Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm chứa Liposome doxorubicin. (LA tiến sĩ)

HOC VIEN QUAN Y

KHANH THI NHI

NGHIEN CUU BAO CHE VA DANH GIA

TAC DUNG TREN KHOI U THUC NGHIEM

THUOC TIEM LIPOSOME DOXORUBICIN

LUẬN ÁN TIÊN SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2017

HOC VIEN QUAN Y

KHANH THI NHI

NGHIEN CUU BAO CHE VA DANH GIA

TAC DUNG TREN KHOI U THUC NGHIEM

THUOC TIEM

LIPOSOME DOXORUBICIN

Chuyên ngành : Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc

Mã số : 62 72 04 02

LUẬN ÁN TIẾN SỸ DƯỢC HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1.PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ

2.PGS.TS.Nguyễn Minh Chính

HÀ NỘI - NĂM 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố

trong bat kỳ công trình nào khác

Tác giả

Khánh Thị Nhi

LỜI CÁM ƠN

Trong quả trình hoc tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được

sự giúp đỡ tận tình của các Thây cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp và những người thân trong gia đình

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng đặc biệt và biết ơn sâu sắc tới:

PGS TS Pham Thị Minh Huệ PGS TS Nguyén Minh Chinh Những người Thấy đã tận tình trang bị cho tôi kiến thức quý báu trong chuyên môn, ngh nghiệp cũng như trong nghiên cứu khoa học Các Thấy đã luôn bên tôi, động viên tôi, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, lời cám ơn chân thành tới: Ban Giám đốc, phòng Sau đại học, các Thây Cô Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Dược, Bộ môn Sinh Lý Bệnh, Bộ môn Dược Lÿ - Học viện Quân Y da tao mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trinh học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu cùng các Thầy, Cô Bộ môn Bào chế Trường đại học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện vệ sinh dịch tễ Trung

ương đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận án

Tôi xin được gửi lời cám ơn chân thành tới Trung tâm Y Tế Hoài Đức Hà Nội,

sở Y tế Hà Nội, các anh/chị đồng nghiệp, người thân trong gia đình và bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án

Khánh Thị Nhỉ

1.1.Đại cương về doxorubicin -2-s¿©s22++2+++2Ex++rx+eExzvrrxezrxerrseeee 3

1.1.1 Đặc điểm hóa lý: 22- 5s 2s E2 E271 2112112111111 1e 3 1.1.2 Độ ồn định 2222+vcctEE1111 tr 4

1.1.3 Cơ chế tác dụng . ¿¿2++222++22E++t22EEtEEEErEEEErrrkrrrrkrrrrkrree 6 1.1.4 Các đạng bào chế của doxorubicin -¿- + ©s2csz+cxzsczsez 6 1„1;5 Dược động HOGisaassssessraioitosogtttoivii21183463105959014414105XXã480659005883.81033 8

1;1:6: ChỈ/đIHđaessszseenniiitsiiintittg0STTASE0T1803XGXEGGSDNISUSISSSIGt4 1A 56g88 9 II? 5 4354 10

1.1.8 Liều lượng -2¿2¿©2++©+++2EESEEEEEEEEEEEEEE2E22E2EEErkrrrkrrrred 11 1.2 Dai curong Vé liposome .sscecssesssssecsssecssssecsssecssseccsseccsssccssseeesseccsseeesses 12

II Niên 0O 4 12

12.2 PHậïi löãI ÌIDOSOIHEissssaessenesssesooiDEEEDOESESIEREEEOEDSEEEEEITSLAGEESSESESSSE 13 1.2.3 Ưu, nhược điểm của HHDOSO HỆ c0 nnnnd2a0n015465660051315456489416088 15 1.2.4 Nguyên liệu bào chế HIDOSOITi11655515565622362356546535653853585588584E433 50008 16

1.2.5 Phương pháp bào chế liposome -2- 2-22 ©++++++zxzz+zsd 18 1.2.6 Dannh 00009 vcaiaiadđầida - 21 1.3 Các nghiên cứu về liposome doxorubicin -z©z+c5s2 26 1.3.1 Nghiên cứu bào ChẾ 2° ©22c22222EE22221227122713121122112711211221ec xe 26

1.3.2; Danh giá tác dụng H7 VŨVO tacgaatititttitictit84118811111591205165G8011418388545888 33

Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU,THIẾT BỊ, ĐÓI TƯỢNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . -ccccccvceeeesassee 38

2;1:.Nguyên :vật HIẾN: sxescasaxxesgiixii0215400111044558511311804485145555043158631538454X558 38 2.2 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu - 2 +¿++++x++2zx++zxzzrxzezzx 39 2.3 Đối tượng nghiên cứu -¿-©z+2Ex2E+z+EEEtEEEEEEESEEErrrkerrkrrree 40 2.4 Phương pháp nghiên CỨU 5 55+ £+*£+E++EE+EEseeseereeeeeereree 41 2.4.1 Phuong phap ba0 Ch6 ccccccscsesssesssessssesssessssessseessessseesssecssecesecenes 41 2.4.2 Phuong phap danh gia cac dac tinh liposome doxorubicin 45 2.4.3 Phuong phap danh gia chat lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin

2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng cua liposome doxorubicin trên khối

QC ORB Vũ vcssssscnssseersensas meses amma 52 2.5 Phương pháp xử lý số liệu . -¿+++2+++2v+++cvve+trxrerres 55 P.fïiỂuLkiềh thímphiỜitasssesseginssrntrettottitinh/S0G0S0I20000180100009/0000005809300080 56 2.7 Địa điểm nghiên cứu -¿- + ©2s+Ex2 E121 2112112121121 re 56

Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả xây dựng phương pháp định lượng doxorubicin

3.1.1 Phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS - 3.1.2 Phuong: phip HRC sis ccnissnncacn acacia amma on 61 3.2 Két quả xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin 64 3.2.1 Bồ trí thí nghiệm . 2 2£ ©+2+E+++EEEtEEEt2EEESEEEtEEErrrkrrrrerres 64

3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng của tý lệ các thành phần đến đặc tính của liposorme dOXOTUDIGIT sx:sxcsz:i252663073565565030336151956E55E5SSS5ASEXHEXEESHSXSESRSHSA3E91855815XE 66 3.3 Kết quả xây dựng qui trình bào chế liposome đoxorubicin 76 3.3.1 Bào chế liposome chưa mang được chất . -2- 2s 76 3.3.2 Quá trình đưa được chất vào liposome -2-c-¿©2cz+c+ 84 3.4 Kết quả bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 92 3.5 Kết quả đề xuất tiêu chuẩn và đánh giá độ ôn định của thuốc tiêm

Tiposome dOXOLUDTGÌHzzxszzixssc2i2215511511843663058963351515518SSESEISSSRSSSSSSSESESESIEEETSESE 96 3.5.1 Đề xuất tiêu chuẩn ¿- 2+©+s+2+z+EE+EEESEEEEEEEEEEEEkrrkrrrerrrrrex 96 3.5.2 Đánh giá độ ôn định 2-2¿©++++++2Ext2Ex+erxxerrxrsrxerrxerrrs 98 3.6 Kết quả đánh giá tác dụng của thuốc tiém liposome doxorubicin trên

