Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ tách từ chuột cống trắng của ba hợp chất flavonoid nụ vối

Cấu tạo động mạch, sự hình thành mảng xơ vữa và vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch .... Vì vậy đã có những nghiên cứu được tiến hành để đánh giá khả năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TĂNG SINH

TẾ BÀO CƠ TRƠN ĐỘNG MẠCH CHỦ TÁCH

TỪ CHUỘT CỐNG TRẮNG CỦA BA HỢP

CHẤT FLAVONOID NỤ VỐI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI - 2017

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN NGÂN HÀ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ TĂNG SINH

TẾ BÀO CƠ TRƠN ĐỘNG MẠCH CHỦ TÁCH

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch trong xơ vữa động mạch 2

1.1.1 Một vài nét về bệnh xơ vữa động mạch 2

1.1.2 Cấu tạo động mạch, sự hình thành mảng xơ vữa và vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch 5

1.2 Một số phương pháp cô lập và tách tế bào cơ trơn động mạch từ động vật 12

1.2.1 Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Ricardo Villa-bellosta 12

1.2.2 Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Rupande Tripathi 13

1.2.3.Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Neeta Adhikari 14

1.3 Một số phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ 14

1.3.1 Phương pháp Alamar Blue 14

1.3.2 Phương pháp MTT 16

1.3.3 Phương pháp SRB 16

1.4 Một vài nét về cây vối 17

1.4.1 Tên khoa học 17

1.4.2 Đặc điểm thực vật 17

1.4.3 Phân bố, sinh thái 17

1.4.4 Thành phần hóa học 18

1.4.5 Công dụng và tác dụng dược lý 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Nguyên vật liệu 22

2.1.1 Động vật nghiên cứu 22

2.1.2 Hóa chất và trang thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống 23

2.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối 26

2.2.3 Xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3:29 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 29

3.1 Kết quả tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống 29

3.2 Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối 35

3.2.1 Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối 35

3.2.2 Đánh giá độc tính trên tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối 37

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 38

4.1 Tách tế bào cơ trơn động mạch chủ chuột cống trắng 40

4.2 Tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ của một số chất chiết tách từ nụ Vối 44

KẾT LUẬN 49

KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

OxLDLs Lipoprotein tỉ trọng thấp bị oxy hóa

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1: Bố trí trong từng giếng với dịch chiết CO1, CO2, CO3 27 Bảng 3.1 Giá trị mật độ quang của các lô thử so với lô chứng 35 Bảng 3.2 Kết quả đánh giá độc tính của các mẫu thử CO1, CO2 và CO3 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cấu tạo động mạch 7 Hình 3.1 Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 1 29 Hình 3.2 Bộc lộ động mạch chủ chuột 30 Hình 3.3 Đăt động mạch chủ trong dung dịch collagenase tuýp 2 30 Hình 3.4 Qui trình tách tế bào cơ trơn động mạch chủ theo phương pháp 2 32 Hình 3.5 Tế bào cơ trơn động mạch chủ thu được theo phương pháp 1 34 Hình 3.6 Tế bào cơ trơn động mạch chủ thu được theo phương pháp 2 34 Hình 3.7 Số lần tăng sinh tế bào của các lô thử so với lô chứng trắng 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xơ vữa động mạch là bệnh ngày càng phổ biến đặc biệt ở các nước có kinh tế phát triển trên thế giới Bệnh thường tiến triển âm thầm nhưng để lại những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe và cuộc sống Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới WHO, hàng năm có khoảng 17 triệu người tử vong do bệnh tim mạch có nguyên nhân từ xơ vữa động mạch Các nghiên cứu về bệnh cũng đã được triển khai nhằm hiểu rõ hơn về nguyên nhân gây bệnh và các phương pháp điều trị Kết quả cho thấy sự tăng sinh của tế bào cơ trơn đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh xơ vữa động mạch [12] Vì vậy đã

có những nghiên cứu được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào cơ trơn của các chất trong điều trị xơ vữa động mạch

Việt Nam là một nước nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên

có hệ thực vật đa dạng và phong phú Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tốt

đã được phân lập và đưa vào sử dụng với mục đích chữa bệnh bởi ưu điểm dễ hấp thu, chuyển hóa trong cơ thể, ít tác dụng phụ và ít độc tính hơn so với các chất có nguồn gốc tổng hợp hóa học Ở nước ta, cây Vối có tên khoa học là

Cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry họ Sim Myrtaceae, đã được sử

dụng theo kinh nghiệm dân gian điều trị nhiều chứng bệnh như chữa sốt, viêm

dạ dày, đặc biệt là đái tháo đường, mỡ máu [2] Tuy nhiên các công trình khoa học nghiên cứu về cây Vối còn ít Đặc biệt chưa có nghiên cứu nào về tác dụng của nụ Vối trên các bệnh và các biến chứng liên quan đến đái tháo đường, mỡ máu như xơ vữa động mạch Từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề

tài: “Đánh giá tác dụng ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch chủ

tách từ chuột cống trắng của ba hợp chất dịch chiết nụ Vối” với hai mục

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn động mạch trong xơ vữa động mạch 1.1.1 Một vài nét về bệnh xơ vữa động mạch

1.1.1.1 Định nghĩa

Tổ chức Y tế thế giới định nghĩa: “Xơ vữa động mạch là sự phối hợp các hiện tượng thay đổi cấu trúc nội mạc của các động mạch lớn và vừa, bao gồm sự tích tụ cục bộ của các lipid, các phức hợp glucid, máu và các sản phẩm của máu, mô xơ và cặn lắng acid, các hiện tượng này kèm theo sự thay đổi ở lớp trung mạc” [1]

Xơ vữa động mạch là hiện tượng xơ hóa thành động mạch trong đó chủ yếu xảy ra ở các động mạch trung bình và động mạch lớn Biểu hiện chủ yếu

là sự lắng đọng mỡ và các mảng tế bào tại lớp bao trong thành động mạch (gọi là mảng vữa) Xơ vữa động mạch là bệnh do động mạch bị xơ cứng và nhỏ hẹp hơn bình thường, bệnh có thể xảy ra ở bất kỳ vùng nào trong cơ thể

và là nguyên nhân chính gây đột quỵ (rối loạn tuần hoàn não), cơn đau tim và thiểu năng tuần hoàn ở cẳng chân Xơ vữa động mạch gây ra hai biến chứng nguy hiểm là nhồi máu cơ tim và tai biến mạch não

