Xây dựng quy trình phát hiện pseudomonas aeruginosa trong một số mẫu chế phẩm thuốc bằng kỹ thuật PCR

Tuy nhiên, tại Việt Nam việc triển khai ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử như PCR trong kiểm nghiệm phát hiện vi sinh vật gây bệnh như P.aeruginosa chưa được nghiên cứu, triển kh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THU CÚC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG

MỘT SỐ MẪU CHẾ PHẨM THUỐC

BẰNG KỸ THUẬT PCR

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THU CÚC

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN

PSEUDOMONAS AERUGINOSA TRONG

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và rèn luyện tại trường cũng như quá trình tôi tiến hành làm luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo trường Đại học Dược Hà Nội, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng với các thầy cô giáo và anh chị bộ môn Hóa sinh trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt công việc nghiên cứu khoa học của mình

Đặc biệt tôi xin tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với PGS.TS Nguyễn Thị Lập người đã trực tiếp tận tình hướng dẫn và góp ý để tôi hoàn

thành luận văn này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và cơ quan công tác

đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Hà nội, ngày 3 tháng 4 năm 2017

Học viên

Trần Thị Thu Cúc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 PSEUDOMONAS AERUGINOSA 3

1.1.1.Đặc điểm hình thái và nuôi cấy 3

1.1.2.Đặc điểm sinh hóa 4

1.1.3 Đặc điểm kháng nguyên 5

1.1.4 Hệ gen 6

1.1.5.Các yếu tố độc lực 7

1.1.6 Khả năng gây bệnh 9

1.1.7 Khả năng kháng thuốc kháng sinh 10

1.2 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOÀI VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG 11

1.2.1 Theo phương pháp truyền thống 11

1.2.2 Theo phương pháp hiện đại 12

1.2.2.1 Phương pháp ELISA 13

1.2.2.2 Phương pháp giải trình tự DNA 13

1.2.2.3 Phương pháp lai phân tử (Hybridization) 14

1.2.2.4 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) 15

1.3 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 23

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 23

2.1.2.Nguyên vật liệu, trang thiết bị: 23

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.2.1 Các bước tạo mẫu tự tạo dùng trong nghiên cứu 26

2.2.2.Quy trình phát hiện P aeruginosa theo phương pháp truyền thống .27

2.2.3 Tách chiết DNA của vi khuẩn và phương pháp PCR 29

2.2.3.1 Tách chiết DNA của vi khuẩn: 29

2.2.3.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) 30

2.2.3.3 Nhân bản đoạn gen 16S ribosomal RNA của các loài vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 30

2.2.3.4 Lựa chọn các yếu tố của phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của P aeruginosa 32

2.2.3.5 Nhân bản của các đoạn gen đặc hiệu của P aeruginosa bằng các cặp mồi đặc hiệu đã chọn 35

2.2.3.6 Điện di ADN trên gel agarose 35

2.2.3.7 Đánh giá độ đặc hiệu: 36

2.2.3.8 Đánh giá độ nhạy của phương pháp: 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 39

3.1 TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM THUỐC TỰ TẠO 39

3.1.1 Tạo các mẫu tự tạo và kiểm tra sự có mặt của P aeruginosa theo phương pháp truyền thống 39

3.1.2 Kết quả kiểm tra tách chiết DNA tổng số bằng điện di 41

3.1.3 Kết quả kiểm tra tách chiết DNA của vi khuẩn tổng số bằng PCR .42

3.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR 43

3.2.1.Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen

đặc hiệu của P aeruginosa 43

3.2.2 Nhân bản đoạn gen đặc hiệu của P aeruginosa 50

3.2.3 Xác định độ đặc hiệu của các quy trình đã thiết lập 51

3.2.4 Xác định ngưỡng phát hiện của các quy trình đã thiết lập 55

3.3.ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PCR ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG MẪU CHẾ PHẨM TỰ TẠO 57

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 61

4.1 VỀ KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA CỦA P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM 61

4.2 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG CHẾ PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR 61

4.3 VỀ KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUY TRÌNH PCR ĐÃ THIẾT LẬP ĐỂ PHÁT HIỆN P.AERUGINOSA TRONG MẪU CHẾ PHẨM TỰ TẠO 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

PCR Polymerase chain reaction (phản ứng trùng hợp chuỗi)

P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa

DNA Acid deoxyribonucleic

RNA Acid ribonucleic

dNTP Deoxynucleotide triphotphat

ATCC American Type Culture Collection (Ngân hàng chủng chuẩn

Hoa kỳ) CFU Colony forming unit (đơn vị hình thành khuẩn lạc)

bp Base pair (cặp base)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Đặc điểm hình thái của P.aeruginosa trên các môi trường lựa

chọn 28 Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR kiểm tra DNA mới tách…………31 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng của một phản ứng PCR thông thường…… 32

Bảng 2.4: Dải nồng độ lựa chọn thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen đặc hiệu……… 33 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR khảo sát lựa chọn các thành phần phản

ứng nhân bản gen đặc hiệu ……… …….34

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra P aeruginosa trong 5 mẫu tự tạo theo phương

pháp truyền thống ……… 40

Bảng 3.2 Chu trình nhiệt thích hợp cho phản ứng nhân bản đoạn gen đặc hiệu

của P aeruginosa ……… 44

Bảng 3.3 Bảng thành phần PCR phù hợp nhất cho phản ứng nhân bản các

đoạn gen đặc hiệu ……….……….49

Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp mồi trên 26 loài chủng vi

sinh vật chuẩn……… 52

Bảng 3.5 Kết quả đếm lại số lượng vi sinh vật đưa vào mẫu ban đầu… ….55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA ……….41

Hình 3.2: Nhân bản đoạn gen 16s rRNA của vi khuẩn bằng cặp mồi ID16R08F và IDL16R09R ………42 Hình 3.3 Kết quả tối nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR nhân bản đoạn gen

đặc hiệu của P aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 43

Hình 3.4: Kết quả lựa chọn nồng độ mồi cho phản ứng PCR nhân bản đoạn

gen đặc hiệu của P aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 45

Hình 3.5: Kết quả lựa chọn nồng độ Mg2+ cho phản ứng PCR nhân bản đoạn

gen đặc hiệu của P.aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 46

Hình 3.6: Kết quả lựa chọn nồng độ dNTPs cho phản ứng PCR nhân bản đoạn

gen đặc hiệu của P aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 47

Hình 3.7 Kết quả lựa chọn nồng độ enzyme cho phản ứng PCR nhân bản

đoạn gen đặc hiệu của P aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 48

Hình 3.8: Kết quả lựa chọn nồng độ đệm cho phản ứng PCR nhân bản đoạn

gen đặc hiệu của P aeruginosa bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……… 49 Hình 3.9 Kết quả nhân bản các đoạn gen đặc hiệu của P aeruginosa bằng các

cặp mồi PAL-F/PAL-R ………51 Hình 3.10.Kết quả PCR kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi PAL-F/PAL-R 54 Hình 3.11: Kết quả kiểm tra ngƣỡng phát hiện của quy trình

