  globin giảm hoặc không được tạo thành gọi là bệnh β-thalassemia [14]

1.1.2 Bệnh α-thalassemia

α-thalassemia là bệnh di truyền alen lặn NST thường do đột biến gen α globin nằm trên nhánh ngắn NST số 16 (16p13.3), gây giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin

Hình 1.2 Vị trí gen α globin trên NST 16

(Nguồn: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBA1 [15] )

Cụm gen α globin ở người dài khoảng 70kb, chứa 2 gen α globin: α1 (chiều dài 840bp, chứa 3 exon và 2 intron), và α2 (chiều dài 830bp, chứa 3 exon và 2 intron) Ngoài ra nó còn chứa một gen ζ2 phôi thai; 3 gen giả gồm pseudo zeta1 (ψζ1), pseudo α1 (ψα1), pseudo α2 (ψα2) và một gen theta1 (θ) Gen ζ2 hoạt động tổng hợp chuỗi ζ trong suốt giai đoạn phôi thai, gen α1 và α2 chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi α globin, các gen còn lại không có chức năng Các gen chức năng sắp xếp theo trật tự 5’- ζ2 - α2 - α1 - 3’, được bao quanh bởi các gen có biểu hiện mạnh như MPG, NPRL3 và Luc7L, được điều

tiết chủ yếu bởi vùng không mã hóa có tính bảo thủ cao (multispecies conserved sequences, MSCR2) hay còn gọi là vùng HS-40 [16]

Hình 1.3 Sự sắp xếp các gen chức năng trên cụm gen α

(Nguồn: Douglas R Higg, 2013 [16] )

Gen α1 và α2 đều mã hóa các chuỗi α globin gồm 141 acid amin nhưng

do trình tự khởi động (promoter) của 2 gen khác nhau nên khả năng biểu hiện của gen α2 mạnh hơn gen α1 từ 2 đến 3 lần Vì vậy các đột biến xảy ra ở gen α2 thường có hậu quả nặng nề hơn những đột biến ở gen α1 [16], [17]

α-thalassemia là một trong những bệnh Hb phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới [18] Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu, chiếm tới 60 ÷ 90% các nguyên nhân gây phù thai ở các nước Đông Nam Á [19] Trong đó,

tỷ lệ người mang gen đột biến mất đoạn dạng SEA ở Đông Nam Á là cao nhất, ở Bắc Thái Lan là 14%, Nam Trung Quốc là 5,0 ÷ 8,8%, Hồng Kông là 4,5%, Trung tâm Thái Lan là 3,7%, Bắc Đài Loan là 3,5% [18]

1.1.2.1 Cơ chế sinh bệnh

Bệnh α-thalassemia là bệnh Hb do thiếu hụt hoặc thiếu hoàn toàn chuỗi

 trong phân tử Hb [14] Đột biến gây bệnh α-thalassemia chủ yếu là các đột biến mất đoạn, đột biến không mất đoạn ít gặp hơn Cơ chế sinh bệnh cũng khác nhau với từng loại đột biến

Đến nay, hơn 300 loại đột biến trên vùng gen α globin đã được phát hiện, bao gồm các đột biến mất đoạn lớn - mất đoạn cả 2 gen (mất 1 phần hoặc toàn bộ cả 2 gen α), đột biến mất đoạn nhỏ - mất đoạn 1 gen (mất 1 phần hoặc toàn bộ gen α1 hoặc gen α2) và đột biến điểm [4]

- Đột biến mất đoạn gen thalassemia: là nguyên nhân chủ yếu gây

α-thalassemia (~ 90%), bao gồm mất đoạn từ 1 đến 2 gen α globin

+ Đột biến dẫn đến α + -thalassemia

Là đột biến mất đoạn ở 1 gen α gây giảm tổng hợp chuỗi α globin Phổ biến là các mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trong gen α Cơ chế tạo ra các mất đoạn này là do sự tái tổ hợp giữa các vùng tương đồng trên gen α Các gen mã hóa chuỗi α nằm trong 2 vùng tương đồng cao, các vùng đó được chia thành các vùng: X, Y và Z, tách biệt nhau bởi các đoạn chèn nhỏ Trong quá trình phân bào của dòng tế bào mầm, sự trao đổi chéo không cân bằng sẽ làm cho 1 NST bị mất 1 gen α và 1 NST có 3 gen α Trao đổi chéo xảy ra ở vùng Z, tạo ra 1 NST mất 1 đoạn gen dài 3.7kb và 1 NST có 3 gen α (αααanti3.7) Tương tự, nếu trao đổi chéo xảy ra ở vùng X sẽ tạo nên 1 NST mất 1 đoạn gen dài 4.2kb và 1 NST có 3 gen α (αααanti4.2) Tần suất xuất hiện NST có 1 gen α và 3 gen α trong tinh trùng là từ 1 ÷ 5 x 10-5 Các mất đoạn và lặp đoạn cũng có thể xảy ra trong các tế bào sinh dưỡng bởi các cơ chế liên quan [16]