3.6.1 Đánh giá trên chuột nhắt mang tế bào ung thư Sacoma TG 180 103 3.6.2 Đánh giá tác dụng trên khối u chuột thiếu hụt miễn dịch mang tế bảo ung thư tiền liệt tuyến -2- 2+ ©22£+2E++2EE+EEEtEEEEvEEErrrkrrrkeree 109 Chương 4: BÀN LUẬN s °-s<cscesvsscssevseersersserseessersserssre 112 4.1 Phương pháp bào chế liposome -.2- 2 22©2+£x2zz+cxzcrseee 112 4.1.1 Bào chế liposome chưa mang được chất -2- +: 112 4.1.2 Giảm và đồng nhất kích thước liposome 2-2 +: 113 4.1.3 Đưa dược chất vào liposome -.2- 2+ s+xz+£sztxesrxerrseee 116 4.2 Xây dựng công thức bào chế liposome doxorubicin

422.1: Tỷ lệ CÁC HĐÍ-cssnssssniiisisesEEL1958515000335561683955856593155538551514384855E

4:2:2 Tỷ:lệ lIpid./ doXoTUDIGIT š-:-<:zá::sx:sscszc1265663653566465444336151956855E535639530ã 121 4.3 Phương pháp đánh giá liposome ¿- 5 +5 +++<++<£++cx+exeeexes 124 4.3.1 Phương pháp định lượng hàm lượng dược chất . - 124 4.3.2 Phương pháp đánh giá phân bố kích thước tiểu phân 125

4.3.3 Phương pháp đánh giá hình thái cấu trúc . - 125 4.3.4 Đánh giá giải phóng dược chất từ liposome - 126 4.3.5 Độ ổn định liposome .ccecsesssesseessesssessesssessseeseessecssessesesecseeeseesses 127 4.3.6 Về đánh giá tác dụng trên khối u ¿¿+z+z+z2cszze- 128 KẾT LUẬN . - 22: ©22-22S2ES222212221227112111211127112112111111 211.11 xe 132

HẾ XUẤT gunnggnnrndttinorneidiidiititgtiiT0810206100100053180050230001060160800000050831580030088đ 133

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNHĐÃCÔNG BÓ KET QUA NGHIEN

CỨU CỦAĐÈ TÀI LUẬN ÁN . -e-s<escssccsecsseessessersserssse 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MUC CAC TU VIET TAT

1 ADN Acid Deoxyribonucleic

2 ARN Acid ribonucleic

3 BP Bristish Pharmacopoeia ( Dugc dién Anh)

4 CHF Congestive heart failure (Suy tim sung huyét )

5 CHL Cholesterol

7 DC Dược chất

9 DCUT Đối chứng ung thư

10 |DĐVN Dược điển Việt Nam

11 DOPE Dioleoylphosphatidyl ethanolamin

12 DDAB Dimethyldioctadecylammonium bromid

13 DOX Doxorubicin hydroclorid

19 DSPE Distearoyl phosphatidylethanolamin

20 DSPE-PEG | Distearoyl phosphoethanolamin polyethylene glycol

21 DSPG Distearoyl Phosphatidyl glycerol

22 EPC Egg-derived phosphatidylcholin

23 EPG Egg-derived phosphatidylglycerol

24 EurPh European Pharmacopoeia ( Duge dién Chau Au)

25 FDA Food and Drug Administration ( Cục Quản Lý Thực

Phẩm và Dược Pham Hoa Kỳ)

26 HEPES N-2- hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid

27 HER2/neu | Human Epidermal Growth Factor Receptor 2

(Thu thé cua yếu tố tăng trưởng thượng bi)

28 HPC Hydrogenated phosphatidylcholin

29 HPI Hydrogenated phosphatidylinositol

30 HPLC High-performance liquid chromatography (Sac kí lỏng

hiệu năng cao)

32_ |KTTP Kích thước tiểu phân

33 LUV Large unilamellar vesicle ( Liposome đơn lớp lớn)

34 LVEF Left ventricular ejection fraction (Thé tich tống máu

43 PTFE Polytetrafluoroethylene Teflon

44 RSD Relative Standard deviation ( Độ lệch chuẩn tương đối)

45 SD Standard deviation (Độ lệch chuẩn )

50 |TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

51 TEM Transmission electron microscopy (Kinh hién vi điện

tir truyén qua)

52 | TKHH Tinh khiết hóa học

53 Tf Nhiét chay hoan toan

54 Tm melting temperature (Nhiét chay long)

55 USP United State Pharmacopoeia (Dugc dién MF )

56 H Cường độ Ion

DANH MUC CAC BANG

1.1 | Một số phương pháp định lượng doxorubicin 4 1.2 | Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường 7 1.3 | Phan loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp 14 1.4 | Mốt số đặc tinh của phospholipid dùng bảo chế liposome 17 1.5 | Tổng hợp một số nghiên cứu về liposome tuần hoàn lâu trong |_ 29 máu và hướng đích

2.1 | Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu 38

3.1 | Mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở bước sóng | 58

482 nm có và không có tá dược

3.2 | Mối tương quan giữa mật độ quang ở các bước sóng và các | 59

pH khác nhau với nông độ doxorubicin

3.3 | Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng |_ 60

đo quang pho hap thu UV-VIS

3.4 | Méi tương quan gitra dién tich pic va nong d6 doxorubicin 61 3.5 | Độ lặp lại của phương pháp định lượng bằng HPLC 62 3.6 | Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ky 62

3.8 | Các công thức bào chế liposome doxorubicin 65 3.9 | Hàm lượng và hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome 66 3.10 | Tỷ lệ giải phóng dược chất từ các mẫu liposome DOX (pH| 1) 67

3.12 | Kết quả đánh giá kích thước tiểu phân của các mẫu 69

3.13 | Kết quả đánh giá kích thước tiêu phân của các mẫu sau 4 tuần |_ 72

bảo quản

3.14 | Hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 4 tuần và mới bào chê i 73

3.15 | Tỷ lệ giải phóng được chất ( %) liposome DOX sau 4 tuần |_ 74

bảo quản tại pH 7.4

3.16 | Tỷ lệ giải phóng dược chat ( %) liposome DOX sau 4 tuan| 75

bao quan tai pH 5,5

3.17 | Phân bố kích thước hé liposome ở các điều kiện siêu âm khác | 78

3.21 | Hiệu suất liposome héa cia doxorubicin t 6 50°C 85

3.22 | Hiéu suat liposome héa cia doxorubicin ủ trong 30 phút 87 3.23 | Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp thâm |_ 88

tích 3 lân đệm HEPES

3.24 | Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo số lần đổi đệm tiếp | 89 tuyên