……… …… 56

Hình 3.12 Kết quả điện di kết quả PCR kiểm tra hiệu quả tách chiết DNA từ các mẫu tự tạo ……… 57

Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của P

aeruginosa trong các mẫu tự tạo bằng cặp mồi PAL-F/PAL-R ……….58

Hình 3.14 Kết quả PCR phát hiện P aeruginosa trong một chế phẩm nghi ngờ nhiễm P aeruginosa ……… 60

ĐẶT VẤN ĐỀ

Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) là vi khuẩn phổ biến gây

bệnh cho người và động vật Trong thời kì thị trường thuốc đang rất phát triển

và sôi động như hiện nay, việc giám sát chất lượng thuốc càng trở nên khó khăn và phức tạp, đòi hỏi ngành kiểm nghiệm nói riêng và cả ngành y tế nói chung càng phải có nhiều nghiên cứu chặt chẽ Do vi khuẩn có khả năng dị hóa để lấy năng lượng từ các hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ nên nếu có mặt trong thuốc vi khuẩn có thể sẽ gây ra sự hư hỏng công thức thuốc bằng cách phá hỏng hoạt chất cũng như các tá dược Hơn thế nữa, sự hiện diện của một

số lượng lớn các vi sinh vật và các vi sinh vật gây bệnh sẽ là mối đe dọa sức khỏe nghiêm trọng cho người dùng thuốc Vì vậy, việc giám sát chặt chẽ các

vi sinh vật này không được có mặt trong thuốc là vấn đề tối cần thiết

Dược điển của các nước trên thế giới và Dược điển Việt Nam IV qui

định không được có mặt P.aeruginosa trong các chế phẩm dùng cho nướu

răng, lợi, da, mũi, tai, miếng dán qua da, chế phẩm xông hít, dạng đặt âm đạo, chế phẩm dùng đường uống có chứa nguyên liệu chưa qua xử lí có nguồn gốc

từ động vật và dược liệu

Mặt khác, sử dụng các phương pháp truyền thống thường mất nhiều công sức, tốn thời gian, chậm và đôi khi không đặc hiệu nên không đáp ứng được các trường hợp cần chẩn đoán nhanh, chính xác và điều trị kịp thời PCR đã được nghiên cứu và đang được ứng dụng rộng rãi trong các phòng kiểm ngiệm trên thế giới nhằm phát hiện một cách nhanh chóng, chính xác các vi sinh vật chỉ điểm y tế Tuy nhiên, tại Việt Nam việc triển khai ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử như PCR trong kiểm nghiệm phát

hiện vi sinh vật gây bệnh như P.aeruginosa chưa được nghiên cứu, triển khai

và ứng dụng

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài ―Xây dựng quy trình

phát hiện Pseudomonas aeruginosa trong một số mẫu chế phẩm thuốc bằng kỹ thuật PCR‖ với các mục tiêu cụ thể sau:

+ Tách chiết được DNA của P.aeruginosa trong các mẫu chế phẩm thuốc + Xây dựng được quy trình phát hiện P.aeruginosa bẳng phương pháp PCR + Ứng dụng được quy trình đã xây dựng để phát hiện P.aeruginosa trong các

mẫu chế phẩm thuốc

Chương I: TỔNG QUAN

1.1 PSEUDOMONAS AERUGINOSA

1.1.1.Đặc điểm hình thái và nuôi cấy

Pseudomonas aeruginosa (P aeruginosa) là trực khuẩn Gram âm, hiếu

khí có hình dạng thẳng hoặc hơi cong, hai đầu tròn, kích thước khoảng 1μm × 1,5-5μm Có một lông ở một đầu nên có khả năng di động, có các pili

0,5-là nơi tiếp nhận nhiều loại phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ, ít khi có vỏ và không sinh nha bào[2] Mặc dù được phân loại là

một sinh vật hiếu khí, P aeruginosa còn được xem như là sinh vật kị khí tùy

nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy[10]

P.aeruginosa có thể thể hiện ra các kiểu hình: chủng trơn nhẵn, mịn

(smooth), chủng sần sùi, thô (rough), hay chủng nhầy (mucoid) tùy thuộc trong các điều kiện môi trường sống Các chủng mịn và nhầy có vai trò trong

sự xâm lấn và sản xuất các yếu tố độc lực

P.aeruginosa dễ dàng nuôi cấy trên các môi trường nuôi cấy thông

thường (thạch thưòng, thạch máu, canh thang), hiếu khí tuyệt đối pH thích hợp từ 7,2 – 7,5 (dao động 4,5 – 9,0), nhiệt độ tối ưu là 37°C, nhưng chúng có thể mọc được trong khoảng dao động rộng (5 – 42°C), sự kết hợp giữa sản

xuất pyocyanin và khả năng phát triển ở 42°C là đủ để phân biệt P.aeruginosa

từ Pseudomonas spp khác (Ví dụ, P.fluorescens, P.putida, P.stutzeri,

P.putrefaciens) Thời gian thế hệ của P.aeruginosa là 0,58 giờ[2] Trên môi

trường đặc, có thể gặp hai loại khuẩn lạc: loại chủng to, mịn, bò trải dẹt, giữa lồi lên trông giống như quả trứng ốp (fried egg) và loại chủng thô, đôi khi gặp loại chủng lạc nhầy Trong các bệnh phẩm lâm sàng thường gặp loại thứ nhất và trong các mẫu lấy từ môi trường, thường gặp loại thứ hai

Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố và chất thơm Có hai loại sắc tố chính:

- Pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuyếch tán tốt ra môi trường nuôi cấy, làm cho môi trường và khuẩn lạc có màu xanh nên có thể nhận ra một cách dễ dàng bằng mắt thường

- Pyoverdin: là loại sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím có bước sóng 400 nm Pyoverdin không bền vững, dễ mất đi trong điều kiện nuôi cấy không chuẩn Khi nuôi cấy vi khuẩn ở môi trường có nồng

độ sắt thấp, nó được tổng hợp nhiều hơn Cấu trúc hóa học của pyoverdin chưa được biết đầy đủ [1]

Có khoảng 10% P.aeruginosa không sinh sắc tố[1] Trong trường hợp

này chuẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn King, Ward và Raney đã tìm ra thạch Pseudomonas Agar P (môi trường aka King A) để tạo điều kiện cho vi khuẩn tăng sinh pyocyanin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường aka King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tăng sinh sắc tố pyoverdin[31]