Hình 1.4 Cơ chế hình thành mất đoạn 3.7kb và 4.2kb trên gen α

(Nguồn: Douglas R Higgs, 2013 [16])

Bên cạnh các mất đoạn 1 gen phổ biến là 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) thì các mất đoạn toàn bộ 1 gen α (α1 hoặc α2) cũng đã được quan sát Các mất đoạn này được hình thành do sự tái tổ hợp giữa các vùng không tương đồng trong cụm gen α Mặc dù bị mất hẳn 1 gen α nhưng ảnh hưởng của loại đột biến này đến hoạt động biểu hiện của gen α còn lại cũng tương tự như -α3.7 và -α4.2, điều này đã được khẳng định trong một số nghiên cứu theo dõi các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các cá thể mất 1 phần gen α và các cá thể mất toàn bộ 1 gen α [20]

+ Đột biến mất đoạn dẫn đến α 0 -thalassemia

Hiện nay đã xác định được khoảng 50 loại mất đoạn 2 gen bao gồm mất

1 phần gen trên cả 2 gen α, mất hoàn toàn 2 gen α làm vắng mặt hoàn toàn quá trình tổng hợp gen α Cơ chế hình thành các mất đoạn này được cho là do các tổ hợp sai lệch, các chuyển đoạn tương hỗ và quá trình cắt ngắn NST số

16 Phổ biến là các đột biến vùng Địa Trung Hải (Mediterranean, MED), đột

biến vùng Đông Nam Á (Southeast Asia, SEA), đột biến người Philippin

( FIL) Các đột biến mất đoạn khác như: -α5.2, -(α)20.5, mất đoạn 100 ÷ 200 kb lấy

đi toàn bộ cụm gen α globin cùng các gen khác (gen quy định 1 enzym sửa chữa DNA và ức chế sự phân tách GDP từ Rho - Rho GDP, gen mã hóa protein disulfide isomerase - PDI-R, và vùng điều hòa gen - promotor), mất gen α1, gen θ, vùng trình tự xuôi chiều tính từ tâm động từ cụm gen α, mất vùng điều tiết gen MCS-R nhưng còn lại 2 gen α, dù hiếm gặp hơn nhưng đều dẫn đến α0-thalassemia Đồng hợp tử các nhiễm sắc thể có đột biến α0-thalassemia sẽ gây hội chứng phù thai do Hb Bart’s Dị hợp tử đột biến α0-thalassemia và α+-thalassemia sẽ gây bệnh HbH [16], [17]

Hình 1.5 Một số đột biến mất đoạn trên gen α globin

(Nguồn: David H K Chui, 1998[21])

- Đột biến không mất đoạn trong α-thalassemia

Bao gồm chủ yếu là các đột biến điểm trong vùng HS-40 và trong gen α1 hoặc gen α2 Hiện nay người ta đã xác định được 69 đột biến điểm liên quan đến biểu hiện của gen α, ký hiệu αNDα hoặc ααND (ND: nondeletion, αND: đột biến điểm trên gen α)

Điển hình trong nhóm đột biến điểm là đột biến T thành C ở bộ ba kết thúc dịch mã Đây là đột biến điểm phổ biến nhất ở Đông Nam Á (~ 4%) Đột biến làm bộ 3 kết thúc dịch mã từ TAA chuyển thành codon CAA mã hóa cho acid amin Glutamine vì vậy ribosom tiếp tục dịch mã đến khi nó chạm vào mã kết thúc tiếp theo trong khung dọc mới dừng lại, kết quả là 1 chuỗi α globin bị kéo dài thêm 31 acid amin so với phân tử protein 141 acid amin ban đầu, tạo nên Hb Constant Spring (HbCs) Đột biến này phá vỡ các vùng không

mã hóa làm phân tử ARN thông tin tạo thành không ổn định nên mức độ biểu hiện yếu, chỉ khoảng 3% so với chuỗi α2 bình thường, vì vậy trong một số trường hợp không thể phát hiện được bằng điện di phân tích các thành phần Hb [16], [20]

Ngoài ra còn có các mất đoạn trong khung dọc (in-frame deletions), đột biến dịch khung dọc (frame-shift mutations), đột biến vô nghĩa (nonsenses mutations) dẫn tới sản xuất ra các protein bất thường (như mô tả ở bảng 1.2)

Bảng 1.2 Một số đột biến không mất đoạn tạo các Hb bất thường [16], [20]

Vị trí đột biến Biến đổi protein Huyết sắc tố

T > G (codon 32) Methionin > Arginin Hb Rotterdam

T > C (codon 125) Leucin > Prolin Hb Quong Sze

G > A (codon 32) Methionin > Isoleucin Hb Amsterdam

G > C (codon 59) Glycin > Arginin Hb Aadana

1.1.2.2 Quy luật di truyền và cơ chế di truyền

Quy luật di truyền: theo quy luật alen lặn trên NST thường

Cơ chế di truyền: bệnh có thể do gen bệnh truyền từ bố, mẹ cho con hoặc do đột biến mới phát sinh qua quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ đi vào thế hệ con, sự biểu hiện bệnh ở thế hệ con còn tuỳ thuộc vào kiểu gen

