Nghiên cứuđánh giáthựctrạng vi khuẩn helicobacterpylori ởbệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh hải dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử (tt)

Lý do chọn đề tài Helicobacter pylori được biết đến như là một nguyên nhân chính hay thủ phạm của bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và là yếu tố được công nhận nhiều nhất

PHẦN I - MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Helicobacter pylori được biết đến như là một nguyên nhân chính hay thủ phạm của

bệnh viêm dạ dày mãn tính, loét dạ dày tá tràng và là yếu tố được công nhận nhiều nhất gây

ung thư dạ dày, đặc biệt là ở các nước đang phát triển Người nhiễm Helicobacter pylori

tăng nguy cơ ung thư dạ dày gấp 6 lần so với người bình thường

Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng như ở nhiều nơi trên thế giới, các bệnh dạ

dày liên quan đến Helicobacter pylori đã và đang được điều trị nhờ sử dụng phác đồ chống tiết và kháng sinh Tuy vậy, trên thực tế các chủng Helicobacter pylori kháng thuốc đã xuất hiện và do đó

nhiều bệnh nhân được điều trị nhưng không khỏi hoặc điều trị không triệt để Cho tới nay vẫn chưa

có một nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm Helicobacter pylori và khả năng kháng thuốc của

Helicobacter pylori trên địa bàn tỉnh Hải Dương Do đó, ứng dụng các kỹ thuật y sinh học

hiện đại như PCR để phát hiện nhanh và chính xác Helicobacter pylori, đồng thời xác định tính kháng kháng sinh của chủng Helicobacter pylori nhằm hỗ trợ điều trị bệnh viêm dạ dày

ở các bệnh viện tuyến tỉnh nói chung và ở một số bệnh viện tuyến huyện tại Hải Dương là rất cần thiết Xuất phát từ ý nghĩa lý luận và thực tiễn đó chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đánh giá thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori ở bệnh nhân viêm

dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương bằng kỹ thuật sinh học phân tử”

2 Mục đích nghiên cứu

2.1 Mục tiêu chung

Góp phần trong chẩn đoán và điều trị viêm dạ dày ở bệnh nhân nhiễm vi khuẩn

Helicobacter pylori tại tỉnh Hải Dương

2.2 Mục tiêu cụ thể

- Đánh giá được thực trạng nhiễm Helicobacter pylori và Helicobacter pylori kháng

thuốc ở các bệnh nhân viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

- Bước đầu đưa một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

3 Nội dung của đề tài

- Phân tích dịch tễ học đánh giá thực trạng bệnh nhân viêm dạ dày

- Nghiên cứu thực trạng vi khuẩn Helicobacter pylori kháng kháng sinh ở bệnh nhân viêm dạ dày do Helicobacter pylori

- Bước đầu đề xuất một số giải pháp kiểm soát và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả thực trạng nhiễm vi khuẩn H pylori và tình trạng kháng kháng sinh là cơ sở

khoa học cho việc kiểm soát, đánh giá và điều trị hiệu quả căn bệnh viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc ứng dụng quy trình phát hiện nhanh, chính xác

H pylori và H pylori kháng thuốc trong điều trị viêm dạ dày trên địa bàn tỉnh Hải Dương

PHẦN II - NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ H PYLORI

1.1.1 Lịch sử phát hiện

Gulio Bizzozero lần đầu tiên ghi nhận sự hiện diện của một loại vi khuẩn sống ở dạ dày chó Tiếp theo, nhiều nhà khoa học cũng tìm thấy một loại xoắn khuẩn hiện diện trong lớp nhầy của dạ dày nhưng lại thất bại trong việc nuôi cấy vi khuẩn Năm 1982, Robin Warren và người học trò của mình là Barry Marshall mới thành công nuôi cấy vi khuẩn từ 11 bệnh nhân

bị viêm dạ dày và Marshall đã chứng minh được những ảnh hưởng của vi khuẩn này đối với bệnh lý dạ dày Căn cứ vào hình dạng và đặc tính tăng trưởng của vi khuẩn mà người ta