Chất thơm do trực khuẩn mủ xanh sinh ra là kimetylamin

1.1.2.Đặc điểm sinh hóa

Các tính chất hóa sinh thường được sử dụng trong lâm sàng gồm: urease(-), indol(-), H2S (-), citrate Simmon (+), catalase (+), agrinin dihydrolase và gelatinase (-), khử NO3

thành N2 Trên môi trường Oxidase fermentation (OF) nhiều loại cacbonhydrat bị thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethanol, arabinose, fructose và galactose

-P.aeruginosa không lên men đường lactose

P.aeruginosa có đủ các cytochrome (b,c,a và oxidase) trong hệ thống

vận chuyển điện tử Trong thực hành thường dùng ―oxidase test‖ để kiểm tra

sự có mặt của cytochrome oxidase [1]

1.1.3 Đặc điểm kháng nguyên

- Kháng nguyên liên kết với tế bào:

+ Kháng nguyên lông H là các protein đặc hiệu nằm trong lông của vi khuẩn Có 50 type kháng nguyên H Kháng nguyên H không chịu nhiệt nên khó khăn trong việc điều chế, do đó việc định type huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi

+ Kháng nguyên thân O có bản chất là lipopolysaccharide(LPS) -

protein LPS của P aeruginosa gồm 3 phần: phần lõi (core), chuỗi bên đặc

hiệu O (mang tính kháng nguyên đặc hiệu type huyết thanh) và lipid A quy

định độc tính Trong các chủng mịn của P aeruginosa, 5-30% của các lõi

LPS được thay thế bằng chuỗi bên O có cấu trúc, chiều dài và biến thể khác nhau gọi là type huyết thanh [48][59] Với các chủng thô chứa ít, ngắn, hoặc không có chuỗi O bên và dễ bị tiêu diệt trong ống nghiệm bằng cách bổ sung

huyết thanh [18][59] Nói chung, chủng P aeruginosa phân lập từ môi trường

và từ các bệnh nhiễm trùng bệnh viện là chủng mịn và kháng huyết thanh còn chủng phân lập từ phổi của bệnh nhân xơ nang tiến triển là chủng thô và nhạy

cảm với huyết thanh [18] Ngoài chủng thô, nhiều P aeruginosa phân lập từ

các bệnh nhân xơ nang hiển thị kiểu hình nhầy do sản xuất rất nhiều alginate exopolysaccharide [32] Kháng nguyên O được nghiên cứu nhiều và được sử

dụng kích thích miễn dịch bảo vệ chống P aeruginosa Theo Uỷ ban phân

loại Quốc tế (International Antigenic Typing Scheme, IATS), việc định type

kháng nguyên O (serotype) chia P aeruginosa thành 17 nhóm kháng nguyên

được ký hiệu từ O1 đến O17[29] Đến năm 1990 ba kháng nguyên mới đã được Liu và Wang bổ sung thêm vào hệ thống phân loại này thành 20 type

kháng nguyên[36] Việc xác định type rất có ý nghĩa trong phân loại, xác định tính phổ biến và sự phân bố của vi khuẩn theo địa dư và các loại bệnh, để từ

đó có cơ sở nghiên cứu chế tạo ra các chế phẩm miễn dịch phòng và điều trị

các nhiễm khuẩn do P aeruginosa Đồng thời việc các phương pháp xác định

type cũng có tầm quan trọng trong điều tra dịch tễ học quá trình lây nhiễm loài vi khuẩn này

- Các kháng nguyên ngoại bào: P aeruginosa sản xuất nhiều loại enzyme

ngoại bào góp phần vào cơ chế bệnh sinh như: kiềm protease, elastase, exotoxin A, exoenzyme S và hemolysin

Một số enzym này cũng đồng thời còn là những kháng nguyên được nghiên cứu để sử dụng chế tạo vaccine gây miễn dịch Năm 2006 một nhóm nghiên cứu người Anh đã công bố nghiên cứu về hiệu quả và độ an toàn một loại vaccine đường uống có tên Pseudotat 1 có thể giúp cơ thể kháng lại

P.aeruginosa [5]

1.1.4 Hệ gen

Vật chất di tuyền của P aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tai trong nguyên sinh chất Bộ gen của P.aeruginosa là tương đối

lớn (5,5-7,5 Mb) với khoảng 65% Guanine + Cytosine và mã hóa giữa 5.500

và 6.500 khung đọc mở cửa tùy thuộc vào chủng

Năm 2000, trình tự gen của chủng PAO1 đã được giải mã hoàn toàn Với 6.264.403 cặp base 5.570 khung đọc mở (ORFs) dự đoán, kích thước và

độ phức tạp của bộ gen P.aeruginosa phản ánh một sự thích nghi tiến hóa cho

phép nó phát triển mạnh trong môi trường đa dạng và kháng lại một loạt các kháng sinh [9]

Ngoài ra P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài nhân là

các Plasmid Các đoạn plasmid này chứa các gen TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra các betalactamase làm cho vi khuẩn kháng các thuốc nhóm này

Tìm hiểu cấu trúc bộ gen rất quan trọng trong việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh, cơ chế kháng thuốc và các phương pháp điều trị nhiễm khuẩn

- Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn Nội độc tố

bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein LPS có vai trò quan trọng trong bệnh sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết Nội độc tố của

P aeruginosa tác động tới bạch cầu, tiểu cầu, kích hoạt hệ nội tiết enzyme và

cả hệ thần kinh giao cảm làm tăng tiết các chất như renin, catecholamin, serotonin, histamin Bên cạnh đó nội độc tố còn hoạt hóa hệ kallikreinogen – kinin gây nên rối loạn vi tuần hoàn, rối loạn vận mạch, rối loạn đông máu, gây ức chế miễn dịch Ngoài ra nội độc tố của vi khuẩn còn gắn lên thụ thể CD4 trên bề mặt monocyte và macrophage kích thích chúng sinh ra chất gây

hoại tử tổ chức [13]

- Ngoại độc tố (exotoxin A): Exotoxin A là một độc tố mạnh nhất của P

aeruginosa Exotoxin A có khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp

protein của tế bào, gây rối loạn chức năng huyết động trung tâm, thay đổi chức năng đông máu, rối loạn chuyển hoá lipid, gây tổn thương nhiều cơ

quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan 90% số chủng P

aeruginosa sản xuất exotoxin A nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau

tuỳ từng chủng

- Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết,

các enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập, gây bệnh tại chỗ:

+ Protease: P aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alkaline và

elastase Nhiều chủng tiết ra collagenase Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng Elastase (lasA elastase và lasB elastase) phân giải các cấu trúc protein của tế bào nhân chuẩn như collagen, elastin và hủy hoại cấu trúc protein của tế bào này Nó phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu của cơ thể (IgA, IgG, bổ thể làm cho nhiễm trùng lan tỏa với các biểu hiện lâm sàng như viêm màng keratin, hoại tử tổ chức trong bỏng và tạo các xơ nang Ngoài ra elastase còn dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ dàng bám vào màng nhầy phổi Elastase phá vỡ biểu mô và cản trở chức năng của các lông mao

bên trong đường hô hấp Elastase cũng hỗ trợ P aeruginosa trong việc tránh

thực bào tại các vị trí tổn thương bằng cách ức chế hoá hướng bạch cầu [16][30] Alkaline can thiệp vào sự hình thành và phân giải fibrin Elastase và alkaline còn gây ra sự bất hoạt với hai yếu tố quan trọng của hệ miễn dịch là Inteferon gamma (IFN) và Tumor Necrosis Factor (TNF) [35]

+ Heamolysine có 2 loại:

Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): không có tính enzyme, không có

tính kháng nguyên và ít độc, có vai trò hoà tan các lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C

Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với glycolipide và protease alkaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương

+ Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung tính và các tế bào lympho

+ Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng không hoạt động và không có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme

+ Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này còn ít được biết đến Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên nhân gây viêm ruột non Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong lòng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngoài lòng mạch

1.1.6 Khả năng gây bệnh

P aeruginosa hiếm khi gây bệnh ở người khỏe mạnh Chúng thường

gây bệnh cơ hội ở các bệnh nhân có hệ miễn dịch suy giảm hoặc chấn thương

Nhiễm khuẩn do P aeruginosa thường gặp nhiều ở các khoa Bỏng, khoa Hồi sức tích cực, khoa Tiết niệu, khoa chăm sóc bệnh nhân sau phẫu thuật P

aeruginosa thường gây nhiễm khuẩn có mủ ở vết thương, vết mổ, vết bỏng

Có nhiễm khuẩn sinh trưởng ngay trong các thuốc dùng để điều trị Từ vết thương, vết bỏng vi khuẩn có thể vào máu gây nhiễm khuẩn huyết Nhiễm

khuẩn huyết do vi khuẩn này tỷ lệ tử vong thường rất cao Đầu tiên, P

aeruginosa bám vào bề mặt các mô sử dụng roi của nó, pili, và EXO-S; sau

đó, chúng tạo ra sự tập chung lây nhiễm trầm trọng; và cuối cùng, làm tổn

thương mô do sử dụng các yếu tố độc lực của chúng [22].Từ đó P aeruginosa

giải phóng mạnh mẽ các ngoại độc tố và nội độc tố của chúng trong quá trình

tiếp tục lây nhiễm sang vật chủ thậm chí ngay cả sau khi P aeruginosa đã bị giết chết bởi thuốc kháng sinh Các bệnh cấp tính do P aeruginosa có xu

hướng trở nên mãn tính và đe dọa tính mạng

Trong bệnh xơ nang P aeruginosa sử dụng roi của mình để đi đến những vùng thiếu dưỡng khí- môi trường oxy cạn kiệt Tại vị trí này, P

aeruginosa trải qua một quá trình chuyển đổi từ một hiếu khí một loại vi

khuẩn kỵ khí và bắt đầu hình thành màng sinh học kỵ khí Khi màng sinh học

đƣợc hình thành, P aeruginosa trong cộng đồng này có thể cảm nhận mật độ của chúng thông qua hiện tƣợng thụ cảm đám đông (quorum sensing), chúng

tiết ra các pheromone trọng lƣợng phân tử thấp cho phép chúng giao tiếp với nhau [20] Điều này khiến cho chúng có khả năng chống lại sự bất lợi nhƣ kháng các kháng sinh ticarcillin, ceftazidime, tobramycin, và ciprofloxacin, bởi vì một khi các vi khuẩn nhận biết rằng lớp bên ngoài màng sinh học của chúng đang bị phá hủy, các lớp bên trong sẽ phát triển mạnh mẽ hơn để thiết lập lại cộng đồng [52]

P aeruginosa cũng lây nhiễm động vật Trên động vật thí nghiệm, ở

chuột lang tiêm vào màng bụng khoảng 0,5 – 0,1ml canh khuẩn khoảng 50% chuột chết sau vài giờ, những con chuột sống dần dần hình thành những ổ mủ

1.1.7 Khả năng kháng thuốc kháng sinh

P aeruginosa có khả năng kháng tự nhiên số lƣợng đáng kể các kháng

sinh nhƣ ampcilin, amoxicillin, amoxicillin/clavulanic, các cehalosporin thế

hệ 1,2, cefotaxime, ceftiaxone, nalidixic acid, trimethoprim Hơn nữa, chúng

dễ dàng có đƣợc khả năng kháng thuốc kháng sinh mới bằng cách thay đổi đột biến hoặc trao đổi vật liệu di truyền qua plasmid, transposon hay integron [38]

Một số cơ chế kháng thuốc đã đƣợc xác định của P aeruginosa, bao

gồm:[7]

- Sản xuất các enzym phá hủy cấu trúc các kháng sinh phổ rộng: lactamase các cephalosporinase hay các carbapenemase

β P aeruginosa cũng có thể thay đổi các đích tác dụng của kháng sinh, ví

dụ nhƣ methyl hóa 16S rRNA để ngăn chặn sự tấn công của aminoglycoside vào quá trình sao chép DNA, hoặc thay đổi topoisomerase ngăn cản tác động của quinolone

- Hình thành màng sinh học, tăng tiết alginat làm giảm tính thấm với thuốc

- Hệ thống bơm đẩy thuốc ra ngoài (Efflux pumps):

Các chủng vi khuẩn đa kháng có thể có thể kháng kháng sinh bằng cách đẩy kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn bằng hệ thống các bơm này Các gen

mã hóa hệ thống bơm như MexAB-OprM , MexEF-OprN, MexXY-OprM, MFP-RND-OMF cũng chính là các đích tác dụng mục tiêu để nghiên cứu các kháng sinh mới [31]

1.2 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOÀI VI SINH VẬT TRONG CHẾ PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM CHỨC NĂNG

1.2.1 Theo phương pháp truyền thống

Hiện nay, có hai phương pháp được sử dụng để định tính vi sinh vật

là phương pháp truyền thống kinh điển và phương pháp hiện đại Mỗi phương

pháp đều có những ưu cũng như nhược điểm riêng Phương pháp truyền thống

để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: Đặc điểm

về hình thái, đặc điểm sinh lý, đặc điểm sinh hoá hay các đặc điểm về biến đổi năng lượng dinh dưỡng[3]

* Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái

- Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến): Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu crystal violet trên thành tế bào sau khi nhuộm và rửa bằng cồn Gram âm có màu đỏ và Gram dương có màu tím

- Kiểm tra khả năng di động: bằng cách nhuộm tiêm mao hoặc phương pháp kiểm tra trên môi trường thạch mềm, nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy

và lan cả ra ngoài đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có khả năng di chuyển

- Nhuộm bào tử: nhuộm lục Malachit (phương pháp Schaeffer-Fulton), nhuộm Carbolic Fuchsin