Tùy mức độ đột biến của gen mà có các thể bệnh khác nhau

1.1.2.3 Phân loại các thể bệnh theo kiểu gen

Như đã biết có hai gen chi phối tổng hợp  globin Như vậy cặp NST

số 16 có 4 alen chi phối tổng hợp  globin

- Trong 4 alen có 1 alen không hoạt động, kiểu gen của người thuộc thể bệnh này là: /- (HBA1HBA2/HBA-) hoặc -/ (HBA-/HBA1HBA2), người mang kiểu gen này thường không biểu hiện triệu chứng (silent carrier) Thể bệnh này còn gọi là -thalassemia 2

- Trong 4 alen có 2 alen không hoạt động, loại này còn gọi là thalassemia thể nhẹ hoặc -thalassemia 1 Người bệnh -thalassemia thể nhẹ trong máu hồng cầu thể tích giảm, nhưng không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Người thuộc thể bệnh này có 2 kiểu gen là:

-+ / (HBA1HBA2/ ): cả hai gen  globin trên cùng một NST bị đột biến, hai gen trên NST kia vẫn bình thường Loại này chủ yếu gặp ở Đông Nam Á

+ -/- (HBA-/HBA-): trong hai NST, mỗi NST có một alen bị đột biến, alen kia hoạt động bình thường Thể bệnh này thường gặp ở những người da đen, cá thể mang kiểu gen này do nhận được hai NST mang kiểu gen

- từ hai người bệnh -thalassemia 2

- Người bệnh mang kiểu gen -/ (HBA-/ ): có 3 trong 4 alen 

globin trên hai NST không hoạt động, chỉ có 1 alen  globin hoạt động Người bệnh mang kiểu gen này thường là con của cặp bố mẹ, mà một trong hai bố mẹ mang thể bệnh -thalassemia 2, còn người kia mang thể bệnh -thalassemia 1 Người bệnh này có mức độ thiếu máu vừa phải hoặc nặng,

trong máu có HbH (4), hồng cầu thể tích trung bình thấp khoảng 50m3(bình thường là 100m3), thể hiện bệnh ngay lúc mới sinh

- Người bệnh không có gen  nào hoạt động, kiểu gen là ( / ), đây là thể bệnh nặng nhất, kiểu gen này là hậu quả giao phối của hai cá thể -thalassemia 1 có kiểu gen là / (HBA1HBA2/ ) hoặc cá thể có kiểu gen -/ (HBA-/ ) với cá thể có kiểu gen / (HBA1HBA2/ ) -thalassemia thuộc thể bệnh này trong máu xuất hiện Hb Bart’s (4) Hb Bart’s không có khả năng vận chuyển oxy gây phù bào thai dẫn đến thai chết ngay trong giai đoạn bào thai hoặc khi mới sinh

α α

HBA1HBA2/ HBA1HBA2

Người mang gen -thalassemia:

Bệnh HbH (4): thiếu máu tan máu

1.1.3 Bệnh β-thalassemia

Bệnh β-thalassemia là bệnh do đột biến gen HBB (Hemoglobin beta - gen β globin) nằm trên nhánh ngắn NST số 11 (11p15.5) Gen HBB dài 1600bp, gồm 3 exon và 2 intron β-thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố khắp thế giới [22] Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nguyên nhân thiếu máu ở trẻ em Việt Nam, Nguyễn Công Khanh

và cộng sự đã cho thấy bệnh β-thalassemia chiếm 49% các trường hợp thiếu máu tan máu nặng và đứng hàng đầu trong các nguyên nhân gây thiếu máu do tan máu ở trẻ em [23] Bệnh β-thalassemia phổ biến ở các dân tộc ít người khu vực miền núi và trung du phía bắc Tỷ lệ người mang gen phân bố trong

cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc Đặc biệt, tỷ lệ mang gen bệnh rất cao ở các dân tộc ít người như: Mường (25%), Thái (16,6%), Nùng, Sán dìu (14,3%), Pako (8,33%) [24], [25]

Hình 1.6 Vị trí gen β globin trên NST 11

(nguồn: http://ghr.nlm.nih.gov/gene/HBB [27])

Trẻ mắc β-thalassemia thể nặng gây hậu quả nghiêm trọng đến sự phát triển cá thể và ảnh hưởng đến tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng [26] Đặc biệt việc điều trị rất khó khăn và tốn kém, ít hiệu quả, thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống Vì vậy, việc phòng bệnh được đặt

ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan tràn của bệnh di truyền này Tập

quán kết hôn cùng huyết thống là nguyên nhân chính lan truyền nguồn gen bệnh và làm tăng tỷ lệ mắc bệnh gây ảnh hưởng đến nòi giống tộc người Nên việc phát hiện sớm người mang gen bệnh để tư vấn di truyền trước hôn nhân

là giải pháp quan trọng nhất trong việc phòng bệnh, từ đó làm giảm tỷ lệ mắc bệnh β-thalassemia ở trẻ em

Đột biến gen dẫn đến không tổng hợp, hoặc giảm tổng hợp chuỗi 

globin, thay vào đó là sự tăng tổng hợp các chuỗi  và các chuỗi  để tạo thành HbF (22), loại bệnh này còn tăng cường tổng hợp các chuỗi  để tạo thành HbA2 (22),, vì vậy người bệnh có HbF và HbA2 nhiều hơn người bình thường

Locus gen  globin nằm trên NST số 11, nếu cả hai gen  globin đều bị đột biến mất chức năng hoàn toàn, không sản xuất được  globin, khi đó gọi

là 0-thalassemia Nếu một hoặc hai gen  globin bị đột biến nhưng vẫn sản xuất một số lượng nhỏ  globin, khi đó gọi là +-thalassemia

1.1.3.2 Quy luật di truyền

Bệnh di truyền theo quy luật alen lặn trên NST thường

1.1.3.3 Một số dạng đột biến trên gen  globin

Hiện nay đã phát hiện trên 200 loại đột biến trên gen  globin [11], xếp vào 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số lượng chuỗi β globin làm mất chức năng của gen β gây β0-thalassemia, và nhóm làm giảm số lượng chuỗi β globin gây β+-thalassemia Các đột biến này mang tính đặc trưng và phân bố với tỷ lệ khác nhau ở từng dân tộc

Sau đây là cơ chế một số dạng đột biến thường gặp:

- Đột biến điểm tại vùng promoter: do thay thế nucleotid tại vị trí hộp TATA

hoặc CACCC dẫn đến giảm tổng hợp chuỗi  globin chỉ còn 10% so với bình thường

- Những đột biến vô nghĩa (nonsense mutations): sự thay thế một nucleotid

trong exon có thể dẫn đến sự tạo thành một trong ba mã kết thúc (UAA, UAG hoặc UGA) làm cho việc dịch mã kết thúc sớm hơn so với bình thường và tạo sản phẩm  globin không vững bền bị phá hủy ngay trong tế bào Dạng đồng hợp tử những đột biến này gọi là 0-thalassemia

- Đột biến tại những dấu hiệu nối (splicing signals): quá trình cắt những

intron và nối các exon của gen  globin đòi hỏi các vị trí cho nối GT tại đầu 5’ của intron và vị trí nhận nối AG tại đầu 3’ của intron bình thường là đòi hỏi cần thiết cho việc nối exon bình thường Những đột biến ở vị trí cho nối GT hoặc vị trí nhận nối AG của intron gây cản trở việc nối exon, do đó không tạo mARN  globin thuần thục và hậu quả không tạo ra sản phẩm  globin gọi là

0-thalassemia

Hình 1.7 Năm đột biến xẩy ra (đóng khung)

ở vị trí đầu của intron thứ nhất của gen  globin

(Nguồn: Trịnh văn Bảo, 2011 [14] )

Những đột biến tại vị trí 5, 6 của intron dẫn tới giảm khả năng nối RNA (Ribonucleic Acid) chính xác nhưng còn tổng hợp được  globin gọi là +-thalassemia

- Đột biến ở trong các exon: luôn tạo ra các bản sao mRNA (Messenger

Ribonucleic Acid) được lắp ghép không chính xác và dẫn tới +-thalassemia

- Đột biến tại vị trí gắn đuôi poly A: vị trí AATAAA tại vùng không dịch mã

là vị trí gắn poly Adenin cần thiết cho mARN di chuyển từ nhân ra tế bào chất tham gia vào quá trình dịch mã tạo sản phẩm protein Các đột biến điểm xẩy

ra tại vị trí AATAAA sẽ gây giảm tổng hợp  globin gây +-thalassemia

- Những đột biến khung xẩy ra ở các exon: do thêm vào hoặc mất đi một

hoặc vài nucleotid, hoặc một đoạn có dẫn đến thay đổi khung đọc mã di truyền làm thay đổi sản phẩm  globin, ví dụ: thêm AG vào trước mã 145 của

gen  globin tạo nên Hb Cranston có 157 acid amin dài hơn chuỗi  globin bình thường 11 acid amin

Bảng 1.4 Các đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở người Việt Nam [11]

1.1.3.4 Phân loại bệnh -thalassemia theo thể bệnh

- -thalassemia thể nhẹ (thalassemia minor): người bệnh có kiểu gen dị hợp,

một gen bình thường và một gen bị đột biến + hoặc 0, tuy nhiên ở người bệnh gen  globin bình thường vẫn sản xuất một số lượng lớn  globin, do vậy người bệnh không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng, cơ thể phát triển bình thường không có biến dạng xương, thiếu máu thường rất nhẹ (Hb 90 ÷

