Biến đổi cấu trúc và khả năng dung nạp sau ghép đồng loại xương tươi, đông khô và bảo quản lạnh sâu trên thực nghiệm

Xuất phát từ điều này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu : “Biến đổi cấu trúc và khả năng dung nạp sau ghép đồng loại xương tươi, đông khô và bảo quản lạnh sâu trên thực nghiệm” vơ

MỤC LỤC

TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Sơ lược về cấu tạo mô học của xương 3

1.2 Phân loại xương 8

1.3 Các loại xương ghép 9

1.3.1 Xương ghép tự thân9

1.3.2 Xương ghép đồng loại 10

1.3.3 Xương khử khoáng 11

1.3.4 Xương ghép dị loài 11

1.4 Các phương pháp bảo quản xương ghép 12

1.4.1 Bảo quản lạnh sâu mảnh xương ghép 12

1.4.2 Phương pháp bảo quản đông khô 18

1.5 Sinh học mô ghép xương 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.1 Địa điểm nghiên cứu 25

2.2 Đối tượng nghiên cứu 25

2.2.1 Động vật thực nghiệm 25

2.2.2 Vật liệu thực nghiệm 25

2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu 25

2.4 Mô hình thực nghiệm 32

2.5 Chỉ tiêu cần nghiên cứu 33

2.5.1 Các chỉ tiêu về hình thái, cấu trúc các mẫu xương không ghép33

2.5.2 Các chỉ tiêu về hình thái, cấu trúc của vùng ghép, vùng mô xung quanh mảnh ghép 33

2.6 Phương pháp xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 36

3.1 Cấu trúc mô xương chuô ôt cống trắng không ghép 36

3.1.1 Cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản đông khô 363.1.2 Cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng38

3.1.3 Cấu trúc mô xương tươi không ghép 40

3.1.4 So sánh cấu trúc mô xương của ba lô xương không ghép 433.2 Hình thái, cấu trúc của vùng ghép, vùng mô xung quanh mảnh ghép43

3.2.1 Cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép được bảo quản đông khô 43

3.2.2 Cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng 48

3.2.3 Cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép tươi 533.2.4 So sánh cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép của

ba lô xương ghép đồng loại 58

4.1 Bàn luâ ôn về cấu trúc mô xương chuô ôt cống trắng không ghép sau đông khô và sau bảo quản ở -75ºC ba tháng 59

4.2 Bàn luâ ôn về cấu trúc vùng mô liên kết xung quanh xương ghép ở ba

lô xương chuô ôt: lô xương được ghép tươi, lô xương được ghép sau đông khô, lôxương được ghép sau bảo quản ở -75ºC ba tháng 68

KHUYẾN NGHI 80

TÀI LIÊÂU THAM KHẢO

PHIẾU THU THÂÂP SỐ LIÊÂU

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BMPs – Bone Morphogenetic Proteins/ Protein tạo hình xương

CPAs – Cryopreservation agents/ Chất bảo quản lạnh

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Cơ chế gây chết tế bào trong bảo quản lạnh 13

Hình 1.2 Hiê ôn tượng vâ ôt lý bên trong tế bào trong quá trình đông lạnh 15

Hình 2.1 Ghép xương tươi 27

Hình 2.2 Ghép xương được bảo quản đông khô 29

Hình 2.3 Ghép xương được bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng 30

Hình 2.4 Mẫu xương ghép sau khi được lấy ra khỏi cơ thể 31

Hình 2.5 Mô hình nghiên cứu 32

Hình 2.6 Mô phỏng quan sát hình ảnh vi thể vùng nghiên cứu với các đô ô phóng đại khác nhau 33

Hình 3.1 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản đông khô (HE x100) 37

Hình 3.2 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản đông khô (HE x250) 37

Hình 3.3 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản đông khô (HE x1000) 38

Hình 3.4 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng (HE x100) 39

Hình 3.5 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng (HE x250) 39

Hình 3.6 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương không ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng (HE x1000) 40

Hình 3.7 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương tươi không ghép (HE x100) 41Hình 3.8 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương tươi không ghép (HE x250) 41Hình 3.9 Hình ảnh vi thể cấu trúc mô xương tươi không ghép (HE x1000) 42Hình 3.10 Vết mổ sau 7 ngày ghép xương được bảo quản đông khô 44Hình 3.11 Vết mổ sau 1 tháng ghép xương được bảo quản đông khô 44Hình 3.12 Hình ảnh đại thể vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép

sau 1 tháng ghép xương được bảo quản đông khô 44Hình 3.13 Hình ảnh đại thể vùng mô xung quanh xương ghép sau 1 tháng

ghép xương được bảo quản đông khô 45Hình 3.14 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép được bảo quản đông khô (HE x100) 46Hình 3.15 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép được bảo quản đông khô (HE x250) 46Hình 3.16 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép được bảo quản đông khô (HE x1000) 47Hình 3.17 Vết mổ sau 7 ngày ghép xương được bảo quản ở -75ºC ba tháng 48Hình 3.18 Vết mổ sau 1 tháng ghép xương được bảo quản ở -75ºC ba tháng 48Hình 3.19 Hình ảnh đại thể vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép

sau 1 tháng ghép xương được bảo quản ở -75ºC ba tháng 49Hình 3.20 Hình ảnh đại thể vùng mô xung quanh xương ghép sau 1 tháng

ghép xương được bảo quản ở -75ºC ba tháng 49Hình 3.21 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng (HE x100) 51

Hình 3.22 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng (HE x250) 51Hình 3.23 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép được bảo quản ở -75ºC ba tháng (HE x1000) 52Hình 3.24 Vết mổ sau 7 ngày ghép xương tươi 53Hình 3.25 Vết mổ sau 1 tháng ghép xương tươi 53Hình 3.26 Hình ảnh đại thể vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép

sau 1 tháng ghép xương tươi 54Hình 3.27 Hình ảnh đại thể vùng mô xung quanh xương ghép sau 1 tháng

ghép xương tươi 54Hình 3.28 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép tươi (HE x100) 56Hình 3.29 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép tươi (HE x250) 56 Hình 3.30 Hình ảnh vi thể cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương

ghép tươi (HE x1000) 57Hình 4.1 Cấu trúc phân tử của oxy già 60Hình 4.2 Cấu trúc phân tử của ethanol 61Hình 4.3 Hình ảnh vi thể (HE) ba loại xương ghép đồng loại khi chưa ghép 67Hình 4.4 Hình ảnh đại thể vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép

sau 1 tháng ghép xương đồng loại 69Hình 4.5 Hình ảnh vi thể vùng mô xung quanh xương ghép sau 1 tháng

ghép xương đồng loại (HE x100) 71

Hình 4.6 Hình ảnh vi thể vùng mô xung quanh xương ghép sau 1 tháng

ghép xương đồng loại (HE x250) 72Hình 4.7 Hình ảnh vi thể vùng mô xung quanh xương ghép sau 1 tháng

ghép xương đồng loại (HE x1000) 73

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 So sánh cấu trúc mô xương của ba lô xương không ghép 43Bảng 3.2 .So sánh cấu trúc vùng ghép, vùng mô xung quanh xương ghép

của ba lô xương ghép đồng loại 58

ĐẶT VẤN ĐỀ

Mô xương là thành phần thiết yếu của cơ thể giữ nhiều vai trò quantrọng, tạo ra một khung sườn cứng để nâng đỡ bảo vệ các mô mềm của cơ thể.Trong đời sống hằng ngày, chúng ta thường gặp những tổn thương ở hệ thốngxương gây khuyết hổng xương Nhiều phương pháp được sử dụng để sửachữa các khiếm khuyết xương trong phẫu thuật chỉnh hình tái tạo [1] vàxương là mô ôt trong những mô cơ thể thường được cấy ghép nhất [2] Nhu cầughép xương để thay thế những khiếm khuyết xương hoặc tăng cường tái tạoxương gần đây trở nên phổ biến hơn bởi vì khả năng điều trị cao trong các