đặt tên vi khuẩn là Campylobacter pylori Do có những khác biệt lớn trong tính chất sinh hóa và cấu trúc chuỗi RNA Do đó hiện nay vi khuẩn được đặt lại là Helicobacter pylori

[44,45]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của Helicobacter pylori

Về mặt sinh học, Helicobacter pylori (H pylori) là vi khuẩn Gram âm không tạo bào

tử, có lông roi, một đầu được cấu tạo từ các sợi bao bọc bởi lớp vỏ bên ngoài có tác dụng bảo vệ khỏi axít dạ dày Dưới kính hiển vi, vi khuẩn có hình xoắn cong, đường kính khoảng 0,3 - 1 µm, dài 1,5 -10 µm

Hình 1.1: Vi khuẩn H pylori Bảng 1.1: Vị trí phân loại học của H pylori

Giới(regnum): Bacteria Họ (familia): Helicobacteraceae

Ngành(phylum): Proteobacteria Chi (genus): Helicobacter

người, H pylori sống trong phần sâu của lớp màng nhầy của niêm mạc dạ dày, giữa lớp

nhầy với bề mặt của lớp tế bào biểu mô và ở các vùng nối giữa các tế bào này

1.1.3 Đặc điểm di truyền của H pylori

H pylori có kích thước genome bằng khoảng 1/3 kích thước genome của E coli và

tương đương với genome của Haemophilus influenza Genome của H pylori là một nhiễm

sắc thể mạch vòng có kích thước khoảng 1,67 Mb, gồm khoảng 1600 gen tổng hợp các protein tham gia vào quá trình trao đổi chất của vi khuẩn [38,42]

1.1.4 Dịch tễ học về H pylori

Nhiễm H pylori là một trong những nhiễm khuẩn mãn tính thường gặp nhất ở người Tần suất nhiễm H pylori thay đổi tùy theo tuổi, tình trạng kinh tế, xã hội và chủng tộc

Đường lây nhiễm chủ yếu gồm 3 nguồn lây chính thức:

- Nguồn lây từ động vật: một số loại gia súc, gia cầm và động vật trong tự nhiên có thể

mang H pylori như chó, gà, vịt, chim, cừu… và trở thành nguồn lây cho người

- Nguồn lây từ môi trường, trong đó nước được coi là yếu tố quan trọng nhất

- Nguồn lây từ người sang người: là đường lây phổ biến, nhất là trẻ em và đặc biệt tại

những nơi có điều kiện vệ sinh kém

1.1.5 Cơ chế gây bệnh của H pylori

H pylori có khả năng tiết urease mạnh, enzym này có hoạt tính rất mạnh phân giải urê

thành amoniac Amoniac có phản ứng kiềm, tạo thành một lớp đệm bao quanh H pylori,

giúp cho chúng tránh được môi trường axit cao của dạ dày Mặt khác, amoniac sinh ra cũng

gây độc trực tiếp đối với tế bào niêm mạc dạ dày H pylori còn tiết ra các độc tố tế bào, các

độc tố này cũng gây độc và phá huỷ tế bào

Hình 1.3: Cơ chế gây bệnh của H pylori 1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN H PYLORI

Hình 1.4: Mẫu thử CLO test

Thực tế cho thấy, sử dụng test urea có thể cho kết quả âm tính do mật độ vi khuẩn thấp

hoặc dương tính giả do men urease của các vi khuẩn như Enterobacter.sp và

Pseudomonas.sp trong dạ dày làm cho thuốc thử chuyển màu Trong khi đó sử dụng các kỹ

thuật phân tử sẽ không bỏ sót bất cứ trường hợp nào bởi tính nhạy và tính đặc hiệu của các

kỹ thuật phân tử rất cao

1.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn H pylori

H Pylori phát triển tốt và phân lập được dễ dàng trên môi trường thạch máu Sau khi đã