Xơ vữa động mạch là sự nhiễm mỡ và xơ hóa một số chỗ ở thành các động mạch Lipid đến gắn vào thành động mạch ở các vị trí tổn thương thành từng mảng gọi là mảng xơ vữa Xơ vữa động mạch thường xảy ra ở các động mạch lớn

và vừa, ít đi vào các tiểu động mạch Các mảng xơ vữa gây bệnh nhiều ít rất khác nhau, có những mảng nằm yên trong thời gian dài nhưng không có một tác hại nào, một số mảng xơ vữa nằm ở những nơi “xung yếu” như lỗ đi vào hai động mạch thận, khúc gần của động mạch vành trái, cửa ngõ các động mạch sọ não thì có thể gây tăng huyết áp, gây tai biến nặng mạch vành, mạch não [3]

1.1.1.2 Phân loại xơ vữa động mạch

Có một số cách phân loại xơ vữa động mạch như phân loại theo nguyên nhân, phân loại theo vị trí tổn thương, phân loại theo các giai đoạn của xơ vữa động mạch…

Phân loại xơ vữa động mạch theo nguyên nhân:

Xơ vữa động mạch nguyên nhân huyết động: trong loại này, tăng huyết

áp đóng vai trò rất quan trọng, xơ vữa động mạch xuất hiện sớm Hiện tượng

co mạch nhiều và kéo dài gặp trong tăng huyết áp, tạo điều kiện cho các tổn thương xơ vữa động mạch hình thành tại chỗ hay ở từng vùng Các rối loạn vận mạch khác gây tình trạng mất ổn định của trương lực động mạch, có thể dẫn tới tình trạng tăng lipid máu [9], [6]

Xơ vữa động mạch nguyên nhân chuyển hóa: các rối loạn di truyền liên quan đến chuyển hóa lipid nhất là cholesterol là một trong những yếu tố nguy hại lớn nhất Chế độ ăn uống không hợp lý, nhất là việc sử dụng quá nhiều mỡ động vật đã làm tăng loại cholesterol có hại như cholesterol tỷ trọng thấp (LDL) và rất thấp (VLDL) Trong các bệnh nội tiết dễ gây vữa xơ động mạch phải kể đến bệnh đái tháo đường, thiểu năng giáp, thiểu năng hormon sinh dục [9]

Xơ vữa động mạch nguyên nhân hỗn hợp: trong đó có mặt các nguyên nhân nói trên, nhất là tăng huyết áp và tăng lipid máu

Phân loại xơ vữa động mạch theo vị trí tổn thương: theo vị trí tổn

thương gồm xơ vữa động mạch chủ và các nhánh động mạch lớn, xơ vữa động mạch vành, não, thận, mạc treo Các động mạch ngoại vi nhất là chi dưới Xơ vữa động mạch nơi khác ít gặp hơn

Phân loại theo các giai đoạn của xơ vữa động mạch: Xơ vữa động

mạch gồm hai giai đoạn Giai đoạn đầu gọi là giai đoạn tiền lâm sàng Ở giai đoạn này, tại một cơ quan nhất định, các tổn thương chưa đủ lớn để có thể phát hiện được bằng các phương pháp hiện dùng như chụp cản quang động

mạch, siêu âm doppler Tuy nhiên ở giai đoạn này cũng đã có một số triệu chứng có ý nghĩa báo hiệu Các dấu hiệu chung nhất là sự thay đổi về sinh hóa thành phần lipid trong máu và các biểu hiện có tính chất toàn thể Giai đoạn này có thể phân chia thành hai thời kỳ Thời kỳ trước xơ vữa và thời kỳ

xơ vữa động mạch tiềm tàng Trong giai đoạn này đã có những rối loạn chức năng thành mạch nhưng chưa đáng kể về cấu trúc và chức năng của các cơ quan được động mạch đó nuôi dưỡng [9]

Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn đã có các biểu hiện lâm sàng Trong giai đoạn này có thể chia làm ba thời kỳ Thời kỳ một, cơ quan được nuôi dưỡng bởi động mạch bị thiểu năng tuần hoàn và đã có những rối loạn dinh dưỡng nhưng còn khả năng phục hồi Thời kỳ hai, đã có các thương tổn thoái hóa và hoại tử nặng hơn, có nhiều biểu hiện lâm sàng đặc hiệu tùy theo từng

vị trí tổn thương Thời kỳ ba, tại các cơ quan bị bệnh, tổ chức sẹo phát triển sau nhiều biến đổi liên tiếp và kéo dài [9]

Cách phân loại khác: theo tính chất tiến triển của vữa xơ động mạch

dựa vào một số tiêu chuẩn gián tiếp như các kết quả sinh hóa máu, nghiệm pháp gắng sức, chụp động mạch, triệu chứng lâm sàng…trên cơ sở đó chia xơ vữa động mạch làm ba loại: loại đang phát triển, tức là loại hoạt động; loại đã

ổn định, tức là không còn hoạt động nữa và loại thoái triển trong đó có các thương tổn giảm dần tuy không thể hết hẳn [9]

1.1.1.3 Một vài nét về dịch tễ xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch cùng với các biến chứng của nó là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và bệnh tật ở các nước phát triển Chỉ tính riêng ở Hoa Kỳ, một thống kê gần đây cho thấy có 60 triệu người trưởng thành đang bị bệnh tim mạch do xơ vữa động mạch Tử vong do xơ vữa động mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong hàng năm và phí tổn do bệnh lên đến 128 tỉ đô la mỗi năm [42] Tỷ lệ người trên 60 tuổi mắc xơ vữa động mạch lên tới 88% [1]