trường hợp mất xương lớn [3] Có nhiều tùy chọn ghép xương có sẵn cho bác

sĩ phẫu thuật [3], [4] bao gồm: xương đồng loại, xương tự thân, xương dị loại

và các vật liệu thay thế mô xương, chất kích thích tái tạo xương

Ghép tự thân luôn luôn được xem là tiêu chuẩn vàng của việc cấy ghépxương [5], [6] Tuy nhiên, việc sử dụng xương tự thân cũng có nhiều hạn chế[7] và trong một số trường hợp không cho phép ghép xương tự thân, sử dụngxương đồng loại là lựa chọn tốt nhất Xương đồng loại đã được sử dụng từ lâunhư vật thay thế tự nhiên để sửa chữa các khuyết tật xương Xương đồng loạimang đến một sự thay thế hấp dẫn cho xương ghép tự thân Nhu cầu ghép môđồng loại được mở rộng nhanh chóng, do bởi sự gia tăng số lượng của việcsửa lại các phẫu thuật thay khớp đang được tiến hành trong một dân số già vàbởi những xu hướng mới hơn của phẫu thuật xâm lấn tối thiểu, đặc biệt ở cộtsống, nhu cầu ghép xương hay vật thay thế đang phát triển nhanh Sự thay thếxương được sử dụng nhiều nhất ở Châu Âu [7] Các kỹ thuật ghép xươngđược các chuyên gia y tế sử dụng hơn 100 năm nay [8] Năm 1881, Macewen

đã ghép thành công mô xương người đồng loại thay thế 2/3 đầu gần củaxương cánh tay ở trẻ 4 tuổi [8], [9] Trên thế giới có khoảng hơn 2,2 triê ôuxương được ghép mỗi năm, trong đó ở Mỹ có khoảng 20% [2], [9] Cho đếnnay, xương ghép đồng loại được cung cấp dưới 3 dạng khác nhau tùy theo kỹthuật bảo quản xương: xương đồng loại bảo quản lạnh sâu, xương đồng loạibảo quản đông khô và xương đồng loại khử muối khoáng [10] Hai kỹ thuậtbảo quản xương đồng loại thường được sử dụng là lạnh sâu và đông khô [11].Tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về khả năng dung nạp củaxương đồng loại bảo quản lạnh sâu và xương đồng loại bảo quản đông khômặc dù hai loại xương này vẫn được sử dụng thường xuyên trên lâm sàng

Xuất phát từ điều này, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu : “Biến đổi cấu

trúc và khả năng dung nạp sau ghép đồng loại xương tươi, đông khô và bảo quản lạnh sâu trên thực nghiệm” với các mục tiêu sau:

+ Đánh giá biến đổi cấu trúc mô xương chuột cống trắng sau đông khôhoă ôc bảo quản lạnh sâu

+ Đánh giá khả năng dung nạp sau ghép đồng loại của mô xương tươi,đông khô, bảo quản lạnh sâu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về cấu tạo mô học của xương

Xương là một mô liên kết cứng chắc và không đàn hồi, có chất nềnngoại bào ngấm muối calcium và phosphate nhờ một quá trình gọi là sựkhoáng hóa Xương có nhiều mạch máu và có hoạt động chuyển hóa mạnh[12]

Chức năng của xương [12] là:

+ Chống đỡ và bảo vệ cho cơ thể và các tạng

+ Tích trữ các calcium và phosphate

Xương là một cấu trúc sống thường xuyên có sự đổi mới và xây dựnglại trong suốt đời sống của con người hay các động vật Xương cũng bị ảnh

hưởng bởi các tác động của sự chuyển hóa, của sự dinh dưỡng và của các nộitiết tố Sự mất chức năng dẫn đến tình trạng teo, còn sự tăng chức năng làmxương phì đại với sự tăng khối lượng xương [13]

Thành phần cấu tạo của mô xương gồm: các tế bào, các sợi và chất cănbản Trong xương có những hốc tủy chứa tủy, phía ngoài cùng của thân vàđầu xương có một màng liên kết bọc gọi là màng xương

1.1.1 Chất căn bản

Chất căn bản xương nằm xen kẽ vào khoảng cách giữa các tế bàoxương Chất căn bản xương gồm hai thành phần chính: chất nền hữu cơ vànhững muối vô cơ

Chất nền xương hữu cơ (chiếm 30% trọng lượng xương khô) bao gồm[12]:

+ Các sợi collagen I (90%)

+ Các proteoglycan giàu chondroitin sulfate, keratan sulfate vàhyaluronic acid

+ Các protein không là collagen bao gồm osteocalcin, osteopontin

và osteonectin, được tổng hợp bởi các tạo cốt bào và chỉ tham gia vào sựkhoáng hóa xương

Dưới kính hiển vi quang học, chất căn bản mịn, không có cấu trúc, ưathuốc nhuộm acid Chất căn bản xương tạo thành những lá xương gắn vớinhau Trong các lá xương có những ổ xương chứa tế bào xương Từ các ổxương tỏa ra những vi quản xương liên hệ với những ổ xương bên cạnh.Trong vi quản xương có các nhánh của tế bào xương liên hệ với các nhánhcủa tế bào xương lân cận [13]

Thành phần vô cơ của xương gồm có: những muối khoáng (chứakhoảng 70% trọng lượng xương khô, muối calcium, kalium, magnesium, chủyếu là muối calcium dưới dạng tinh thể hydroxyapatit tricalcic và hydrat-

canxi) Ngoài ra còn có muối natrium dưới dạng phosphat, cacbonat hay citrat[13].

1.1.2 Những sợi

Những sợi trong mô xương chủ yếu là những sợi ossein vùi trong chấtcăn bản Những sợi này giống như sợi collagen của mô liên kết thông thường.Đó là những sợi có đường kính 5-7nm, có vân ngang, có chu kỳ lặp đi lặp lạicó chiều dài bằng 68nm Những sợi này nhìn rõ khi mô xương đã bị khử muốivôi Các sợi trong mô xương có tác dụng làm giảm các lực cơ học tác độngvào xương [13]

1.1.3 Những tế bào

Xương đang tăng trưởng có chứa bốn loại tế bào: tiền tạo cốt bào, tạocốt bào, tế bào xương và hủy cốt bào

1.1.3.1 Tiền tạo cốt bào

Tiền tạo cốt bào hay là những tế bào gốc của tế bào mô xương, lànhững tế bào chưa biệt hóa, tồn tại sau khi trẻ ra đời Những tế bào này có khảnăng phân chia bằng gián phân và sau đó biệt hóa về cấu trúc và chức năng.Những tiền tạo cốt bào có nhân hình bầu dục hoặc dài, bắt màu nhạt, bàotương bắt màu acid kém, đôi khi hơi ưa màu base Những tiền tạo cốt bàothường thấy trên mặt xương, ở lớp trong màng xương, lớp mặt trong ốngHavers [13]

Các tiền tạo cốt bào tạo ra các tạo cốt bào theo một cơ chế được điềuhòa bởi các yếu tố tăng trưởng và yếu tố phiên mã hiện diện ở lớp trong củamàng ngoài xương và màng trong xương Các tiền tạo cốt bào tồn tại suốt đờisau sinh, dưới dạng các tế bào phủ miếng xương; chúng được tái hoạt hóa ởngười trưởng thành khi cần sửa chữa do gãy xương và các loại tổn thươngkhác [12]

1.1.3.2 Tạo cốt bào

Là những tế bào đa diện hay lăng trụ, dài 20-30m, có nhánh nối vớinhau hoặc nối với những tế bào nằm trong tủy xương, những tạo cốt bàothường xếp thành một hàng trên mặt các bè xương đang hình thành Nhân tếbào lớn, hình cầu hay hình bầu dục, thường nằm lệch về phía đối diện vớivùng xương mới đang hình thành, có một đến hai hạt nhân Bào tương ưa màuthuốc nhuộm base, vì chứa nhiều RNA, có nhiều glycogen và các enzym.Lưới nội bào và ti thể phát triển [13]