mọc thành khuẩn lạc, H Pylori được xác định nhờ các tính chất: vi khuẩn Gram âm, có các

enzyme urease, oxydase, catalase Dù vậy, về mặt thực tiễn lâm sàng ít khi dùng phương pháp

này H pylori là loài vi khuẩn rất khó nuôi cấy ở điều kiện in vitro, nó cần môi trường và khí trường đặc biệt khi nuôi cấy Hơn nữa khuẩn lạc của H pylori trên môi trường đặc thường trong

hoặc màu xám nhạt thường khó phân biệt, đôi khi gây tan máu, đường kính của khuẩn lạc rất nhỏ khoảng 1 mm, xuất hiện sau thời gian dài 48-72 giờ Do vậy kết quả chẩn đoán dựa trên kết quả nuôi cấy thường không ổn định, kém chính xác và mất nhiều thời gian

Bảng 1.2: Độ nhạy của thử nghiệm nuôi cấy

1.2.3 Ứng dụng PCR trong chẩn đoán nhiễm H pylori

Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhưng chưa được phổ biến rộng rãi

ở Việt Nam trong chẩn đoán nhiễm H pylori Theo một số kết quả nghiên cứu thì PCR có

độ nhạy khá cao Mẫu bệnh phẩm có thể lấy từ mẫu sinh thiết dạ dày, dịch hút dạ dày, mãng cao răng, nước bọt hay từ phân

Ngoài việc chẩn đoán nhiễm H pylori trước điều trị, PCR còn dùng để theo dõi sau điều trị tiệt trừ H pylori Hơn nữa, PCR có thể phân biệt được sự khác nhau giữa tái nhiễm và tái

phát, hoặc là một nhiễm khuẩn khác kết hợp

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H.PYLORI TRÊN THẾ GIỚI

1.3.1 Xác định sự có mặt của H.pylori bằng phân tích trình tự gen đặc hiệu 16S rRNA

1.3.1.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen 16S rRNA

16S rRNA là gen tổng hợp rRNA 16S cấu tạo nên tiểu phần nhỏ ribosome của vi

khuẩn Ở H pylori gen này có kích thước khoảng 133 bp Người ta cho rằng rRNA đóng vai

trò rất quan trọng trong cấu trúc của ribosome, giúp cho việc gắn kết của các protein ribosome và góp phần quyết định hình dạng của ribosome [19,27]

Hình 1.5 Cấu trúc của gen 16S rARN đặc thù cho các loài vi khuẩn Prokaryote và

Archea (Woese et al 1987)

Woese và các cộng sự (1977) đã xác định 16S rRNA là phân tử rất thích hợp làm thước đo tiến hóa Tuy nhiên, do những đòi hỏi cẩn trọng trong thao tác với rRNA bởi rRNA dễ bị phân hủy nên sử dụng gen mã hóa cho rRNA thường là đối tượng phân tích trong các nghiên cứu

Trình tự gen 16S rRNA còn là một công cụ được sử dụng để định danh vi khuẩn vì nhiều lý do

- Đầu tiên, số liệu DNA của một sinh vật là đáng tin cậy hơn số liệu hình thái trong nghiên cứu phân loại

- Các gen 16S rRNA là tương đối ngắn, làm cho nó nhanh hơn và rẻ hơn, nhưng lại đủ dài để có thể để xác định trình tự gen của vi khuẩn

Cho đến nay, số lượng các gen 16S rRNA đã được giải trình tự lên đến hơn 10.000

Điều này cho thấy sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học đến đối tượng này [30,46]

1.3.1.2 Tình hình nghiên cứu về gen 16S rRNA

Gen 16S rRNA được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu để xác định vi khuẩn gây

bệnh Cũng như tất cả các loài vi sinh vật tiền nhân khác, H pylori mang gen 16S rARN có trình tự đặc thù cho mỗi loài vi khuẩn Vì vậy, để xác định tên của H pylori trong mẫu bệnh

phẩm, người ta dùng một cặp mồi đặc thù để nhân vùng bảo thủ trên gen, sau đó giải trình

tự và đối chiếu nó với các đoạn gen đó biết trên các thư viện gen bằng chương trình Blast