Các yếu tố chính gây ra sự tăng tần suất xơ vữa động mạch là hút thuốc

lá, ít vận động thể lực và chế độ ăn nhiều năng lượng, giàu chất béo và cholesterol Trong những năm gần đây xơ vữa động mạch bắt đầu trở thành một vấn đề lớn đối với ngành y tế ở nhiều nước đang phát triển Theo ước tính của các chuyên gia y tế, tử vong do bệnh tim mạch ở các nước đang phát triển là 9 triệu ca trong năm 1990 sẽ tăng đến 19 triệu ca trong năm 2020 [31]

Ở một số nước Châu Á, Trung Đông và Mỹ La tinh tỷ lệ tử vong do bệnh tim mạch hiện đã cao hơn tử vong do bệnh truyền nhiễm [32]

Tại Việt Nam, năm 1986, tử vong do nguyên nhân xơ vữa động mạch gây nên chủ yếu là tai biến mạch mãu não (85,14%) và tai biến mạch vành (14,8%) [5]

Tại bệnh viện Trung ương Quân đội 108, theo Nguyễn Văn Tảo, từ 1985 đến 1989 số tử vong của bệnh nhân thuộc nhóm 7 đứng hàng thứ hai trên 17 nhóm bệnh và chiếm 14% tổng số tử vong, 2/3 các trường hợp trong nhóm này chết ở tuổi 50 do các biến chứng của xơ vữa động mạch và tăng huyết áp [10]

Theo thống kê của tác giả Phạm Trường Sơn năm 2013, trong các nghiên cứu giải phẫu bệnh ở các bệnh nhân đái tháo đường có tới 75% bệnh nhân không

có biểu hiện lâm sàng của bệnh động mạch vành nhưng có xơ vữa động mạch mức độ nặng và tỷ lệ nhồi máu cơ tim, thiếu máu cơ tim thầm lặng tăng cao [8]

Theo thống kê của Viện Tim Mạch Việt Nam, tỉ lệ bệnh động mạch vành chủ yếu do nguyên nhân xơ vữa động mạch gây ra tăng dần trong những năm gần đây

1.1.2 Cấu tạo động mạch, sự hình thành mảng xơ vữa và vai trò của sự

tăng sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch

Lớp tế bào nội mô lót mặt trong lòng ống mạch máu Các tế bào nội mô

không chỉ tạo nên một bề mặt trơn phẳng mà còn tiết collagen tuýp II, IV và

V, lamin, endothelin, nitric oxid (NO) Ngoài ra tế bào nội mô thành mạch còn tiết ra men chuyển angiotensin, bradykinin, serotonin, các prostaglandin, thrombin, norepinephrin

Lớp dưới nội mô: nằm ngay dưới lớp tế bào nội mô (nằm ở giữa của lớp

nội mô và lá chun trong) bao gồm những mô liên kết lỏng lẻo và các tế bào cơ trơn nằm rải rác

Phía dưới lớp dưới nội mô là lá chun trong, có các sợi chun, ngăn cách lớp áo trong với lớp áo giữa

Lớp áo giữa: là lớp dày nhất, cấu tạo chủ yếu gồm các tế bào cơ trơn

được bao quanh bởi rất nhiều sợi collagen, chất nền ngoại bào và các vòng lá chun có các lỗ hở không đều Các sợi collagen tạo khung nâng đỡ các tế bào

cơ trơn và chống phình giãn thành mạch Khoảng gian bào giữa các tế bào cơ trơn cũng chứa nhiều các glycoprotein như fibronectin, vitronectin… Elastin cũng được xếp xen kẽ giữa các lớp tế bào

Lớp áo ngoài (vỏ ngoài): ở ngoài cùng, gồm nhiều sợi nguyên bào,

cấu tạo chủ yếu gồm mô liên kết Ngăn áo giữa với áo ngoài là lá chun ngoài

Áo ngoài của các mạch máu lớn như động mạch, tĩnh mạch còn có các mạch máu nhỏ nằm trong vùng ngoài của lớp áo giữa để cung cấp oxy và các chất nuôi dưỡng cho các tế bào này hoạt động

Hình 1.1 Cấu tạo động mạch

1.1.2.2 Sự hình thành mảng xơ vữa

Mảng vữa xơ hình thành âm thầm từ rất sớm khi còn trẻ, tiến triển lặng

lẽ hàng chục năm và thường chỉ biểu hiện khi ở tuổi 40-60 Theo thuyết về “đáp ứng với tổn thương”: khi động mạch có những tác động gây tổn thương như tình trạng tăng lipid máu, tăng huyết áp, lipoprotein phân tử lượng thấp (LDL) và các tác nhân kích thích khác tác động vào tế bào nội mô gây ra đáp ứng dẫn đến tình trạng viêm Quá trình viêm mạn tính sẽ dẫn đến xơ vữa động mạch

Xơ vữa động mạch bắt đầu từ tổn thương của tế bào nội mô Khi tế bào nội mô tổn thương, biểu hiện bằng sự giảm sản xuất nitric oxid (NO), đảo lộn cấu trúc sợi chun làm mất dần các sợi tạo keo, tăng tính thấm của tế bào nội

mô với lipoprotein và các thành phần khác của huyết tương, tăng khả năng bám dính của tế bào nội mô với bạch cầu và tiểu cầu, tăng khả năng hình thành huyết khối Đây là sự đáp ứng thích nghi của thành mạch máu với các tác nhân kích thích Khi có các kích thích các tế bào nội mô bộc lộ trên bề mặt

tế bào các phân tử bám dính nội bào (ICAM-1) có khả năng liên kết với nhiều loại bạch cầu khác nhau và phân tử bám dính tế bào mạch máu (VCAM-1)

liên kết với các tế bào mono và lympho-T [34] Sau khi tế bào mono bám dính vào các tế bào nội mô chúng được cố định tại lớp áo trong thành mạch, lúc này nếu gặp các yếu tố gây tổn thương như chemokin và các lipoprotein bị oxi hóa đặc biệt là LDL sẽ kích thích và biến đổi chúng thành các đại thực bào [36] Đại thực bào sản xuất interleukin (IL)-1, và các yếu tố hoại tử khối

u (TNF) càng làm tăng cường sự bám dính hơn nữa của các đại thực bào Đồng thời đại thực bào cũng sản xuất ra các chemokin, bao gồm protein hoá hướng động bạch cầu mono (MCP)-1, thu hút nhiều bạch cầu tới mảng xơ vữa Khi có LDL trong thành mạch máu, các phân tử LDL sẽ bị các đại thực bào thu dọn thông qua các receptor dọn rác trên bề mặt đại thực bào dẫn tới hình thành nên các peroxid lipid và tạo điều kiện để hình thành cholesterol ester và như vậy hình thành nên tế bào bọt Các tế bào bọt tụ lại thành đám dưới lớp nội mô

Giai đoạn hai là giai đoạn hình thành các vệt nhiễm mỡ Trên bề mặt của lớp nội mô động mạch xuất hiện các vệt nhỏ màu vàng nhạt, kéo dài, dọc theo dòng máu, rải rác từng chỗ, ít nổi gờ Ban đầu các vệt mỡ chỉ gồm các tế bào mono, lympho và tế bào bọt, về sau có mặt của rất nhiều tế bào cơ trơn mạch máu Tế bào mỡ tăng sinh dần làm thành các hạt mỡ Bao bọc các hạt

mỡ là các tế bào cơ trơn và xung quanh là chất nền giàu collagen Sự tích tụ cholesterol trong mảng xơ vữa phản ánh sự mất cân bằng giữa lượng cholesterol đi vào và đi ra khỏi mạch máu Trong trường hợp này sự xuất hiện HDL là có ích, nồng độ cao HDL có thể giúp thu dọn cholesterol từ các mảng

xơ vữa Lúc đầu các vệt nhiễm mỡ còn thưa, càng về sau càng dày làm thành các đám dạng lưới Các thương tổn ở giai đoạn này chứa rất nhiều mỡ trong

và ngoài tế bào

Giai đoạn ba là giai đoạn hình thành các thương tổn xơ vữa động mạch Đến giai đoạn này, các thương tổn xơ vữa động mạch tiến triển nhanh Tổn thương khiến cho các tế bào nội mô sinh ra các yếu tố tiền đông thay vì các

chất chống đông và hình thành các chất tạo mạch, các cytokin và các yếu tố tăng trưởng Quá trình viêm kích thích sự di chuyển và tăng sinh của các tế bào cơ trơn mạch máu tới ổ viêm để hình thành các tổn thương Kết hợp hai yếu tố trên với sự tích lũy dịch ngoại bào sẽ làm thành động mạch dày lên làm cho lòng động mạch hẹp dần

Khi quá trình viêm vẫn tiếp diễn dẫn đến sự gia tăng số lượng đại thực bào, tế bào lympho và các tiểu cầu có nguồn gốc từ máu, tế bào cơ trơn mạch máu vẫn di chuyển tới lớp áo trong, tăng sinh và sản xuất dịch gian bào, chuyển các vết mỡ thành các mảng xơ vữa bền vững làm tổn thương lan rộng Quá trình viêm kéo dài sẽ gây tổn thương vừa và nặng, lúc này sẽ có một vỏ chất xơ bao quanh một lõi hoại tử gồm bạch cầu, lipid và các mảnh vỡ, tổn thương bị cô lập khỏi thành mạch Lõi hoại tử là kết quả của sự gia tăng hoạt động của yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF), TGF-β, IL-1, TNF-α, osteoponin, và sự giảm thoái hoá các mô liên kết Lúc này bạch cầu xâm nhập vào tổn thương và bám dính tại đó làm tăng kích thước của tổn thương Các yếu tố kích thích sự tập trung của các đại thực bào bao gồm yếu

tố kích thích đại thực bào (MCSF), MCP-1 và LDL bị oxi hoá

Giai đoạn bốn tổn thương canxi hóa, loét Lắng đọng can xi ở vùng hoại tử của vùng xơ vữa Các vùng bị canxi hóa đều bị cản quang, nên khi chụp xquang đều có thể thấy dạng chấm kiểu “vỏ trứng” Loét có thể xuất hiện ở ngay giữa mảng xơ vữa hay ở vùng xung quanh Loét bao giờ cũng mở vào lòng động mạch Trên cơ sở các thương tổn trên, thường hình thành huyết khối Bất cứ thương tổn nào ở nội mô dù do bất cứ nguyên nhân nào cũng làm tăng độ dính tiểu cầu vị trí đó Huyết khối tiểu cầu bám chặt vào nội mô và được một lớp fibrin phủ lên, dần dần hợp nhất với mảng xơ vữa có sẵn, làm cho mảng này dày lên Các vi huyết khối tiểu cầu có thể gây đông máu tại chỗ làm thành cục máu đông Những cục máu đông này có thể bong ra, trôi đi dòng máu và gây nên tắc mạch

Ở giai đoạn cuối, các mảng xơ vữa ngày càng nhiều, diện tích ngày càng lớn, các mảnh canxi hóa có xu hướng nối tiếp nhau, đồng thời tổ chức

xơ cũng phát triển ngày càng rộng Thương tổn đến giai đoạn này sẽ không hồi phục được, làm hẹp dần lòng động mạch, cản trở tuần hoàn gây bít tắc động mạch sẽ gây nên nhiều hậu quả nghiêm trọng

1.1.2.3 Vai trò của sự tăng sinh tế bào cơ trơn trong bệnh xơ vữa động mạch

Quá trình hình thành mảng xơ vữa động mạch được bắt đầu khi nội mạc bị viêm do một số chất như lipoprotein tỉ trọng thấp bị oxy hóa (OxLDLs) Các nguyên nhân gây nên tình trạng trên có thể là các chất hóa học như tăng cholesterol máu, hoặc do nguyên nhân cơ học như tăng huyết

áp, hoặc do nguyên nhân miễn dịch như trong trường hợp bệnh nhân có ghép tim hay ghép thận Chính những thương tổn đầu tiên ở lớp tế bào nội mô động mạch này làm cho một số thành phần của huyết tương bám vào và làm tăng kết dính tiểu cầu [9] Khi các phân tử kết dính tế bào trên bề mặt nội mô ngày càng nhiều sẽ thúc đẩy quá trình kết dính bạch cầu và kích hoạt các quá trình tiếp theo của chúng trong nội mạc

Tế bào cơ trơn thành mạch máu có thể tồn tại ở hai trạng thái, trạng thái đàn hồi và trạng thái tổng hợp, trong đó trạng thái đàn hồi là trạng thái không hoạt động của tế bào, trạng thái tổng hợp là trạng thái hoạt động của tế bào cơ trơn Khi ở trạng thái tổng hợp, các tế bào cơ trơn sản sinh các collagen, elastin, các proteoglycan, các yếu tố tăng trưởng và các cytokin Một trong những yếu tố tăng sinh mạnh mẽ tế bào cơ trơn động mạch được các đại thực bào và tiểu cầu khi xâm nhập vào tiết ra là yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF) PDGF hoạt động thông qua receptor tyrosine kinase thúc đẩy hoạt hóa enzym kinase phụ thuộc cyclin, tổng hợp ADN và tham gia vào pha S của chu kỳ tế bào Thậm chí một LDL bị oxi hóa nhẹ thông qua tín hiệu của thụ thể PDGF cũng gây ra những thay đổi trong mảng xơ vữa Chính những yếu tố này sẽ tác động đến tế bào cơ trơn thành mạch máu (VSMC) làm các

tế bào cơ trơn biến đổi dần và chuyển đổi kiểu hình theo hướng lan rộng, tăng sinh và tăng tiết, đây chính là “trạng thái tổng hợp” của tế bào cơ trơn Sau khi chuyển đổi sang trạng thái tổng hợp, các tế bào cơ trơn mạch máu tiết ra quá nhiều collagen ảnh hưởng đến chu trình hoạt động bình thường của mạch máu Mất chu trình hoạt động bình thường của mạch máu và tính toàn vẹn nội mô, tiếp theo là việc tích tụ của VSMC do tăng sinh quá mức, dẫn đến dày lòng mạch trong xơ vữa động mạch

Các tế bào cơ trơn tổng hợp phần lớn chất nền ngoại bào là thành phần quan trọng trong tổn thương xơ vữa động mạch Đây là bước chuyển tiếp quan trọng trong quá trình xơ hóa các vệt mỡ Các tế bào cơ trơn trong các mạch máu được bao bọc bởi một chất dịch gian bào có cấu trúc phức tạp bao gồm một lượng lớn collagen tuýp I và III, elastin và các proteoglycan Các chất này có tác dụng giữ vững cấu trúc mô và giúp thực hiện các chức năng của tế bào Matrix metallo proteinases (MMPs) là yếu tố định cư trên bề mặt

tế bào có khả năng làm giảm dịch gian bào, MMPs xúc tác và loại bỏ màng đáy xung quanh tế bào cơ trơn và tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác với dịch gian bào, tạo điều kiện để các tế bào cơ trơn di chuyển ra ngoài khi có tổn thương và thúc đẩy sự biến đổi tế bào từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Khi tế bào cơ trơn di chuyển từ lớp áo giữa ra lớp áo ngoài, tại đây chúng tăng sinh và làm lắng đọng các thành phần của dịch gian bào, chuyển vệt mỡ thành các mảng xơ vữa trưởng thành, và góp phần vào sự phát triển của các tổn thương xơ vữa động mạch Hoạt động di chuyển và tăng sinh của tế bào cơ trơn được điều hoà bởi các yếu tố kích thích tăng trưởng và các chất ức chế Các chất kích thích như PDGF, ET-1, thrombin, FGF, FN-1 và IL-1 Yếu tố ức chế bao gồm: heparin sulfat, nitric oxid (NO) và yếu tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF-β) Các yếu tố điều hoà khác bao gồm: angiotensin (AT)-II, các catecholamine, estrogen receptor, và osteopontin, một thành phần của dịch gian bào Các cytokine gây viêm như: IL-1, IL-4 và yếu tố hoại tử khối

u (TNF-α) hiệp đồng tác dụng với PDGF và các yếu tố tăng sinh xơ (FGF-2) sản sinh một lượng lớn MMP trong đó PDGF đóng vai trò quan trọng nhất

Như vậy các tổn thương trên thành mạch máu, sự tạo thành các vệt mỡ,

tế bào bọt hoặc các yếu tố tăng trưởng tiểu cầu, yếu tố tăng sinh xơ sẽ tăng hoạt hóa tế bào cơ trơn chuyển sang trạng thái hoạt động, tăng sinh và tăng di chuyển các tế bào cơ trơn mạch máu từ màng trong ra ngoài Tế bào cơ trơn tăng sản xuất các chất góp phần hình thành mảng xơ vữa trong đó yếu tố tăng trưởng tiểu cầu đóng vai trò quan trọng trong hình thành mảng xơ vữa Vì vậy, ức chế tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu do các yếu tố trên đặc biệt do yếu tố tăng trưởng tiểu cầu

có tác dụng quan trọng trong phòng và điều trị xơ vữa động mạch

1.2 Một số phương pháp cô lập và tách tế bào cơ trơn động mạch từ động vật

1.2.1 Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Ricardo

KH2PO4, 155,17 mM NaCl và 2,70 mM Na2HPO4, pH 7.4 [39]

Phương pháp cô lập và tách tế bào cơ trơn động mạch chủ của Ricardo được tiến hành gồm các bước cơ bản như sau:

Động mạch chủ sau khi được tách khỏi cơ thể sống được đặt trong đệm PBS Loại bỏ các mô xung quanh động mạch chủ mới được cô lập Chuyển động mạch chủ vào đĩa có chứa dung dịch collagenase tuýp 2 và đặt trong tủ

ấm ở 37°C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2 trong 15 phút

mà không tác động gì thêm Loại bỏ các mảng mô bám xung quanh động mạch Cắt động mạch chủ thành các mảnh nhỏ, chuyển vào ống falcon có

chứa collagenase tuýp 2 tiếp tục ủ ở 37° C trong 90 phút Khuấy trộn nhẹ nhàng liên tục trong suốt quá trình ủ [39]

Ly tâm hỗn hợp tế bào với tốc độ 3000 vòng trong 5 phút Loại dịch nổi

và thêm vào môi trường MEM Rửa tế bào 2 lần bằng môi trường MEM bổ sung 10% FBS Tế bào thu được đem nôi cấy trong đĩa petri ở 37°C trong môi trường không khí có 95% O2 và 5% CO2 Thay môi trường nuôi cấy sau mỗi 2 ngày (sử dụng MEM bổ sung với 10% FBS)

1.2.2 Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả

Rupande Tripathi

Về hóa chất sử dụng: ngoài enzym collagenase tuýp 2 như trong phương pháp của tác giả Ricardo Villa-bellosta, tác giả Rupande Tripathi còn

sử dụng thêm enzym elastase (Worthington Biochemical LS002279) và chất

ức chế trypsin (Worthington Biochemical LS003570) Sử dụng đệm HBSS (Hank’s Buffered Salt Solution) thay cho đệm phosphat PBS Môi trường nuôi cấy tế bào MEM được thay thế bằng môi trường DMEM/F12 (Gibco

11.320) [38]

Về phương pháp tiến hành, tác giả Rupande Tripanthi cũng sử dụng động vật nghiên cứu là chuột cống trưởng thành tuy nhiên theo tác giả Rupande Tripathi thì quá trình cô lập tế bào sẽ thành công hơn nếu sử dụng chuột dưới 10 tuần tuổi, và tác giả này đã lựa chọn chuột 3-4 tuần tuổi để tiến hành thí nghiệm tách tế bào cơ trơn Để tách tế bào cơ trơn động mạch chủ, các bước tiến hành tương tự như phương pháp của tác giả Ricardo Villa-bellosta nhưng sau khi ủ với collagenase từ 8-10 phút tác giả Rupande Tripanthi tiếp tục ủ động mạch chủ với collagenase và elastase ở nhiệt độ

trường nuôi cấy lần 1 Các bước cấy chuyển tế bào tương tự như phương pháp

của tác giả Ricardo Villa-bellosta

1.2.3 Phương pháp cô lập và nuôi cấy tế bào cơ trơn của tác giả Neeta

Adhikari

Về hóa chất đã sử dụng, tác giả Neeta Adhikari đã tiến hành tách tế

bào cơ trơn động mạch ở chuột nhắt C57BL6J, giống đực, trưởng thành (14-16 tuần tuổi) Sử dụng enzym collagenase tuýp 2, trypsin, đệm phosphat PBS, môi trường DMEM

Phương pháp cô lập tế bào cơ trơn giống phương pháp của tác giả Ricardo Villa-bellosta [13]

Về phương pháp tiến hành và nuôi cấy: tác giả Neeta Adhikari cấy chuyển tế bào giống tác giả Rupande Tripanthi vào ngày thứ 5, pha loãng ½,

sử dụng một nửa để thí nghiệm Phần còn lại được nhuộm xanh trypan để đếm

số lượng tế bào sống Kết quả cho thấy số lượng tế bào trong 1mL là 25-35 x

103 tế bào/mL sau 5 ngày phát triển

1.3 Một số phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế tăng sinh

tế bào cơ trơn động mạch chủ

Có nhiều phương pháp để nghiên cứu sự tăng sinh của tế bào đã được

áp dụng Một số tác giả sử dụng các chất đồng vị phóng xạ như 51Cr hoặc các chất sinh hóa có gắn phân tử phóng xạ ví dụ như (3H) thymidin hoặc (125I) iododeoxyuridin [35] Bên cạnh đó có những phương pháp không sử dụng chất phóng xạ đã được phát triển như sử dụng MTT, XTT, MTS và INT [16,

18, 22] hoặc sử dụng lysozomal hexosaminidase NAG [24] hoặc BrDU bromo-2-deoxyuridin) [30] hoặc nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm đặc hiệu DNA có huỳnh quang Hoechst 33258 [15]

(5-1.3.1 Phương pháp Alamar Blue

AlamarBlue là một chất chỉ thị cho khả năng sống của tế bào Thành phần của thuốc thử Alamar Blue là resazurin, một hợp chất không độc đối với tế bào,

có khả năng thấm qua tế bào, có màu xanh và không phát huỳnh quang Khi đi vào tế bào, resazurin chuyển thành resorufin có huỳnh quang đỏ Chỉ tế bào sống mới có khả năng chuyển resazurin thành resorufin Số lượng huỳnh quang tạo ra

tỉ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót, do đó mức độ phát quang là thước đo về khả năng sống sót của tế bào

Tế bào cơ trơn động mạch chủ tách từ chuột được chia thành các lô và được kích thích bằng 50 ng/mL PDGF-BB Lô chứng tế bào được ủ với dung môi dùng để pha mẫu thử Lô thử tế bào được ủ với mẫu thử trong 24 giờ Sau khi ủ tế bào với mẫu thử, ủ tế bào với Alamar Blue Tiến hành đo quang ở bước sóng 570 nm và 595 nm So sánh mật độ quang của lô ủ mẫu thử và lô chứng để đánh giá tác dụng của thuốc

Ưu điểm của phương pháp so với những phương pháp sử dụng chất phóng xạ lớn nhất là không độc hại, đơn giản và dễ sử dụng [28] Thuốc thử được bổ sung trực tiếp vào môi trường nuôi cấy tế bào ở giai đoạn cuối cùng, không gây độc hại cho tế bào và cho cả người sử dụng Không như phương pháp truyền thống sử dụng các đồng vị phóng xạ, phương pháp Alamar Blue không đòi hỏi phải xử lý đặc biệt nên ít tốn kém hơn Phương pháp này có thể

áp dụng cho việc sàng lọc in vitro ở quy mô lớn do có tính chất đồng nhất

Đồng thời phương pháp Alamar Blue cho kết quả chính xác tương đương với các phương pháp có chất sinh hóa phóng xạ kết hợp với thymidin hoặc phương pháp đo lượng giảm tetrazolium trong các thí nghiệm về sự tăng sinh

và độc tính của tế bào [14, 17, 29]

1.3.2 Phương pháp MTT

Kỹ thuật MTT được dựa trên nguyên tắc MTT [3- (4,5- dimethylthiazol

- 2- yl) - 2,5 - diphenyl tetrazolium bromid] tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào và tạo thành các formazan dạng tinh thể Dùng một số dung dịch (như ethanol, DMSO) để phá huỷ màng tế bào đồng thời hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 550 nm

để đánh giá ảnh hưởng của mẫu thử trên mức độ sống chết của tế bào

Cách tiến hành

Tế bào cơ trơn động mạch chủ sau khi tách được chia thành các lô và được kích thích bằng 50 ng/mL PDGF-BB Lô thử tế bào được ủ với mẫu thử

ở các nồng độ khác nhau trong 24 - 48 giờ Sau đó ủ tế bào với MTT trong 4 -

5 giờ Hút loại bỏ dung dịch nổi, bổ sung ethanol hoặc DMSO và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng 550 nm

1.3.3 Phương pháp SRB

Phương pháp SRB được phát triển bởi Philip Skehan và cộng sự năm

1990 để đánh giá độc tính của chất nghiên cứu và khả năng phát triển của tế

bào Phương pháp này được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm ở

Mỹ và các nước khác [36]

SRB (Sulforhodamine B) là tinh thể màu tím thẫm, có màu ánh hồng khi tan trong dung môi acid yếu được dùng làm thuốc nhuộm tế bào SRB bám vào các acid amin kiềm của protein trong tế bào Lượng SRB tỷ lệ thuận với lượng protein trong tế bào, do đó định lượng được SRB sẽ định lượng được tế bào cần nghiên cứu Dựa trên nguyên tắc đó, SRB được sử dụng để đánh giá sự tăng sinh của tế bào và độc tính của chế phẩm

1.4 Một vài nét về cây vối

1.4.1 Tên khoa học

Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry

Tên đồng nghĩa: Eugenia operculata Roxb

1.4.3 Phân bố, sinh thái

Chi Cleistocalyx Blume gồm một số loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt

đới Đông Nam Á Việt Nam có ba loài Vối là cây đặc hữu của vùng Bắc Việt

Nam và Nam Trung Quốc Ở Việt Nam, Vối mọc tự nhiên dọc theo các bờ suối hay bờ các ao hồ ở vùng núi thấp và trung du thuộc các tỉnh Cao Bằng (Hà Quảng, Nông Thôn, Thạch An…); Lạng Sơn (Đồng Mỏ, Hữu Lũng); Bắc Giang (Sơn Động, Lục Nam, Yên Thế…); Vĩnh Phúc (Lập Thạch, Tam Dương), Phú Thọ, Tuyên Quang, Hà Tây, Hòa Bình… Cây Vối còn được trồng rải rác ở các tỉnh đồng bằng và trung du Bắc Bộ Cây được trồng ở bờ

ao vừa để chống sạt lở đất, vừa để tận dụng khoảng không gian

Vối thuộc loại cây gỗ ưa sáng, ưa ẩm, sinh trưởng và phát triển nhanh chóng, trong vòng ba năm đầu, chiều cao thân có thể đến 5 m Cây phân cành nhiều, chồi và lá non ra nhiều trong mùa xuân hè Những cây mọc ở chỗ được chiếu sáng đầy đủ ra hoa quả rất nhiều, tái sinh tự nhiên từ hạt khỏe Ngoài ra,

để cho cây có nhiều cành lá, người ta thường chặt bớt cành hàng năm, nhằm kích thích cho sự sinh chồi mới Chồi mới mọc ra theo kiểu lưỡng phân, những chồi phát triển thành cành có trên một năm tuổi mới ra hoa [2]

1.4.4 Thành phần hóa học

Tinh dầu lá vối có khoảng 30 thành phần đã được xác định trong đó các thành phần chính là (Z)-β-ocimen 32,1%, myrcen 24,6%, β-caryophylen 14,5% và (E)-β-ocimen 9,4% [2]

Theo nghiên cứu của Hà Thị Kim Quý và cộng sự năm 2016, từ lá

Cleistocalyx operculatus tìm thấy hai acetophenon mới là

(2S)-2,6-dihydroxy-4-methoxy-5,7-dimethylcoumaran-3-one và 3,5-dimethylacetophenone, một flavonoid mới là (2S)-7,2-dihydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanone, cùng với sáu hợp chất đã biết là (2S)-7-

7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylisoflavone,2,4-dihydroxy-6-methoxy-3,5-dimethylchalcone

myricetin-3-methylether 3-O-β-Dgalactopyranoside,

myricetin-3,5-dimethylether 3-O-β-D-galactopyranoside và 3-O-methylellagic L-rhamnopyranosid

acid-4-O-α-Vỏ cây Vối chứa một chất triterpen nhóm olean được nhận dạng là acid arjunolic

Có 9 chất đã được phân lập từ nụ vối trong đó 8 chất đã được nhận dạng là 2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchacon, 5-7-dihydroxy-6,8-dimethylflavon, 7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanon, ethyl galat, acid galic, acid ursolic, β-sitosterol và acid cinamic [2]

Nụ Vối còn có tinh dầu trong đó có myrcen, geraniol, cis-caryophylen, 8-murolen, alo-aromadendren, δ-cadinen, farnesol

Năm 2012, PGS.TS Phương Thiện Thương, TS Đào Trọng Tuấn (Viện Dược liệu) đã phân lập và xác định cấu trúc của 14 flavonoid từ nụ Vối là : 7-

5,7-dihydoroxy-6,8-dimethyldihydroflavonol ; 2,7-dihydoroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanone ; 4,2’,4’-trihydoroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone ; 7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavone ; 5-hydroxy-7-methoxy-6,8-dimethylflavanone ; 2’,4’-dihydoroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone ; 2’,4’-dihydoroxy-3’-methyl-6’-methoxychalcone ; 6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin ; (2S)-8-formyl-5-hydroxy-7-methoxy-6-methylflavanone ;7-hydroxy-5-methoxy-8-

Ở Trung Quốc, nụ Vối được dùng chữa sốt, đau đầu, ăn không tiêu, lỵ trực trùng, viêm dạ dày - ruột cấp [2]

 Tác dụng dược lý

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm phân lập, xác định thành phần của cây Vối, cũng như nghiên cứu tác dụng của cây