3.25 | Hiệu suất liposome hóa doxorubicin theo phương pháp đổi| 90

đệm băng lọc tiêp tuyên

3.26 | KTTP liposome trước và sau khi gắn doxorubicin 91

3.27 | Thời gian hòa tan DOX và hiệu xuất liposome hóa khi sử | 94

dụng dược chât đông khô

3.28 | So sánh các chỉ tiêu chất lượng giữa liposome dox bảo chế | 96

với chê phâm Lipodox

3.29 | Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm | 99

liposome doxorubicin ở điêu kiện dài hạn

3.30 | Theo dõi độ ổn định và một số chỉ tiêu của thuốc tiêm | 101

liposome doxorubicin ở điêu kiện phòng thí nghiệm

3.31 | Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày 103 3.32 | Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày 104 3.33 | Khối lượng u dưới đa của chuột sau 30 ngày 105 3.34 | Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày 106 3.35 | Khối lượng khối u cơ trung bình của chuột sau 30 ngày 107 3.36 | Thể tích khối u cơ của chuột sau 30 ngày 108 3.37 | Kích thước khối u UTTTL người ở các nhóm 110 4.1 | Các hệ đệm được sử dụng để bào chế hỗn dịch liposome| DOX 123

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 | Sự phân hủy doxorubicm trong môi trường acid 5

2.2 | Cơ chế đôi đệm của phương pháp thẩm tích 43 2.3 | Mô tả quá trình thâm tích đề tách doxorubicin tự do trong 49 mau liposome

3.1 | Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang ở các |_ 59 bước sóng và các pH khác nhau với nông độ doxorubicin

3.2 | Mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ doxorubicin 61

3.3 |Đồ thị biểu diễn các chỉ số PDI và Z-average hệ liposome của |_ 70 các mầu

3.4 | Hình ảnh chụp TEM cua liposome doxorubicin bao chế theo 71 công thức A3.2

3.5 | Đồ thị so sánh các chỉ số PDI và Z-average của các mau| 73 liposome sau 4 tuân và mới bào chê

3.6 | Hình ảnh chụp bề mặt soi âm bản của mẫu liposome sau siêu | 81

âm

3.7 | Hình ảnh chụp cắt ngang của mẫu liposome sau siêu âm 82 3.8 | Hình ảnh chụp TEM của liposome khi sử dụng các phương | 84 pháp giảm KT'TP khác nhau

3.9 | Sơ đồ bào chế lọ chứa bột doxorubicin đông khô 93

3.17 | Diễn biến kích thước khối u trên chuột 110

4.1 | Cơ chế tăng thấm thuốc từ tuần hoàn vào vùng u 114 4.2 | Co ché dua doxorubicin hydroclorid vao trong liposome bang | 117 pH-gradient

DAT VAN DE

Từ những năm 50 của thế kỷ XX, doxorubicin (DOX) đã được phát hiện, phan lap tir chung vi khudn Streptomyces peucetius var caesius va duge tng dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh ung thư Hiện nay, doxorubicin có thể được bán tông hợp từ daunorubicin và được sử dụng khá phô biến Tuy nhiên, cũng giống như các thuốc điều trị ung thư thuộc nhóm kháng chuyển hóa khác, doxorubicin có rất nhiều tác dụng không mong muốn, đặc biệt là độc tính gây suy tủy, làm thiếu bạch cầu, giảm tiểu cầu, làm rối loạn nhịp tim và

có thê dẫn đến tử vong Do đó, hiện nay, thuốc tác dụng tại đích đề điều trị

bệnh ung thư là sự lựa chọn thích hợp để tăng cường hiệu quả của thuốc tại

các khối u và giảm độc tính ở các tế bào lành

Một trong những hệ đưa thuốc tại đích đang được chú trọng phát triển trong bào chế hiện đại là dang thuốc liposome Day là dạng thuốc có nhiều ưu điểm trong quá trình vận chuyền, phân bó, kiểm soát giải phóng và tăng sinh khả dụng của dạng thuốc Ưu điểm đặc biệt của liposome sử dụng trong điều trị ung thư là các phân tử thuốc sẽ đi nhiều vào khối u, giải phóng thuốc và hạn chế thuốc đến các mô lành Nhờ sự phát triển của công nghệ nano, trên thế giới đã có một vài hãng sản xuất nanoliposome doxorubicin và được ứng dụng trong lâm sàng như các biệt dược: DoxIl, Caelyx, LipoDox, [41] với nhiều cải tiến về mặt bào chế nhằm nâng cao sinh khả dụng và giảm độc tính

Tuy nhiên ở Việt Nam, các nghiên cứu về liposome chưa nhiều, chưa

có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất Hiện nay, dạng bào chế liposome đang được chú trọng phát triển và có tiềm năng lớn cho tương lai Vì vậy

nghiên cứu liposome doxorubicin là vấn đề cấp thiết nhằm phát triển một thế

hệ thuốc mới cho ngành Dược Việt Nam

Với lý do trên, đề tài luận án: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng trên khối u thực nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin” được tiễn hành với 2 mục tiêu:

1 Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá được độ ổn định

3 Đánh giá độ ôn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml

4 So sánh hiệu quả kháng u của thuốc tiêm doxorubicin bào chế được

và thuốc đối chiếu trên động vật thực nghiệm.

Chương 1 TONG QUAN

1.1 Dai cwong vé doxorubicin

Công thức cầu tạo:

1.1.1 Dac diém hoa lý

Tính chất: Ở điều kiện thường doxorubicin hydroclorid tồn tại dưới dạng tỉnh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Điểm nóng chảy 230”C Dung dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5 Hang sé phan ly pKa, = 7,34 (phenol); pKa, = 8,46 (amin); pKa3 = 9,46 (ester) Tan trong nudc (50 mg/ml

6 25°C), methanol, acetonitril, tetrahydrofuran Khong tan trong cloroform, aceton, ethyl ether, benzene, ether dầu hỏa [133] Trong methanol hấp thụ ở bước sóng 233, 252, 288, 479, 496, 529 nm Dung dịch nước có màu vàng cam với pH acid, màu đỏ da cam tại môi trường trung tính, và màu tím màu xanh ở pH > 9 Với các đặc tính trên, có thể ap dung dinh luong doxorubicin bằng phương pháp quang phổ UV-vis hoặc HPLC với detector tử ngoại hoặc huỳnh quang [131] (bảng 1.1)

Bảng 1.1 Một số phương pháp định lượng doxorubicin

Đo quang ở bước sóng | Đánh giá giải phóng dược chất từ | [15],[79],[133]

bột đông khô, liposome

- đaunorubicinon đo các tác nhân: acid mạnh, ion kim loại, kiềm

Ở pH 9,0 và 10,0 DOX bị phân hủy nhanh chóng Sự phân hủy có thê quan sát trực tiếp bằng mắt thường thông qua sự thay đổi màu sắc dung dịch

từ màu đỏ đến màu xanh-tím và cuối cùng là phân hủy hoàn toàn [34] Công thức của doxorubicin có nhóm NH; có khả năng bị proton hóa và 2 nhóm OH

có khả năng tách proton Do đó trong dung dịch, doxorubicin có thê tồn tại ở các dạng: phân tử trung hòa, Ion lưỡng cực, anion và cation