- Nhuộm vỏ nhầy (Capsule): phương pháp nhuộm âm bản, phương pháp

Đỏ Congo và phương pháp dùng Tím kết tinh (Crystal violet)

- Nhiệt độ sinh trưởng, tính bền nhiệt, chịu axit, chịu muối mật…

- Nhu cầu oxy và carbonic

* Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa

Tùy thuộc vào nguồn phân lập mà ta định hướng cho các phản ứng sinh hóa định danh cho phù hợp như: khả năng đồng hóa các nguồn carbon, khả năng đồng hóa các nguồn nitơ, khả năng sinh sắc tố huỳnh quang, tính mẫn cảm đối với chất kháng khuẩn, đồng hóa Malonat, xét nghiệm đồng hóa citrat, nhu cầu muối và tính chịu muối, khả năng đồng hóa tartrat, khả năng sinh trưởng với KCN, xét nghiệm oxidase, xét nghiệm catalase, khả năng lên men/ôxy hóa glucose, amygdalin, arabinnose, xenlobiose, fructose, glucose, lactose, maltose, manitol, melezitose, saccarose, sorbitol, phản ứng Methyl - Methyl Red, phản ứng V.P (Voges-Proskauer), phản ứng ONPG- ase…

Những vi sinh vật gây bệnh này có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định lại sự có mặt của vi sinh vật thường có mặt trong mẫu[3]

1.2.2 Theo phương pháp hiện đại

Một số phương pháp hiện đại hiện nay hay được sử dụng bao gồm:

1.2.2.1 Phương pháp ELISA

Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng và nguyên tắc chung đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu hoặc phát sáng Thông qua cường độ màu sẽ biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện [15,55]

Một số nghiên cứu dùng phương pháp ELISA để phát hiện các kháng thể IgG, IgA trong huyết thanh kháng lại các protein ngoại bào của

P.aeruginosa như: Protein Alkaline (AP), Elastase (Ela) và Exotoxin A (Exo)

Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu phát hiện P.aeruginosa trong các mẫu

bệnh phẩm của bệnh nhân để chẩn đoán bệnh [40],[41] Tuy nhiên phương pháp này có chi phí rất tốn kém do phải sử dụng các kháng thể đơn dòng đắt tiền

1.2.2.2 Phương pháp giải trình tự DNA

Là các phương pháp dùng để xác định trình tự sắp xếp các nucleotid trên phân tử DNA.Từ những năm 1977 hai phương pháp giải trình tự DNA đã được phát minh đó là phương pháp hóa học giải trình tự DNA (Phương pháp Maxam-Gilbert) và phương pháp enzyme giải trình tự DNA (Phương pháp Sanger)

- Phương pháp Maxam-Gilbert: Là phương pháp sử dụng hóa chất để phân hủy phân tử DNA ở vị trí các base đặc hiệu tạo ra các đoạn có chiều dài khác nhau 1 nucleotid, sau đó điện di các đoạn DNA này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng xạ Dựa vào đó đọc được trình tự phân tử DNA

- Phương pháp Sanger: Là phương pháp sử dụng enzym DNA polymerase, các dNTP (deoxynucleotid triphosphat), và các ddNTP (dideoxynucleotid triphosphat) để tổng hợp các đoạn DNA bổ xung với mạch DNA ban đầu, tạo ra các đoạn DNA chênh lệch nhau 1 nucleotid, sau đó cũng điện di các đoạn DNA này và nhận biết vị trí của chúng nhờ đánh dấu phóng

xạ Dựa vào đó đọc được trình tự phân tử DNA Các phòng thí nghiệm hiện đại ngày nay đều có các máy đọc kết quả điện di tự động bằng tia laser và phần mềm xử lý số liệu, không những giải trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể phát hiện các chi tiết trên gen như: mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở, trình tự đặc hiệu cho enzym cắt hay các dấu ấn di truyền cần thiết cho việc thiết lập bản đồ gen

Phương pháp này cũng ít sử dụng để phát hiện các vi sinh vật trong các mẫu bệnh phẩm hay chế phẩm mà chủ yếu dùng để xác định các đột biến gen

1.2.2.3 Phương pháp lai phân tử (Hybridization)

Phương pháp lai phân tử là phương pháp sử dụng mẫu dò để phát hiện một đoạn gen đặc trưng cho vi sinh vật nhờ hiện tượng lai phân tử Quá trình này bao gồm sự tách rời của mạch đôi chuỗi xoắn kép phân tử DNA khi nhiệt

độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy của phân tử và sự tái bắt cặp của các đoạn DNA có trình tự bổ xung khi nhiệt độ trở lại bình thường Một trong hai mạch DNA mục tiêu được gắn cố định trên giá thể hoặc màng lai, sử dụng các mẫu dò DNA có đánh dấu và quá trình lai sẽ xảy ra do chuyển động nhiệt của các phân tử Các mẫu dò DNA (hoặc RNA) có trình tự bổ xung với vùng DNA mục tiêu sẽ bắt cặp với nhau bởi các liên kết Hydro Ðể đánh dấu mẫu

dò người ta thường sử dụng P32, biotin/streptavidin hoặc một mẫu dò phát quang sinh học Ðịnh vị các phân tử lai DNA-mẫu dò Nếu sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ P32 thì dùng phương pháp phóng xạ tự ghi (autoradiograph) để xác định, nếu sử dụng biotin/streptavidin thì dùng

phương pháp so màu hoặc nếu sử dụng mẫu dò phát quang sinh học thì phát hiện bằng sự phát quang

Năm 2000 một nghiên cứu của Michael Hogardt và cộng sự đã sử dụng phương pháp lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescent in situ hybridization, FISH)

để phát hiện P.aeruginosa, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas

maltophilia, Haemophilus influenzae và Staphylococcus aureus trong mẫu

bệnh phẩm và có độ đặc hiệu 100% so với phương pháp nuôi cấy truyền

thống [39] Một nghiên cứu khác của S.Tajbakhsh phát hiện P.aeruginosa

trong 63 mẫu đờm bẳng phương pháp FISH cũng cho kết quả độ đặc hiệu 100% [49] Phương pháp này hiện nay cũng rất chiếm ưu thế

1.2.2.4 Phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

a Nguyên tắc

Kỹ thuật PCR là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại invitro các đoạn gen đích nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này

b Các thành phần tham gia phản ứng PCR

* DNA mẫu

Mẫu có thể là một mảnh DNA, một chế phẩm gen DNA, một sản phẩm tái tổ hợp plasmid hoặc bacteriophage λ hay bất kỳ mẫu khác có chứa đoạn DNA mục tiêu Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch[29]

* Enzyme

Trong các phản ứng PCR hiện nay thường hay sử dụng enzym là Taq

polymerase, enzym được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nước nóng

