Nghiên cứu định lượng indapamid trong huyết tương người bằng LC MS MS phục vụ đánh giá tương đương sinh học

Tuy nhiên, do nền mẫu dịch sinh học thường rất phức tạp, các k thuật phân tích thường quy như sắc k lỏng hiệu năng cao HPLC kết nối với các detector UV, huỳnh quang, … thường không đủ độ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LA

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG INDAPAMID

TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG LC-MS/MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ

TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THỊ LA

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG INDAPAMID

TRONG HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG LC-MS/MS PHỤC VỤ ĐÁNH GIÁ

TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Đoàn Cao Sơn, TS Tạ Mạnh Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung

ương đã tận tình hướng dẫn và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô công tác tại Bộ môn Hóa Phân tích - độc chất đã giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường

Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn tới toàn thể cán bộ của Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã chia

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp

đã giúp đỡ và động viên để tôi có đủ nghị lực, quyết tâm hoàn thành luận văn

Hà nội, ngày 03 tháng 04 năm 2017

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN……… 3

1.1 INDAPAMID……… 3

Công thức cấu tạo và tính chất hóa l ……… 3

2 Liều dùng và dược động học……… 3

3 Một số phương pháp định lượng INDA trong dịch sinh học 5

2 SẮC KÝ LỎNG – KHỐI PHỔ (LC-MS)……… 8

1.2.1 Nguyên l hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ……… 8

2.2 Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ loại tứ cực chập ba… 9 1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu……… 9

1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)……… 10

1.2.2.3 Bộ phận phân tích khối tứ cực chập ba……… 10

1.2.2.4 Bộ phận phát hiện (detector)……… 11

3 PH NG PHÁP PH N T CH THUỐC TRONG D CH SINH H C 12 3 K thuật x l mẫu……… 12

1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein……… 12

1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng……… 13

1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha r n……… 14

3.2 Th m định phương pháp LC-MS MS phân tích thuốc trong dịch sinh học………

15 1.3.2.1 ộ ch n l c……… 16

1.3.2.2 Giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……… 16

1.3.2.3 ư ng chu n và khoảng tuyến tính……… 17

1.3.2.4 Ảnh hưởng của nền mẫu……… 17

1.3.2.5 ộ nhiễm chéo……… 17

1.3.2.6 ộ đ ng, độ chính ác trong ngày và khác ngày……… 18

1.3.2.7 T lệ thu hồi……… 18

1.3.2.8 Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh h c………… 19

CHƯƠNG 2 Đ I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 20

20 2 NGUY N VẬT LIỆU……… 20

2.2 ĐỐI T NG NGHI N C U……… 21

2.3 NỘI DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHI N C U……… 21

2.3 Xây dựng phương pháp phân tích……… 21

2.3.1.1 ây dựng điều kiện khối phổ ác định IN và chu n nội………… 21

2.3.1.2 Khảo sát điều kiện s c k ……… 22

2.3.1.3 Khảo sát qui tr nh ử l mẫu huyết tương……… 22

2.3.2 Th m định phương pháp phân tích……… 23

2.3.3 Xác định nồng độ INDA trong mẫu huyết tương người tình nguyện… 25 CHƯƠNG 3 ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 27

3 KẾT QUẢ X Y D NG PH NG PHÁP PH N T CH……… 27

3 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng INDA và chu n nội……… 27

3.1.1.1 iều kiện khối phổ định lượng IN ……… 27

3.1.1.2 Khảo sát lựa ch n chu n nội……… 30

3 .2 Khảo sát điều kiện sắc k ……… 32

3.1.3 Nghiên cứu quy trình x l mẫu huyết tương……… 36

3.1.4 Kết quả xây dựng phương pháp LC-MS MS định lượng INDA trong huyết tương……… 39

3.2 KẾT QUẢ TH M Đ NH PH NG PHÁP PH N T CH……… 40

3.2 Độ chọn lọc của phương pháp……… 40

3.2.2 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)……… 43

3.2.3 Xây dựng đường chu n và khoảng tuyến tính……… 44

3.2.4 Ảnh hưởng của nền mẫu……… 45

3.2.5 Độ nhiễm chéo……… 46

3.2.6 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và khác ngày ……… 46

3.2.7 Xác định tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chu n nội 51

3.2.8 Nghiên cứu độ ổn định……… 53

3.2.8.1 ộ ổn định mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong th i gian ng n……… 53

3.2.8.2 ộ ổn định sau 3 chu kỳ đông – rã đông……… 54

3.2.8.3 ộ ổn định của mẫu sau ử l (trong autosampler)……… 54

3.2.8.4 ộ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương……… 55

3.2.8.5 ộ ổn định dài ngày dung dịch chu n nội gốc……… 56

3.2.8.6 ộ ổn định dung dịch chu n nội làm việc ở nhiệt độ phòng………… 57

3.3 KẾT QUẢ Đ NH L NG INDA TRONG MẪU HUYẾT T NG NTN……… 58

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN……… 63

4 PH NG PHÁP PH N T CH Đ NH L NG INDA TRONG HUYẾT T NG NG ỜI 63

4 Phương pháp định lượng INDA 63

4.1.2 K thuật x lý mẫu 64

4.1.3 Th m định phương pháp phân tích 65

4.2 KẾT QUẢ PH N T CH MẪU HUYẾT T NG NTN 66

ẾT LUẬN VÀ IẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM HẢO

EMA : Cơ quan quản l Dược Châu u

(European Medicines Agency)

ESI : Ion hóa kiểu phun điện t (Electrospray ionization)

GLB : Glibenclamid

GLP : Glipizid

HPLC : Sắc k lỏng cao áp

(High performance liquid chromatography)

HQC : Mẫu kiểm tra ở nồng độ cao (High quality control)

HT

INDA

: :

Huyết tương Indapamid

IS : Chu n nội (Internal standard)

ISMN : Isosorbid mononitrat

LC-MS : Sắc k lỏng khối phổ

(Liquid chromatography – Mass spectrometry)

LC-MS/MS : Sắc k lỏng khối phổ hai lần

(Liquid chromatography – tandem mass spectrometry)

LLOQ : Giới hạn định lượng dưới (Lower limit of quantitation)

LQC : Mẫu kiểm tra ở nồng độ thấp (Low quality control)

m/z : Khối lượng điện tích

MeCN : Acetonitril

MeOH : Methanol

MF : Hệ số nền mẫu (Matrix factor)

MQC : Mẫu kiểm tra ở nồng độ giữa (Medium quality control)

Mẫu kiểm tra bổ sung (Supplement quality control)

Thời gian bán thải

STT : Số thứ tự

TĐSH : Tương đương sinh học

T max : Thời gian đạt nồng độ cực đại

ULOQ : Giới hạn định lượng trên (Upper limit of quantitation)