So sánh với các glycoside khác, ví dụ ginsenosid, trong công thức thiếu

một nhóm chức amin so với doxorubicin, cho thay rang doxorubicin 6n dinh hơn trong dung dịch acid Dược chất tương đối ồn định trong môi trường pH

< 4 Doxorubicin hydrochlorid bền trong dung dịch có pH gần 4,0 Trong

môi trường acid với pH trên 4, DOX có thé bi phân hủy như sau:[133]

Hình 1.1 Sự phân hủy doxorubicin trong môi trường acid

*Nguon: Theo Dominique M.M (1986)[34]

Các chế phẩm dung dịch đậm đặc dé pha dung dịch tiêm truyền trên thi trường đều có pH 3,0-4,0; sử dụng acid hydrocloric để điều chỉnh pH

Ảnh hưởng của nông độ ion:

Sự ảnh hưởng của nồng độ ion tới tốc độ phân hủy DOX đã được nghiên cứu Dung dịch dược chất được điều chỉnh ở pH không đổi (1,25) và thay đôi nồng độ ion bằng cách thêm natri clorid Độ ổn định của dược chất tỷ

lệ căn bậc hai của cường độ ion (0) trong khang 0,14 <(u)'”<0,75 Tại (u)'”> 0,75 tốc độ phản ứng phân hủy dược chất tăng cùng với tỷ lệ trao đổi ion doxorubicin va proton H*[21],[23]

Anh huong cua nhiét do:

Doxorubicin không bền dưới tác động của nhiệt độ Chế phẩm thông thường được bảo quản tại nhiệt độ 4°C Các nghiên cứu đánh giá sự ổn định của DOX trong huyết tương cũng cho thấy tại nhiệt độ 39°C, DOX nhanh chóng bị phân hủy thành các hợp chất không phân cực (DOX-ONE và DOX- OL); quá trình diễn ra chậm hơn tại nhiệt độ 23°C và tương đối ổn định tại

4°C [34]

Bao quan:

Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp Dược chất doxorubicin hydroclorid thường bảo quản dưới 25°C, tránh ánh sáng Các chế

phẩm như dung dịch, hỗn dịch liposome được bảo quản tránh ánh sáng, dé ở nhiệt độ khoảng từ 2- 8°C, bột đông khô pha dung dịch tiêm bảo quản không quá 30°C, tránh ánh sáng [3], [133]

1.1.3 Cơ chế tác dụng

Cơ chế tác dụng chính xác của doxorubicin còn chưa được biết rõ hoàn toàn, tuy nhiên người ta cho rằng nó có khả năng chen vào giữa các cặp ADN,

do đó làm ngăn cản quá trình tổng hợp ADN và loại ARN phụ thuộc ADN

làm rối loạn và phá vỡ cấu trúc Viêc chen vào giữa chuỗi có thê làm đứt

mạch đơn hoặc mạch đôi cũng như làm thay đổi chromatid chị em Sự chia cắt của ADN bằng thuốc qua tác dụng của topoisomerase II hoặc bởi sự phát sinh ion xúc tác của các gốc tự do, cả hydrogen peroxyd và hydroxyl, là những tác nhân phá hủy tế bào Doxorubicin cũng gây ra sự tạo phức topoisomerase- ADN cùng hóa trị do đó ngăn cản phần hàn kín mạch của phản ứng cắt hở- hàn kín mạch trong quá trình sao chép ADN Mặc dù tác dụng của nó qua chu trình tế bào, nhưng độc tính cao nhất xảy ra trong pha tổng hợp ADN (pha S) Với nồng độ dược chất thấp, các tế bào qua được pha

S nhưng sẽ chết ở pha G›[17], [44], [45] [62], [112]

1.1.4 Các dạng bào chế của doxorubicin

về mat bao ché, có thể chia thành 2 dạng thuốc chứa doxorubicin để pha dung dịch tiêm truyền trên thị trường Một là dạng chứa doxorubicin hydroclorid tự do, hai là hỗn dịch liposome Với dạng chứa dược chất tự do,

phô biến là dạng dung dịch đậm đặc để pha dung dịch tiêm truyền, thường với hàm lượng 2 mg/ml, đóng lọ với thể tích khác nhau Một số nhà sản xuất lại bào chế bột đông khô để pha dung dịch tiêm truyền nhằm tăng tuổi thọ cho chế phẩm

Các dạng bào chế chứa doxorubicin được tóm tắt ở bảng 1.2 [3].[17].L118], [72I

Bảng 1.2 Một số chế phẩm thuốc tiêm chứa doxorubicin trên thị trường

Phân loại | Dạng bào chế | Biệt dược Hàm lượng Nước sản xuất

Adorucin 10mg/5ml Korea United

Dang bao chế chứa Eb ewe 50mg/25ml me Ph ( ° Á -

c2 | Doxorubicin | 10mg/Sml David Bull Lab

` m ayne Pharm (Úc

Boi dong tho DBL |50mg/25ml | Mayne Pharmm (Úc)

P ha dj ch truyền Doxorubicin I0me 50m Laboratorios IMA

tinh mach Servycal Es 8 (Achentina)

Doxt ox’ 1 Omg, 50 mg (Achentina)

Zodox 10mg, 50mg Intas (Ấn Độ)

Lọ bột đô

khô pha hôn dịch tiê Myocet 50m Ban Nha):

EE ¥ 5 Sopherion (M¥)

liposome qui ước

20mg/10ml Schering Plough

chứa Doxil 5 ie /30ml Sequus pharm.(Mỹ)

doxorubicin THEGHBE 20mg/10ml (Đài Loan)

liposome nhay | ThermoDox 30mg/15m Corporation,

1.1.5 Dược động học

Doxorubicin hydroclorid không ôn định trong dạ dày và các nghiên cứu trên động vật cho thấy thuốc hấp thu rất kém qua đường tiêu hóa Ngoài ra, thuốc rất khó được phân bồ tới các mô qua đường uống, do đó thuốc được bào

chế dạng tiêm truyền tĩnh mạch Doxorubicin được chuyên hóa bởi enzym

aldoketoreductasesẨ-NADPH thành chất chuyển hóa ưa nước doxorubicinol 13-hydroxyl có tác dụng chống ung thư và là chất chuyên hóa chính Những reductases có mặt trong hầu hết các tế bào, đặc biệt là trong hồng cầu, gan và thận Chất chuyển hóa khác không có tác dụng điều trị bao gồm các aglycon ít tan trong nước, như doxorubicInon (adriamycinon) và 7-deoxy-doxorubicinon (17-deoxy-adriamycinon) Các enzyme reductase chuyển doxorubicin thành 7-deoxyaglycon làm tăng tác dụng gây độc tế bào của thuốc vì nó tạo ra các gốc hydroxyl gây tồn thương tế bào [133]