110 g/l) Điện di Hb có tăng HbA2

- -thalassemia thể trung gian (thalassemia intermedia): thể bệnh này trong

lâm sàng chỉ những người có triệu chứng thiếu máu, nhưng chưa đòi hỏi phải truyền máu Những người này có bất thường trong cả hai gen  globin, nhưng một hoặc cả hai gen đột biến này là nhẹ, vì vậy vẫn còn sản xuất được 

globin Những người thuộc thể bệnh này có biểu hiện thiếu máu nhẹ, điện di

Hb có tăng HbF và HbA2

- -thalassemia thể nặng (thalassemia major): người bệnh có kiểu gen đồng

hợp, cả hai gen  globin ở trạng thái đột biến Có thể xuất hiện 0-thalassemia

hoặc +-thalassemia tuỳ thuộc vào không còn khả năng hoặc còn khả năng sản xuất một lượng nào đó của chuỗi  globin

Người -thalassemia thể nặng biểu hiện bệnh rất sớm ngay năm đầu tiên của cuộc sống, với triệu chứng thiếu máu nặng (Hb < 60g/l), màng xương trở nên mỏng dẫn đến dễ gẫy xương bệnh lý, hoặc biến dạng xương mặt, xương sọ, gan, lách to vì phải tăng cường sản xuất những tế bào máu Điện di

Hb có chủ yếu HbF

- Thể phối hợp -thalassemia với HbE: còn gọi là dị hợp tử kép thalassemia/HbE, thể bệnh này biểu hiện thiếu máu nặng và các triệu chứng tương tự -thalassemia thể nặng Điện di Hb có chủ yếu HbF và HbE

-1.1.3.5 Điều trị và tiên lượng

Người mang gen β-thalassemia thể nhẹ không cần điều trị đặc hiệu kể

cả khi có thiếu máu nhẹ và vừa β-thalassemia thể trung gian có thể truyền máu khi có thiếu máu nặng, nhưng không thường xuyên Nếu phải truyền máu nhiều lần thì bệnh nhân β-thalassemia thể trung gian cũng có thể có nhiễm sắt

và phải dùng thuốc thải sắt từng đợt β-thalassemia thể nặng thường thiếu máu nặng phải truyền máu thường xuyên Việc truyền máu (khối hồng cầu) phải đảm bảo duy trì nồng độ Hb từ trên 100g/l để cho trẻ được phát triển bình thường Đối với những bệnh nhân có mức độ thiếu máu nặng và tốc độ thiếu máu nhanh thì việc duy trì Hb từ 100g/l đòi hỏi một phác đồ truyền hồng cầu rất tích cực [28]

Một trong những mặt trái của truyền máu thường xuyên là làm cho cơ thể ứ đọng một lượng sắt lớn, làm tổn thương đến các cơ quan như tim, gan, tụy… gây ra những biến chứng nặng nề Trong trường hợp này, thải sắt là biện pháp quan trọng giúp bệnh nhân tránh được các biến chứng đó Có thể

thải sắt bằng đường tiêm dưới da liên tục hoặc tiêm tĩnh mạch (Desferal), hoặc đường uống (Kelfer) Việc thải sắt cần tiến hành đều đặn 2 ÷ 5 ngày mỗi tuần [29], [30]

Ngoài truyền máu và thải sắt, các tác giả còn đề xuất một số biện pháp điều trị hỗ trợ như kích thích sinh tổng hợp HbF (bằng Hydrea và Erythropoetin), dùng các chất chống oxy hóa, chống gốc tự do…

Gần đây phương pháp ghép tủy xương đã được áp dụng để điều trị - thalassemia thể nặng và đã tiến hành thành công ở một số bệnh nhân, tuy nhiên tỷ lệ tử vong của phương pháp ghép tủy xương vẫn còn cao, do đó phương pháp này không được phổ biến rộng rãi Kết quả ghép tủy tốt hơn ở trẻ em dưới 3 tuổi, mới truyền máu ít và không có biến chứng nặng Những bước tiến khác trong điều trị -thalassemia thể nặng, đó là liệu pháp gen, dựa trên nguyên tắc những gen  globin của người bình thường được truyền vào tủy xương của người bệnh -thalassemia thể nặng hoặc phương pháp kích thích để mở gen Hb bào thai theo cơ chế hoạt động đền bù cho những gen khuyết tật ở người trưởng thành [31]

Tiên lượng của bệnh -thalassemia phụ thuộc vào thể bệnh nhẹ hay nặng và việc truyền máu Người bệnh -thalassemia có tuổi thọ giảm, thường

sống dưới 25 tuổi

1.1.3.6 Phòng bệnh

Áp dụng các biện pháp sàng lọc phát hiện bệnh thalassemia, phát hiện người mang gen ở trạng thái dị hợp tử, tư vấn di truyền cho các gia đình có tồn tại gen bệnh, tư vấn di truyền trước hôn nhân để cho các cặp vợ chồng tự lựa chọn hạn chế sinh đẻ hoặc áp dụng chẩn đoán trước sinh với các phương pháp di truyền phân tử dựa trên DNA (Deoxyribonucleic Acid) chiết tách từ

tế bào ối hoặc tế bào tua rau, hoặc những tế bào bào thai lưu hành trong máu

mẹ Sự áp dụng đồng bộ các phương pháp này có thể làm giảm tỷ lệ sinh ra những trẻ bị bệnh Thalassemia