Thermus aquaticus Taq polymerase có khả năng chịu nhiệt nên vẫn còn

nguyên hoạt tính trong quá trình biến tính DNA ở nhiệt độ cao Enzyme này hoạt động tối ưu ở 75 – 80oC, 2-4 mM MgCl2 và 10-55 mM KCl.[ 8]

* Mồi (primer)

Mồi là những đoạn oligonucleotid ngắn từ 20-30 nucleotid, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được kéo dài để hình thành mạch mới Mồi là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR

* Các thành phần khác

- Các dNTP (deoxynucleotide triphotphat)

Là các nucleotid tự do chứa nhóm triphosphat, thành phần cơ bản tạo nên chuỗi DNA mới Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20-200μM Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại ―ký sinh" Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase

cao làm tăng tỷ lệ lỗi trong quá trình tổng hợp DNA [43] Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố

ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Nếu lượng Mg2+

quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài hạn chế quá trình kéo dài, ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biệt thấp

- Dung dịch đệm

Dung dịch đệm tạo pH thích hợp cho hoạt động tối ưu và ổn định của DNA polymerase

c Các bước thực hiện một phản ứng PCR

Bước khởi phát: Bước này thực ở nhiệt độ 94-96°C (hoặc 98°C nếu

polymerase chịu nhiệt cực tốt) trong 1 -9 phút cho DNA khuôn biến tính hoàn toàn

Bước biến tính tách đôi sợi DNA (denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của

phân tử (94 – 95oC) trong vòng 30 giây đến 1 phút Ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị mất đi làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới

Bước bắt cặp (annealing)

Nhiệt độ phản ứng được hạ xuống đến 50-65°C trong 20-40 giây cho phép gắn mồi vào các mẫu DNA sợi đơn Nhiệt độ này phải đủ thấp để cho phép mồi bắt cặp các sợi, nhưng phải đủ cao để mồi bắt cặp đặc hiệu

Bước kéo dài ( elongation, extension)

Nhiệt độ tại bước này phụ thuộc vào polymerase DNA được sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ tối ưu hoạt động ở 75-80°C, và thường nhiệt độ 72°C được sử dụng với các loại enzyme này[33] Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung Ở nhiệt độ tối ưu của nó, DNA polymerase kéo dài 1000 nucleotid mỗi phút [28] Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Các bước biến tính, bắt cặp và kéo dài tạo thành một chu kỳ Trong thực tế một phản ứng PCR không nên vượt quá 40 chu kì lặp lại vì càng về sau hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, hoặc các bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau

-Bước kéo dài kết thúc: bước này có thể được thực hiện ở nhiệt độ 70-74°C

(đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu cho hầu hết các polymerase dùng trong PCR) trong 5-15 phút sau khi chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo rằng bất kỳ chuỗi DNA đơn nào còn lại đều được bổ xung

- Bước lưu giữ: Bước thực hiện ở 4-15°C để lưu giữ sản phẩm phản ứng cho

đến khi phân tích

PCR đã được nghiên cứu nhiều và được chấp nhận như là một phương pháp để phát hiện nhanh chóng và đáng tin cậy sự có mặt của các vi khuẩn gây bệnh trong các mẫu thực phẩm, nước và dược phẩm Có thể nói kĩ thuật

PCR đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các phòng kiểm nghiệm vi sinh trên thế giới nhằm phát hiện một cách nhanh chóng, chính xác các vi sinh vật chỉ điểm y tế

Ưu điểm của phương pháp:

+ Thời gian cho kết quả nhanh

+ Có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy, việc tăng sinh

là đơn giản hơn và đôi khi là không cần thiết

+ Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường

+ Ít tốn kém về nhân sự, có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh có trong các chế phẩm thuốc

Mặt khác, phương pháp này còn cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh của các vi sinh vật gây bệnh

1.3 TỔNG QUAN CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁT HIỆN VI SINH VẬT

Dược điển Việt Nam và các nước đều có chuyên luận hướng dẫn phân lập các vi sinh vật gây bệnh không được có trong thuốc

Do có sự hạn chế nhất định trong việc sử dụng các phương pháp truyền thống để phân lập vi sinh vật gây bệnh trong thuốc nên trong những năm gần đây việc triển khai các phương pháp nhanh và chính xác nhằm phát hiện các

vi sinh vật gây bệnh trong thuốc đã được rất nhiều công ty dược nghiên cứu

và phát triển Việc sử dụng các phương pháp phát hiện nhanh, chính xác và hiệu quả kết hợp với phương pháp phân lập truyền thống sẽ dẫn đến tối ưu

hóa quá trình kiểm soát dược phẩm, đảm bảo chất lượng thuốc tới tay người dùng

Trên thế giới đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng PCR để phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm y tế trong thuốc Nghiên cứu của Jimenez và

cộng sự (năm 1998) chủng được lựa chọn nghiên cứu là Salmonella

typhimurium đã so sánh phương pháp PCR so với phương pháp truyền thống

Kết quả thu được cho thấy phương pháp này đã cho kết quả phát hiện nhanh hơn rất nhiều So với phương pháp truyền thống là 5-7 ngày trong khi hệ thống BAXTM sử dụng kĩ thuật phát hiện Salmonella spp dựa vào kĩ thuật

PCR giảm thời gian phát hiện xuống 30 giờ Hệ thống này sẽ cho phép kiểm soát đánh giá chất lượng của các nguyên liệu, dược phẩm và mỹ phẩm yêu

cầu không có Salmonella spp một cách nhanh chóng và hiệu quả Hệ thống này cũng được dùng để phát hiện Ecoli O157:H7 [26]

Mới đây, R.Vijayakumar và cộng sự cũng đã ứng dụng kĩ thuật PCR

để phát hiện sự có mặt của P aeruginosa trong dụng cụ dùng trong phẫu thuật

mắt (ophthalmic viscosurgical devices, OVD) Giới hạn phát hiện

P.aeruginosa là 2,1 ng, thời gian phát hiện chỉ mất 4-5 giờ so với phương

pháp truyền thống là 5-6 ngày Điều này sẽ giúp cho việc kiểm soát chất lượng OVDs một cách nhanh chóng, độ nhạy cao và kết quả chính xác Điều

này có nghĩa rất lớn bởi nếu có sự tạp nhiễm P aeruginosa trong các chế

phẩm này có thể gây mù mắt của các bệnh nhân được phẫu thuật [56]

Jimenez Luis và cộng sự cũng đã so sánh độ nhạy, nhanh khi sử dụng

PCR với phương pháp truyền thống để phát hiện Escherichia coli,

Staphylococcus aureus, P.aeruginosa, và Aspergillus niger trong các mẫu

nguyên liệu thuốc và thành phẩm, kết quả cho thấy với phương pháp truyền

thống thời gian yêu cầu là 6-8 ngày trong khi với kỹ thuật PCR chỉ mất 27 giờ, độ nhạy cũng cao hơn nhiều so với phương pháp truyền thống [27]