Do sự khác biệt về mặt bào chế, các chế phẩm chứa doxorubicin khác nhau khi sử dụng cho các thông số dược động học khác nhau [141]

Với dung dịch truyền tĩnh mạch, đồ thị nồng độ trong huyết tương không xuất hiện ở 3 pha tương ứng với thời gian bán thải là 12 phút; 3,3 giờ và 33 giờ Thời gian bán thải tương đối dài của doxorubicin phản ánh việc phân bố vào các mô của dược chất Chỉ khoảng 33-50% dạng chuyền hóa tìm thấy trong nước tiêu, mật và phân sau 5 ngày truyền tĩnh mạch Phần còn lại của dược chất và các sản phẩm chuyển hóa vẫn còn nằm lại trong các mô tại các

tổ chức của cơ thể Với bệnh nhân ung thư, doxorubicin làm giảm adriamycinol, một chất có độc tính Quá trình này được xúc tác bởi enzym aldoketoreductases-NADPH, được tìm thấy trong tất cả các mô và đóng vai trò quan trọng để xác định dược động học của doxorubicin [28] Thể tích phân

bố lớn (700 - 1100 L/m?, liên két doxorubicin va chất chuyển hóa doxorubicinol với protein huyết tương là 74-76% và không phụ thuộc vào nồng độ của doxorubicin (> 2 uM)

Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do Sự phân bố của dạng liposome bị giới hạn bởi lòng mạch, liên kết protein không đáng kể, thời gian phân bố dược chất tới các mô là 5 phút cho thấy sự hấp thu nhanh chóng của doxorubicin Trong khi thời gian bán thải của thuốc gắn với liposome thường là dài (ví dụ Doxil có tịạ= 20-48 giò) Khác với dạng dung dịch, liposome chuyên hóa theo hai giai đoạn: giai đoạn đầu tương đối ngắn (5 giờ) và giai đoạn thứ hai kéo dài (55 h)[134]

Gabizon và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu với chế phẩm Caelyx cho thấy thời gian bán thải khoảng 50-55 giờ với liều lượng từ 10-20 mg/m” trong điều tri các bệnh nhân sarcoma Kaposi liên quan đến AIDS, 60-80 giờ với mức liều 35-70 mg/m” ở bệnh nhân mang khối u rắn; 36 giờ với liều 40- 70mg/ni trên các bệnh nhân khoa nhi

Độ thanh thải huyết thanh của Doxil 0,041 1⁄h/m2 với liều 20 mg/m”

Do thanh thải chậm, nên sinh khả dụng của Doxil gấp 2-3 lần so với doxorubicin tự do [105]

Các chế phẩm liposome gan PEG va khéng gan PEG cũng có sự khác biệt Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn Dạng liposome doxorubicin khéng PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh trong huyết tương của tổng lượng doxorubicin sử dụng cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng tự do [134]

Với dạng bào chế bột pha tiêm, dung dịch tiêm doxorubicin hydroclorid các chỉ định được đưa ra thường là điều trị trong một số khối u răn và khối u

10

máu ác tính, và thường được sử dụng trong điều trị các khối u sau đây: ung thư vú, ung thư phổi, ung thưbiểu mô buồng trứng, ung thư bàng quang, u nguyên bào thần kinh, khối u Wilm, u liên kết mô mềm, u xương ác tính, bệnh bạch cầu cấp tính Iymphocytic — lymphoblastic, bệnh bạch cầu nguyên bào tuỷ cấp tinh, ung thu khéng Hodgkin, bénh Hodgkin (lién quan mach bach huyét)

Doxorubicin cũng đã thê hiện hoạt tính chống ung thư, các khối u ác tính

ở người lớn và nhi khoa sau đây: ung thư biểu mô tuyến giáp, ung thư biểu

mô nội mạc tử cung, ung thư đầu và cổ, ung thư dạ dày, ung thư biểu mô tế bào gan chính, ung thư tỉnh hoàn, ung thư biểu mô tuyến tiền liệt, Ewing sarcoma, Rhabdomyosarcoma, đa u tủy, ung thư bạch cầu mạn tính

Trong khi đó dạng bào chế thuốc gắn trong PEGylated liposome (Doxil, Caelyx) có những chỉ định hẹp hơn, cụ thể hơn như:

*Diéu tri ung thư vú và buồng trứng, nó được sử dụng đề giếtcác tế bào ung thư, thu nhỏ kích thước và trì hoãn sự tăng trưởng của khối u

*Sử dụng trong kết hợp với thuốc khác là bortezomib để điều trị nhiều u tủy,

là một ung thư huyết tương tế bào Tế bào huyết tương được sản xuất trong tủy xương và là một thành phần của hệ thống miễn dịch

*Sử dụng để điều trị bướu thịt Kaposi, một dạng khác của ung thư, cải thiện làm phẳng, làm sáng và co rút bướu thịt Kaposi của bệnh ung thư [105],

[134]

Đối với dạng bào chế liposome chứa doxorubicin hydroclorid nhung không gắn PEG đại diện là Myocet chỉ định chính được đưa ra trong điều trị ung thư vú nhằm mục đích giảm chi phí cho người bệnh tuy nhiên vẫn đảm bảo tập trung dược chất

1.1.7 Độc tính

Nhìn chung, sử dụng các chế phẩm chứa doxorubicin đều có nguy cơ gây độc tính lên cơ thể Độc tính trên tim là nghiêm trọng nhất, nhất là khả năng

11

suy tìm sung huyết (CHF) đe dọa tính mạng người bệnh Ngoài ra các độc tính trên da, hệ tiêu hóa, thần kinh, cũng đã được ghi nhận [3],[32],[1341 Một trong các mục đích của bào chế liposome doxorubicin là để giảm độc tính do khả năng hướng đích

1.1.8 Liều lượng

*Liéu dùng: được tính trên cơ sở diện tích da

+ Các chế phẩm dung dịch tiêm và bột pha tiém doxorubicin hydroclorid: Điều trị các khối u rắn: Khi một tác nhân duy nhất được sử dụng là doxorubicin, liều được đề nghị là 60-75mg/m” cho mỗi chu kỳ ba tuần Nếu doxorubicin được sử dụng kết hợp với các tác nhân chống ung thư khác có khả năng chồng chéo độc tính, liều khuyến cáo cho mỗi chu kỳ là 30- 60mg/m’

Điều trị ung thư bạch cầu cấp tính: liều khuyến cáo của doxorubicin là 2,4 mg/kg trọng lượng cơ thé (tương ứng 75-90 mg/m”), được dùng trong ba ngày liên tiếp (một chu kỳ) Thời gian và liều của chu kỳ thứ hai được quyết định dựa vào tình trạng tủy xương và các tế bào máu ngoại vi, thời gian giữa chu kỳ ít nhất là 10 ngày [3]

Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bảng quang trong điều trị ung thư

ác tính Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin Img/ml trong 1h cách nhau 1 tuần hoặc 1 thang [3]

+Các chế phẩm liposome:

Sau khi được gắn vào liposome, doxorubicin được lưu giữ lâu hơn trong tế bao ung thư, do đó liều lượng của dạng bào chế này ít hơn và khoảng cách xa hơn so với dùng dạng dược chất tự đo

- Ung thu budng trimg: 50 mg/m’ trong 4 tuần điều trị, dùng tối thiểu 4 đợt

- AIDS liên quan đến Kaposi bướu thịt: 20 mg/m” trong 3 tuần điều trị

- Da u tủy: 30 mg/m” vào ngày thứ 4 sau khi sử dụng bortezomib được kiểm soát ở mức 1,3 mg/m” vào những ngày 1,4,8 và 11, sau mỗi 3 tuần[105],[134].