1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia

1.2.1 Một số kỹ thuật di truyền phân tử thường dùng để chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia ở Việt Nam

Bệnh huyết sắc tố (haemoglobinopathies) là một nhóm đa dạng các bệnh di truyền lặn nguyên nhân do các bất thường về cấu trúc hoặc số lượng chuỗi globin của phân tử Hemoglobin (Hb) Đây là một trong những bệnh di truyền đầu tiên được mô tả ở cấp độ phân tử và do đó trở thành nguyên mẫu cho việc phát triển các kỹ thuật xác định đột biến mới Hiện nay trên thế giới

có rất nhiều kỹ thuật khác nhau dựa trên phản ứng PCR được sử dụng nhằm phát hiện các đột biến gen globin, bao gồm: dot blot analysis, reverse dot blot analysis, ARMS (the amplification refractory mutatin system), DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis, gap-PCR, phân tích enzyme endonuclease hạn chế (restriction endonuclease - RE analysis), real-time PCR, Sanger sequencing, Pyrosequencing, MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) và hệ thống phân tích gen [32], [33], [34], [35]

Mỗi kỹ thuật đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng, và việc lựa chọn phương pháp sử dụng ở mỗi phòng xét nghiệm (labo) phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: trình độ chuyên môn và kỹ thuật hiện có của labo chẩn đoán, các dạng đột biến và tỷ lệ đột biến trong quần thể, ngoài ra còn phụ thuộc vào kinh phí hiện có tại mỗi cơ sở

Ở Việt Nam, các phương pháp thường được dùng để xác định đột biến gen globin được trình bày như ở phần dưới đây

1.2.1.1 Kỹ thuật multiplex gap-PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử, nhằm phát hiện và nhân đoạn DNA nhiều lần trong ống nghiệm Phương pháp này được Mullis và cộng sự đề xuất năm 1985 và Saiki thử nghiệm thành công vào năm 1988

Gap-PCR, hay còn gọi là PCR khoảng cách, là kỹ thuật sử dụng hai mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch xuôi và mạch ngược trong vùng DNA chứa đoạn gen bị mất Với các đột biến mất đoạn có kích thước nhỏ hơn 1 kb, cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm, trong đó đoạn nhỏ hơn là sản phẩm từ allen bị mất đoạn Với những đột biến mất đoạn lớn, khoảng cách giữa hai mồi quá lớn để có thể khuyếch đại được allen bình thường, mà chỉ có thể khuyếch đại sản phẩm từ allen mang đột biến mất đoạn Trong trường hợp này allen bình thường sẽ được khuyếch đại thông qua một điểm đứt gãy của đột biến, sử dụng một mồi theo nguyên tắc bổ sung với trình tự bị mất và một mồi khác theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA còn lại Đây là kỹ thuật nhanh, đơn giản, tuy nhiên hạn chế của kỹ thuật này là cần phải biết được điểm đứt gãy mới thiết kế được cặp mồi tương ứng

Multiplex-PCR là phản ứng PCR đa mồi sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi để khuếch đại nhiều đoạn DNA trong cùng một phản ứng PCR Phương pháp này được thử nghiệm thành công vào năm 1988 và được áp dụng vào nhiều công trình nghiên cứu Đối với Thalassemia, người ta thường dùng kỹ thuật Multiplex gap-PCR trong chẩn đoán các mất đoạn α-thalassemia [36], [37], [38], [39], một vài mất đoạn β-thalassemia [40], [41], [42], [43], [44], [45], mất đoạn δβ-thalassemia và HPFH thalassemia [46]

Bảng 1.5 Các đột biến mất đoạn thalassemia được chẩn đoán bằng gap-PCR

MED-(α)20.5 FIL THAI

45 kb deletion

Spanish Sicilian Vietnamese Macedonian/Turkish

HPFH2 (Ghanaian) HPFH3 (Indian) Gap-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh các đột biến mất đoạn gây α0-thalassemia và α+-thalassemia, nhưng đòi hỏi sự ứng dụng cẩn thận đối với chẩn đoán trước sinh Hầu hết các dạng α-thalassemia thường gặp do đột biến mất đoạn đều có thể được chẩn đoán bằng gap-PCR [47] Hiện nay người