US-FDA : Cơ quan quản l thuốc và thực ph m M

(United States – Food and Drug Administration)

v/v : Thể tích thể tích

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Trang

Bảng 1.1- Tóm t t thông số dược động h c của INDA trong một số nghiên

cứu……… 4

Bảng 1.2- Một số phương pháp định lượng INDA trong huyết tương 6

Bảng 2.1- ách chu n bị các mẫu trong huyết tương……… 24

Bảng 2.2- ách chu n bị các mẫu Q trong huyết tương……… 24

Bảng 3.1- iều kiện khối phổ định lượng IN và IS……….………… 40

Bảng 3.2- Ảnh hưởng của mẫu tr ng tại th i gian lưu của INDA……… 42

Bảng 3.3- Ảnh hưởng của mẫu tr ng tại th i gian lưu của IS 42

Bảng 3.4- Kết quả ác định giới hạn định lượng dưới……… 43

Bảng 3.5- Kết quả khảo sát đư ng chu n……… 44

Bảng 3.6- Kết quả đánh giá sự ảnh hưởng của nền mẫu……… 45

Bảng 3.7- Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo……… 46

Bảng 3.8-1 - 3.8-5- Kết quả độ đ ng, độ chính ác trong ngày 47

Bảng 3.9- Kết quả ác định độ đ ng, độ chính ác khác ngày 49

Bảng 3.10- Kết quả ác định t lệ thu hồi của IS 51

Bảng 3.11- Kết quả ác định t lệ thu hồi của IN ……… 52

Bảng 3.12- Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng trong 6 gi … 53 Bảng 3.13- Kết quả nghiên cứu độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông……… 54

Bảng 3.14- Kết quả độ ổn định của mẫu sau ử l trong autosampler……… 55

Bảng 3.15- Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu huyết tương……… 56

Bảng 3.16- Kết quả độ ổn định dài ngày của dung dịch IS gốc……… 57

Bảng 3.17- Kết quả độ ổn định của dung dịch IS làm việc ở nhiệt độ phòng 57 Bảng 3.18- Kết quả nồng độ IN trong huyết tương NTN……… 60

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

H nh 1.1- ông thức cấu tạo của indapamid……… 3

Hình 1.2- Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ……… 9

Hình 1.3- ấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba……… 11

Hình 3.1- Phổ khối MS dung dịch chu n IN ……… 27

Hình 3.2- Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 364 a 28

Hình 3.3- Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [INDA-H] - ……… 28

Hình 3.4- Giản đồ năng lượng phân mảnh [INDA-H] - ……… 29

H nh 3.5- SK mẫu huyết tương có chu n IN và GLP, GLB, ISMN, LR,

H nh 3.8- SK mẫu chu n chứa IN và IS khi sử dụng pha động với t lệ là

MeOH : amoni acetat 10 mM (70 : 30, v/v)……… 33

H nh 3.9- SK mẫu chu n chứa IN và IS khi sử dụng cột 18 (150 4,6

Hình 3.12- Sơ đồ chiết IN trong HT bằng phương pháp LLE……… 36

Hình 3.13- SK dòng ion IN và IS khi phân tích mẫu huyết tương tr ng

đã được ử l tủa protein bằng Me N……… 37

Hình 3.14- SK dòng ion IN và IS khi phân tích mẫu huyết tương tr ng

Hình 3.15- SK dòng ion IN và IS khi phân tích mẫu huyết tương tr ng

đã được chiết lỏng - lỏng bằng tert-butyl methyl ether……… 39

Hình 3.16- SK mẫu huyết tương tr ng……… 41

Hình 3.17- SK mẫu huyết tương tr ng có pha IS và chu n IN ở nồng độ

LLOQ (0,5 ng/mL)………

41

H nh 3.18- SK mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc 58

H nh 3.19- SK mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc có thêm IS…… 58

H nh 3.20- SK mẫu huyết tương NTN ở th i điểm 14 gi sau khi uống thuốc 59

60

60

H nh 3.21- ư ng cong nồng độ thuốc - th i gian của NTN……… 61

ĐẶT VẤN ĐỀ

Indapamid (INDA) là một sulfonamid có nhân indol không thuộc nhóm thiazid Thuốc có tác dụng lợi tiểu và chống tăng huyết áp (có thể dùng một mình

hoặc phối hợp với các thuốc chống tăng huyết áp khác) Theo các nghiên cứu gần

đây [2] và thực tế lâm sàng, INDA có hiệu quả rõ rệt trong điều trị tăng huyết áp nhưng không ảnh hưởng đến chuyển hóa lipid và đường huyết Vì vậy, INDA ngày càng được s dụng nhiều trong điều trị tăng huyết áp thể nhẹ và vừa

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có nhiều dược ph m chứa INDA của các công ty trong và ngoài nước Tuy nhiên, việc kiểm soát chất lượng của các thuốc này thông qua đánh giá tương đương sinh học vẫn chưa được thực hiện đầy

đủ, đặc biệt là các dạng thuốc tác dụng kéo dài [3] Nồng độ INDA trong máu khá thấp – Cmax chỉ đạt khoảng 25 ng mL sau khi uống liều đơn 1,5 mg viên kéo dài [30] Để xác định được chính xác nồng độ INDA trong máu, cần phải xây dựng được một phương pháp phân tích có đủ độ nhạy và độ tin cậy Tuy nhiên,

do nền mẫu dịch sinh học thường rất phức tạp, các k thuật phân tích thường quy như sắc k lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết nối với các detector UV, huỳnh quang, … thường không đủ độ nhạy để phát hiện và định lượng được chính xác nồng độ của thuốc có trong nền mẫu [ 3], [30]

Hiện nay, k thuật LC-MS/MS với ưu điểm vượt trội về độ nhạy, độ chọn lọc, pic của chất phân tích không cần phải tách khỏi các pic khác có trong nền mẫu nên ngày càng được ứng dụng nhiều trong phân tích thuốc trong dịch sinh học đặc biệt là đối với những thuốc có hàm lượng thấp như INDA [20], [26]

Để góp phần kiểm soát chất lượng và th tương đương sinh học các thuốc

chứa INDA phù hợp với điều kiện hiện có, luận văn: “Nghiên cứu định lượng

Indapamid trong huyết tương ngư i bằng L -MS/MS phục vụ đánh giá tương đương sinh h c”được thực hiện với những mục tiêu sau:

Xây dựng và th m định phương pháp định lượng INDA trong huyết tương người b ng sắc k lỏng khối phổ (LC-MS/MS) theo các hướng dẫn th m định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA

2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định nồng độ INDA trong các mẫu huyết tương người tình nguyện (NTN) tham gia th tương đương sinh học đối với các thuốc chứa INDA

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 INDAPAMID

1.1.1 C ng thức cấu tạo và tính chất hóa lý

 Công thức cấu tạo

Indapamid là một sulfonamid lợi tiểu, có công thức phân t C16H16ClN3O3S, khối lượng phân t 365,06 g/mol và tên khoa học là 4-chloro-N-(2-methyl-2,3-dihydroindol-1-yl)-3-sulfamoylbenzamide [8], [16]