Kết quả nghiên cứu của Devos Daniel và cộng sự cũng cho thấy sử dụng kỹ thuật PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu cao và phát hiện nhanh trên các mẫu bệnh phẩm thu được [14]

Tương tự như vậy, Venkateswara và cộng sự cũng đã tối ưu hóa kĩ

thuật PCR phát hiện đồng thời E coli, S.aureus, P aeruginosa và Salmonella,

làm giảm thời gian phát hiện các vi sinh vật chỉ điểm này từ 5-7 ngày xuống chỉ còn 24giờ [57]

Trên thế giới cũng đã có rất nhiều các nghiên cứu sử dụng phương pháp

PCR trên đối tượng P.aeruginosa với các gen đặc hiệu loài khác nhau như exotoxin A [34] ,algD [37][ 19] [58][23], hoặc với các gen cảm biến sinh học

(Quorum sensing): lasI, lasR, rhlI, rhlR, và các gen độc lực: toxA, aprA, rhlAB, plcH, lasB, fliC[29] hay với các gen ngoài màng như oprL và oprI [45], để phát hiện loài sinh vật này trong các mẫu chế phẩm hay bệnh phẩm Các phương pháp trong các nghiên cứu này đều có độ đặc hiệu và độ nhạy rất cao

Ở Việt Nam, việc ứng dụng sinh học phân tử nói chung, PCR nói riêng

để phát hiện các vi sinh vật gây bệnh cũng đã được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực y học, thực phẩm Trong kĩ thuật chẩn đoán, các bệnh viện đã sử

dụng phương pháp PCR để chẩn đoán nhanh các bệnh do E coli,

Salmonella, Trong lĩnh vực thực phẩm, kĩ thuật PCR cũng đã được ứng dụng

để phát hiện nhanh Salmonella spp, E coli, S.aureus Bộ kít PCR phát hiện

nhanh nhiều vi sinh vật gây bệnh trong phẩm do trường Đại học khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh đã được đưa vào sử dụng [4]

Tuy nhiên, tại Việt Nam, trong lĩnh vực dược phẩm, đặc biệt là trong công tác kiểm nghiệm giám sát chất lượng vi sinh của thuốc, hiện nay chủ yếu vẫn sử dụng phương pháp truyền thống tốn rất nhiều thời gian và đôi khi không đặc hiệu Ứng dụng PCR trong việc phát hiện các vi sinh vật chỉ điểm

y tế không được có trong thuốc sẽ là một phương pháp mới cho phép kiểm soát chất lượng thuốc ngày càng hiệu quả hơn Việc ứng dụng PCR trong công tác kiểm nghiệm thuốc có đặc thù riêng, khác với các mẫu bệnh phẩm thông thường, do đó cần phải nghiên cứu đầy đủ và toàn diện hơn trước khi ứng dụng kỹ thuật này trong công tác kiểm nghiệm thuốc Cho đến nay chưa

có nghiên cứu nào về phát hiện P.aeruginosa trong chế phẩm thuốc bằng kỹ

thuật PCR

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

+ Chủng vi khuẩn chuẩn P aeruginosa ATCC 9027 có nguồn gốc từ

Ngân hàng chủng chuẩn Hoa kỳ được đặt mua từ hãng Biologist (Mỹ)

+ Các chế phẩm thuốc để tạo mẫu tự tạo: Là các thuốc thành phẩm thu mua trên thị trường Hà Nội có dạng bào chế khác nhau đại diện cho các mức yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn theo bảng 7 phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam

IV, 5 mẫu tự tạo được ký hiệu từ A đến E, bao gồm: A: Viên hoàn cứng (mức 4), B: Viên nang mềm (mức 4), C: Syro (mức 4), D: Thuốc xịt mũi (mức 2); E: Kem bôi da (mức 3)

2.1.2.Nguyên vật liệu, trang thiết bị:

- Trang thiết bị: Được hiệu chuẩn theo ISO/IEC-17025 và GLP

- Cân kĩ thuật điện tử Sartorius TE 412 (Đức)

- Buồng thổi khí sạch Kebo, Kojair (Thuỵ Điển)

- Tủ ấm CO2 T 305-F (Thuỵ Điển)

- Tủ sấy Memmert ULE 600 (Đức)

- Nồi hấp Tomy SS-325 (Nhật)

- Máy quang phổ tử ngoại khả kiến Shimadzu (Nhật Bản)

- Tủ lạnh sâu Kebo 2951 (Thuỵ Điển)

- Máy điện di gel XL-ULTRA-V-2 (Mỹ)

- Máy chụp ảnh gel UVDI- 312 (Đài Loan)

- Máy khuyếch đại gen RealTime Step one Plus (Singapore)

- Máy lắc trộn Vortex Genie 2 (Mỹ)

+Các chủng chuẩn đối chiếu: đặt mua từ Biologist (Mỹ)

Escherichia coli ATCC 8739

Escherichia coli ATCC 25922

Bordetella bronchiseptica ATCC 4617

Micrococcus luteus ATCC 9341

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Staphylococcus epiderminis ATCC 12228

Staphylococcus aureus ATCC6538

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Salmonella typhimurium ATCC 14028

Salmonella enterica ATCC 700720D-5

Micrococcus luteus ATCC 10240

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Enterobacter cloacae ATCC 23355

Enterobacteria cloacae subsp cloacae ATCC 15337 Citrobacter freundii ATCC 8090

Proteus vulgaris ATCC 13315

Serratia marcescens ATCC 8100

Acinetobacter calcoaceticus ATCC 19606

Aspergillus niger ATCC 16404

Candida albicans ATCC 10231

Saccharomyces cerevisiae ATCC 2601

Bacillus subtilis ATCC 6633

Bacillus cereus ATCC 11778

Bacillus pumilus ATCC 14884

+Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh

học phân tử

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Các bước tạo mẫu tự tạo dùng trong nghiên cứu

Bước 1: Lựa chọn các chế phẩm thuốc có dạng bào chế khác nhau đại diện cho các mức yêu cầu giới hạn nhiễm khuẩn theo phụ lục 13.6 Dược điển Việt Nam IV, 5 mẫu tự tạo được ký hiệu từ A đến E, bao gồm: A: Viên hoàn cứng (mức 4), B: Viên nang mềm (mức 4), C: Syro (mức 4), D: Thuốc xịt mũi

(mức 2); E: Kem bôi da (mức 3)

Bước 2:

+ Hòa tan hoặc làm nhũ hóa 10g hay 10ml các chế phẩm mang thử vừa

đủ trong 100ml để được dung dịch pha loãng 1/10 Với 3 dạng bào chế viên nang mềm, syro, thuốc xịt mũi lấy 10ml chế phẩm hòa tan bằng dung dịch đệm phosphat pH 7,2 vừa đủ 100ml Với dạng bào chế viên hoàn cứng và kem bôi da cân 10g chế phẩm, thêm chất nhũ hóa vô khuẩn là các polysorbat (tween 80) sau đó chế tạo nhũ dịch bằng dung dịch đệm phosphat 7,2 vừa đủ 100ml Đây gọi là dung dịch (hỗn dịch) gốc, có nồng độ 1g chế phẩm/10ml dung dịch(hỗn dịch) hoặc 1ml chế phẩm/10ml dung dịch(hỗn dịch)

+ Các mẫu thuốc trên được tiến hành kiểm tra thử giới hạn nhiễm khuẩn theo quy trình mô tả ở phụ lục 13.6 , Dược Điển Việt Nam IV, sao cho

đảm bảo không phát hiện được P aeruginosa trong 1g hoặc 1ml chế phẩm

này theo phương pháp truyền thống

Bước 3: Hút 10ml dung dịch gốc vào 100 ml môi trường Casein soybean digest broth Mỗi mẫu lặp lại trên 2 bình môi trường

Bước 4: Bổ sung một lượng chủng chuẩn P aeruginosa ATCC® 9027

vào 5 bình môi trường đã có các mẫu nghiên cứu 5 bình môi trường chứa mẫu không bổ sung chủng chuẩn là mẫu chứng âm tính Tiến hành nuôi cấy các bình môi trường có mẫu ở nhiệt độ 35-37o

C trong 18-24 giờ

2.2.2.Quy trình phát hiện P aeruginosa theo phương pháp truyền thống

Thực hiện theo phương pháp và hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam

IV, tóm tắt các bước chính như sau:

Bước 1: Đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, dùng phương pháp đĩa thạch: Lấy 10ml dung dịch gốc (cách pha dung dịch gốc như mục 2.2.1 bước 2), nuôi cấy trong 90ml môi trường lỏng casein soyabean ủ ở 30-35oC trong thời gian 24-48 giờ

Sau thời gian ủ, kiểm tra vi khuẩn mọc trên đĩa, đếm số khuẩn lạc Tính

ra số lượng khuẩn lạc có trong 1g hay 1ml chế phẩm Nếu không thấy có khuẩn lạc mọc trên đĩa thì kết luận chế phẩm có ít hơn 10 khuẩn lạc trong 1g hay 1ml

+ Phát hiện P.aeruginosa bằng phản ứng Oxydase: Chuyển khuẩn lạc

lên một khoanh giấy đã tẩm trước N-dimethyl-phenylen diamin dihydroclorid

Nếu thấy hiện màu đỏ hồng chuyển sang màu tím, chế phẩm có P.aeruginosa

+ Cấy khuẩn lạc lên ria môi trường thạch pseudomonas để phát hiện pyocyanin và môi trường thạch pseudomonas để phát hiện Fluoresin trong đĩa Petri, ủ ở 33-37o

C trong ít nhất 72 giờ, soi đường cấy dưới ánh sáng đèn

tử ngoại Kiểm tra các đĩa để xác định có khuẩn lạc đặc trưng theo Bảng 2.1 dưới đây

Bảng 2.1: Đặc điểm hình thái của P.aeruginosa trên các môi trường lựa chọn

Môi trường Thạch

Cetrimid

Thạch Pseudomonas để

Fluorecin

Thạch Pseudomonas để phát hiện Pyocyanin

Đặc điểm

hình thái

khuẩn lạc

Màu lục nhạt thông thường

Không màu đến màu vàng nhạt

Dương tính Dương tính Dương tính

Nhuộm Gram Trực khuẩn

Gram âm

Trực khuẩn Gram

âm

Trực khuẩn Gram âm

Nghi ngờ có P aeruginosa : Khẳng định bằng kit API 20NE

2.2.3 Tách chiết DNA của vi khuẩn và phương pháp PCR

2.2.3.1 Tách chiết DNA của vi khuẩn:

DNA của các loài vi khuẩn được tách và tinh sạch theo quy trình tách chiết đã thiết lập, tóm tắt như sau:

- Hút 1,0 ml hỗn dịch vi khuẩn chuẩn đã tăng sinh sau 24-48 giờ, cho vào ống eppendorft 1,5 ml, li tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút để thu lấy cắn Rửa lại cắn bằng dung dịch NaCl 0.9%

- Bổ sung 1 ml dung dịch Sol I (EDTA 50mM) và 10µl lysozym (20mg/ml),

trộn đều bằng máy vortex và ủ ở 65oC trong 1h sau đó li tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút để thu lại cắn

- Thêm 600 µl dung dịch Nuclei lysis, hỗn hợp được trộn kỹ bằng pipet và ủ ở

80oC trong 5 phút Li tâm 3000 vòng/phút trong 2 phút để tránh các giọt dính trên nắp

- Bổ sung 3 µl Rnase, hỗn hợp được trộn đều bằng cách đảo ống 3-5 lần, và ủ

ở 37o

C trong 30 phút Ống được li tâm nhẹ ở 3000 vòng/phút trong 2 phút

- Thêm 200 µl dung dịch Protein precipitation (dung dịch kết tủa Protein), hỗn hợp được trộn kỹ bằng máy vortex trong 20 giây, ủ trên đá trong 5 phút Hỗn hợp được li tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút Dịch nổi chứa DNA được chuyển sang một ống eppendorft mới đã có sẵn 600 µl dung dịch Isopropanol

- Hỗn hợp được trộn đều bằng cách đảo ống 5-7 lần, sau đó li tâm ở 12000 vòng/ phút trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi

- Bổ sung 600 µl Ethanol 70% để rửa tủa DNA Li tâm ống ở 12000 vòng/phút trong 2 phút, loại bỏ dịch nổi Để ống khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút

- Thêm 100 µl dung dịch DNA Rehydration (dung dịch hòa tan DNA) ủ ở

65oC trong 1 giờ Dung dịch DNA được bảo quản ở -20oC

2.2.3.2 Định lượng DNA bằng phương pháp đo độ hấp thụ ánh sáng tử

Nguyên tắc: dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng

260 nm (A260) của các phân tử DNA Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng

260 nm của các mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với dung dịch có nồng

2.2.3.3 Nhân bản đoạn gen 16S ribosomal RNA của các loài vi khuẩn bằng

kỹ thuật PCR

16S ribosome RNA là một thành phần của các tiểu đơn vị 30s trong ribosome vi khuẩn Các gen mã hóa cho thành phần này được gọi là 16S

rDNA (hay cũng có thể gọi là 16S rRNA) có tính đặc thù cho vi khuẩn Để

nhận biết các loài vi khuẩn, PCR được sử dụng với cặp mồi chung (universal primer) khuếch đại trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn theo quy trình của

Hyunk- Sang Kwon và cộng sự (2004) đã công bố [21]

Trình tự của mồi như sau: