Nghiên cứu xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn lẫn trong các chế phẩm thuốc đông dược bằng sắc ký mỏng hiệu năng cao

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn lẫn t

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM THUỐC ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN LẪN TRONG CÁC CHẾ PHẨM THUỐC ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, người thầy đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên khoa Dược trường Đại học Y-Dược Huế, người đã động viên, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà - giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội và PGS.TS Lê Văn Vũ – trung tâm Khoa học vật liệu, khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên bộ môn Hoá phân tích - Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp

đã luôn bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập

và nghiên cứu

Hà Nôi, ngày 3 tháng 4 năm 2017

Học viên

Phạm Thị Tâm

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các kí hiệu, chữ viết tắt

Danh mục bảng

Danh mục hình ảnh

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1.Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dược hỗ trợ điều trị và điều trị tiểu đường 3

1.1.2 Cấu trúc, tính chất lý hoá và tác dụng của metformin, glibenclamid 6 1.2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 8

1.2.1 Sắc ký lớp mỏng 8

1.2.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 9

1.2.3 Phương pháp quang phổ Raman 10

1.3 Một số nghiên cứu định tính, định lượng nhóm thuốc giảm glucose máu trộn trong các chế phẩm từ dược liệu 14

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 19

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 19

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng metformin HCl và glibenclamid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC 20

2.2.2 Thẩm định phương pháp 22

2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 23

2.2.4 Bước đầu khảo sát các điều kiện phát hiện glibenclamid bằng TLC-SERS 23

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 26

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC 26

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC 26

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu HPTLC 27

3.1.3 Thẩm định phương pháp HPTLC 30

3.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 36

3.2 Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện glibenclamid bằng TLC-SERS 40

Chương 4: BÀN LUẬN 49

4.1 Phương pháp HPTLC 49

4.1.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 49

4.1.2 Lựa chọn xử lý mẫu 50

4.1.3 Thẩm định phương pháp 51

4.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 52

4.2 Phương pháp TLC-SERS 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức

(Association of Official Analytical Chemists) DMF N,N-dimethylformamid

HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao

(High Performance Thin Layer Chromatography) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SERS Tán xạ Raman tăng cường bề mặt

(Surface- enhancedRamanspectroscopy)

TFA Acid trifloracetic

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua

(Transmission Electron Microscopy) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khoẻ

WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết metformin HCl, glibenclamid 28 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống của phương pháp HPTLC 31 Bảng 3.3 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của metformin HCl, glibenclamid 32 Bảng 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng của metformin 33 Bảng 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại và độ đúng của glibenclamid 34 Bảng 3.6 Kết quả xác định LOD, LOQ của metformin HCl và glibenclamid 36 Bảng 3.7 Kết quả hàm lượng glibenclamid trong các mẫu thử 39 Bảng 3.8 Cách pha các nồng độ khác nhau của dung dịch keo M5 44 Bảng 3.9 Thể tích chấm khảo sát LOD của phương pháp TLC-SERS 48

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Các thành phần tán xạ thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu 11

Hình 1.2.Tán xạ Raman Stokes và đối Stokes, m, n, r: các mức năng lượng 12

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động 26

Hình 3.2 Kết quả quét phổ UV tại vị trí của chất phân tích 27

Hình 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết 28

Hình 3.4 Sơ đồ xử lý mẫu phân tích 29

Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC 30

Hình 3.6 Sắc ký đồ analog của hỗn hợp hoạt chất xác định tính chọn lọc của phương pháp 30

Hình 3.7 Sắc ký đồ 3D khoảng tuyến tính của metformin HCl và glibenclamid 32

Hình 3.8 Đường biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của metformin và glibeclamid 32

Hình 3.9 Sắc ký đồ xác định LOD của glibenclamid và metformin HCl 35

Hình 3.10 Sắc ký đồ analog xác định LOD của glibenclamid) 35

Hình 3.11 Sắc ký đồ analog xác định LOD của metformin HCl 35

Hình 3.12 Sắc kí đồ phân tích các mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường bằng HPTLC 37

Hình 3.13 Kết quả chồng phổ UV quét tại vị trí có Rf  0,77 (vết glibenclamid)của các mẫu dương tính với glibenclamid 38

Hình 3.14 Phổ Raman của bột glibenclamid chuẩn, phổ SERS của glibenclamid sau khi nhỏ các hỗn dịch keo bạc M5 và F4 42

Hình 3.15 Hình ảnh đo TEM của các hỗn dịch keo bạc trong nước (M5) và keo bạc trong DMF (F4) ở các độ phóng đại khác nhau 43

Hình 3.16 Phổ hấp thụ UV-vis của các hỗn dịch keo bạc M5 và F4 44 Hình 3.17 Mối quan hệ giữa nồng độ keo bạc M5 với mức độ tương đối của

đỉnh cao nhất 1244 cm-1

của glibenclamid 45 Hình 3.18 Phổ Raman ở glibenclamid bột chuẩn, vết glibenclamid khi không

nhỏ keo bạc và vết glibenclamid có nhỏ keo bạc 46 Hình 3.19 Hình ảnh thể hiện tính chọn lọc của phương pháp 47 Hình 3.20 Kết quả khảo sát LOD của phổ SERS của glibenclamid 48

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, con người có xu hướng quay về thiên nhiên trong việc phòng bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những bệnh mãn tính Các thuốc đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ (TPBVSK) có nguồn gốc tự nhiên đang là mục tiêu mà các nhà sản xuất và người tiêu dùng trong nước cũng như trên thế giới hướng tới Tuy nhiên, tình trạng tân dược được trộn trái phép trong đông dược, TPBVSK từ dược liệu đang diễn ra (thành phần có hoạt chất tân dược nhưng không công bố trên nhãn)

Đái tháo đường là một bệnh mạn tính và có thể gây tổn hại nghiêm trọng cho nhiều hệ thống cơ thể trong một thời gian dài Theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), có khoảng 422 triệu bệnh nhân đái tháo đường trên toàn thế giới và khoảng 90% trong số đó là đái tháo đường typ II (không phụ thuộc insulin) [31] Hơn nữa, trên thị trường dược phẩm, bốn loại thuốc tổng hợp chính bao gồm: sulfonylure, biguanid, thiazolidin và các thuốc khác không phải sulfonylure, được sử dụng phổ biến để điều trị tiểu đường typ II Tuy nhiên, những thuốc giảm glucose máu thường bị phát hiện trộn lẫn trái phép trong các chế phẩm đông dược như metformin, glibenclamid, gliclazid [23], [28]; Nếu sử dụng các chế phẩm này trong một thời gian dài mà không biết rõ thành phần, người sử dụng có thể xuất hiện tình trạng nhiễm toan lactic, rối loạn tiêu hóa, tổn thương gan thận…[33], [35] Do đó, một nhu cầu cấp thiết nhằm phát triển một phương pháp nhanh chóng để sàng lọc các chế phẩm đông dược bị trộn lẫn các thuốc tổng hợp hoá học này Do metformin và glibenclamid là hai thuốc tân dược thường được trộn nhiều nhất vào các chế phẩm đông dược, nên đề tài đã chọn 2 dược chất này để nghiên cứu Hiện nay đã có một số nghiên cứu phát hiện các thuốc tân dược trộn lẫn trong thuốc đông dược, TPBVSK được triển khai như sắc ký lớp mỏng

vì nền mẫu của các chế phẩm đông dược rất đa dạng Trong khi đó, tán xạ Raman là một kỹ thuật nhạy trên bề mặt, có thể tăng cường từ 104-106 so với quang phổ Raman bình thường [32] Kết hợp TLC và SERS sẽ thuận lợi cho việc phát hiện tại chỗ vì tính đơn giản, nhanh chóng, cung cấp nhiều thông tin về dược chất và tăng độ chọn lọc của phương pháp, đồng thời loại trừ khả năng phát huỳnh quang của dược liệu

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn

trong các chế phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu

xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn lẫn trong các chế phẩm thuốc đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao”

Với mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định tính, định lượng metformin và glibenclamid trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao; đồng thời ứng dụng phương pháp này để phân tích một số mẫu chế phẩm đông dược trên thị trường

2 Bước đầu khảo sát các điều kiện phát hiện glibenclamid bằng TLC kết hợp với tán xạ Raman tăng cường bề mặt

3

Chương 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1.Các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ và thuốc thảo dược hỗ trợ điều trị và điều trị tiểu đường

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe là sản phẩm được chế biến dưới dạng viên nang, viên hoàn, viên nén, cao, cốm, bột, lỏng và các dạng chế biến khác có chứa một hoặc hỗn hợp của các chất sau đây: a) Vitamin, khoáng chất, acid amin, acid béo, enzym, probiotic và chất có hoạt tính sinh học khác; b) Hoạt chất sinh học có nguồn gốc tự nhiên từ động vật, chất khoáng và nguồn gốc thực vật ở các dạng như chiết xuất, phân lập, cô đặc và chuyển hóa [2]

Thuốc y học cổ truyền (bao gồm cả vị thuốc y học cổ truyền và thuốc thang) là thuốc có thành phần là dược liệu được chế biến, bào chế hoặc phối ngũ theo lý luận và phương pháp của y học cổ truyền hoặc theo kinh nghiệm dân gian thành chế phẩm có dạng bào chế truyền thống hoặc hiện đại [1].Thuốc thành phẩm y học cổ truyền (thuốc đông y, thuốc từ dược liệu) là dạng thuốc y học cổ truyền đã qua tất cả các giai đoạn sản xuất, kể cả đóng gói và dán nhãn, bao gồm: Thuốc dạng viên, thuốc dạng nước, thuốc dạng chè, thuốc dạng bột, thuốc dạng cao và các dạng thuốc khác [1]

Mặc dù trong những năm gần đây đã có sự cải tiến của các loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp, điều trị bệnh tiểu đường vẫn không đạt được thành công rõ rệt Điều trị bệnh tiểu đường là phức tạp do đây là bệnh mạn tính, người bệnh phải dùng thuốc cả cuộc đời, trong khi đó lại thiếu thuốc an toàn và hiệu quả, không bền vững về lâm sàng…Ngược lại, các loại thuốc thảo dược đã đạt được tầm quan trọng lớn hơn trên toàn thế giới, chủ yếu là

do tính an toàn cao hơn, ít tác dụng bất lợi hơn và khả năng hạ thấp lượng đường trong máu ổn định Ở các nước phát triển, việc sử dụng thuốc thảo dược cho người mắc bệnh tiểu đường được khuyến khích bởi những lo ngại

4

về tác dụng phụ và chi phí liên quan tới việc sử dụng lâu dài các thuốc tổng hợp Ở Việt Nam, các thuốc đông dược và TPBVSK sử dụng hộ trợ điều trị tiểu đường rất đa dạng Người bệnh có thể đến các nhà thuốc để mua các TPBVSK có số đăng ký, được bào chế thành dạng viên nén, viên nang hoặc trà túi lọc thuận tiện cho việc sử dụng Trong khi đó, các chế phẩm thuốc đông dược của các lương y, lương dược (không có số đăng ký) được bào chế dưới dạng viên hoàn hay thuốc bộtngoài được bán tại cơ sở chế biến còn được bán trên các trang mạng xã hội, người bệnh không cần đến tận nơi cũng có thể

có được sản phẩm thuốc để sử dụng Điều này vừa có lợi vừa bất lợi cho người bệnh, khi những chế phẩm này chưa được kiểm soát chặt chẽ có thể có những chế phẩm bị trộn lẫn tân dược mà người sử dụng không được biết

Về thành phần của các thuốc đông dược và TPBVSK hỗ trợ điều trị tiểu đường cũng rất đa dạng Các chế phẩm có thể chỉ có 1 thành phần là dược liệu như Diabetna, Dây thìa canh Gia Huy…trong thành phần có chứa dược liệu là dây thìa canh.Các chế phẩm phổ biến có nhiều thành phần hơn, từ 2 tới 10 thành phần là dược liệu Cũng có những chế phẩm có khá nhiều thành phần như các thuốc gia truyền điều trị tiểu đường của các lương y, lương dược có thể lên tới 14, 15 thành phần là dược liệu Các dược liệu phổ biến nhất được

sử dụng trong các chế phẩm này là dây thìa canh, khổ qua, nhàu, giảo cổ lam, sinh địa, hoài sơn…

Tuy thuốc từ thảo dược đã sử dụng lâu đời, nhưng người sử dụng có rất ít kiến thức về tính an toàn của nó Thuốc đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng Do quy định thiếu chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp không khai báo Đã có 85 tỷ USD các thuốc từ dược liệu bị làm giả được bán ra trong năm 2010 và hàng năm tăng lên 5,4% Có 222 trong số 332 các sản phẩm bị làm giả đã được thu hồi Hơn 95% các sản phẩm được tìm thấy bị làm giả với

5

các thuốc tăng cường tình dục [22] Các nước chi tiêu hàng đầu cho các sản phẩm này là: Singapore, Hồng Kông, Na Uy, Australia và Hàn Quốc [22] Khảo sát gần đây được tiến hành bởi một nhóm người Pháp phát hiện ra rằng 61% trong số 150 thực phẩm chức năng đã được pha trộn với các chất ức chế PDE-5 (27% sildenafil, tadalafil và vardenafil; 34% từ các chất có cấu trúc tương tự) [30]

Đây cũng là vấn đề mà các cơ quan chức năng của nước ta cũng rất quan tâm Trong những năm gần đây, cùng với sự phối hợp của các cơ quan công

an, thanh tra dược, hệ thống kiểm nghiệm từ Trung ương đến địa phương đã phát hiện nhiều loại thuốc và chế phẩm đông dược có trộn lẫn tân dược Trong đó bao gồm cả chế phẩm có và không có nguồn gốc, được sản xuất trong nước hay nhập từ nước ngoài nhưng nhiều nhất là các chế phẩm không

có số đăng ký Các chế phẩm này ngày càng được làm giả một cách khéo léo

và tinh vi: ví dụ trộn tân dược vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc…

Nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ đạo tăng cường công tác quản lý chất lượng dược liệu, thuốc y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu, đặc biệt là Chỉ thị số 03/CT-BYT ngày 24/02/2012 về việc tăng cường quản lý cung ứng, sử dụng dược liệu, thuốc Y học cổ truyền, thuốc từ dược liệu trong các cơ sở khám chữa bệnh bằng y học cổ truyền với nhiều giải pháp đồng bộ Kết quả kiểm tra đánh giá chất lượng thuốc năm 2013, toàn quốc có 56.179 mẫu thuốc đã được kiểm tra đánh giá chất lượng (cả thuốc tân dược và đông dược), trong đó phát hiện 1004 mẫu thuốc (1,79 %) không đạt chỉ tiêu chất lượng và 08 (0,014%) mẫu thuốc giả; tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng là (1,8%) Tỷ lệ thuốc giả và thuốc kém chất lượng năm 2013 (1,8%) giảm so với năm 2012 (3,09%) [12]

6

Đã có nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tình trạng trộn lẫn tân dược trong các chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường tại các nước [15], [23] Tại Trung Quốc năm 2010, khi kiểm tra 30 mẫu thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng trên thị trường đã phát hiện trong 14 mẫu có chứa các thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (gồm có: glibenclamid, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin…) [23] Trong một nghiên cứu khác tiến hành năm

2009 cũng tại nước này, trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5 thuốc được phát hiện có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, 3 thuốc chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin [28] Tại Ả Rập Saudi, trong nghiên cứu công bố năm 2006, khi tiến hành kiểm tra các mẫu chế phẩm nguồn gốc dược liệu cũng đã phát hiện một số mẫu dương tính với glibenclamid [15]

Từ các nghiên cứu ở các nước trên thế giới, nhận thấy glibenclamid và metformin thường được trộn vào các chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị tiểu đường, do đó đề tài này đã lựa chọn 2 hoạt chất này để tiến hành nghiên cứu

1.1.2.Cấu trúc, tính chất lý hoá và tác dụng của metformin, glibenclamid

1.1.2.1 Metformin

Công thức hoá học: C4H11N5 HCl

Tên khoa học: 1,1 – dimethylbiguanid hydroclorid [6]

Tính chất: Tinh thể trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong aceton và dicloromethan Điểm chảy từ 2220C đến

226oC [3], [6]

Liều dùng: Viên nén 500 mg: Bắt đầu uống 500 mg/lần, ngày 2 lần Tăng liều thêm một viên mỗi ngày, mỗi tuần tăng 1 lần, tới mức tối đa là 2.500 mg/ngày [5]

7

Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng ức chế hấp thu glucose ở ruột, tăng nhập glucose vào tế bào, kích thích phân huỷ và ức chế tái tạo glucose Ngoài ra còn làm giảm lipid máu [4]

Tác dụng không mong muốn [5]: thường gặp là tình trạng tăng acid lactic gây toan máu; miệng có vị kim loại, chán ăn, nôn, buồn nôn, ỉa chảy, đầy thượng vị, táo bón, ợ nóng; ban, mày đay, cảm thụ với ánh sáng; giảm nồng

độ vitamin B12 Ít gặp hơn là các tác dụng không mong muốn trên huyết học như: loạn sản máu, thiếu máu bất sản, thiếu máu tan huyết, suy tuỷ, giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt

1.2.Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

Pha động thay đổi tuỳ thuộc vào cơ chế sắc ký Để tăng cường sức rửa giải, thường kết hợp 2-3 dung môi Nguyên lý chia tách dựa vào hệ số phân bố giữa hai pha Pha động di chuyển qua pha tĩnh nhờ lực mao dẫn Các chất phân tích sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào bản chất của chúng, kết quảlà chúng được tách riêng có vị trí khác nhau trên

bản mỏng [7]

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số này được tính bằng tỷ lệ giữa quãng đường di chuyển của chất phân tích và quãng đường dịch chuyển của pha động [7], [3]

Rf = dR /dM

dR: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

9

dM: Khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động (đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf: có giá trị dao động giữa 0 và 1

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát); thực hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn; phương pháp này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để đánh giá nhanh chất lượng của thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm tra độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả [7]

1.2.2.Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một hình thức tiên tiến của TLC HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất các số liệu đưa ra Trong đó, các thông số của quá trình phân tích được ghi lại và kiểm soát chặt chẽ,

do đó có độ lặp lại cao Các bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá trình phân tích Quá trình phun mẫu được tiến hành tự động hoặc bán tự động, đảm bảo chính xác thể tích mẫu phun, đồng thời có sấy bằng khí nitơ do đó giảm sự oxy hóa đối với chất phân tích dễ bị oxy hóa Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt

độ, độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau Hệ thống đèn UV tích hợp máy ảnh và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính và định lượng [14]

10

Hiện nay để tăng cường độ tin cậy của kết quả phân tích, người ta sử dụng bản mỏng hiệu năng cao (high performance plates) Bản này được tráng lớp pha tĩnh mỏng hơn TLC (dày khoảng 100µm) với bột mịn có kích thước hạt 5µm độ đồng đều cao hơn Khi dùng bản mỏng này, hiệu quả cao hơn do kích thước hạt mịn hơn, độ nhạy và độ phân giải được tăng cường vì vết sắc ký nhỏ, thời gian sắc ký ngắn hơn và lượng dung môi ít hơn so với TLC [14]

Ưu điểm của HPTLC:

- Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng

- Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao

- Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ,

độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích

- Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu

Do những ưu điểm trên nên chúng tôi lựa chọn kỹ thuật HPTLC cho nghiên cứu này

1.2.3.Phương pháp quang phổ Raman

1.2.3.1 Nguyên lý cơ bản của quang phổ Raman

Khi chiếu chùm bức xạ tán xạ vào một tấm kính ảnh thì nhận được một dải vạch khác nhau, gọi là phổ Raman Trong phổ Raman có một vạch đậm ở

giữa có tần số v o bằng tần số của bức xạ kích thích, còn ở hai bên là các vạch đối

xứng nhau có tần số lớn hơn hoặc nhỏ hơn Các vạch có tần sốv o – vgọi là « tán

xạ Stokes », còn vạch có tần số v o + v gọi là « tán xạ đối Stokes » [9], [11]

Quang phổ Raman xuất hiện là do sự tương tác giữa ánh sáng với các phân

tử Qua sự tương tác này mà lớp vỏ electron của các nguyên tử trong phân tử

bị biến dạng tuần hoàn Hay nói cách khác là nguyên tử trong phân tử bị dao

11

động Sự dao động này cần năng lượng lấy ra từ năng lượng của bức xạ kích thích ban đầu, nhưng khi dao động thì đồng thời nó cũng bức xạ năng lượng trở lại, nhưng năng lượng bức xạ có thể bằng hoặc lớn hơn hay nhỏ hơn năng lượng mà bức xạ kích thích cung cấp cho nó [11]

Ánh sáng tới với tần số v 0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các

photon với năng lượng E=hv0 Nếu phân tử nhận năng lượng hv từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h(v 0 -v), và tần số của photon tán

xạ khi đó là (v 0 -v) Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng hv từ phân tử,

các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h(v 0 +v) và tần số của

photon tán xạ là (v 0 +v) [9], [11]

Tần số của các vạch Stokes (v 0 +v) và đối Stokes (v 0 -v) phụ thuộc vào bản

chất của chất tán xạ và tần số v o của bức xạ kích thích nhưng hiệu số Δv=v chỉ

phụ thuộc vào bản chất của chất tán xạ (mẫu đo) Vì vậy phổ Raman ghi theo

v (cm-1) đặc trưng cho cấu tạo của các hợp chất hoá học [11]

Hình 1.1 Các thành phần tán xạ thu được sau khi cho ánh sáng kích thích

đến mẫu

Hình 1.1 và 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes Tán xạ Stokes xảy

ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng kích thích Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng

1.2.3.3 Phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS)

Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (surface-enhancedRamanspectroscopy: SERS) là một kỹ thuật quang phổ dao động nhạy trên bề mặt, có thể tăng cường từ 104

- 106 so với quang phổ Raman bình thường, và hệ số tăng cường

có thể lên đến 1014 - 1015 với sự cộng hưởng [32] Các huỳnh quang nền bắt nguồn từ các chất màu của mẫu thực vật có thể khắc phục bằng kỹ thuật này SERS đã được áp dụng trong các lĩnh vực sinh hóa và khoa học đời sống, cho

13

cả phân tích định tính và định lượng Các cơ chế lý thuyết của SERS liên quan đến việc tăng cường điện từ (EME) và tăng cường hoá học (CE) EME liên quan đến độ nhám bề mặt tạo bởi các hạt nano kim loại (còn gọi là chất nền SERS) và thậm chí sự kết tập các hạt nano có thể mang lại hệ số tăng cường lớn lên đến 1012 EME cũng phụ thuộc vào khoảng cách giữa các chất phân tích và bề mặt kim loại (cũng được gọi là một điểm nóng) CE là kết quả của sự tương tác giữa các phân tử hoá chất hấp thụ và bề mặt kim loại Hoá chất hấp thụ gây ra sự dịch chuyển vị trí, tăng tán xạ Raman cắt ngang, và có thể mang lại hệ số tăng cường lớn tới 102 Như vậy, hiệu ứng kết hợp của những yếu tố tăng cường có thể mở rộng độ nhạy phát hiện của quang phổ SERS tới một mức độ đơn phân tử [19]

Yin và cộng sự đã thử nghiệm với điều kiện pH khác nhau để phát triển một cơ sở dữ liệu dấu vân tay SERS cho các thuốc cổ truyền Trung Quốc, được hấp thụ trên các hạt nano Ag Phương pháp này có thể giúp người dùng tránh mua phải các sản phẩm có chứa các chất thêm vào không rõ ràng [32] Bên cạnh đó, Du và cộng sự đã sử dụng các hạt nano Au hoặc Ag để thiết lập một tương quan tuyến tính giữa phát hiện SERS và nồng độ aminopyrin Giới hạn phát hiện (LOD) là 2.50 × 10-7 M trong dung dịch nước [34] Những phương pháp này có thể giúp người dùng xác định sự hiện diện của các thành phần bất hợp pháp trong các chế phẩm thuốc cổ truyền

Ngoài ra, SERS còn được sử dụng trong phân tích các dược liệu để xác định các thông tin sinh hoá của nước sắc dược liệu hay các thành phần hoá học của các thảo dược [19]

Các nghiên cứu về Raman ở Việt Nam hiện nay đang là xu hướng mới Đã

có một số nghiên cứu bước đầu sử dụng quang phổ Raman trong sàng lọc nhanh thuốc giả [8], [10]…Có thể thu phổ Raman trực tiếp trên bề mặt mẫu qua đầu đo nhanh, đo mẫu bên trong các bao bì lớn thông qua các đầu dò quang học, đo mẫu lỏng bằng curvet, đo mẫu rắn (như mẫu viên) bằng thiết bị

1.3.Một số nghiên cứu định tính, định lƣợng nhóm thuốc giảm glucose máu trộn trong các chế phẩm từ dƣợc liệu

Ning Li [23] sử dụng phương pháp UPLC-MS/MS để phát hiện và định lượng 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp bổ sung bất hợp pháp trong thuốc cổ truyền và thực phẩm chức năng của Trung Quốc Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên, thuốc hạt được chuyển về dạng bột đồng nhất Lượng bột mẫu tương đương với một đơn vị liều được cân chính xácvà chuyển vào một bình nón 100ml, thêm 40 ml methanol, siêu âm trong

20 phút, lọc qua giấy lọc Mẫu được tách trên cột C18 với pha động gồm acetonitril và nước (cả hai có chứa 0,1% acid formic) rửa giải theo gradient, tốc độ dòng 0,20 ml/phút, thể tích tiêm 10µl, chế độ phát hiện MRM, các LOD dao động 0,03-5,45 ng/mL Kết quả có 9 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, rosiglitazon, glimepirid, phenformin, gliclazid, chlorpropamid, nateglinid và mitiglinid) được tìm thấy từ 14 mẫu trong số 30 mẫu thu thập từ thị trường Lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,88 mg/viên đến 6,78 mg/viên; lượng metformin thay đổi từ 4,33 mg/viên đến 341 mg/viên

Wensheng Pang [28] đã tiến hành phát hiện và xác định cấu trúc của các thuốc hạ đường huyết tổng hợp thêm trái phép vào các sản phẩm thuốc từ thảo dược để chống bệnh tiểu đường bằng phương pháp LC-MS-MS, phân

15

tích theo chế độ MRM Các mẫu dạng viên nén hoặc nang được nghiền thành bột, sau đó chiết siêu âm với methanol (2 lần x 100 ml; 20 phút mỗi lần); gộp dịch chiết và ly tâm 10 phút, gạn dịch và chuyển sang bình định mức 250 ml

và pha loãng đến vạch bằng methanol; 1ml dung dịch này được chuyển sang bình định mức 10ml và pha loãng đến vạch bằng methanol Sử dụng cột C18 (2,1mm x 150mm, 5µm); pha động là hỗn hợp của acetonitril và dung dịch acid formic 0,05% trong nước tỷ lệ 60:40; tốc độ dòng 0,2ml/phút tại 40,7 bar; thể tích tiêm 10µl Trong số 20 mẫu thuốc thảo dược được kiểm tra, 5 thuốc phát hiện thấy có chứa glibenclamid, 3 thuốc chứa gliclazid, và 3 thuốc chứa phenformin, hai thuốc khác chứa glimepirid và metformin Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,28 mg/viên đến 4,9 mg/viên, tính theo liều dùng tối đa hàng ngày là 1,56 mg đến 29,4 mg; lượng metformin được trộn là 21,3 mg/viên, tính theo liều dùng tối đa hàng ngày là 127,8 mg

Kenichi Kumasaka [21] đã sàng lọc và định lượng cho 6 sulfonylure chữa tiểu đường: tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid, và glimepirid pha trộn trong thực phẩm chức năng Các sulfonylure được chiết với aceton, sau đó dịch chiết đem tiến hành TLC và HPLC Trong phân tích TLC, các chất tách tốt với pha động gồm n-butyl acetat có chứa 0,4% acid formic Quan sát vết ở UV 254nm Thuốc thử phát hiện: Dragendoff, acid phosphomolybdic 10%/methanol, acid sulfuric 30%/methanol Giá trị Rf tương ứng của tolbutamid, acetohexamid, chlorpropamid, gliclazid, glibenclamid và glimepiridtrong các mẫu là 0,78; 0,58; 0,69; 0,48; 0,40 và 0,35 Với phương pháp HPLC sử dụng cột Cadenza CD-C18, pha động: acetonitril-đệm amoni acetat theo gradient, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm 10 µl, bước sóng phát hiện: 230 nm, 247 nm

Mei Cui [16] sử dụng sắc ký lỏng cặp ion pha đảo (RP-IPC) kết hợp với DAD để xác định đồng thời 14 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp trong các thuốc cổ truyền của Trung Quốc Các mẫu ở các dạng: viên nén,

16

viên nang, thuốc viên và thuốc hạt được nghiền thành bột đồng nhất Lượng bột tương đương 1 liều dùng được cho vào bình định mức 50ml, thêm 40ml methanol, chiết siêu âm trong 20 phút, pha loãng đến vạch bằng methanol Việc tách được thực hiện trên cột C18 với pha động gồm acetonitril và dung dịch chứa 1,0mmol natri dodecyl sulfat và triethylamin 0,1% (sử dụng acid phosphoric điều chỉnh tới pH 3,75), tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo gradient, thể tích tiêm 20µl, phát hiện ở UV 220nm Kết quả, có 7 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp (glibenclamid-phổ biến nhất, metformin, phenformin, rosiglitazon, gliclazid, glimepirid và mitiglinid) được tìm thấy từ

9 trong số 26 mẫu thuốc cổ truyền thu thập được Hàm lượng glibenclamid được trộn lẫn thay đổi từ 0,58 mg/viên đến 3,25 mg/viên, tính theo liều dùng

là 3,34 mg/ngày đến 13,8 mg/ngày; hàm lượng metformin được trộn thay đổi

từ 2,28 mg/viên đến 2,57 mg/viên, tính theo liều dùng là 21,5 mg/ngày đến 65,4 mg/ngày

Yan Zhang và cộng sự [32] đã xây dựng phương pháp phân tích sử dụng tán xạ Raman tăng cường bề mặt (SERS) cho năm loại thuốc bổ sung bất hợp pháp (rosiglitazon, phenformin, metformin, pioglitazon và sibutramin) trong thuốc cổ truyền Trung Quốc Các chất chuẩn được hoà tan trong nước khử ion Mẫu phân tích là các chế phẩm thuốc cổ truyền dạng viên nang được mua tại thị trường Trung Quốc Các mẫu phân tích (bao gồm cả vỏ nang) được trộn lẫn với một lượng xác định các chất phân tích mục tiêu và sau đó hỗn hợp được hoà tan trong nước khử ion Sử dụng máy quang phổ Raman cầm tay (i-Raman, BWTEK, USA) để phát hiện Bước sóng kích thích là785 ±1 nm, phổ SERS được ghi từ 175-3100 cm-1 với độ phân giải của phổ

là 5 cm-1, và thời gian thu là 20s Sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (JEM-2010, JEOL Ltd, Nhật Bản) để thu được hình ảnh TEM Các điều kiện pH tối ưu cho mỗi loại thuốc cũng đã được thăm dò Đỉnh đặc trưng

17

được sử dụng để phân tích định tính Các thuốc có thể được phát hiện tốt ngay

cả khi thêm vào ở tỷ lệ 0,1% Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng SERS để phân tích các hỗn hợp thuốc trong chế phẩm thuốc cổ truyền mà không cần bất kỳ quá trình tách nào

Qingxia Zhu [35] đã xây dựng phương pháp TLC-SERS để phát hiện nhanh chóng tại chỗ bốn loại thuốc trị đái tháo đường (phenformin, metformin, rosiglitazon và pioglitazon) được bổ sung bất hợp pháp vào các TPBVSK Các mẫuTPBVSK thực mà không chứa các loại thuốc bổ sung và

đã được phân tích âm tínhvới các loại thuốc này được cung cấp bởi Viện Shandong về kiểm soát Thực phẩm và Dược phẩm Mẫu tự tạo được chuẩn bị bằng cách hoà tan các mẫu (bao gồm các TPBVSK được thêm các chất chuẩn

tỷ lệ 1% (kl/kl) với methanol, siêu âm 20 phút, ly tâm và lấy phần dịch trong Mẫu thực đã được chuẩn bị bằng cách hoà tan với methanol, siêu âm, sau đó

ly tâm Hai loại bản mỏng TLC gồm silica gel F254 và HP silica gel F254 đã được sử dụng Các dung dịch mẫu tự tạo và mẫu thực (1μl) được chấm trên bản mỏng TLC, khai triển với hệ dung môi dicloromethan-methanol-nước tỷ lệ 8: 2: 0,2, sau đó tiếp tục với hệ dicloromethan-cyclohexan-methanol- acid acetic tỷ lệ 8: 8: 0,5: 1,5 (nếu cần) Sau khi rửa giải, tấm TLC được để làm khô tự nhiên, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu trên một máy quét TLC ở bước sóng 254 nm Hỗn dịch keo bạc (6μl) được nhỏ trực tiếp tới mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC Cuối cùng, phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman xách tay (BWS415; B & W Tek, Mỹ) với bước sóng kích thích 785nm, độ phân giải 5 cm-1

60- Phổ SERS chất lượng cao có thể thu được bằng cách tích hợp đơn các kết quả thu được bằng cách sử dụng một năng lượng laser 100 mW cho 5s trong khi những điểm này vẫn còn ướt Tất cả các phép

đo được lặp lại ít nhất ba lần Kết quả TSERS được xác nhận lại bằng

LC-18

MS-MS với cột Agilent Zorbax SB C18 (1,8 µm, 2,1 mm ID×50 mm), pha động methanol: amoni acetat 0,01% theo gradient, tốc độ dòng là 0,2 ml/phút, thể tích tiêm 0,4 µl

Hiện nay, các nghiên cứu về nhóm thuốc này được trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược và TPBVSK tại Việt Nam còn rất ít Hơn nữa, ở các đơn

vị tuyến dưới ít có thiết bị LC-MS/MS Do đó, sử dụng phương pháp TLC sẽ

có ý nghĩa thực tiễn cao, đóng góp cho chuyên ngành Từ những tham khảo trên, đề tài tiến hành xây dựng các phương pháp HPTLC để phát hiện và định lượng metformin và glibenclamid được trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược và TPBVSK được thu thập tại thị trường Việt Nam

19

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

a Chất chuẩn:

- Metformin hydroclorid 99,12% SKS: 0215208.02 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

- Glibenclamid 100,10 % SKS: 0103129 (Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

b Hoá chất: Methanol, n-butyl acetat, acid formic, acid acetic băng, ethanol, dicloromethan, cloroform, n-hexan, bạc nitrat, natri citrat, polyvinylpyrolidon, dimethylformamid…đạt độ tinh khiết thuốc thử phân tích (AR)

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao HPTLC CAMAG, CAT No 027.6200 (Thuỵ Sỹ): bộ phận chấm bán tự động, bộ phận khai triển tự động, máy chụp ảnh Phần mềm điều khiển winCAT và phần mềm video Scan của Camag: quét bản mỏng, thu nhận hình ảnh vết sắc ký, xử lý dữ liệu hình ảnh trên máy tính

- Bản mỏng TLC Silicagel 60 F254 của Merck (Đức)

- Cân phân tích Sartorius TE 214S(d=0.1 mg) (Đức)

- Máy lắc xoáy Labinco BV L46

- Máy siêu âm D-78224 Singen/Htw (Đức)

- Máy ly tâm Kubota 6500 (Nhật Bản)

- Tủ sấy WiseVen WOF-105 (Hàn Quốc)

- Thiết bị đo phổ Raman LABRAM HR 800 của hãng HORIBA Jobin Yvon

- Máy đo quang Shimadzu UV-1800 (Nhật Bản)

- Các dụng cụ thủy tinh: bình định mức, bình chiết, pipet

20

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

-Mẫu thử: từ 41 chế phẩm đông dược và TPBVSK dạng bào chế viên nén, viên nang cứng và viên hoàn được sử dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường đang lưu hành trên thị trường, được mua tại các nhà thuốc, mua qua các trang mạng internet, của các lương y hoặc do người dùng nghi ngờ yêu cầu kiểm tra

- Nền mẫu: 04 loại chế phẩm đông dược sử dụng hỗ trợ bệnh tiểu đường

có công thức đăng ký, thử sàng lọc bằng thực nghiệm không có chất nghiên cứu đang lưu hành trên thị trường

- Mẫu placebo: mẫu tự tạo được thiết kế chứa các thành phần dược liệu gồm dây thìa canh, hoài sơn, giảo cổ lam, câu kỷ tử, mạch môn, nhàu, ngũ vị tử, mướp đắng, sinh địa, bạch linh, mẫu đơn, sơn thù, trạch tả, quế chi, phụ tử, ngưu tất, diệp

hạ châu, nấm linh chi và tá dược tham khảo từ công thức bào chế của 41 loại chế phẩm dùng hỗ trợ điều trị tiểu đường đã thu thập được làm mẫu thử, dạng bào chế viên nén, viên nang, thuốc bột, hoàn cứng, hoàn mềm và trà túi lọc.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Xây dựng quy trình định tính, định lượng metformin HCl và glibenclamid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC

2.2.1.1.Xây dựng quy trình xử lý mẫu

Dựa vào khả năng hòa tan của các chất nghiên cứu trong dung môi [3], [13] và căn cứ vào kết quả của các nghiên cứu đã công bố [18], [23], tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc tân dược từ nền mẫu bằng các dung môi với nhiều tỉ lệ khác nhau và lựa chọn dung môi chiết hiệu suất cao, cho vết gọn, sắc nét Các dung môi khảo sát bao gồm:

-Methanol

-Methanol: Nước

-Methanol: nước: TFA

-Ethanol

µm Tiến hành sắc ký

2.2.1.2.Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

-Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 với kích thước khác nhau

-Pha động: Dựa trên điều kiện của các tác giả [21], [29], [35], tiến hành khảo sát bằng thực nghiệm các hệ dung môi pha động sau:

+ Hệ 1: MeOH - nước - acid acetic băng (6:4:0,25)

+ Hệ 2: n-butanol - acid acetic - nước (11:2:2)

+ Hệ 3: n-butyl acetat chứa 0,4% acid formic

+ Hệ 4: n-butyl acetat - MeOH - acid formic (11:2,5:1,5)

Lựa chọn dung môi khai triển tách được metformin HCl và glibenclamid cho vết gọn, sắc nét

22

thử và lượng chất phân tích trong mẫu chuẩn tính lượng chất phân tích trong mẫu thử

2.2.2 Thẩm định phương pháp

Theo hướng dẫn của AOAC [20] với các tiêu chí:

 Độ chọn lọc: Phân tích đồng thời 3 mẫu: dung dịch hỗn hợp chuẩn chất phân tích, mẫu trắng là nền mẫu đông dược và mẫu trắng thêm chuẩn trên hệ thống HPTLC Thực hiện trên 4 nền mẫu đông dược và 1 nền mẫu placebo Yêu cầu: trên sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn có các vết chính

có cùng hình dạng, màu sắc, giá trị Rf với các vết chính trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện các vết tương ứng với các vết chính trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn

 Độ phù hợp của hệ thống: Phân tích lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 chất phân tích trên hệ thống HPTLC với các điều kiện đã lựa chọn Yêu cầu: diện tích pic thu được của 6 lần sắc ký lặp lại mẫu chuẩn của 2 chất phân tích đạt yêu cầu theo AOAC có giá trị RSD (%) < 3 %

 Khoảng tuyến tính: Pha riêng dãy các dung dịch chuẩn gốc metformin và glibenclamid rồi tiến hành phân tích trên hệ thống HPTLC Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng Yêu cầu: phương trình hồi quy có 0,99≤ r

 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng (LOD, LOQ): giới hạn phát hiện là nồng độ thấp nhất có S/N khoảng 3 (tín hiệu đáp ứng của pic gấp khoảng 3 lần đường nhiễu nền), giới hạn định lượng được tính theo công thức: LOQ = LOD x 3,3

 Độ lặp lại, độ đúng: Thực hiện trên mẫu placebo Một mức nồng

độ chất chuẩn được thêm vào nền mẫu Tiến hành xử lý mẫu và sắc kí theo các điều kiện đã chọn

23

Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua giá trị RSD thu được khi phân tích 6 mẫu tự tạo khác nhau của một nồng độ Làm lặp lại ở 1 ngày khác Độ chính xác trung gian được xác định dựa vào RSD (%) của 12 kết quả ở 2 ngày phân tích.Yêu cầu: RSD ≤ 5,3%

Độ đúng (độ thu hồi) được xác định dựa vào phương trình hồi quy đã xây dựng trong cùng ngày phân tích và so sánh với lượng chuẩn thêm vào để đánh giá độ đúng của phương pháp Yêu cầu: độ thu hồi đạt 90-107%

2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực

Áp dụng phương pháp HPTLC vừa xây dựng được để xác định hàm lượng metformin và glibenclamid được trộn lẫn trong một số chế phẩm thu thập được trên thị trường (nếu có) Dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích, tính nồng độ chất phân tích được trộn lẫn trong mẫu thử

Tính hàm lượng chất phân tích trong các mẫu dương tính (mg/đơn vị mẫu) theo công thức:

ử

ử Trong đó:

Cthử: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử tính theo đường chuẩn (µg/ml)

mTB đơn vị : khối lượng trung bình đơn vị mẫu(g)

mthử: khối lượng bột mẫu thử được cân(g)

Vthử: thể tích MeOH dùng để pha loãng mẫu thử (ml)

2.2.4.Bước đầu khảo sátcác điều kiện phát hiện glibenclamid bằng SERS

TLC-2.2.4.1 Khảo sát các điều kiện SERS

 Chuẩn bị hỗn dịch keo bạc: tham khảo các tài liệu [26], [36], chuẩn

bị các hỗn dịch keo bạc trong nước và keo bạc trong Dimethylformamid (DMF)

N,N-24

 Phương pháp phân tích: tham khảo các tài liệu [24], [35], phương pháp phân tích dự kiến: dung dịch chuẩn chất phân tích pha trong methanol được tiến hành sắc ký TLC với pha động được lựa chọn Sau khi rửa giải, tấm TLC được để làm khô tự nhiên, các điểm phân tách được quan sát và đánh dấu ở bước sóng 254 nm Hỗn dịch keo bạc (1,5μl) được nhỏ trực tiếp tới mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi lại bằng máy quang phổ Raman khi vết vẫn còn ướt, với bước sóng kích thích 632,9 nm, thời gian ghi phổ 60 giây

 Lựa chọn hỗn dịch keo bạc: Tiến hành khảo sát khả năng tăng cường cường độ tín hiệu Raman của các hỗn dịch keo bạc trên các điểm phân tách của chất chuẩn glibenclamid sau khi đã tiến hành sắc ký TLC Lựa chọn keo bạc cho tín hiệu phổ SERS của glibenclamid rõ nhất, các đỉnh đặc trưng của glibenclamid không bị chồng lấp bởi tín hiệu Raman của keo bạc

 Đánh giá chất lượng và khảo sát nồng độ hỗn dịch keo: tiến hành đo kích thước hạt keo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), khảo sát cực đại hấp thụ của hỗn dịch keo bạc và khảo sát nồng độ dung dịch keo tối ưu

 Xây dựng phổ SERS của glibenclamid trong chất chuẩn, xác định các đỉnh đặc trưng của dược chất

2.2.4.2.Đánh giá phương pháp

 Tính chọn lọc: tiến hành đo phổ SERS của dung dịch chuẩn glibenclamid, phổ Raman của đế silicagel được nhỏ hỗn dịch keo lựa chọn để khẳng định các đỉnh đặc trưng của phổ Raman chất phân tích không bị thay đổi bởi đế silicagel và hỗn dịch keo

 Xác định giới hạn phát hiện (LOD): Pha dãy các dung dịch chuẩn glibenclamid có nồng độ giảm dần bằng methanol, tiến hành sắc ký với pha động được lựa chọn Sấy khô bản mỏng, nhỏ trực tiếp keo bạc lên mỗi điểm

25

phân tách của glibenclamid được đã được đánh dấu và đo cường độ phổ SERS Giới hạn phát hiện được lựa chọn là nồng độ dung dịch chuẩn thấp nhất mà ở đó tín hiệu cho các đỉnh đặc trưng của glibenclamid còn rõ ràng

26

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp HPTLC

3.1.1 Khảo sát và lựa chọn điều kiện HPTLC

Pha riêng các dung dịch chuẩn gốc metformin HCl và glibenclamid có nồng độ khoảng 1mg/ml trong methanol Khảo sát các hệ pha động, tiến hành trên bản mỏng silica gel 60 F254, thể tích chấm: 5 µl, bước sóng phát hiện

254 nm Kết quả thể hiện ở hình 3.1

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi pha động, trong đó: 1- metformin HCl ; 2- glibenclamid ; 3- hỗn hợp metformin HCl và glibenclamid Nhận xét:

- Hệ 1: MeOH- nước–acid acetic băng (6:4:0,25): Rf của metformin là 0,74; của glibenclamid là 0,95

- Hệ 2: n-butanol – acid acetic – nước (11:2:2): Rf của metformin là 0,14;của glibenclamid 0,92

- Hệ 3: n-butyl acetat chứa 0,4% acid formic: Rf của metformin HCl ≈ 0; của glibenclamid là 0,52

- Hệ 4: n-butyl acetat – MeOH - acid formic (11:2,5:1,5): Rf của metformin HCl và glibenclamid tương ứng là 0,05 và 0,77, vết rõ ràng

27

Từ các kết quả trên, lựa chọn hệ 4 cho nghiên cứu tiếp theo

Tiến hành quét phổ UV tại vị trí vết của 2 chất phân tích metformin và glibenclamid trên sắc ký đồ, kết quả thể hiện ở hình 3.2

a b

Hình 3.2 Kết quả quét phổ UV tại vị trí của chất phân tích: (a)-Phổ UV của

metformin; (b)-Phổ UV của glibenclamid

Kết quả ở hình 3.2 cho thấy metformin HCl và glibenclamid đều có hấp thụ cực đại ở bước sóng khoảng 230 nm; glibenclamid còn có hấp thụ cực đại

ở 310 nm, nhưng độ hấp thụ chỉ bằng khoảng 60% so với ở 230 nm Do đó, bước sóng 230 nm được lựa chọn để phát hiện khi tích phân lấy kết quả định lượng cả 2 chất phân tích

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu HPTLC

 Khảo sát dung môi chiết

Với mẫu tự tạo gồm nền mẫu placebo và hỗn hợp chuẩn 2 chất nghiên cứu, tiến hành xử lý bằng cách chiết lần lượt với 05 hệ dung môi khác nhau

và phân tích theo các điều kiện HPTLC đã chọn Tính tỷ lệ đáp ứng phân tích (diện tích pic -A) và khối lượng chuẩn (m) Lựa chọn hệ dung môi chiết hiệu suất cao, cho vết gọn, sắc nét Kết quả thu được như sau:

28

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát dung môi chiết metformin HCl, glibenclamid

Lượng chuẩn (mg)

Diện tích pic

A/m (×10)

Lượng chuẩn (mg)

Diện tích pic

A/m (×10)

Hình 3.3 Kết quả khảo sát dung môi chiết Nhận xét:

Kết quả ở bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy: khả năng chiết (A/m) của metformin HCl và glibenclamid bằng dung môi methanol là cao nhất, cho vết sắc ký gọn, sắc nét Do đó lựa chọn dung môi methanol để chiết đồng thời 2 chất phân tích từ chế phẩm đông dược

Từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện phân tích được lựa chọn như sau:

1 nền mẫu placebo (TTD) Kết quả được trình bày ở hình 3.5