Các sản phẩm đặc hiệu của tạo cốt bào là collagen I, osteocalcin,osteopontin và sialoprotein của xương Các tạo cốt bào còn sản xuất được cácyếu tố tăng trưởng, đặc biệt là các thành viên họ protein tạo hình xương –BMPs (bone morphogenetic proteins) có vai trò cảm ứng sự tạo xương [12]

Ở nơi nào cần có sự tạo xương thì tạo cốt bào xuất hiện Chúng tạo ramột cái nền protein và gián tiếp tham gia vào việc làm lắng đọng muốikhoáng vào cái nền ấy Như vậy chất căn bản xương được tạo ra Trong quátrình tạo xương mới, một số tạo cốt bào tự vùi trong chất căn bản do chúngtạo ra và trở thành cốt bào (tế bào xương chính thức) [13]

1.1.3.3 Tế bào xương

Trong xương đã hoàn toàn được hình thành, tế bào xương là những tếbào chính và chủ yếu

Tế bào xương là những tế bào có nhiều nhánh dài Thân tế bào dài

20-30m, nằm trong các ổ xương, những nhánh của tế bào xương mảnh, nằmtrong các tiểu quản xương Dưới kính hiển vi quang học, không thể phát hiệnđược nơi các nhánh đi vào các tiểu quản Nhưng dưới kính hiển vi điện tử cóthể nhìn thấy nhánh của tế bào xương đi trong vi quản xương đến tiếp xúc vớinhánh của những tế bào xương bên cạnh Ở chỗ tiếp xúc của các nhánh,chúng liên kết với nhau bởi mối liên kết khe

Trong mỗi ổ xương chỉ có một tế bào xương, nhưng những tế bàoxương không phải là những tế bào đơn độc mà chúng liên hệ với nhau nhờnhững nhánh nằm trong các vi quản Trong quá trình phát triển của mình, mỗi

tế bào xương chính là một tạo cốt bào biến thành sau khi bị bao vây bởi chấtnền xương Tế bào xương không còn khả năng sinh sản

Trong bào tương của tế bào xương có nhiều ribosom, lưới nội bào, bộGolgi, những hạt glycogen Trong bào tương của những tế bào xương đã giàthì người ta thấy nhiều lysosom chứa nhiều enzym (cathepsin, phosphataseacid,…) Những men này có tác dụng tiêu hủy protein của chất căn bảnxương Nhân tế bào hình trứng, sẫm màu, màng nhân có nhiều lỗ thủng

Tế bào xương có ảnh hưởng rất rõ ràng đến chất nền của xương Các tếbào xương có vai trò tích cực trong việc giải phóng chất calci của nền xương

để đưa vào máu [13]

Hủy cốt bào là những tế bào rất lớn, đường kính 20-100m, có nhiềunhân (50-60 nhân) Hủy cốt bào thường xuất hiện ở những vùng xương đangbị phá hủy, ở trên mặt xương của các khoảng trống Howship trong mô xương

Các nhân của hủy cốt bào thường hình cầu, ít chất nhiễm sắc Bàotương ưa acid, có nhiều lysosom, nhiều không bào lớn chứa mảnh vụn củachất căn bản Phía tiếp xúc với chất căn bản của xương, mặt hủy cốt bào cónhiều vi nhung mao ăn sâu vào chất căn bản [13]

1.1.4 Tủy xương

Tủy xương là mô liên kết nằm trong hốc tủy ở đầu xương dài, ở xươngxốp và cả ở trong ống tủy của thân xương dài Ở người trưởng thành, nếuquan sát bằng mắt dễ dàng phân biệt được tủy đỏ và tủy vàng Tủy đỏ là môtủy giàu hồng cầu và các giai đoạn phát triển của dòng hồng cầu, đang hoạtđộng tạo máu tích cực Tủy vàng giàu tế bào mỡ là trạng thái mô tủy ngừngtham gia tạo máu Khi cơ thể có nhu cầu tạo máu, tủy vàng mau chóng trởthành tủy đỏ [13]

+ Lớp ngoài có nhiều mạch máu và các sợi collagen neo dày (gọi làsợi Sharpey) chạy cắm vào các lá xương giới hạn ngoài ở miếng xương

Màng trong xương lót bên trong các khoang xương Màng trong xươnggồm có các tế bào dẹt và các sợi mô liên kết, phủ mô xương xốp chứa tủyxương và tiến vào bên trong tất cả các hốc của miếng xương, kể cả ốngHavers [12] Cũng như màng ngoài xương, màng trong xương cũng có tiềmnăng sinh xương

1.2 Phân loại xương

 Theo giải phẫu hình thái xương [13]:

Xương dài, xương ngắn và xương dẹt

 Theo cách sắp xếp các lá xương của xương Havers [13]:

Xương đặc và xương xốp

 Theo cấu trúc mô học [13]:

+ Xương lưới (xương nguyên phát): Là loại xương chủ yếu tronggiai đoạn hình thành xương phôi thai

+ Xương lá (xương thứ phát): Là loại xương chủ yếu ở ngườitrưởng thành

 Theo nguồn gốc sinh xương [13]:

+ Xương cốt mạc do màng xương tạo ra

+ Xương Havers do tủy xương tạo ra

1.3 Các loại xương ghép

1.3.1 Xương ghép tự thân

Ghép xương tự thân là lý tưởng trong nhiều trường hợp, vì xươngđược lấy từ chính bệnh nhân [14] Mô ghép tự thân ít có khả năng bị thải loại.Xương tự thân có thể được ghép kết hợp với mô ghép đồng loại hoặc mô ghépdị loài Xương tự thân có đặc tính tạo xương và cảm ứng xương có thể giúpchữa lành xương Tuy nhiên, ghép tự thân sẽ làm kéo dài thêm thời gian phẫuthuật, thêm vết thương ngoại khoa thứ hai [15], gă ôp hạn chế khi ghép, đòi hỏiđiều trị đă ôc biê ôt, cần sử dụng nhiều phương tiê ôn phẫu thuâ ôt [16], phải phẫuthuật tái tạo sau khi lấy mô và vị trí lấy xương của bệnh nhân thường gặp biếnchứng [14] Ngoài ra, ở những bệnh nhân có nhiều bệnh đi kèm, viê ôc phẫuthuâ ôt mổ lấy xương và ghép xương sẽ bị hạn chế, xương được lấy có thể bịtổn thương và không có khả năng lành xương

Ghép xương tự thân có thể thất bại trong điều trị lâm sàng vì hầu hếtcác yếu tố tế bào (tạo xương) không thể sống sót khi cấy ghép [6] Những hạnchế khác bao gồm các bệnh nhân lớn tuổi hoặc trẻ em và bệnh nhân bị bệnhác tính Ngoài ra, các biến chứng có thể gặp khi lấy xương tự thân như: hìnhthành máu tụ, mất máu, chấn thương thần kinh, hình thành thoát vị, nhiễmtrùng, tổn thương động mạch, tổn thương niệu quản, gãy xương, mất ổn định

vùng chậu, các khuyết tật thẩm mỹ, cấy ghép khối u và đôi khi đau mãn tínhtại vị trí lấy xương [6]

1.3.2 Xương ghép đồng loại

Xương ghép đồng loại được lấy từ người và được khử trùng tuyê ôt đốitrước khi chúng được sử dụng để ghép cho người khác [14] Ghép xươngđồng loại giúp giảm bớt thời gian phẫu thuật [17], không giới hạn về nguồncung cấp, loại bỏ được tỷ lê ô bê ônh tâ ôt do lấy xương, khả năng thẩm mỹ của

mô ghép gần với giải phẫu hơn tại vị trí ghép [16] Nhược điểm của ghépđồng loại là không có khả năng loại bỏ được nguy cơ bê ônh truyền nhiễm Cácngân hàng mô với những kỹ thuâ ôt hiê ôn đại và những quy tắc nghiêm ngă ôt đãgiúp giảm đáng kể nguy cơ này, tuy nhiên vẫn còn tồn tại khả năng gây ra đápứng miễn dịch trên mô ghép Viê ôc đông lạnh các mô có thể làm giảm đượcthành phần kháng nguyên [16]