Công thức cấu tạo của indapamid được trình bày ở hình

- Là acid yếu với pKa = 8,8;

- Hệ số phân bố: Log P (octanol) = 2,2

1.1.2 Liều dùng và dược động học

 Liều dùng: INDA được dùng để điều trị bệnh tăng huyết áp vô căn, thể nhẹ

và vừa Liều dùng điều trị tăng huyết áp: từ 1,25 mg đến 2,5 mg/ngày, uống

một lần

 Dược động học:

Các chế ph m INDA được lưu hành trên thị trường thường dưới dạng viên nén bao phim với hàm lượng 1,25 mg; 1,5 mg hoặc 2,5 mg/viên Dạng bào chế chủ yếu là viên nén giải phóng kéo dài Nồng độ tối đa trong máu của thuốc đạt được trong khoảng từ 2 – 2,5 giờ sau khi uống với dạng giải phóng qui ước, từ 8 – 4 giờ với dạng giải phóng kéo dài [22] Thời gian bán thải của thuốc khoảng

14 - 8 giờ ở người trưởng thành với chức năng thận bình thường Thức ăn hay thuốc kháng acid hầu như không ảnh hưởng đến sự hấp thu của INDA Khoảng 60% thuốc bài tiết qua nước tiểu trong vòng 48 giờ, chỉ có 7% thuốc bài tiết dưới dạng nguyên thể [2]

Các thông số dược động học của INDA trong một số nghiên cứu tương đương sinh học và 0 nghiên cứu dược động học trên mẫu huyết tương NTN được trình bày trong bảng

Bảng 1.1- Tóm t t thông số dược động h c của INDA trong một số nghiên cứu

23,2

± 4,5 Liều đơn 3

Cmax) và giới hạn trên của đường chu n khoảng 00 ng mL (khoảng 2-3 lần

Cmax)

1.1.3 Một số phương pháp định lượng INDA trong dịch sinh học

Trong phân tích thuốc trong dịch sinh học, mẫu máu thường được s dụng phổ biến hơn so với các mẫu khác như nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy, do thao tác lấy mẫu thường dễ dàng và chủ động hơn Các mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm có chứa chất chống đông Na2-EDTA, ly tâm, tách lấy phần huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ qui định cho đến khi được phân tích

Với các thuốc chứa INDA, 60% hoạt chất được bài tiết qua nước tiểu trong vòng 48 giờ, trong đó chỉ có 7% ở dạng nguyên thể [2] Do vậy, nồng độ INDA trong nước tiểu thường thấp hơn nhiều so với nồng độ INDA trong huyết tương Chính vì lý do này, đa số các nghiên cứu định lượng INDA trong dịch sinh học được tiến hành trên mẫu huyết tương [25], [20], [22], [33], [26], [30], [13]

Bảng 1.2- Một số phương pháp định lượng INDA trong huyết tương

(ng/mL)

Tài liệu tham khảo

Chiết SPE

- Cột: C 8; 00 x 2, mm; ,7 µm

- Pha động: MeCN - amoni acetat 2mM (thêm 0,5 mL acid formic/1 L đệm) (90 - 10)

+ Phương pháp [30], [13]: định lượng INDA b ng HPLC với detector UV, phương pháp này có ưu điểm nổi bật là trang thiết bị khá phổ biến Tuy nhiên, giới hạn định lượng dưới cao (10 ng/mL) và thời gian phân tích mẫu khá dài (khoảng 20 phút mẫu) Ngoài ra, phương pháp [ 3] còn s dụng k thuật chiết SPE nên tương đối tốn kém về chi phí thí nghiệm

+ Phương pháp [33], [20]: s dụng detector khối phổ, s dụng dung môi chiết dễ bay hơi, có giới hạn định lượng dưới phù hợp với yêu cầu đề ra, tuy nhiên thời gian phân tích mẫu khá dài (khoảng 7,5 phút mẫu [33], 13 phút [20]) + Phương pháp [22]: s dụng detector khối phổ, tuy nhiên giới hạn định lượng dưới cao (2 ng mL), thời gian phân tích mẫu dài (9 phút mẫu) Hơn nữa, phương pháp này còn s dụng hỗn hợp dung môi chiết (n-hexan và dicloromethan) khó bay hơi nên không phù hợp để triển khai với số lượng mẫu nhiều trong nghiên cứu SKD và TĐSH

1.2 SẮC Ý LỎNG – H I PHỔ (LC-MS)

1.2.1 Nguyên lý hoạt động của thiết bị phân tích khối phổ

Sắc k lỏng khối phổ là một k thuật phân tích dựa trên sự kết hợp giữa khả năng phân tách các chất của hệ thống HPLC và khả năng phân tích khối của

detector khối phổ [1]

Trong k thuật LC-MS, sắc k lỏng hiệu năng cao có vai trò phân tách (một phần hoặc hoàn toàn) hoạt chất cần phân tích khỏi các thành phần tạp chất có trong nền mẫu, hạn chế số lượng các chất đồng r a giải cùng với hoạt chất đi vào nguồn ion Do vậy, hiệu suất ion hóa được cải thiện góp phần làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích [9]

Phương pháp khối phổ là một k thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m z) được tạo thành trong pha khí từ phân t hoặc nguyên t của mẫu Tùy thuộc vào cấu tạo của chất phân tích và k thuật ion hóa được s dụng

mà chất phân tích có thể bị nhiễm điện bề mặt tạo ra các tiểu phân tích điện hoặc

bị phân mảnh, bẻ gẫy cấu trúc phân t để hình thành các ion hoặc các tiểu phân mang điện có khối lượng nhỏ hơn Hỗn hợp các ion, tiểu phân mang điện hình thành ở nguồn ion, được gia tốc và chuyển đến bộ phận phân tích khối Dưới tác động của điện trường, các ion có khối lượng, điện tích khác nhau sẽ chuyển động với tốc độ và qu đạo khác nhau Tốc độ, qu đạo chuyển động của ion phụ thuộc vào cường độ điện trường của bộ phận phân tích khối; điện tích và khối

lượng của ion Do vậy, sau khi đi qua bộ phận phân tích khối, các ion trong hỗn hợp sẽ được phân tách riêng thành từng loại Bộ phận phát hiện sẽ ghi nhận loại ion được lựa chọn thành từng vạch phổ tương ứng trên phổ đồ

Năng lượng phân mảnh ion là một yếu tố quyết định sự phân mảnh của các hợp chất Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của mỗi phân t và là cơ

sở để nhận dạng, định danh, định tính chất phân tích [7]