12

Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú di căn với liều tương tự như dang doxorubicin tự do[133]

*Cách sử dụng:

Với dung dịch tiêm cũng như bột pha dung dịch tiêm doxorubicin:

Dung dịch doxorubicin được cho từ từ vào ống truyền tĩnh mạch có sẵn dung dịch tiêm truyền natri clorua, hoặc dextrose 5% tiêm [3]

Voi hon dich tiém liposome doxorubicin:

Việc pha loãng hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin phụ thuộc vào công thức bào chế Với liposome không gắn PEG (ví dụ như Myocet) quá trình hydrat hóa dùng đệm citrat, do đó nhà sản xuất thường khuyên pha loãng với dung dịch natri clorid đẳng trương Đối với liposome gắn PEG như Lipodox, Caclyx, quá trình đưa dược chất vào liposome sử dụng chênh lệch đệm amoni, môi trường bên ngoài liposome được đẳng trương bằng sucrose do đó nên pha loãng với dung dich glucose 5% [72], [118]

1.2 Dai cwong vé liposome doxorubcin

1.2.1 Khai niém

Liposome thuộc hệ đưa thuốc tới đích, là dạng phát triển ở mức cao hơn thuốc tác dụng kéo dài Nó là một dạng đặc biệt của microcapsule và nanocapsule, cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích thước thay đổi từ

hàng chục đến hàng nghìn nanomet [1], [2], [9]

Đặc tính của mang phospholipid cua liposome 1a mang kép lipid gém hai lớp Trong quá trình hình thành liposome, các phân tử lipid hòa tan bao gồm một đầu ưa nước và một đuôi ky nước, các lưỡng phân tử lipid tự kết tụ, sắp xếp liền nhau thành phiến mỏng khi độ hòa tan của chúng giảm dần ở môi trường nước

Các đầu ưa nước của màng kép lipid quay ra tiếp xúc với pha nước, trong khi đó các đuôi ky nước quay vào nhau trong màng kép (hình 1.2)

Phân loại về mặt cấu trúc:

Tùy theo phương pháp bào chế và quy trình làm giảm kích thước tiểu phân (KTTP), các liposome có kích thước, số lớp vỏ khác nhau Qua đó, có thể phân thành các loại liposome như trong bảng 1.3[1]

Phân loại theo cau tao lop vo cua liposome: / ; Theo thành phân phospholipid cũng như theo sự thay đôi trên bê mặt phospholipid ta có thể phân chia thành: liposome quy ước, liposome nhạy cảm pH hoặc nhiệt độ, liposome tích điện dương bề mặt, liposome gắn các yếu tố 6n định, liposome gắn kháng thể (Hình 1.3)

Tuy nhiên cách phân chia này chỉ là tương đối dựa trên từng nghiên cứu

của các tác giả khác nhau (hinh 1.3) [20], [47], [69], [81].

14

Bảng 1.3 Phân loại liposome trên cơ sở kích thước và số lớp

Loai liposome Đường | Số lớp | Đối xứng Hình ảnh

theo cầu trúc kính vo

Cac liposome da lop 0,4 -3,5 Be as

(Multilamellar - MLV) oem | | số | THAI XEHg

Các liposome đa túi 4-10 - Không đối

(Large unilamellar - LUV) um I Đôi xứng

Cac liposome đơn lớp nhỏ | 0,02- ko

(Small unilamellar - SUV) | 0,1 um Ị Đôi xứng ©

*Nguon theo Jesorka A (2008) [74]

ol?

— S*

*Nguon theo Torchilin V P (2005)[138]

A: Liposome quy wéc; B: Liposome gan khang thé; C: Liposome gan yéu to

ổn định; D: Liposome gắn kháng thể và các yếu tố ổn định; E: Các dạng liposome với các chất hướng đích khác; a- Thuốc tan trong nước; b-Thuốc tan trong dâu; c,d- Kháng thể gắn trên bê mặt liposome; e- Các phân tử PEG

- Cau trúc màng phospholipid cua liposome tuong tự cau tric mang sinh học của cơ thể sống, do vậy liposome sẽ là chế phẩm y học có tính an toàn

ung thư là các tiểu phân liposome mang dược chất có đường kính nhỏ hơn các

lỗ rò ở các mạch máu nuôi khối u nên sẽ vượt qua được những khe hở này đi vào khối u, giải phóng thuốc Còn kích thước các khe hở ở những mạch máu của các mô bình thường có đường kính nhỏ hơn, không cho các tiểu phân

liposome đi qua, vì vậy giảm thuốc đến các mô lành và gây độc Trong công

nghệ mới người ta bào chế các liposome có gắn trên bề mặt các ligand (phối

tử hay khớp nối) ví dụ kháng thể bề mặt, folat, vv , các khớp nối này sẽ hướng liposome tập trung nhiều ở mô ung thư giải phóng được chất Với vai trò là một chất mang, liposome phát huy tốt khả năng chứa và vận chuyên những vật chất như gen, hemoglobin, vv mà dạng thuốc khác không làm được hoặc không hiệu quả bằng [9], [20], [138]

*Nhuoc diém:

- Độ ổn định của liposome không cao Liposome là một hệ không đồng pha, luôn có khả năng kết tập của các tiểu phân trong hệ dẫn đến sự không ôn

- Nguyên liệu tinh khiết, đắt tiền nên giá thành chế phẩm cao [1], [138] 1.2.4 Nguyén liéu bao ché liposome

Phospholipid là thành phần chính của liposome, do có cấu tạo gồm một đầu thân dầu và một đầu thân nước nên nó có khả năng tự kết hợp để tạo thành lớp màng kép trong môi trường nước với những hình dạng khác nhau tùy thuộc nồng độ lipid Cac phospholipid ding dé bao ché liposome rat da

dang, co thể xuất tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên (đậu nành, lòng đỏ trứng) hoặc tổng hợp Các phospholipid có thể kế tên các nhóm chính sau:

Loại lipid

carbon: sô dang (°C) (pH 7,4)

dây nối đôi)

DPPE-mPEG-2000.Na 16:0 N/A -1

*Nguon Volkmar Weissig(2010)[147]