Tại Việt Nam, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kết quả để phân tích trình tự 16S

rRNA nhằm phát hiện nhanh H pylori trong các bệnh nhân viêm loét dạ dày tá tràng

(Nguyễn Đức Toàn và cs, 2012; Nguyễn Văn Thịnh, 2010)

1.3.2 Xác định tính kháng kháng sinh của H.pylori qua phân tích trình tự gen 23S RNA

1.3.2.1 Tiêu chuẩn chọn kháng sinh điều trị H pylori

Các kháng sinh được lựa chọn điều trị H pylori phải thỏa mãn được các yêu cầu sau:

- Nhạy với H pylori

- Nồng độ kháng sinh trong dạ dày phụ thuộc vào pH của dạ dày, nên nồng độ kháng sinh phải cao

- Để tiêu diệt được vi khuẩn H pylori kháng sinh phải vượt qua được hàng rào chất nhày, đến với lớp biểu mô bề mặt nơi H pylori cư trú

1.3.2.2 Dịch tễ học của kháng kháng sinh

Sự đề kháng kháng sinh của H pylori là yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu quả của các

phác đồ điều trị hiện dùng Tỉ lệ loài vi khuẩn kháng thuốc thay đổi tùy theo từng vùng địa

lý khác nhau, và tương quan với mức sử dụng kháng sinh trong dân số nói chung Do đó,

việc theo dõi tỉ lệ đề kháng kháng sinh tỏ ra có ý nghĩa đối với việc điều trị nhiễm H pylori

trong thực hành lâm sàng

1.3.2.3 Tình hình nghiên cứu về gen 23S rRNA liên quan đến kháng kháng sinh ở

H pylori

Tổng cộng có 31 nghiên cứu hội đủ các tiêu chí thu nhận, báo cáo số liệu của bệnh nhân được thu thập từ năm 1993 đến 2009 Cụ thể, có 17 nghiên cứu ở châu Âu, 10 ở châu

Á, 2 ở châu Phi và 2 ở châu Mỹ Tỉ lệ kháng kháng sinh tính chung của H pylori là 17,2%

dao động trong khoảng 16,5-17,9% với clarithromycin; 26,7% (25,2-28,1%) với metronidazole; 11,2% (9,6-12,7%) với amoxicillin; 16,2% (14,4-18,0%) với levofloxacin; 5,9% (4,7-7,1%) với tetracyclin; 1,4 (0,8-1,9%) với rifabutin và 9,6% (8,5-10,7%) với 2 hoặc nhiều loại kháng sinh [44]

Bảng 1.3 : Tỉ lệ đề kháng kháng sinh ở các khu vực khác nhau trên thế giới

Khu vực Amoxicillin Clari

thromycin Tetracylin Levofloxacin Đa kháng Châu

Mỹ

8/352 (2,2%)

118/402 (29,3%)

11/393

53/352 (15%)

11/456 (2,4%)

106/908 (11,6%)

21/252 (8,3%)

Châu Âu 3/599

(0,5%)

352/3156 (11,1%)

14/599 (2,1%)

148/614 (24,1%)

204/2272 (8,9%)

Tính

chung

184/1640 (11,2%)

2014/11697 (17,2%)

94/1580 (5,9%)

254/1562 (16,2%)

278/2876 (9,6%)

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ H PYLORI TẠI VIỆT NAM

Trong các bệnh viện Việt nam, nhiễm H pylori thường được phát hiện bằng các test

như sau:

1 Test thứ nhất: Lấy sinh thiết dạ dày của bệnh nhân đến khám chưa qua điều trị

kháng sinh bằng phương pháp nội soi, sau đó xác định hoạt tính urease của H pylori trong

sinh thiết bằng các test thử bán sẵn ở thị trường hay các phản ứng sinh hoá

2 Test thứ hai: Xác định H pylori qua test thở 13 C và 14C Trong phân tích, bệnh nhân được nuốt một viên thuốc chứa urea mang cacbon đánh dấu đồng vị phóng xạ, sau một thời gian, các bác sĩ thu thập hơi thở của người bệnh và xác định lượng phóng xạ có trong khí CO2- sản phẩm hoạt động men urease của vi khuẩn

1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU H PYLORI TẠI HẢI DƯƠNG

Hiện nay, ở tất cả các đơn vị Bệnh viện đa khoa tuyến tỉnh cũng như tuyến huyện tại

Hải Dương, H pylori chưa được xác định bằng các phương pháp thích hợp mà chỉ được chẩn đoán là có trong dạ dày người bệnh, dựa trên hình ảnh nội soi kết hợp nuôi cấy H

pylori từ dịch tiêu hóa, làm test Urease để phát hiện H pylori Ở thời điểm hiện tại, các kỹ

thuật Y sinh học hiện đại như PCR phát hiện nhanh và chính xác H pylori cũng như xác định tính kháng kháng sinh của H pylori nhằm hỗ trợ điều trị bệnh còn hầu như chưa được

ứng dụng ở các bệnh viện tuyến huyện cũng như tuyến tỉnh

CHƯƠNG II- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

100 bệnh nhân đến khám tự nguyện tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương từ tháng 1/2015 đến tháng 7/2015 Các bệnh nhân được lấy sinh thiết đều có:

- Tuổi từ 18- 80;

- Bị viêm dạ dày mãn tính, loét hoặc ung thư dạ dày;

- Không dùng kháng sinh trong thời gian 1 tháng trước khi nội soi, từ tháng 1/2015 đến tháng 7 năm 2015

Các mẫu sinh thiết được bảo quản trong nitơ lỏng, lưu giữ ở -200 C hoặc -700 C cho tới khi tách chiết DNA

2.2 HÓA CHẤT VÀ TRANG THIẾT BỊ

Các loại hóa chất và các dung dịch đệm cần pha dùng trong các thí nghiệm của đề tài được trình bày trong các bảng sau

Bảng 2.1: Danh mục các dung dịch đã sử dụng

2 Đệm TBE 10X 1M Tris - HCl; 830 nM axit boric; 1 nM EDTA; pH 8,0

Bảng 2.2: Danh mục các hoá chất và hãng sản xuất

1 Hóa chất tách DNA (ProteinaseK,

Bảng 2.3: Các thiết bị, dụng cụ phân tích thí nghiệm STT Thiết bị, dụng cụ Hãng sản xuất (nước)

10 Tủ lạnh sâu –200C, tủ lạnh 40C Sanyo (Nhật Bản)

12 Găng tay, khẩu trang, tube các cỡ 1,5 và

Tổng số mẫu trong nghiên cứu này được xác định là 100 mẫu

2.3.2 Phương pháp lấy mẫu

Thủ thuật nội soi được thực hiện bởi các bác sĩ Khoa Thăm dò Chức năng Bệnh viện

đa khoa tỉnh Hải Dương

2.3.3 Phương pha ́ p tách chiết DNA từ mẫu bê ̣nh phẩm

Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu sinh thiết được tiến hành theo phương pháp của Ausubel(1995)

2.3.4 Điện di

DNA sau khi tách chiết, được phân tích định tính bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

2.3.5 Định lượng, định tính DNA bằng quang phổ kế

Sau khi thu nhận DNA, tiến hành xác định nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp quang phổ kế

2.3.6 Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA xác định sự có mặt của H pylori

1-10 ng DNA được sử dụng để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA có kích thước 133 cặp base bằng phương pháp PCR với cặp mồi:

F: 5′-AGGGGTAAAATCCGTAGAGAT- 3’

R: 5′-CGTTTAGGGCGTGGACTA- 3’

+ Điện di trên thạch Agarose 1,5% để kiểm tra kích thước sản phẩm