Sau khi các mô ghép được thu gom, chúng được xử lý thông qua cácphương pháp khác nhau Với việc xử lý bổ sung này, tuy nhiên, đặc tính sinhhọc và cơ học của mô ghép bị làm yếu đi Mục đích của các bước là để loại bỏcác thành phần kháng nguyên và giảm lưu trữ đáp ứng miễn dịch khi giữ lạicác đặc điểm sinh học của các mảnh ghép [8]

Nói chung, những mô xương ghép đồng loại có thể được phân thànhcác loại tươi, tươi - đông lạnh, đông khô và khử khoáng, tùy thuộc vào quátrình chuẩn bị [14] Xương ghép đồng loại tươi hoặc đông lạnh có khả năngcảm ứng xương và dẫn tạo xương cao nhất So với xương ghép đồng loạiđông khô, xương ghép đồng loại tươi hay được đông lạnh gây ra đáp ứngmiễn dịch mạnh hơn rất nhiều Xương ghép được đông khô ít gây ra miễndịch nhất nhưng các đặc tính cảm ứng xương, tính chất cơ học, độ bền kémhơn so với xương ghép đồng loại tươi hoặc được đông lạnh Mặc dù việc

đông khô làm chết tất cả các tế bào nhưng sự toàn vẹn hóa học của mô ghépvẫn không bị ảnh hưởng [8].

Tuy không có quy tắc chung nhưng mô ghép tươi được dùng chủ yếucho sửa chữa xương sụn, cụ thể là ở xương sên trong các ứng dụng bàn chân

và mắt cá chân Bởi vì mô ghép tươi có nhiều tế bào sụn tồn tại hơn và hỗ trợcấu trúc bên dưới sụn lớn hơn, chúng phù hợp hơn khi cả hai cấu trúc xương

và sụn cần phải được thay thế tại cùng một thời điểm Mô ghép đông lạnh tươi thường được sử dụng ở những nơi cần có độ cứng về cấu trúc Mặc dùchúng có thể không cứng như mô ghép tươi nhưng các nhà ngoại khoa sửdụng mô ghép tươi – đông lạnh dễ dàng hơn Những mô ghép đồng loạiphong phú nhất là mô ghép đông khô, thường được ghép ở những vị trí có sựtưới máu tốt để được cung cấp đủ các yếu tố cảm ứng xương tự nhiên Hiê ôuquả ghép xương đông khô tốt hơn so với ghép xương tươi Xương ghép đồngloại khử khoáng thường được sử dụng để lấp đầy các khoảng trống xương[14]

-1.3.3 Xương khử khoáng

Xương khử khoáng là xương đă ôc được khử canxi bằng axit, sau đóđược đông khô, nghiền thành hạt nhỏ hoă ôc cắt dạng lát mỏng Phần hữu cơcòn lại sau khử khoáng có chứa các yếu tố kích thích sự tăng sinh xương nhưprotein BMPs, collagen typ I và các protein không phải collagen Nhờ các yếu

tố đó, xương khử khoáng tuy mất toàn bô ô cấu trúc nhưng vẫn có tính dẫnxương và cảm ứng xương [9], [18], [19] Xương khử khoáng đã được loại bỏtính kháng nguyên và không còn khả năng truyền bê ônh [6], [9]

1.3.4 Xương ghép dị loài

Mô ghép dị loài xuất phát từ mô không phải của người, thường lấy từtrâu bò Do đó, loại mô này có tính kháng nguyên lớn hơn nhiều so với môghép đồng loại Xương ghép dị loài đòi hỏi phải được xử lý vô trùng nghiêm

ngă ôt hơn, điều này có thể dẫn đến giảm đặc tính cảm ứng xương Tuy nhiên,xương ghép dị loài có nguồn cung cấp phong phú, giá thành rẻ và luôn có sẵn,có quy trình tiê ôt trùng rô ông và hạn sử dụng dài [14]

1.4 Các phương pháp bảo quản xương ghép

Nguyên tắc bảo quản mô là làm bất hoạt các enzym phân hủy proteincó trong mô để giữ cho mô không bị phân hủy trong thời gian dài Xương saukhi được bảo quản, mảnh xương phải đạt 3 yêu cầu: vô trùng, không bị biếnđổi các đă ôc tính sinh học, chi phí rẻ [20], [21] Có nhiều phương pháp để bảoquản mảnh xương ghép nhưng phương pháp bảo quản đông khô và phươngpháp bảo quản lạnh sâu là hai phương pháp được áp dụng phổ biến nhất trongcác ngân hàng mô trên thế giới [11]

1.4.1 Bảo quản lạnh sâu mảnh xương ghép

Bảo quản lạnh là lưu giữ mô ở nhiệt độ thấp, đă ôc biê ôt dưới 0C [22].Quá trình bảo quản lạnh sâu bắt đầu từ nhiê ôt đô ô -40C [23] Xương được bảoquản lạnh ở nhiê ôt đô ô -20C hoă ôc -70C, -80C hoă ôc -196C (bảo quản trongnitơ lỏng) [24] Cơ chế của phương pháp bảo quản lạnh là hạ thấp nhiê ôt đô ôcủa mô nhằm gây ức chế tạm thời hoạt tính của các enzym mà không gây biếntính đáng kể protein của mô

Mục đích của bảo quản là để ghép lại hoặc tái sử dụng các sản phẩm

Do đó, điều kiện tối ưu sau khi được bảo quản, các sản phẩm vẫn không bịmất đi những đặc tính sinh học vốn có của nó Tuy nhiên, trong quá trình bảoquản có một số lượng tế bào hoặc mô sẽ bị chết đi do việc hình thành tinh thểđá trong tế bào, do mất nước, lắng đọng chất hòa tan trong tế bào, do thiếunuôi dưỡng

Hình 1.1 Cơ chế gây chết tế bào trong bảo quản lạnh.

Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào trong quátrình bảo quản lạnh như: tính thấm nước của màng tế bào, kích thước tế bào,giai đoạn chu kỳ của tế bào, nồng độ các chất bảo quản lạnh, phương pháplàm lạnh, tốc độ làm lạnh, kỹ thuật rã đông, nhiệt độ bảo quản… Trong cácyếu tố đó, chất bảo quản lạnh ảnh hưởng nhiều nhất đến khả năng sống sótcủa tế bào và mô sau bảo quản, vì các yếu tố này ảnh hưởng đến hoạt độngcủa các enzym, các loại protein và tính ổn định màng tế bào

Thời gian bảo quản phụ thuộc vào nhiệt độ đông lạnh: bảo quản mô từnhiê ôt đô ô 4C đến -10C được 1 tuần, bảo quản mô ở -20C được 6 tháng, bảoquản mô từ -35C đến -45C được 2 năm [23], bảo quản mô ở -80C được 5năm [25], ở nhiệt độ -196C (bảo quản trong nitơ lỏng): thời gian bảo quản là

vô định

Ở nhiệt độ bảo quản lạnh lý tưởng sẽ không có sự phân giải protein, sựphân giải lipid và giảm sự đáp ứng miễn dịch Ở nhiê ôt đô ô -80°C hoàn toànkhông xảy ra hoạt đô ông của các enzym để dẫn đến sự biến tính bên trongmảnh mô được bảo quản [23]

Chất bảo quản lạnh:

SỰ CHẾT TẾ BÀO

Trong quá trình làm lạnh tế bào, đặc biệt ở khoảng -10oC đến -60oC sẽcó hiện tượng mất nước tế bào làm cho thể tích tế bào co nhỏ lại Để ngănchặn hiện tượng hình thành băng trong tế bào do tốc độ làm lạnh, trong quátrình bảo quản có thể sử dụng chất bảo quản lạnh

Chất bảo quản lạnh sẽ làm giảm nồng độ các chất điện giải trong quátrình đóng băng và giảm mức độ co rút thẩm thấu Tế bào sẽ hấp thụ chất bảoquản lạnh, ngăn cản hiện tượng mất nước trong tế bào và tế bào trở lại thể tíchban đầu Khi tế bào trở lại thể tích bình thường, quá trình đông lạnh bắt đầu