ta đã công bố các trình tự mồi (primers) cho chẩn đoán 3 đột biến mất đoạn gây α0-thalassemia và 2 đột biến mất đoạn gây α+-thalassemia [36], [37], [38], [39], được liệt kê như trong bảng 1.4 Các đột biến mất đoạn α0-thalassemia bao gồm: đột biến dạng SEA, thường được tìm thấy ở các cá thể người Đông Nam Á; MED và -(α)20.5, thường gặp ở người Địa trung hải; FIL, hay gặp ở người Philippin; và THAI, ở người Thái 2 đột biến mất đoạn α+-thalassemia

bao gồm đột biến mất đoạn 3.7kb (-α3.7) và 4.2kb (-α4.2) trên 1 gen α Hiện nay, các mồi thường được thiết kế theo dạng kép hoặc đa mồi, theo đó 2 đột biến -α3.7 và -α4.2 sẽ được phát hiện qua 1 phản ứng, MED và -(α)20.5 trong 1 phản ứng, và 3 đột biến ở người Đông Nam Á ở 1 phản ứng [47]

multiplex gap-PCR

(Nguồn: John Old , 2012 [47])

(Nguồn: John Old, 2012 [47])

tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và 1 mồi chung ngược chiều với mồi đặc hiệu alen [50] Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước

Các primer ARMS đặc hiệu đột biến được sử dụng trong thư viện Oxford được dùng để chẩn đoán 25 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp trên thế giới cũng như 1 số đột biến điểm gây bệnh α-thalassemia [47]

Hình 1.10 Chẩn đoán β-thalassemia bằng ARMS-PCR

(Nguồn: Hossein N., 2001 [51])

(Internal control band: band nội chuẩn)

Ở Việt Nam, Lê Thị Hảo đã ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử phát hiện đột biến gen gây bệnh β-thalassemia và xây dựng được kỹ thuật ARMS

để phát hiện đột biến gen này tại thành phố Hồ Chí Minh [52]

Hiện nay, ARMS-PCR thường được dùng để sàng lọc 2 đột biến điểm HbCs, HbQs gây α-thalassemia Còn với β-thalassemia, 9 đột biến thường gặp được chia thành 3 nhóm và được được sàng lọc đồng thời như bảng 1.5 theo nghiên cứu của Hương Lê (2000) trên quần thể người Đông nam Á [53] Đột biến được phát hiện qua multiplex ARMS-PCR, được xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR Riêng với đột biến CD26 của HbE được phát hiện trực tiếp bằng ARMS-PCR nếu có HbE dương tính với điện di huyết sắc tố

Bảng 1.6 Các đột biến gen β globin và mồi đặc hiệu

Bước sàng

lọc Loại đột biến Mồi đặc hiệu

Mồi chung

Độ dài (bp)

TAG) CD41/42 (-TTCT) -28 (A > G)

IVS 1-1 (G > T)

CD17M CD41/42M -28M IVS 1-1M

IVS 1-5M CD71/72M IVS 2-654M CD95M

Thal B Thal C Thal F Thal B

Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)

ra đời năm 2002 và được MRC-Holland phát triển, là một bước tiến mới trong chẩn đoán các bệnh di truyền nói chung và Thalassemia nói riêng Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng MLPA là phương pháp dễ dàng, nhanh chóng, hiệu quả, kinh tế và phù hợp trong việc phát hiện các vi mất đoạn và vi lặp đoạn, thậm chí là những mất đoạn nhỏ Trong phản ứng MLPA, vấn đề thiết kế các

probe gắn đặc hiệu với các đoạn DNA đích đóng vai trò cực kỳ quan trọng Thông thường, mỗi probe chứa 2 đoạn oligonucleotid có kích thước khác nhau

Ở Việt Nam, kỹ thuật MLPA được thực hiện bằng cách sử dụng bộ đầu

dò thương mại P140-B4 để phát hiện các đột biến mất đoạn trên gen α và β globin Kết quả được phân tích trên phần mềm COFALYSER

1.2.1.4 Phương pháp giải trình tự gen

Giải trình tự gen là xác định thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotid: A (adennine), C (cytosine), G (guanine), T (thymine) trên phân tử DNA Hiện nay, giải trình tự gen thường được thực hiện trên các máy tự động (như ABI 3130 ), kết quả được phân tích bằng phần mềm đi kèm, sau đó được đưa lên ngân hàng gen (Gene Bank) để so sánh với trình tự gen globin chuẩn Qua đó,

có thể xác định các đột biến điểm chưa biết và các biến thể của bệnh

Mặc dù các phương pháp như: multiplex gap-PCR và ARMS-PCR đã giúp sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia khá hiệu quả nhưng vẫn còn tồn tại nhiều hạn chế, đó là không phát hiện được cùng lúc nhiều đột biến, sử dụng đa mồi nên khá phức tạp, cần điện di để kiểm tra sản phẩm, sử dụng hóa chất độc hại đối với người làm xét nghiệm, thời gian lâu, trong khi yêu cầu quan trọng của chẩn đoán trước sinh là phải đơn giản, nhanh chóng

và chính xác Với phương pháp MLPA và giải trình tự gen thì chi phí lại quá đắt, không phù hợp với phần đông dân số Việt Nam

1.2.2 Phát hiện các đột biến gây bệnh Thalassemia trong chẩn đoán trước sinh bệnh Thalassemia bằng phương pháp lai ngược (reverse hybridyzation)

Kỹ thuật Reverse dot blot hybridization (Reverse hybridization) cung cấp một nền tảng cho kỹ thuật lai các đầu dò đặc hiệu cao Các đầu dò đặc

hiệu alen (allele specific oligonucleotide - ASO probes) bình thường và đột biến được gắn cố định trên các dải nitrocenllulose (nitrocenllulose strips) có màng nylon hoặc các hạt Luminex (Luminex beads), thay vì gắn trực tiếp lên mẫu DNA phân tích Đây là một phương pháp không sử dụng phóng xạ Trong kỹ thuật này, các đầu dò ASO đặc hiệu đột biến (mutant) và bình thường (wild type) được lai với các mẫu DNA nhằm sàng lọc nhiều đột biến cùng lúc Phương pháp Reverse hybridization lần đầu được mô tả bởi Saiki và cộng sự [54], và sau đó được phát triển để sàng lọc các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở người Sicilian, và được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh [55], [56]

Về lý thuyết, Reverse hybridization có thể được thiết kế để phát hiện bất cứ đột biến nào đã được xác định trong một quần thể nhất định sau khi các điều kiện đã được sắp đặt cẩn thận Reverse hybridization đã được sử dụng để xác định các đột biến gây bệnh α-thalassemia [56], β-thalassemia cũng như xác định kiểu gen của các biến thể của gen β globin chính (HbS, HbC, HbD…) [47]

Sản phẩm khuếch đại DNA được đánh dấu bằng cách sử dụng mồi có đầu 5’ sửa đổi với biotin, hoặc đánh dấu trong quá trình khuếch đại DNA (bằng biotin-16-dUTP) Các sản phẩm khuếch đại này có thể được biến tính

và lai với các đầu dò cố định Sau các bước rửa nghiêm ngặt, sản phẩm lai đặc hiệu có thể được phát hiện Trên các thanh lai (Reverse hybridization Strips), kết quả này có thể nhìn thấy bằng mắt thường Còn đối với Luminex beads, kết quả sẽ được đo bằng phần mềm đặc hiệu (Luminex Reader)

Dựa trên kỹ thuật Reverse hybridization, hãng ViennaLab Diagnostics GmbH của Austria đã xây dựng bộ kit Globin StripAssay ứng dụng cho chẩn đoán bệnh Thalassemia, nhằm phát hiện 22 đột biến trên gen β globin - dạng phổ biến ở người Đông Nam Á (β-Globin StripAssay SEA), và 21 đột biến trên gen α globin (α-Globin StripAssay) Bộ kit này đáp ứng tiêu chuẩn ISO,

tất cả các sản phẩm đều được đánh dấu CE (Conformité Européene) và IVD (In Vitro Diagnostics) Nhiều nghiên cứu của các tác giả trên thế giới đã chứng tỏ Globin StripAssay là một phương pháp đơn giản, nhanh, hiệu quả trong việc phát hiện các đột biến gen gây bệnh Thalassemia [51], [57], [58], [59], [60] Hiện nay, kit Globin StripAssay đã được ứng dụng ở nhiều nước trên thế giới như: Áo, Iran, Singapo, Thái Lan…

1.2.2.1 Ưu điểm của phương pháp

Phương pháp này đã chứng tỏ có nhiều ưu điểm so với các phương

- Không sử dụng các hóa chất độc hại

- Phương tiện máy móc đơn giản ( máy PCR, agarose gel, máy lắc …)

- Phân tích kết quả đơn giản từ các thanh phản ứng (Teststrip)

1.2.2.2 Quy trình xét nghiệm

Quy trình xét nghiệm gồm 3 bước:

- Tách chiết DNA

- Phản ứng khuếch đại PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu

- Lai các sản phẩm khuếch đại với Teststrip có sẵn chứa các đầu dò oliginucleotide đặc hiệu alen đột biến (mutant) và alen người bình thường không có đột biến (wild type) Sau các bước rửa đặc hiệu, trình tự giới hạn được phát hiện nhờ các phản ứng màu enzym

1.2.2.3 Các đột biến có thể được phát hiện

Kit Globin StripAssay phát hiện được hơn 20 đột biến trên mỗi gen globin

- β-Globin StripAssay SEA

Bảng 1.7 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng β-Globin StripAssaySEA

STT Loại đột biến Kiểu đột biến Thể bệnh Thalasemia

- α-Globin StripAssay

Bảng 1.8 Các dạng đột biến có thể phát hiện bằng α-Globin StripAssay

STT Tên đột biến Kiểu đột biến Thể bệnh Thalasemia

Hình 1.11 Các vị trí đột biến trên Teststrip của β-Globin StripAssay SEA

Hình 1.12 Các vị trí đột biến trên Teststrip của α-Globin StripAssay