1.2.2 Cấu tạo các bộ phận thiết bị phân tích khối phổ loại tứ cực chập ba

Trong số các k thuật LC-MS, k thuật sắc k lỏng hiệu năng cao ghép nối với đầu dò khối phổ kiểu tứ cực chập ba với nguồn ion hóa kiểu phun điện t (ESI) có độ đặc hiệu - chọn lọc tốt và độ nhạy cao thường được s dụng để phân tích thuốc trong dịch sinh học [32]

Sơ đồ khối của một máy khối phổ được miêu tả như trong Hình 2

Hình 1.2- Sơ đồ cấu tạo của một máy khối phổ

1.2.2.1 Bộ phận nạp mẫu

Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ Tùy thuộc vào trạng thái vật l của mẫu phân tích mà có thể nạp mẫu trực tiếp vào thiết bị MS hoặc nạp mẫu vào MS gián tiếp thông qua các thiết bị phân tích kết hợp, ghép nối như GC, HPLC hoặc CE Căn cứ vào thiết bị phân tích ghép nối, mà người ta chia thành các phương pháp như GC-MS, LC-MS hay CE-MS [1], [6]

Một ghép nối LC-MS cho phép chuyển mẫu hiệu quả và chính xác từ LC sang MS mà không làm phá hủy hay mất chất phân tích, loại bớt dung môi r a giải, giảm pha loãng mẫu

1.2.2.2 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI)

Trong nguồn ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đ y lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ phận phân tích khối Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị khối phổ [7]

Trong k thuật ESI, phân t nhất thiết phải được biến thành chất điện ly, tan trong dung dịch dùng để phun sương Điều này phụ thuộc vào: dung môi, pKa của chất điện ly và pH của dung dịch

Nguồn ESI, với k thuật ion hóa mềm, nhiễm điện bề mặt nên có thể áp dụng để ion hóa nhiều hoạt chất với các đặc điểm hóa l khác nhau như: chất phân cực hoặc bán phân cực, các chất có trọng lượng phân t lớn (protein, peptid) và các chất kém bền với nhiệt [32]

1.2.2.3 Bộ phận phân t ch khối tứ cực chập ba

Bộ phận phân tích khối gồm ba tứ cực Q1, Q2 và Q3 nối tiếp nhau Mỗi tứ cực này được cấu tạo gồm có 4 thanh kim loại đặt song song và sát nhau tạo thành hai cặp điện cực (hình 1.3)

Hình 1.3- ấu tạo và cơ chế hoạt động của phổ khối tứ cực chập ba

Dòng điện một chiều và điện thế xoay chiều cao tần được đặt vào từng cặp đối diện của tứ cực Dưới tác động của điện trường trong lòng ống điện cực, các ion có số khối khác nhau di chuyển với tốc độ và qu đạo khác nhau Ion có số khối càng nhỏ thì di chuyển càng nhanh và ngược lại

Tại Q sẽ lựa chọn các ion có tỷ số m z xác định và được đưa đi thẳng đến Q2, những ion khác sẽ bị loại đi do bị va đập vào các bản điện cực trái dấu Quá trình phân mảnh ion mẹ thành các ion nhỏ hơn (ion con) diễn ra tại Q2 Trong

buồng Q2, ion mẹ chuyển động Brown, va chạm với các phân t khí trơ có mặt

trong buồng (khí argon) Nhờ va chạm này năng lượng động học của các ion chuyển thành nội năng nên chúng phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion con mới hình thành được phân tích khối tách riêng tại Q3 và cuối cùng được đưa đến detector

Các hợp chất với cấu tạo khác nhau sẽ có tỷ số m z của ion mẹ cũng như cơ chế phân mảnh và hình thành nên các ion con có số khối khác nhau Vì vậy, có thể định tính, định lượng các hoạt chất cần phân tích b ng phương pháp LC-MS/MS [32]

1.2.2.4 Bộ phận phát hiện (detector)

Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion Bộ phận này cho phép phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ [31]

1.3 PHƯƠNG PHÁP PH N T CH THU C TRONG DỊCH SINH HỌC

Do mẫu sinh học thường có nồng độ hoạt chất thấp, nền mẫu phức tạp (chứa muối vô cơ, lipid, protein, chất nội sinh,…), lượng mẫu ít và số lượng mẫu phân tích nhiều nên các phương pháp phân tích cần phải có độ nhạy, độ chọn lọc cao, giới hạn định lượng dưới thấp, độ lặp lại tốt và thời gian phân tích cho một mẫu đủ ngắn Đối với những mẫu dịch sinh học có nồng độ dược chất thấp (khoảng ng/mL) k thuật phân tích khối phổ thường được s dụng, đặc biệt là k thuật sắc k lỏng khối phổ hai lần (LC-MS MS) vì có khả năng giảm nhiễu đường nền, tăng độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp lên nhiều lần [ ]

1.3.1 Kỹ thuật ử lý mẫu

Phần lớn các phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học đều không thể xác định được trực tiếp chất phân tích mà chỉ có thể xác định được sau khi mẫu đã được x l Vì vậy, mẫu cần phải được chiết tách, x l để loại bỏ các tạp chất và có thể làm giàu mẫu trước khi tiến hành phân tích để tăng độ nhạy của phương pháp Lựa chọn k thuật x l mẫu, tách chiết hoạt chất cần phân tích trong các mẫu dịch sinh học cần phải dựa trên đặc điểm hóa l của hoạt chất, đặc điểm mẫu sinh học và đặc điểm của phương pháp phân tích Một k thuật x l mẫu được coi là phù hợp nếu: chiết được chất cần phân tích với độ thu hồi cao và lặp lại; quy trình x l mẫu đơn giản, kinh tế và an toàn; loại bỏ được tạp chất và các ảnh hưởng của nền mẫu đối với phương pháp phân tích

Ba k thuật cơ bản thường được s dụng để x l mẫu sinh học là: tủa protein, chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn [28] Ngoài ra, trong một số trường hợp, có thể s dụng đồng thời hai hoặc cả ba k thuật x l mẫu cơ bản đã nêu để tăng độ thu hồi hoạt chất cũng như loại bỏ ảnh hưởng của nền mẫu [6]

1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein

Tủa protein là phương pháp đơn giản để chiết các chất phân tích khỏi nền mẫu Tác nhân gây tủa protein trong dịch sinh học thường dùng là: dung môi hữu

cơ, muối vô cơ, acid,… [23]

- Gây tủa protein b ng dung môi hữu cơ: Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là h ng số điện môi của dung dịch Những phân t dung môi có h ng số điện môi lớn như nước, dimethylsulphoxid… có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân t protein

và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với h ng số điện môi nhỏ như acetonitril, methanol… sẽ ngăn cản

sự phân tán của các phân t protein trong môi trường làm giảm độ hòa tan của protein và xảy ra kết tủa protein [29]

- Tủa protein b ng muối vô cơ: Một số muối như (NH4)2SO4, NaCl… vừa trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân t protein gây ra hiện tượng tủa protein

- Tủa protein b ng acid (do thay đổi pH): Mỗi protein sẽ có một điểm đẳng điện (pI) Ở giá trị pH = pI, phân t protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường Lúc này, phân t protein sẽ kém bền nhất và dễ bị kết tủa Các tác nhân gây tủa protein do thay đổi pH thường là các acid như trichloroacetic, trifluoracetic, perchloric… Phương pháp tủa protein b ng acid được áp dụng cho những hoạt chất dễ tan trong nước và bền với acid

K thuật tủa protein có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, s dụng lượng dung môi ít và kinh tế Trên thực tế, để x l mẫu huyết tương dùng cho phân tích định lượng, người ta hay dùng k thuật tủa protein b ng dung môi hữu cơ hoặc acid Nhược điểm của k thuật này là mẫu bị pha loãng khi tủa b ng dung môi hữu cơ hoặc hoạt chất có thể bị biến đổi khi thêm acid vào mẫu phân tích Mẫu sau x l còn chứa nhiều tạp chất làm giảm tuổi thọ của cột sắc k và gây nhiễu đường nền, ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả khi phân tích b ng các

phương pháp sắc k , đặc biệt là phương pháp sắc k lỏng khối phổ [14]

1.3.1.2 Kỹ thuật chiết ỏng - ỏng

Chiết lỏng - lỏng là phương pháp được dùng phổ biến nhất để phân tích thuốc trong dịch sinh học Nguyên l của k thuật này là chuyển chất phân tích

được hoà tan trong dung môi này (thường là pha nước) sang dung môi khác không đồng tan Tỉ lệ thu hồi hoạt chất phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong dung môi chiết, tính phân cực của dung môi chiết, pH của pha nước, hệ số h ng

số phân bố của hoạt chất trong hai pha lỏng không trộn lẫn với nhau [23], [29]

Để tăng tỉ lệ thu hồi hoạt chất có thể áp dụng những giải pháp sau [24]:

- Thay đổi dung môi hữu cơ chiết (có thể phối hợp một vài dung môi hữu cơ khác nhau theo tỷ lệ thích hợp) hoặc tăng thể tích dung môi chiết

- Nếu chất phân tích ở dạng ion hoặc có khả năng ion hóa, hệ số phân bố của chất phân tích có thể tăng lên b ng cách ức chế sự ion hóa, chuyển hoạt chất về dạng phân t (điều chỉnh pH hoặc chiết tạo cặp ion…)

- Các ion kim loại có thể tạo thành một phức hợp kỵ nước với hoạt chất cần phân tích, nhờ đó có thể tăng hiệu suất chiết hoạt chất với dung môi hữu cơ

Với k thuật chiết lỏng – lỏng, mẫu thu được tương đối sạch, có thể làm giàu mẫu, phù hợp với nhiều dược chất trong điều kiện hiện có ở hầu hết các phòng thí nghiệm So với k thuật tủa protein, k thuật chiết lỏng – lỏng có một

số nhược điểm như s dụng nhiều loại dung môi hơn, mất nhiều thời gian x l mẫu, mẫu cần phải bay hơi dung môi chiết trước khi phân tích, có thể hình thành nhũ tương trong quá trình chiết gây sai lệch kết quả phân tích

Với một số hoạt chất phân cực, dễ tan trong nước, có thể dùng kết hợp đồng thời k thuật tủa protein và chiết lỏng - lỏng để thu được nền mẫu sạch hơn và tăng khả năng thu hồi chất phân tích so với k thuật tủa protein đơn thuần [14],

[28]

1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha r n

K thuật SPE dựa vào sự phân bố giữa một pha lỏng (nền mẫu hoặc dung dịch chất phân tích) và một pha rắn (chất hấp phụ) Các chất phân tích có thể được hấp phụ vào pha rắn hoặc giữ lại trong pha lỏng khi nó đi qua pha rắn Khi hai pha cân b ng, chúng có thể được tách ra nhờ gạn, lọc, ly tâm hoặc một quá trình khác tương tự Nếu chất phân tích bị hấp phụ trên bề mặt pha rắn, chúng có

thể được r a giải b ng cách s dụng dung môi phù hợp Tùy thuộc vào bản chất của chất phân tích mà người ta s dụng các loại cột chứa pha tĩnh có bản chất khác nhau và các hệ dung môi khác nhau để chiết tách Các pha tĩnh và cơ chế liên kết, r a giải của SPE tương tự như HPLC [24]

Do có nhiều loại cột chiết, cơ chế cột chiết đa dạng, phù hợp với chất phân tích nên k thuật chiết SPE thường cho hiệu suất chiết cao, ổn định, lặp lại, nền mẫu sạch ít gây ra hiện tượng ảnh hưởng của nền mẫu Đồng thời, hệ số làm giàu mẫu của k thuật SPE thường cao hơn rất nhiều so với các k thuật x l mẫu khác (trong k thuật SPE thể tích của pha rắn thường nhỏ hơn nhiều lần so với pha lỏng) K thuật SPE chỉ s dụng một lượng dung môi nhỏ để r a giải chất phân tích ra khỏi cột nên an toàn, ít độc hại hơn, thích hợp để tự động hóa, x l cùng lúc nhiều mẫu

Tuy nhiên, k thuật SPE cũng có một số nhược điểm như: khó lưu giữ chất phân cực mạnh (không thích hợp để phân tích các chất dễ tan, tan hoàn toàn trong nước; chất phân tích ở dạng ion…); tính chọn lọc chỉ dựa vào tương tác phân cực, tương tác kỵ nước, chưa dựa vào đặc điểm của chất phân tích nên hiệu suất

và tính đặc hiệu của k thuật chiết chưa cao; cột chiết pha rắn đắt tiền, nên chi

đủ độ nhạy, tin cậy và lặp lại tốt Hiện nay ở Việt Nam, th m định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học được tiến hành theo US-FDA [17], [18], EMA [15],… và gồm những chỉ tiêu sau:

1.3.2 ộ chọn ọc

Độ chọn lọc là khả năng nhận diện và phân biệt rõ ràng chất phân tích với các thành phần khác có trong mẫu Tiến hành phân tích trên 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau và 06 mẫu tự tạo có chứa chu n nội và chất phân tích ở nồng độ thấp nhất của đường chu n (nồng độ LLOQ dự kiến) trong từng nền huyết tương trắng tương ứng Ghi lại sắc đồ, đáp ứng pic và các thông số pic của các mẫu trắng và mẫu chu n

Phương pháp LC-MS MS được coi là chọn lọc đối với chất phân tích và chu n nội (IS) khi:

- Trên SKĐ mẫu chu n, các pic của chất phân tích chất phân tích và IS phải được nhận diện rõ ràng và không bị ảnh hưởng bởi các pic khác (tỷ số tín hiệu nhiễu –

S N phải ≥ 3)

- Tại thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp

ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng; tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng

1.3.2.2 Giới hạn định ượng dưới (LLOQ)

Tiến hành phân tích trên 06 mẫu huyết tương trắng, 06 mẫu tự tạo có chứa

IS và chất phân tích ở nồng độ LLOQ dự kiến Ghi lại sắc đồ và so sánh tỷ lệ đáp ứng pic của mẫu trắng và mẫu chu n

Mẫu tự tạo được coi là LLOQ khi:

- Pic của chất phân tích được nhận diện rõ ràng, giá trị S N ≥ 3, không bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác

- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng

- Nồng độ chất phân tích tính được từ đường chu n phải đạt từ 80% - 20%

so với nồng độ l thuyết, độ chính xác với giá trị CV ≤ 20%

1.3.2.3 ư ng chu n v khoảng tuyến t nh

Đường chu n biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của thiết bị và nồng độ của chất phân tích có trong mẫu

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ của chất phân tích, trong đó có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ AN với tỷ lệ đáp ứng pic AN IS

Đường chu n phải có tối thiểu 6 giá trị nồng độ, bao phủ toàn bộ khoảng tuyến tính, có hệ số tương quan r ≥ 0,98 (xác định b ng phương pháp bình phương tối thiểu) và phải đáp ứng các điều kiện sau:

- Độ đúng n m trong khoảng 85% - 5%, riêng điểm có nồng độ thấp nhất của đường chu n (LLOQ) cho phép độ đúng n m trong khoảng 80% - 120%

- t nhất 75% số điểm của đường chu n đạt được tiêu chu n trên, bao gồm

cả mẫu có nồng độ thấp nhất và nồng độ cao nhất của đường chu n

1.3.2.4 Ảnh hưởng của nền mẫu

Tiến hành x l mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau thu được dung dịch nền mẫu Thêm chu n nội và chất phân tích ở nồng độ LQC và HQC vào từng dung dịch nền mẫu trên Song song chu n bị các mẫu chu n trong pha động chứa chu n nội và chất phân tích ở nồng độ tương ứng với nồng độ của các mẫu chu n trong nền mẫu Phân tích sắc k các mẫu trên Xác định giá trị MFAN, MFIS của AN và IS b ng cách so sánh diện tích pic AN và IS giữa các mẫu pha trong nền mẫu với các mẫu pha trong pha động

Phương pháp LC-MS MS không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu khi giá trị CV của tỷ số MFAN/MFIS trên ít nhất 6 nền mẫu trắng có nguồn gốc khác nhau phải ≤ 15%

1.3.2.5 ộ nhiễm chéo

Tiến hành x l mẫu theo phương pháp đã xây dựng trên 6 mẫu huyết tương trắng, 6 mẫu chu n pha trong huyết tương ở nồng độ LLOQ và 6 mẫu chu n pha trong huyết tương ở nồng độ cao nhất của đường chu n

Mẫu được coi là không bị nhiễm chéo trong quá trình tiêm mẫu khi tiêm mẫu trắng ngay sau mẫu có nồng độ cao nhất của đường chu n thì tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic trung bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của từng mẫu trắng, tại thời gian lưu của IS phải gấp ít nhất 20 lần

Độ đúng và độ chính xác được thực hiện trên 05 mức nồng độ khác nhau (LLOQ, LQC, SQC, MQC, HQC), mỗi nồng độ tiến hành ít nhất 5 mẫu

Độ đúng trong ngày và khác ngày phải đạt trong khoảng 85 - 5%; độ chính xác trong ngày và giữa các ngày với giá trị CV ≤ 5% Riêng nồng độ LLOQ cho phép độ đúng n m trong khoảng 80 - 20% và giá trị CV ≤ 20%

1.3.2.7 T ệ thu hồi

Tỷ lệ thu hồi là chỉ tiêu đánh giá khả năng tìm lại của chất phân tích và chu n nội sau quá trình chiết tách x l mẫu Tỷ lệ thu hồi được xác định b ng cách so sánh kết quả đáp ứng của các mẫu QC có qua chiết tách với đáp ứng của các mẫu chu n không được x l qua chiết tách (mẫu pha trong pha động hoặc trong nền mẫu huyết tương)

Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chu n nội phải ổn định và tỷ lệ thu hồi của chất phân tích tại các mức nồng độ khác nhau không được quá 5%

1.3.2.8 Nghiên cứu độ ổn định của hoạt chất trong dịch sinh học

Trong các nghiên cứu SKD, TĐSH… quá trình phân tích thường kéo dài vì

số lượng mẫu lớn Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu độ ổn định hoạt chất sau các quá trình bảo quản và phân tích Trong th m định phương pháp cần đánh giá các loại độ ổn định sau:

- Độ ổn định của dung dịch chu n gốc, dung dịch chu n làm việc thời gian dài và hoặc thời gian ngắn

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông – rã đông

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

+ Độ ổn định thời gian dài ở nhiệt độ bảo quản

+ Độ ổn định của mẫu sau x l (trong autosampler)

Các mẫu huyết tương được coi là ổn định ở điều kiện nghiên cứu nếu nồng độ của mẫu sau bảo quản sai khác so với nồng độ ban đầu không quá 5% và giá trị

CV giữa các lần phân tích ≤ 15%

CHƯƠNG 2 Đ I TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU

- Các chất chuẩn được sử dụng:

+ Indapamid – chu n Dược điển Việt Nam, số kiểm soát: WS.0 08244, hàm lượng 99,87%; độ m 2,33%;

+ Cloramphenicol - chu n Dược điển Việt Nam, hàm lượng: 99,75%; độ

m 0,04%; số kiểm soát: 0203004, được s dụng làm chất chu n nội (IS) trong phương pháp phân tích

+ Một số chất chu n khác: glipizid, isosorbid mononitrat, prednison, glibenclamid

- Mẫu huyết tương trắng: được cung cấp bởi Viện huyết học và truyền máu

Trung ương, gồm các lô: 16P003396, 16P003381, 16P003266, 16P003397, 16P015580, 16P003390

- Thiết bị, dụng cụ:

Tất cả các thiết bị phân tích tại trung tâm đánh giá tương đương sinh học (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương) đều được chu n hóa theo qui định của ISO IEC 7025- 2005 và GLP, bao gồm:

+ Hệ thống LC-MS loại Triple Quadrupole, model TSQ Quantum Vantage với nguồn ion hóa kiểu phun điện t - ESI, Thermo Fisher Scientific;

+ Cân phân tích Sartorius CP224S (d = 0,1 mg);

+ Máy ly tâm Sartorius Sigma 2-16K;

+ Thiết bị bay hơi dung môi b ng khí nitơ có gia nhiệt Reacti-Therm III, Thermo scientific;

+ Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientific;

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3 ây dựng điều kiện khối phổ ác định IND v chu n nội

S dụng hệ thống LC-MS loại Triple Quadrupole với nguồn ion hóa kiểu ESI, tiến hành thực nghiệm như sau:

- Tối ưu hóa điều kiện khối phổ IN :

Bơm trực tiếp vào máy khối phổ dung dịch INDA 1 µg/mL pha trong hỗn hợp MeOH : H2O (1 : 1) để xác định:

+ Ion mẹ cho INDA;

+ Tối ưu các điều kiện ở nguồn ion hóa và bộ phận thấu kính hội tụ ion để lượng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối là nhiều và ổn định nhất;

+ Mảnh ion con của INDA có cường độ tín hiệu cao và ổn định;

+ Tối ưu năng lượng phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên để lượng ion con tạo thành nhiều và ổn định nhất

- Khảo sát lựa ch n chu n nội:

Dựa trên cấu trúc phân t và tính chất hóa l của các chất để tiến hành lựa chọn chu n nội cho phương pháp Chu n nội được lựa chọn phải đảm bảo bền vững, có thể tham gia quá trình chiết tách và phân tích sắc k cùng chu n Dự kiến chất chu n nội lựa chọn gồm có: glipizid, isosorbid mononitrat, prednison, glibenclamid, cloramphenicol Tiến hành tối ưu hóa điều kiện khối phổ của chu n nội tương tự như với chất chu n INDA để thu được cường độ tín hiệu cao

và ổn định

2.3 .2 Khảo sát điều kiện s c k

Chu n bị dung dịch chu n hỗn hợp chứa đồng thời INDA và IS trong pha động có nồng độ khoảng 50 ng mL Tiến hành khảo sát điều kiện sắc k trên các cột C18 (100 × 2,1 mm; ,7 µm hoặc 50 x 4,6 mm; 5 µm); C8 ( 00 × 2, mm; 1,9 µm), trên các hệ pha động gồm dung môi hữu cơ (MeCN hoặc MeOH) phối hợp với dung dịch đệm (amoni acetat 2 mM, 10 mM hoặc acid formic 0, %, amoni format 2 mM) theo các tỷ lệ khác nhau

2.3 .3 Khảo sát qui trình ử mẫu huyết tương

Tiến hành khảo sát các phương pháp x l mẫu trên mẫu huyết tương trắng

và các mẫu tự tạo có nồng độ INDA chính xác khoảng 0,5 và 00 ng mL (dự kiến tương ứng là mẫu LLOQ và nồng độ cao nhất của đường chu n) b ng các

acetat) được phối hợp theo các tỷ lệ khác nhau Đồng thời với từng hệ dung môi, mẫu huyết tương được kiềm hóa hoặc acid hóa hoặc không kiềm hóa hay acid hóa trước khi thêm dung môi chiết

+ Chu n bị các mẫu có nồng độ chính xác khoảng 0,5 ng/mL và 100 ng/mL trong pha động (không qua chiết tách) để so sánh đáp ứng pic với các mẫu có nồng độ tương ứng trong huyết tương

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Tiến hành th m định phương pháp định lượng INDA trong huyết tương người b ng k thuật LC-MS/MS theo qui định của US-FDA [17], [18] và EMA (2012) [15] về th m định phương pháp phân tích trong dịch sinh học Các chỉ tiêu cần th m định bao gồm: độ đặc hiệu - chọn lọc của phương pháp; ảnh hưởng của nền mẫu; giới hạn định lượng dưới; đường chu n - khoảng tuyến tính; độ nhiễm chéo; độ đúng – độ chính xác trong ngày, khác ngày; tỉ lệ thu hồi và độ ổn định của hoạt chất trong quá trình x l , phân tích và bảo quản mẫu dài ngày Tiến hành th m định trên các mẫu HT trắng và các mẫu HT tự tạo chứa chu n INDA có nồng độ phù hợp Các mẫu HT tự tạo chứa INDA được chu n bị như sau:

- Chu n bị mẫu chu n:

Cân chính xác khoảng 25 mg chất chu n INDA vào bình định mức 00 mL, hòa tan trong MeOH để thu được dung dịch chu n gốc có nồng độ khoảng 250

g mL Từ dung dịch chu n gốc tiến hành pha loãng b ng MeOH để thu được dung dịch chu n làm việc trong MeOH có nồng độ INDA khoảng 000 ng mL Hút mL dung dịch này, bốc hơi dưới dòng khí nitơ ở 40 C để thu được cắn Hòa tan cắn b ng 0 mL huyết tương trắng để thu được dung dịch chu n làm việc (WS-CC ) trong huyết tương có nồng độ INDA khoảng 00 ng mL Hút 0,5

mL dung dịch WS-CC vào bình định mức 0 mL, bổ sung huyết tương trắng vừa đủ để thu được dung dịch chu n làm việc (WS-CC2) trong huyết tương có nồng độ INDA khoảng 5 ng mL

Từ dung dịch chu n làm việc WS-CC1 và WS-CC2, phối hợp với huyết tương trắng theo bảng 2 để được các mẫu đường chu n dự kiến trong khoảng nồng độ 0,5 – 100 ng/mL

Bảng 2.1- ách chu n bị các mẫu chu n trong huyết tương

- Chu n bị mẫu kiểm tra:

Mẫu kiểm tra được chu n bị từ dung dịch gốc độc lập với mẫu chu n Tiến hành tương tự như mẫu chu n làm việc WS-CC1 và WS-CC2 để thu được dung dịch WS-QC1 và WS-QC2 có nồng độ INDA trong huyết tương lần lượt là 00 ng/mL và 5 ng/mL

Từ dung dịch chu n làm việc WS-QC1 và WS-QC2, phối hợp với huyết tương trắng theo bảng 2.2 để được các mẫu kiểm tra LQC, SQC, MQC, HQC có nồng độ dự kiến (LQC có nồng độ INDA b ng khoảng 3 lần nồng độ thấp nhất của đường chu n - LLOQ; SQC có nồng độ INDA b ng khoảng 30 lần nồng độ LLOQ, MQC có nồng độ INDA b ng khoảng 30 - 50% nồng độ cao nhất của đường chu n - ULOQ; HQC có nồng độ INDA b ng khoảng 75 – 90% ULOQ)

Bảng 2.2- ách chu n bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương

- Chu n bị dung dịch chu n nội:

Cân chính xác khoảng 25 mg chất chu n nội vào bình định mức 00 mL, hòa tan trong MeOH để thu được dung dịch chu n nội gốc có nồng độ chính xác khoảng 250 g/mL

Từ dung dịch chu n nội gốc, pha loãng b ng hỗn hợp MeOH : H2O (1 : 1)

để thu được dung dịch chu n nội làm việc có nồng độ thích hợp (đáp ứng của chu n nội b ng khoảng 50% đáp ứng của INDA ở nồng độ ULOQ)