Do cộng thêm chất bảo quản nên có ít nước trong tế bào hơn và ít hình thànhtinh thể đá hơn Sử dụng các chất bảo quản lạnh (CPAs) là rất quan trọng đểtránh sự hình thành tinh thể đá trong tế bào và hạn chế ảnh hưởng của dungdịch bảo quản [22]

Có hai nhóm chất bảo quản lạnh [22]:

- Chất bảo quản lạnh thấm qua màng tế bào (khử nước bên trong tế bào):glycerol (mô ôt trong những CPAs được sử dụng hiê ôu quả hơn và phổ biến hiê ônnay), ethylene glycol, methanol, propylene glycol, dimethylacetamide,dimethylsulfoxide

- Chất bảo quản lạnh không thấm qua màng tế bào (giúp quá trình khửnước bên trong tế bào xảy ra nhanh hơn): sucrose, glucose, galactose, trehalose,polyvinylpyrrolidone, hydroxyethyl starch, polyethylene glycols, dextrans

Việc dùng thêm các chất bảo quản lạnh không thấm qua màng tế bào cóvai trò rất quan trọng trong giai đoạn rã đông Khi áp lực thẩm thấu ngoài tếbào thấp, tế bào sẽ nhanh chóng hấp thụ nước và giải phóng các chất CPAs.Nhưng vì nước qua màng tế bào nhanh hơn so với các chất CPAs nên lúc này

tế bào có thể bị trương lên Vì vậy, để giảm hiện tượng trương tế bào cần chothêm các chất CPAs không thấm qua màng tế bào vào môi trường Khi có mặtcác chất CPAs này sẽ làm tăng áp lực thẩm thấu ngoài tế bào, nước sẽ vào tếbào chậm hơn và đủ thời gian để cho các chất CPAs có thể thoát ra khỏi tế

bào để đạt trạng thái cân bằng, tế bào sẽ không bị trương to Ngoài ra, cácchất CPAs không thấm còn góp phần làm tăng sự thủy tinh hóa của các dungdịch, làm ổn định protein và màng tế bào, ngăn chă ôn sự hình thành đá trong

tế bào [22]

Vai trò của tốc độ làm lạnh:

Hình 1.2 Hiê ên tượng vâ êt lý bên trong tế bào trong quá trình đông lạnh [22].

Ở môi trường đẳng trương (áp lực thẩm thấu khoảng 300 mOsm/kg)tinh thể đá thường hình thành ở nhiệt độ -5C đến -15C Ở nhiệt độ -5C đến-10C, tinh thể đá thường hình thành ở môi trường ngoài tế bào, trong khi đónước trong tế bào không bị đông lại Sự duy trì nước trong và ngoài tế bàotrong cân bằng hóa học chắc chắn sẽ làm mất nước tế bào Mức độ mất nướctrong tế bào phụ thuộc rất nhiều vào tốc độ làm lạnh Ở điểm này, tốc độ làmlạnh phải chậm, đủ để cho phép sự mất nước tế bào xảy ra, tránh đông lạnhnước trong tế bào, nhưng đủ nhanh để tránh tiếp xúc với điều kiện áp suấtthẩm thấu tăng sau đó là mất nước Khi mất nước nghiêm trọng dẫn đến tổnthương dung dịch bảo quản do sự biến tính của các chất đại phân tử và làmcho tế bào bị co lại mà không hồi phục được Điều này ảnh hưởng rất nhiềuđến khả năng sống sót của tế bào sau bảo quản Tại -10C màng tế bào bắt

đầu thay đổi, nước từ trong tế bào thoát ra khoảng gian bào Ở khoảng nhiệt

độ từ -10C đến -30C nếu tốc độ làm lạnh tế bào diễn ra chậm (theo cácnghiên cứu là khoảng 0,15 - 1,7C/phút), nước thoát ra khoảng gian bào ngàycàng nhiều do tăng áp lực thẩm thấu, tế bào mất nước rất nặng, dẫn đến kíchthước tế bào giảm đi nhiều và lúc này các tinh thể đá được hình thành ởkhoảng gian bào [22]

Nếu tốc độ làm lạnh tế bào đủ chậm (khoảng 1C/ phút), tế bào cũngmất nước nhanh chóng, thể tích tế bào cũng giảm đi nhưng ít hơn Và để giữđược thể tích của tế bào cần phải cho thêm các chất bảo quản lạnh [22]

Nếu tốc độ làm lạnh nhanh (5-10C/phút hoặc hơn), nước bên trong tếbào không bị mất đi nhanh, nước bị giữ lại trong tế bào, dẫn đến hình thànhcác tinh thể đá ở cả trong và ngoài tế bào Lúc này tế bào vẫn ở trạng thái siêulạnh, vì vậy ít bị ảnh hưởng đến thể tích tế bào [22]

Như vậy sự xuất hiện của tổn thương tế bào do lạnh có thể phòng tránhđược bằng việc kiểm soát tốc độ làm lạnh và bằng cách bổ sung các chất bảoquản lạnh

Tốc độ rã đông:

Đây cũng là một giai đoạn ảnh hưởng đến khả năng sống sót của tế bàosau bảo quản Trong quá trình bảo quản lạnh có hiện tượng hình thành các tinhthể trong khoảng gian bào, nhưng tế bào vẫn được bảo vệ nhờ các chất bảoquản Khi làm ấm tế bào, lúc này các chất bảo quản lạnh đã thoát ra khỏi tếbào, nếu tốc độ làm ấm tế bào chậm, tế bào có thể bị tổn thương do các tinh thểđá có thể làm tổn thương màng tế bào Chính vì vậy, để làm giảm tổn thương tếbào trong giai đoạn này cần làm tan đông với tốc độ nhanh chóng Hầu hết cácnghiên cứu đều làm tan đông bằng cách đặt mẫu bảo quản ở nhiệt độ phòng20ºC - 37ºC

Đối với mô xương, trước khi cấy, ghép mảnh xương phải được chiếu xạbằng tia gamma với liều khoảng 25 KGy Với liều này, tế bào sẽ bị chết về

mặt chức năng, song các protein trong xương vẫn không bị biến đổi, đặc biệt

là một loại protein BMP (bone morphogenetic protein) Chính protein này sẽkích thích quá trình tái tạo lại xương ở vùng lân cận của mảnh ghép Như vậy,thực chất mô ghép xương là mô ghép chết, trong đó thành phần tế bào hoặc làbị phá hủy ngay trong quá trình xử lý bảo quản, hoặc là bị hoại tử sau khighép Tuy nhiên, điều này không ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của môghép (do thành phần chất căn bản quyết định) Các đặc tính này chỉ thay đổikhi quy trình xử lý tác động lên thành phần chất căn bản (trước khi ghép)hoặc do chất căn bản bị các tế bào sống tác động lên (sau khi ghép) Vai tròcủa một mô ghép xương có thể quy về hai yếu tố: thứ nhất là kích thích sự tạothành xương mới xâm nhập và thay thế dần mảnh ghép, thứ hai là tạo rakhung chịu lực hay phục hồi sự liên tục của một xương bị khuyết trước đó.Trên thực tế thì mô ghép chết đáp ứng được cả hai yêu cầu về sinh học và vậtlý nói trên

Để đáp ứng hai yêu cầu trên thì mảnh ghép phải được áp sát trở lạivùng cung cấp máu của vâ ôt chủ, nghĩa là phải hạn chế tối đa hiện tượng tiêuxương trong quá trình bảo quản, phải cố định mảnh ghép tốt và vững chắc.Thế nhưng sau khi tách khỏi nguồn cung cấp máu của vật chủ, mảnh xương

dù được bảo quản ở đâu, quá trình tiêu xương cũng xảy ra, nó phụ thuộc vàothời gian và phương pháp bảo quản, bảo quản xương càng lâu thì nguy cơ tiêuxương càng nhiều Như vậy, thời gian bảo quản chắc chắn ảnh hưởng đến đặctính của xương Để giảm hiện tượng tiêu xương, ngoài vai trò của yếu tố vềthời gian, còn có vai trò của nhiệt độ bảo quản, chất bảo quản lạnh (CPAs) vàmột số yếu tố khác

Trong các phương pháp thì bảo quản lạnh sâu được đánh giá cao nhất.Tại hầu hết các trung tâm bảo quản mô trên thế giới cũng như Việt Nam đềusử dụng nhiệt độ bảo quản từ -75C đến -85C (bảo quản bằng máy lạnh cơhọc) vì chi phí ít tốn kém hơn so với bảo quản trong nitơ lỏng (-196C) Các

đă ôc tính vâ ôt lý, sinh học của xương không bị ảnh hưởng bất lợi nào ở nhiệt độ-70°C đến -196°C [23], [24] Sau khi bảo quản xương ở nhiệt độ -80°C nămnăm thì các đặc tính vâ ôt lý, sinh học của xương vẫn không thay đổi [23]

1.4.2 Phương pháp bảo quản đông khô

Đông khô là quá trình làm khô dung dịch nước đã được đông lạnh ởnhiệt độ thấp hơn nhiệt độ eutecti của dung dịch, dung môi được loại trực tiếp

từ pha rắn không qua pha lỏng dưới áp suất giảm (thường dưới 100 mmHg),thu được sản phẩm khô [26]

Bảo quản đông khô xương là xương ghép được khử nước trong môitrường chân không và ở nhiệt độ thấp [10], [27]: từ -36C đến -64C, áp suất0,04 - 0,06 mbar, với thời gian 2 giờ đối với xương xốp và 24 - 48 giờ đối vớixương đặc [27] Sau khi đông khô, lượng nước còn lại trong xương không quá5% trọng lượng nếu đo bằng phương pháp cân và 8% nếu đo bằng cộnghưởng từ hạt nhân [21] Phương pháp đông khô không phải là một cách thứctiệt khuẩn Do đó, chúng thường được phối hợp với phương pháp tiệt trùngbằng tia xạ hoặc oxide ethylene Sự tiệt trùng bằng tia xạ đối với xương đãkhử nước được đánh giá ít hiệu quả hơn so với xương vẫn còn nước [10]

Phương pháp bảo quản ảnh hưởng đến các đặc tính vâ ôt lý, sinh học củamảnh xương đồng loại được cấy ghép [28] Hiệu quả của việc đông khônhững mảnh xương ghép được giới hạn bởi sự có mặt của các tế bào và sựthay đổi miễn dịch của mảnh xương hiến [27] Sau khi được đông khô, xươngkhông còn các tế bào sống nên tính kháng nguyên giảm đáng kể, cấu trúc củaxương tạo điều kiện cho xương mới hình thành Tính kháng nguyên củaxương đồng loại bảo quản theo phương pháp đông khô giảm nhưng khôngmất hẳn và có thể gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trunggian tế bào [10] Trong quá trình đông khô xương đồng loại, xương được rửasạch tủy xương và máu, nhằm ngăn ngừa sự truyền bệnh từ mảnh xương ghép

thông qua thành phần của tủy xương [29] Ở người, xương đồng loại đôngkhô có thể dẫn đến việc tạo thành các kháng thể kháng HLA (humanleucocyte antigen), nhưng điều này không ảnh hưởng gì đến kết quả trên lâmsàng [10].

Khi phân tích phương pháp bảo quản lạnh và những ảnh hưởng của nóđến tính phù hợp sinh học của xương, quá trình này liên quan đến việc hìnhthành các tinh thể đá và sự thay đổi chuyển hóa thứ cấp Nhiệt độ bảo quảncũng ảnh hưởng hiệu quả bảo quản mô Để ngừng hoàn toàn hoạt động của tếbào và ổn định sự hình thành tinh thể đá, mô cần phải được bảo quản ở nhiệt

độ -196ºC Với nhiệt độ cao hơn, các hoạt động chuyển hóa trong tế bào vẫnxảy ra ở mức độ cực kỳ nhỏ, dần dần sẽ gây ra sự chết tế bào Phương phápđông khô đã giúp mô được khử nước đạt độ ẩm mong muốn dưới 5% và tránhđược việc bảo quản ở nhiệt độ thấp trong thời gian dài, giảm thiểu biến dạng

mô và bảo quản tốt hơn các thành phần sinh hóa của mô [27]

Về lý thuyết, mảnh ghép được bảo quản theo phương pháp đông khô cóthể giữ ở nhiệt độ thường lâu dài, nhưng trong thực tế lâm sàng thời hạn sửdụng thường chỉ quy định là 5 năm Xương đồng loại bảo quản bằng phươngpháp đông khô được sử dụng ngày càng phổ biến do dễ vận chuyển đi cácnơi, dễ bảo quản và có tính an toàn cao [10]

Giai đoạn đầu tiên của phương pháp đông khô được mô tả bởi Flewett

và cộng sự (1955), từ đó nó mở đường cho việc sản xuất những mô xươngghép [30] Theo Berkin R.C và cộng sự (1957), việc ứng dụng phương phápđông khô đã mang lại những hiệu quả lâm sàng trong thời gian ngắn, việc sửdụng thuận tiện và dễ dàng, đồng thời cũng rút ngắn được thời gian phẫuthuật từ việc sử dụng xương đông khô, điều này chứng minh cho phươngpháp đông khô được ứng dụng ngày càng rộng rãi [30]

Nguyên lý của phương pháp đông khô: nước rất cần cho sự sống của tếbào và sinh vật Mọi hoạt động chuyển hóa trong tế bào luôn cần có nước

Khi thiếu nước, sự sống sẽ ngưng lại Như vậy, để ổn định các sản phẩm bảoquản không bị thay đổi cần phải giảm bớt lượng nước có trong các sản phẩmđược bảo quản [21] Tế bào hoặc mọi sản phẩm đã được đông khô, ngừnghoạt động, cần phải cung cấp nước khi muốn phục hồi lại trạng thái ban đầu.Khi đặt mô được đông khô vào môi trường đẳng trương, lập tức nước thẩmthấu vào trong mô, tế bào để phục hồi lại trạng thái ban đầu Sau khi đôngkhô, khi muốn ghép trở lại chỉ cần thả mảnh xương vào nước muối sinh lýtrong 30 phút đến 1 giờ, lập tức miếng xương có thể trở lại nguyên dạng banđầu kể cả màu sắc cũng như các đặc tính của xương Phương pháp đông khôchỉ áp dụng được cho những mảnh xương có kích thước nhỏ [10], [21]

Ngày nay, các nhà ngoại khoa sử dụng xương đông khô để ghép rất phổbiến Phương pháp này giúp bệnh nhân tránh được thêm đường mổ xẻ phẫuthuật, thời gian phẫu thuật ngắn lại, lựa chọn được vật liệu ghép: xương đặchay xương xốp, xương đông khô luôn có sẵn phong phú Bằng chứng thựcnghiệm rằng xương ghép đồng loại đông khô chậm lành hơn xương ghép tựthân, điều này không được đánh giá về lâm sàng cho đến nay Đồng thờikhông có bằng chứng về lâm sàng của đáp ứng miễn dịch không thuận lợi.Được kiểm soát tại trung tâm, đạt tiêu chuẩn về vi sinh vật, bảo quản được ởnhiệt độ phòng trong thời gian dài, dễ vận chuyển là những thuận lợi có giá trịcủa xương đồng loại đông khô đáp ứng nhu cầu phẫu thuật trong quân đội[31] Xương ghép đồng loại đông khô được rửa 2 lần kháng sinh, đông lạnh ở-70ºC qua đêm, và sau đó được làm khô đến khi lượng nước còn khoảng 5%trọng lượng Xương ghép đồng loại đông khô cảm ứng xương kém hơn và yếuhơn so với xương được đông lạnh, ít gây đáp ứng miễn dịch nhất Virus HIVkhông lây truyền được ở xương ghép đông khô [6]

Tuy nhiên, quy trình đông khô lại có những đòi hỏi cao về trang thiếtbị, thời gian và nhân viên có kỹ thuật, không thể thực hiện được ở những bệnhviện mức độ trung bình [31] Việc khử nước ở xương đông khô có thể gây ra

những đường nứt gãy vi thể và đại thể theo chiều dọc của xương [6] Cho nênphương pháp bảo quản đông khô làm cho độ cứng của xương ghép giảm điđáng kể [6], [24], [32], có thể giảm đến 50% [6]

Phương pháp đông khô có ưu điểm cho phép lưu giữ xương lâu dài ởđiều kiện nhiệt độ thường nhưng nó không có hiệu lực tiệt trùng, kể cả virusHIV Cho nên, việc diệt khuẩn bằng tia xạ sau đóng gói là rất cần thiết Diệtkhuẩn bằng tia xạ có thể thực hiện bằng tia gamma của Cobalt 60 Sức đâmxuyên của tia gamma là rất lớn Khả năng đâm xuyên của tia beta nhỏ hơn vàicentimet Các tác động về mặt sinh học của hai loại tia này đối với mảnhxương ghép là giống nhau Liều diệt khuẩn hiệu quả phụ thuộc vào số lượng

vi khuẩn nhiễm trong mảnh ghép và sức đề kháng của vi khuẩn đối với tácnhân diệt khuẩn Người ta coi liều diệt khuẩn bằng tia xạ trong công nghiệpthương mại là 25 Kilogray cũng bảo đảm một vùng an toàn cho mảnh ghépngay cả đối với các vi khuẩn có sức đề kháng mạnh nhất [10]

1.5 Sinh học mô ghép xương

Mô ghép xương tự thân, đồng loại hay dị loại, xương đă ôc hay xươngxốp đều bị chuyển hoá trong một chuỗi các quá trình sinh học có những đặcđiểm chung và những điểm khác biệt [4]

Các hoạt đô ông tạo xương, cảm ứng xương, dẫn tạo xương của xươngghép xảy ra tại vị trí ghép và kích thích sự lành xương [9] Trong sự tái sinhxương, đây là ba đă ôc tính thiết yếu và xuyên suốt quá trình, cuối cùng mớixảy ra sự kết nối hòa nhâ ôp giữa xương ghép và xương chủ [6] Chỉ duy nhấtxương ghép tự thân mới có đầy đủ 4 đă ôc tính này [8] Vì vâ ôy, xương tự thânluôn là tiêu chuẩn vàng trong ghép xương

Tính tạo xương:

Đă ôc tính tạo xương là sự hình thành xương ban đầu bởi các tế bào sốngđược ghép Đă ôc tính này chỉ có ở xương ghép tự thân [6], [8], [33] Những tếbào gốc xương có trên mảnh xương ghép vẫn còn sống trong quá trình cấyghép, được kích hoạt bởi protein tạo xương, sẽ phân chia và biê ôt hóa thànhcác tạo cốt bào [8], [33] Trong ghép xương tự thân, các bè xương xốp cùngcác tạo cốt bào trở thành yếu tố kích thích cho sự tái sinh xương Tủy xươngcó chứa các protein tạo xương và các tế bào có tiềm năng tạo xương, cùng với

sự cung cấp máu tại chỗ, sẽ kích thích xảy ra sự tạo xương [34]

Tính cảm ứng xương:

Sự hấp thụ chất khoáng bởi các hủy cốt bào hoă ôc khử khoáng bằng axit

sẽ gây ra sự cảm ứng xương Mă ôt khác, sự cảm ứng xương còn là sự kíchthích và hoạt hóa của các tế bào gốc trung mô của người nhâ ôn từ mô xungquanh mảnh xương ghép biê ôt hóa thành các tế bào sụn và các tạo cốt bào.Quá trình này được kích hoạt bởi nhiều thụ thể bên trong và bên ngoài tế bào,quan trọng nhất là các protein tạo xương BMPs (Bone MorphogeneticProteins) 2, 4, 7 [8], [35], [36]

Tính dẫn tạo xương:

Xương ghép sẽ đóng vai trò như mô ôt khung sườn cấu trúc (cả về mă ôtđại thể và vi thể) để hỗ trợ các thành phần tế bào (như tế bào gốc trung mô,tạo cốt bào, hủy cốt bào, mạch máu) di cư vào bên trong khung sườn, gắn kết,phát triển và phân chia, dẫn đến hình thành xương mới [33], [36]

mạch máu ở vùng ghép mô và sự hợp nhất ở bề mă ôt tiếp xúc giữa xươngghép và xương chủ cũng góp phần làm lành xương và sát nhâ ôp xương ghépvào xương chủ [9], [37]

Mô ghép xương đồng loại là nguồn kháng nguyên tiềm năng có khảnăng kích thích tế bào lympho T phản ứng dẫn đến ghép thất bại hoă ôc thất bạitrong hợp nhất mô ghép với xương chủ, phản ứng này có thể được chi phốibởi viê ôc chuẩn bị mô ghép [38] Tỷ lê ô thành công trên lâm sàng cho ghép môxương đồng loại thay đổi từ 65% đến 90%, chứng tỏ có giới hạn trong sự liềnxương [39] Thất bại trong ghép mô đồng loại thường xảy ra trong 2-3 nămđầu sau ghép, thường do nhiễm trùng, gãy mỏi, sự sinh xương mới xảy ra rấtchâ ôm chạp, không liền hoă ôc châ ôm liền xương nơi tiếp giáp giữa xương chủ

và mảnh xương ghép Thất bại muô ôn khi ghép xương đồng loại liên quan đếnhỏng khớp chỉnh hình, dây chằng không ổn định, viêm thoái hóa khớp [40]

Trong mô ôt số nghiên cứu, sinh học của mô ghép xương liên quan đếnphương pháp bảo quản và mức đô ô khác biê ôt về gen giữa người cho và ngườinhâ ôn [41], [42] Xương ghép đồng loại tươi liên quan nhiều nhất với các đápứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, các đápứng miễn dịch này có thể được giảm bằng bảo quản lạnh sâu ở -80ºC hoă ôcthâ ôm chí giảm rất nhiều sau bảo quản đông khô [43] Nói chung, mô ghépđược bảo quản lạnh sâu hoă ôc xương đồng loại chỉ có sự khác biê ôt nhỏ vềtương hợp mô thì khả năng sát nhâ ôp mô ghép vào xương chủ hầu như thànhcông [9]

Xương ghép đồng loại tươi gây đáp ứng miễn dịch nhiều hơn xươngghép đồng loại được bảo quản lạnh sâu [43], [44], xương đồng loại đông khô

ít gây ra đáp ứng miễn dịch và có ít kháng nguyên nhất [43] Tuy nhiên, đểquyết định mô ôt vâ ôt liê ôu xương ghép là hiê ôu quả nhất, cần phải đánh giákhông chỉ về đáp ứng miễn dịch của người nhâ ôn đối với mô ghép mà cònđánh giá về mă ôt mô học và cơ chế sinh học của mô ghép [9]

Xương đồng loại cũng như các mô đồng loại khác đều kích thích đápứng miễn dịch Cơ thể người nhâ ôn sẽ phản ứng lại mảnh mô ghép, đầu tiên là

sự thâm nhiễm các tế bào lympho của hê ô miễn dịch vào mảnh xương ghép,sau đó có sự thâm nhiễm của đại thực bào và bạch cầu đa nhân trung tính [1],[45], [46] Các tế bào lympho T, lympho B có các thụ thể kháng nguyên đă ôctrưng để nhâ ôn diê ôn các kháng nguyên MHC (Major HistocompatibilityComplex) trên bề mă ôt tế bào có trong mô xương ghép Các kháng nguyênMHC này sẽ kích thích các tế bào lympho T hoạt đô ông, tiếp tục phân chiathành các tế bào TCD4+ (tế bào T hỗ trợ) và TCD8+ (tế bào T gây đô ôc tế bào,

ức chế tế bào), các tế bào này tham gia nhâ ôn diê ôn kháng nguyên [35], [47],[48] Sự nhâ ôn diê ôn này kích hoạt tế bào T tiết cytokine, sau đó kích thíchhoạt đô ông hủy cốt bào [1], [35] Điều này dẫn đến tái hấp thu quá mức vàkhông liền xương hoă ôc châ ôm liền xương nơi tiếp giáp giữa mảnh xương ghépvới mô xương chủ [35]

2.2.2 Vật liệu thực nghiệm

Xương xốp chuột lấy từ đầu xương dài của 10 con chuột cống trong số

35 con chuột ở trên, rồi tạo thành các mẫu xương (40 mẫu) hình viên bi cóđường kính 3mm Các mẫu đồng nhất về kích thước, chủng loại

Sau đó lấy 15 viên bi xương đem bảo quản theo phương pháp đông khô

và 15 viên bi xương đem bảo quản lạnh ở -75C ba tháng, 10 viên bi xươngcòn lại để tươi

Các viên bi xương được bảo quản đông khô và bảo quản lạnh ở -75C

ba tháng được tiệt khuẩn bằng tia gamma nguồn từ Cobalt 60 liều 25 KGy(Kilo Gray)

2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu

Bước 1: Kỹ thuâ êt lấy xương, tạo mẫu xương

Chúng tôi chọn 10 con chuô ôt cống trong số 35 con chuô ôt ở trên Mổlấy các xương dài, cắt lấy hai đầu xương, bỏ đoạn thân xương Tiến hành làmsạch mô liên kết phần đầu xương Tạo 40 mẫu xương hình viên bi đường kính3mm Rửa xương bằng nước muối sinh lý nhiều lần

Chọn 5 mẫu viên bi xương để tươi, cố định ngay trong formol

Chọn 5 mẫu viên bi xương để đem ghép tươi ngay

Số mẫu xương còn lại được bảo quản tạm thời ở nhiê ôt đô ô – 6ºC

Bước 2: Ghép xương tươi cho 5 con chuô êt cống trong số 35 con chuô êt ở trên.

Chuô ôt được gây mê bằng ngửi khí ête Chuô ôt được cố định vào bàn mổthực nghiê ôm chuyên dụng Cạo sạch lông vùng mổ, ở vùng lưng Sát khuẩnvùng mổ bằng cồn iod Rạch da vùng lưng dài 1cm theo hướng trục của chi

Dùng pince và kẹp phẫu tích để bô ôc lô ô tổ chức dưới da, đă ôt viên bi xươngvào ngay dưới da Đóng khâu da, sát trùng lại vết khâu bằng cồn iod Đă ôtchuô ôt vào chuồng nuôi, mỗi con mô ôt chuồng

Theo dõi, cắt chỉ sau 7 ngày ghép và sát trùng lại vết khâu bằng cồn iod

Hình 2.1 Ghép xương tươi.

1 Viên bi xương tươi; 2 Vùng ghép; 3 Đóng khâu da vùng ghép

Bước 3: Bảo quản các viên bi xương theo phương pháp đông khô và phương pháp lạnh sâu (ở -75ºC trong ba tháng)

Lấy các viên bi xương được bảo quản tạm thời trong tủ lạnh ở nhiệt độ

60C đem rửa nhiều lần bằng nước ấm (khoảng 400C) cho sạch tủy và mỡ

Rửa trong oxy già 10% cho sạch xương và tế bào máu Ngâm xươngvào dung dịch kháng sinh khoảng 30 phút Rửa lại nhiều lần bằng nước ấm.Khử mỡ bằng cồn tuyệt đối

Chia thành 2 lô, mỗi lô 15 viên bi xương

 Đối với 15 viên bi xương bảo quản theo phương pháp lạnh sâu:

Cho xương vào các túi vô trùng, rồi để vào tủ lạnh sâu -750C chờ chiếutia gamma Khử trùng bằng tia gamma có nguồn Cobalt 60, liều chiếu 25KGy Bảo quản lâu dài ở -750C (ba tháng)

 Đối với 15 viên bi xương bảo quản theo phương pháp đông khô:

Cho xương vào bình đông vô trùng, rồi để vào tủ lạnh sâu -750C quađêm Đông khô trong máy chuyên dụng với điều kiện nhiệt độ -450C, áp suấtchân không 0,04 mbar, thời gian 48-72 giờ, độ ẩm đạt dưới 5% Khử trùngbằng tia gamma có nguồn Cobalt 60, liều chiếu 25 KGy Bảo quản trong ngănmát tủ lạnh ở 200C

Bước 4: Ghép xương đông khô và xương bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng cho số chuô êt còn lại.

Xương đông khô được ngâm vào trong bát nước muối sinh lý 30 phúttrước khi được ghép

Rã đông xương được bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng trước khi đượcghép

Chuô ôt được gây mê bằng ngửi khí ête Chuô ôt được cố định vào bàn mổthực nghiê ôm chuyên dụng Cạo sạch lông vùng mổ, ở vùng lưng Sát khuẩnvùng mổ bằng cồn iod Rạch da vùng lưng dài 1cm theo hướng trục của chi.Dùng pince và kẹp phẫu tích để bô ôc lô ô tổ chức dưới da, đă ôt viên bi xương

vào ngay dưới da Đóng khâu da, sát trùng lại vết khâu bằng cồn iod Đă ôtchuô ôt vào chuồng nuôi, mỗi con mô ôt chuồng

Theo dõi, cắt chỉ sau 7 ngày ghép và sát trùng lại vết khâu bằng cồn iod

Hình 2.2 Ghép xương được bảo quản đông khô

1 Viên bi xương đông khô; 2 Vùng ghép; 3 Đóng khâu da vùng ghép

Hình 2.3 Ghép xương được bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng.

1 Viên bi xương được bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng;

2 Vùng ghép; 3 Đóng khâu da vùng ghép

Bước 5: Lấy mẫu xương sau ghép.

Sau ghép 1 tháng, tiến hành mổ chuô ôt theo từng lô để lấy mẫu xương.Mẫu xương sau khi được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay bằng formol.Cắt đôi mẫu xương ghép theo mă ôt phẳng vuông góc với bề mă ôt da Cắt bỏbớt vùng mô xung quanh xương ghép, chiều rô ông của vùng mô này là 1mmtính từ vị trí tiếp giáp giữa xương ghép và mô liên kết

Hình 2.4 Mẫu xương ghép sau khi được lấy ra khỏi cơ thể.

A Mẫu xương ghép lúc chưa cắt đôi;

B Mẫu xương ghép đã được cắt đôi theo thiết diê ên vuông góc với bề mă êt da;

1 Xương ghép; 2 Da; 3 Mô liên kết dưới da.

Bước 6: Làm tiêu bản mô học: xương tươi không ghép, xương đông khô không ghép, xương bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng không ghép, xương được ghép tươi, xương được ghép sau bảo quản đông khô và xương được ghép sau bảo quản lạnh ở -75ºC ba tháng.

Cố định xương theo từng lô trong dung dịch formol 10% Khử canxixương bằng dung dịch formol và acid nitric Xương được chuyển qua cồn,qua toluen, qua parafin, đúc trong parafin Cắt tiêu bản dày 3 micromet, cách

5 lát cắt lấy 1 lát cắt Nhuộm tiêu bản bằng hematoxylin-eosin (HE) Quan sáttiêu bản dưới kính hiển vi quang học Mỗi mẫu đều được phân tích trên 3 tiêubản theo các chỉ tiêu nghiên cứu

2.4 Mô hình thực nghiệm

Hình 2.5 Mô hình nghiên cứu.

40 mẫu xương (hình viên bi)

Lô 3: 10 mẫu(Lô đối chứng)

10

khô

khôTiêu bản

Đánh giá biến đổi cấu trúc mô

xương Lấy mẫu xương sau

ghép 1 tháng

Tiêu bản mô học

So sánh cấu trúc vùng mô liên kết

xung quanh xương ghép Đánh giá khả năng dung nạpsau ghép đồng loại