Năm 2015, tác giả Yu WG và cộng sự vào đã nghiên cứu tác dụng

chống viêm của tinh dầu được phân lập từ chồi của Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry Trong nghiên cứu này, chồi của Cleistocalyx

operculatus ức chế đáng kể tác dụng kích thích tiết các cytokin gây viêm bởi

lipopolysaccharid Điều đó cho thấy, chồi của Cleistocalyx operculatus có tác

dụng chống viêm là do ức chế biểu hiện của các cytokin gây viêm [19]

Nghiên cứu của tác giả Trương Tuyết Mai và Nguyễn Văn Chuyên về

hoạt động chống tăng đường huyết của dịch chiết tách từ nụ Cleistocalyx

operculatus (Roxb.) Merr et Perry vào năm 2007 cho thấy, dịch chiết nụ hoa Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry ức chế mạnh các alpha-

glucosidase Kiểm tra đường huyết sau ăn ở chuột bình thường và chuột nhắt

đái tháo đường do streptozotocin cho thấy Cleistocalyx operculatus (500

mg/kg cân nặng) làm giảm glucose máu rõ rệt nhưng tác dụng này vẫn kém hơn khi so với acarbose (25 mg/kg cân nặng) Trên chuột đái tháo đường gây

bằng streptozotocin, Cleistocalyx operculatus (500 mg/kg/ngày) có tác dụng làm giảm rõ rệt glucose huyết chuột khi so với lô chứng Các kết quả này cho thấy Cleistocalyx operculatus rất có tiềm năng trong ngăn ngừa và điều trị

bệnh tiểu đường [26]

Một số phenolic có hoạt tính kháng virus cũng được chiết xuất từ

lá Cleistocalyx operculatus Theo Hà Thị Kim Quý và cộng sự, flavonoid từ

(2S)-7,2-dihydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavanone có khả năng ức chế enzym neuraminidases từ các virus cúm khác nhau, bao gồm cả H1N1, H9N2, và virus kháng oseltamivir H1N1

(H274Y đột biến), HEK293 (giá trị IC50 tương ứng từ 5,07 ± 0,94 mM đến 9,34 ± 2,52 mM) [23]

Gần đây một số công trình nghiên cứu về cây Vối đã được tiến hành nhằm làm rõ công dụng của cây Vối tại Việt Nam Năm 2010, Viện dinh dưỡng, Việt Nam kết hợp với trường đại học Phụ nữ Ochanomizu, Nhật Bản

đã tiến hành đánh giá hiệu quả kiểm soát đường huyết của nụ Vối trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 tại Hà Nội và đưa ra kết luận: sử dụng nụ Vối có tác dụng hạn chế tăng đường huyết sau ăn, kiểm soát được đường huyết lâu dài trên bệnh nhân đái tháo đường, kiểm soát được rối loạn lipid máu lâu dài trên bệnh nhân đái tháo đường tuýp 2 như làm giảm đáng kể nồng độ cholesterol và triglycerid, tăng chỉ số HDL-C trên nhóm bệnh nhân dùng nụ Vối [7]

Vào năm 2012, PGS TS Phương Thiện Thương và cộng sự đã nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc của 14 flavonoid từ nụ Vối đồng thời cũng

đánh giá tác dụng của 11 flavonoid trên một số dòng tế bào ung thư in vitro

[11] Kết quả cho thấy, tất cả các flavonoid đều có độc tính đối với dòng tế bào ung thư MCF7, A549 và Hela với giá trị IC50 nằm trong khoảng 1,3 - 27,7 µg/mL, trong đó 5-hydroxy-7-methoxy-6,8-dimethylflavanone cho tác dụng

ức chế mạnh nhất sự phát triển của dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50 là 1,3 µg/mL

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.2 Hóa chất và trang thiết bị

2.1.2.1 Hóa chất

Các hợp chất được chiết tách từ nụ vối được cung cấp bởi Tiến sĩ Đào Trọng Tuấn (Viện Dược liệu) gồm 3 flavonoid:

7-hydroxy-5-methoxy-6,8-dimethylflavone (ký hiệu là CO1)

6-formyl-8-methyl-7-O-methylpinocembrin (ký hiệu là CO2)

7-hydroxy-5-methoxy-8-methylflavanone (ký hiệu là CO3)

Môi trường nuôi cấy tế bào Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (glucose nồng độ cao, Invitrogen-Đức), huyết thanh bò (FBS, Invitrogen-Đức), penicillin/streptomycin (hãng Gibco), Trypsin 0.25% (hãng Corning), đệm phosphate, ethanol 70%, collagenase tuýp 2 (hãng Worthington), elastase (hãng Worthington)

Các hóa chất thí nghiệm khác (KH2PO4, NaOH, NaHCO3 được cung cấp bởi hãng Merk)

Chuẩn bị thuốc thử:

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh : DMEM bổ sung 10% FBS và 1% penicillin/streptomycin và bảo quản ở nhiệt độ 4°C cho đến khi sử dụng

Dung dịch đệm HBSS không có canxi và magie

Dung dịch đệm HBSS có canxi và magie

2.1.2.2 Trang thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ nuôi cấy tế bào (chai nuôi cấy, đĩa petri, đĩa 6 giếng, đĩa 96 giếng…)

Micropipet với các loại thể tích 2-10 µL, 10-100 µL, 100-1000 µL, ống Eppendort thể tích 15 mL và 50 mL

Máy đo PH (EUTECH)

Máy li tâm (HERMLE Z300)

Tủ thao tác cấy tế bào (EUROCLONE Biological Safety Mỹ)

Một số máy móc thiết bị khác phục vụ nuôi cấy tế bào

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ từ chuột cống

Tiến hành triển khai tách tế bào cơ trơn động mạch chủ của chuột theo

2 phương pháp:

 Phương pháp 1: Theo phương pháp của tác giả Rupande Tripathi và cộng sự có chỉnh sửa

 Phương pháp 2: Theo phương pháp của tác giả Lee và cộng sự

Cụ thể phương pháp 1 được tiến hành gồm các bước như sau :

Bước 1 : Tách động mạch chủ

Trước khi mổ chuột, làm ấm các dung dịch đệm và môi trường ở 370

C Làm chết chuột bằng cách trật khớp cổ, xịt cồn 70% để sát trùng Để chuột ở tư thế nằm ngửa