2.3.3 Xác định nồng độ INDA trong mẫu huyết tương người t nh nguyện Người tình nguyện (NTN) là nam hoặc nữ giới khỏe mạnh, tuổi 8 – 55, có

chỉ số BMI về cân nặng và chiều cao phải trong khoảng từ 8 – 25 kg/m2 theo cách tính của Metropolitan Index 983 cho người lớn, được kiểm tra lâm sàng và làm các xét nghiệm cơ bản, xem xét tiền s bệnh, có khả năng hiểu các thông tin

về nghiên cứu [10], [11], [19], [4]

NTN được uống 0 viên nén chứa INDA 1,5 mg sau khi nhịn đói qua đêm Lấy mẫu từ tĩnh mạch cẳng tay NTN ở các thời điểm: ngay trước khi uống thuốc (thời điểm 0 giờ) và sau khi uống thuốc các khoảng thời gian: 2; 4; 6; 7; 8; 9; 10; 11; 12; 14; 16; 24; 36; 48; 72 giờ

Mẫu máu sau khi lấy được chuyển vào các ống nghiệm chứa chất chống đông Na2-EDTA, ly tâm với tốc độ 4000 vòng phút x 0 phút, tách lấy phần huyết tương và bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -35 ± 5°C cho đến khi được phân tích

Sau khi kết thúc lấy mẫu, tiến hành phân tích xác định nồng độ INDA trong các mẫu huyết tương NTN theo phương pháp đã được xây dựng và th m định

Từ nồng độ thuốc đã định lượng được trong các mẫu huyết tương biểu diễn đường cong biến thiên nồng độ INDA theo thời gian và tính toán một số thông số DĐH cơ bản của INDA s dụng phần mềm Excel 2007:

+ Cmax, Tmax: xác định trực tiếp từ dữ liệu thực nghiệm

+ AUC0-t được tính theo nguyên tắc hình thang s dụng công thức tính sau:

Trong đó: Ci, Ci+1 là nồng độ INDA trong huyết tương ở thời điểm ti và ti+1

n là thời điểm lấy mẫu cuối cùng mà nồng độ còn định lượng được + AUC0-∞ = AUC0-t + Cn/λZ

Với Cn là nồng độ INDA tại thời điểm lấy mẫu cuối cùng còn định lượng được và λzlà hệ số thải trừ

CHƯƠNG 3 ẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 ẾT QUẢ X Y D NG PHƯƠNG PHÁP PH N T CH

3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng INDA và chuẩn nội

3.1.1.1 iều kiện khối phổ định ượng IND

 Ion hóa INDA v phổ khối MS

Phân tích phổ khối trên thiết bị LC-MS MS với chế độ phân tích khối lần,

s dụng nguồn ion hóa ESI ở chế độ điện tích âm và k thuật ghi toàn phổ tại tứ

cực Q (full scan) Trên phổ đồ của dung dịch chu n INDA µg mL, xuất hiện

vạch phổ có cường độ lớn và ổn định với tỷ số m z = 364,0 (hình 3.1) Vạch phổ phù hợp với cấu trúc phân t INDA (CTPT: C16H16ClN3O3S, KLPT: 365,0 g/mol) cho một proton và mang điện tích -1 ([INDA-H]-)

Hình 3.1- Phổ khối MS dung dịch chu n INDA

Tiến hành tối ưu hóa điện thế của “thấu kính hội tụ”, để các ion [INDA-H]

hình thành ở nguồn ESI được “tập trung” và đi vào bộ phận phân tích khối với số lượng nhiều nhất trong một thời gian ngắn Giản đồ mối quan hệ giữa điện thế

“thấu kính hội tụ” và tỷ lệ tương đối số lượng ion có số khối 364 Da đi vào bộ phận phân tích khối (hình 3.2) cho thấy ở mức điện thế 26 V các ion [INDA-H]-

“hội tụ” đi vào bộ phận phân tích khối là tối ưu nhất

Hình 3.2- Giản đồ tối ưu điện thế “thấu kính hội tụ” ion có số khối 364 Da

Phân mảnh ion ban đầu v phổ khối MS/MS của IND

Sau khi phân mảnh ion mẹ, phân tích khối lần thứ 2 tại được thực hiện tại tứ cực Q3 với chế độ ghi toàn phổ MS MS để xác định số khối của các ion con tạo thành

Hình 3.3- Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [INDA-H]

-Trên phổ đồ phân mảnh ion [INDA-H]- (hình 3.3) có thể dự đoán vạch phổ có

m z = 89 (phù hợp với cấu trúc [INDA-2-methylindol-NHCO-H]

-) Trong số các ion con tạo thành, ion có tỷ số m z = 89 có cường độ tín hiệu cao nhất, ổn định, lặp lại và đặc trưng cho quá trình phân mảnh INDA Do vậy, cặp ion có m z

= 364 và 189 được lựa chọn cho các thực nghiệm tiếp theo Quá trình phân mảnh ion ban đầu có m z = 364 tạo thành các ion con có m z = 89 phụ thuộc vào mức năng lượng được cung cấp.

Hình 3.4- Giản đồ năng lượng phân mảnh [INDA-H]

-Hình 3.4 biểu diễn sự phụ thuộc giữa số lượng ion m z = 89 tạo thành với mức năng lượng phân mảnh ion [INDA-H]- ban đầu Khi năng lượng phân mảnh lớn (trên 40 V), ion [INDA-H]- bị bẻ gẫy hầu hết các liên kết trong phân t tạo ra các mảnh, tiểu phân hay ion có số khối nhỏ Do đó, ion có số khối 89 Da được tạo thành không nhiều Khi mức năng lượng phân mảnh thấp (dưới 20 V), năng lượng cung cấp không đủ để phá vỡ các liên kết phân t của ion [INDA-H]- nên

số lượng ion có m z = 89 được tạo thành cũng không nhiều Mức năng lượng tối

ưu để phân mảnh ion [INDA-H]- thành ion con có số khối 189 Da là 28 V

 Tối ưu hóa các điều kiện khối phổ

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: điện thế, nhiệt độ đầu phun; lưu lượng khí nitơ cung cấp tại nguồn ESI theo các nội dung đã trình bày ở mục

2.3.1.1 Kết quả khảo sát cho thấy:

- Khi điện thế đầu phun tăng, cường độ vạch phổ 364 Da tăng nhưng đồng thời xuất hiện nhiều vạch phổ có số khối khác (nhiễu đường nền tăng) và ngược lại Điều này, có thể do khi điện thế tăng có nhiều phần t được tích điện hơn (bao gồm cả INDA và tạp chất) làm cho dòng ion mẹ đi vào bộ phận phân tích khối tăng lên đồng thời các ion khác đi vào bộ phận phân tích khối cũng tăng lên và ngược lại Khi điện thế tăng cao trên 3000 V thì có hiện tượng phóng hồ quang điện ở đầu phun ảnh hưởng đến hoạt động của thiết bị Khi điện thế dưới 2000 V, thì cường độ vạch phổ 364 Da thấp, làm giảm độ nhạy của phương pháp