Cholesterol và dẫn chất được thêm vào phospholipid trong bào chế

liposome, thường phối hợp ở tỷ lệ phù hợp trong thành phần của màng

liposome Cholesterol có tác dụng làm giảm độ cứng và tính thấm của vỏ liposome Tỷ lệ giữa các phospholipid và cholesterol là rất quan trọng, quyết định đặc điểm của màng, sự ồn định của màng Trong cấu trúc màng kép của liposome, phospholipid và cholesterol tương tác liên kết nhau qua các cầu nối acyl [99]

Trong quá trình bào chế lớp vỏ liposome, người ta còn dùng các chất khác:

- _ Chất tích điện tạo ra lực đầy tĩnh điện giữa các lớp vỏ cia liposome dé làm tăng dung tích của khoang nước, do đó làm tăng khả năng đưa các dược

- Chất cảm biến pH, cảm biến từ tính, [1], [15], [29],[33],[1 141

Ở phương pháp đông khô còn dùng thêm các tá dược tạo khung cho quá trình đông khô, hay sử dụng các loại duong nhu sucrose, mannitol, lactose

[24],[139],[114],[135]

1.2.5 Phương pháp bào chế liposome

Hiện nay có rất nhiều phương pháp bào chế liposome, một trong các phương pháp hay được dùng nhất, ứng dụng hiệu quả nhất và dé bé sung, cai tiễn là phương pháp Bangham hay còn gọi là phương pháp hydrat hóa màng mỏng lipid

Nguyên tắc của phương pháp: Hoà tan phospholipid và các thành phần cấu tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (cloroform, methanol, ), bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay, phospholipid sẽ tạo thành màng film mỏng bám lên thành bình cất Nhiệt độ tiến hành xấp xỉ nhiệt độ chuyên pha của lipid Có thể sục khí nitrogen để bay hơi hoàn toàn dung môi hữu cơ Trên quy mô lớn người ta tiến hành tạo film mỏng bằng phương pháp phun sấy Hydrat màng film đã tráng: thêm dung dịch nước có hệ đệm (như đệm phosphat, đệm citrat, ), vừa cho vừa lắc để phospholipid hydrat hoá tạo thành liposome [9], [98]

Hạn chế của phương pháp hydrat hóa film là các liposome tạo thành có kích thước lớn không đồng nhất và lớp vỏ có thể có nhiều lớp

Để khắc phục hạn chế này, người ta hay sử dụng các biện pháp sau:

19

-Lọc ép bậc thang nhiều lần qua màng lọc (hay dùng màng poly-

carbonat) có kích thước xác định nhỏ dần, mỗi cỡ lỗ lọc khoảng 10 lần Các

liposome tạo ra với kích thước nhỏ hơn, phân bố kích thước đều hơn [60],

[741.193]

- Có thể siêu âm ở tần số phù hợp dé cho các liposome phân tán đều, các

liposome to vỡ ra tái tạo các liposome nhỏ hơn hoặc sắc ký tách đoạn liposome (hay dùng sắc ký cột lọc gel) [116]

- Kết hợp công đoạn đông lạnh- rã đông tuần hoàn: liposome sau khi bảo chế đem đông lạnh ở nhiệt độ rất thấp sau đó rã đông ở nhiệt độ cao trên nhiệt

độ chảy của lipid, làm tuần hoàn như vậy khoảng 5-10 vòng Trong các thao tác này, các liposome cỡ lớn, nhiều lớp bị vỡ ra và tái tạo các liposome cỡ nhỏ, vỏ lipid ít lớp hơn từ các mảng lipid kép Liposome thu được có kích thước nhỏ và phân bố kích thước đều hơn [47], [98]

Dược chất có thể được đưa vào trong liposome theo hai cách:

- Với cách thứ nhất: Phối hợp ngay trong quá trình bào chế hình thành

liposome Dược chất thân nước thì hoà vào dung dịch nước, dược chất thân dầu hoà vào dung dịch phospholipid trong dung môi hữu cơ Trong quá trình bào chế bản thân dược chất đã được đưa vào bên trong liposome

- Với cách thứ hai: Dược chất có thể được đưa vào liposome bằng cách: sau khi chế tạo xong liposome chưa chứa dược chất, pha dược chất trong dung dịch, phối hợp liposome rồi ủ với điều kiện nhiệt độ, thời gian nhất định

để được chất đi qua màng gắn vào bên trong liposome theo các cơ chế khác nhau

Như vậy sau bước đưa dược chất vào trong liposome, dược chất tan trong nước sẽ nằm trong khoang nước (nhân nước) của liposome, còn dược chat tan trong dầu sẽ nằm trong các lớp vỏ lipid [26],[91]

20

Trong thực tế người ta có thể kết hợp cả hai cách thức trên để đưa được chất vào trong liposome nhằm rút ngắn thời gian và tăng hiệu suất của quá trình này

Trong quá trình đưa dược chất vào trong liposome, dé tang hiệu suất đưa dược chất gắn vào trong liposome có thể dùng các phương pháp:

- Dựa vào chênh lệch pH: dạng tồn tại của dược chất phụ thuộc nhiều vào pH, sau khi hydrat hóa xong, người ta thay đồi pH môi trường bên ngoài tạo ra sự chênh lệch pH, khi dược chất vào bên trong do pH môi trường thay đôi dạng tồn tại của được chất có thể thay đổi ví dụ: ít tan hơn, tạo phức, tạo gel, quá trình này tạo điều kiện cho dược chất được kéo vào bên trong liposome nhiều hơn Hoặc pH môi trường bên ngoài liposome thay đổi làm dược chất thay đổi dạng dễ tiếp cận lớp vỏ lipid dé vao bén trong liposome

nhiều hơn [91]

- Dựa vào chênh lệch áp suất thẩm thấu hoặc chênh lệch nồng do ion: sau khi hydrat hóa người ta tạo ra su thay déi néng d6 ion hay ap suat tham thấu ở môi trường bên ngoài liposome làm cho dược chất vào bên trong liposome nhiều hơn Cơ chế chủ yếu là sự trao đổi ion của các phân tử [91],

[98]

- Dựa vào sự thay đối môi trường chứa dược chất ở bên trong liposome khác với bên ngoài làm thay đổi dạng tồn tại của dược chất dẫn đến tăng quá trình được chất đi vào bên trong liposome

Ví dụ với một được chất có tính base yếu nhu doxorubicin, Bolotin Elijah M va CSda van dung phương pháp này như sau: sau khi bào chế liposome, hydrat hóa bằng dung dịch amoni sulfat 120mM, làm giảm và đồng nhất kích thước liposome, sau đó thấm tích để thay thế môi trường amoni sulfat bên ngoài bằng dung dịch doxorubicin hydroclorid trong amoni clorid Doxorubicin dưới dạng ion (DXR-NH;”) từ môi trường đi qua vỏ liposome vào bên trong liposome, tại môi trường bên trong ion này kết hợp với ion

21

sulfat (SO¿”) tạo thành phân tử dạng gel gần như kết tủa Kết quả là doxorubicin đi qua lớp màng nhiều hơn vào bên trong do thay đổi quá trình cân bằng doxorubicin giữa bên trong và bên ngoài màng [26]

Ngoài ra còn nhiều phương pháp khác để bào chế liposome như:

- Phuong pháp Batzri và Korn (phương pháp hòa tan ethanol) [98]

- Phuong phap Deamer va Bangham [38], [98]

- _ Phương pháp bốc hơi pha đảo [74]

- _ Phương pháp pha loãng polyol [100]

- Phuong phap hoa tan và thâm tách chất diện hoat [100]

- Phuong pháp đông khô [24], [8Š]

- _ Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn [56]

- _ Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới han [126]

1.2.6 Danh gia liposome

*Hinh thai liposome:

Các thông số về hình thái bên ngoài và cấu trúc của liposome nhu hình dáng, đặc điểm bề mặt, cấu trúc lớp vỏ lipid vv ảnh hưởng nhiều đến đặc tính và tác dụng của hệ liposome

Các thông số hình thái bên ngoài được đánh giá bằng cách quan sát, chụp bởi kính hiển vi điện tử quét (SEM) có khả năng phóng đại đến 300.000 lần

và chụp được các tiêu phân liposome tới kích thước trên 10 nm Qua đánh giá này thu được hình ảnh bề mặt cua liposome [3],[74]

Để đánh giá cấu trúc cắt ngang của liposome, người ta sử dụng hệ thống kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) có khả năng chụp được mặt cắt của các tiểu phân Qua đánh giá này thu được hình ảnh mặt cắt ngang cấu trúc cua tiéu phan liposome, hinh anh cau tric lớp vỏ lipid và bên trong nhân của liposome

22

Ngoài ra hiện nay người ta còn dùng một số phương pháp đánh giá như chụp bằng kính hiển vi cộng hưởng từ hạt nhân (ARS) cho hình ảnh 3 chiều của tiêu phân, hiển vi nhiệt quét (STM), hiển vi lực nguyên tử

*Kích thước tiểu phân của liposome và phân bố kích thước tiểu phân:

KTTP của liposome liên quan nhiều đến hiệu quả đưa thuốc đến đích

(mô bệnh) của liposome và hiệu quả lâm sàng, thời gian bán thải của thuốc KTTP càng nhỏ, gần 100nm sé dem lại hiệu quả điều tri cao hon [74], [110] Các tiểu phân liposome được bào chế ra có các kích thước dao động trong một khoảng xác định Khoảng dao động này càng hẹp, kích thước các tiêu phân liposome càng đều đặn thì độ ôn định cua liposome cang cao [153] Do vậy trong bào chế liposome mang dược chất, ngoài việc làm nhỏ các tiểu phân, nhà bào chế còn phải dùng các kỹ thuật đề làm đồng đều hóa các tiểu phan liposome [20], [105]

Để xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích thước tiểu phân có thé

đo trực tiếp bằng các phương pháp chụp hình ánh trên hoặc các phương pháp đánh giá như phương pháp nhiễu xạ ánh sáng động hay dùng các thiết bị laser Kết quả thu được là kích thước của các tiểu phân trong hệ phân bố ở các khoảng nào với tỷ lệ bao nhiêu Liên quan đến sự phân bồ kích thước tiêu phân của hệ liposome 1a chỉ số đa phân tán PDI (polydiversity index) Chỉ số này càng nhỏ phản ánh kích thước các tiểu phân trong hệ liposome càng đồng đều PDI của hệ liposome dưới 0,25 được coi là phân bố hẹp, PDI trên 0,5 là phân bồ rộng[79]

*Hàm lượng dược chất gắn vào liposome và khả năng giải phóng dược chất: Trong dạng thuốc có chứa liposome, tỷ lệ được chất gắn vào liposome càng cao thì càng thỏa mãn yêu cầu của dạng thuốc Để đánh giá hàm lượng dược chất gắn vào liposome người ta định lượng dược chất trong liposome theo phương pháp phù hợp với dược chất Tính toán lượng dược chất tổng

*Ð6 ổn định của liposome:

Một trong những lí do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuất hàng loạt là vấn đề độ ổn định của chế phẩm Trong quá trình bảo quản liposome không bền về cả mặt hoá học và vật lý:

+ Về hoá học: phospholipid, thành phần chính của vỏ liposome là hợp chất dễ bị oxy hoá Quá trình oxy hoá tăng nhanh do tác động của các yếu tố: nhiệt độ, ánh sáng, 1on kim loại, pH môi trường vv [1], [2]

+Vê vật lý: Có hiện tượng thay đổi tính thấm của lớp lipid trong quá trình bảo quản gây rò rỉ dược chất và sự kết vón liposome làm giảm hiệu suất dược chất được gắn vào liposome, thay đổi quá trình giải phóng dược chất

[1], [2]

Đề đánh giá độ ôn định của liposome, người ta đánh giá các chỉ tiêu chất

lượng của liposome (hính thái cảm quan, kích thước, phân bố kích thước, hàm lượng dược chất, khả năng giải phóng dược chất, vv ) sau các khoảng thời gian xác định mà liposome được bảo quản ở các điều kiện nhất định

*Sinh khả dụng của liposome:

Sinh kha dung in vivo cua liposome được đánh giá thông qua các thử nghiệm trên động vật Có nhiều loài động vật được sử dụng để xây dựng mô

hình in vivo như thỏ, mẻo, chuột, cá, gà Trong số đó, chuột được sử dụng

Sau khi động vật thử nghiệm được tiêm liposome, các thông số dược động học của liposome và dược chất được xác định tại các cơ quan đích cần đánh giá như: gan, lách, khối u, bằng các biện pháp khác nhau như bóc tách

mô, chiết được chất, định lượng hoặc chụp ảnh huỳnh quang (kết hợp đánh dấu huỳnh quang trước đó) Qua đánh giá ở các thời điểm khác nhau sẽ cho kết quả đặc điểm dược động học và đặc tính hướng đích của mẫu liposome Các thông số này thường được so sánh với chế phẩm đối chiếu như dạng bào chế thường quy hay chế phẩm dang liposome co san [40], [41], [46], [66],

[94]

*Tinh an todn cua chế phẩm:

Chế phẩm liposome cần được đánh giá độc tính ở nhiều khía cạnh

+ Độc tính với té bao in vitro: chọn tế bào cho ủ với liposome trong môi trường thích hợp rồi xác định tỷ lệ tế bào sống sót, so sánh với chế phẩm đối chiếu để đánh giá độc tinh in vitro cua mau liposome nghién cứu [61], [49]

Do cấu trúc đặc biệt của hệ mang thuốc liposome là lớp vỏ phospholipid kép, do vậy nghiên cứu trên tế bào ¿zviro phải chứng minh được khả năng xâm nhập vào tế bào của liposome cao hơn so với dạng dược chất tự do Ví

dụ, ưu thế của doxorubicin là phát huỳnh quang, nên dễ dàng quan sát bằng thiết bị phù hợp

Tuy nhiên, khi dùng dạng liposome, được chất được chứa trong khoang