Ứng dụng nhựa macroporous trong phân lập isoflavonoid từ sắn dây

Hiện nay, một số tác giả đã đề xuất phương pháp phân lập nhóm hoạt chất này từ Sắn dây như: Phương pháp phân lập của Xueli Cao và cộng sự[39] sử dụng sắc ký phân bố ngược dòng với hệ dun

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ VĂN TUẤN

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID

TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ VĂN TUẤN

ỨNG DỤNG NHỰA MACROPOROUS TRONG PHÂN LẬP ISOFLAVONOID

TỪ SẮN DÂY LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUY N NGHÀNH: C NG NGH DƯ C PH M BÀO CHẾ THUỐC

M SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Để có được sự thành công của luận văn, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân

thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Hân–Bộ môn Công Nghiệp Dược,

Trường Đại học Dược Hà Nội - là người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo

và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong

bộ môn Công Nghiệp Dược cùng các bộ môn, phòng ban trong trường đại học Dược Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ủng

hộ, động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Hà Nội, tháng 03 năm 2017

Học viên

Vũ Văn Tuấn

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 7

DANH MỤC CÁC BẢNG 8

DANH MỤC CÁC HÌNH 9

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vài nét về sắn dây 2

1.1.1 Tên gọi 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Bộ phận dùng 3

1.1.4 Thành phần hóa học 3

1.1.5 Tác dụng dược lý của Sắn dây 4

1.1.6 Tính vị, công năng 6

1.1.7 Công dụng 6

1.1.8 Ứng dụng của isoflavonoid Sắn dây 7

1.2 Isoflavonoid 7

1.2.1 Công thức hóa học 7

1.2.2 Tính chất lý hóa 8

1.2.3 Tác dụng sinh học 8

1.2.4 Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây 9

1.3 Nhựa hấp phụ macroporous 10

1.3.1 Giới thiệu chung về nhựa hấp phụ macroporous 10

1.3.2 Phân loại nhựa macroporous 13

1.3.3 Ứng dụng của nhựa macroporous trong phân lập các hoạt chất thiên nhiên 14 1.4 Quá trình hấp phụ 17

1.4.1 Bản chất của lực hấp phụ 17

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hấp phụ chất tan 18

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 21

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất 21

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.2.1 Xác định hàm lượng isoflavonoid trong Sắn dây 23

2.2.2 Chiết xuất các isoflavonoid từ Sắn dây 23

2.2.3 Khảo sát quá trình hấp phụ 23

2.2.4 Khảo sát quá trình giải hấp phụ 23

2.2.5 Phân lập isoflavonoid từ Sắn dây quy mô 10kg nguyên liệu/mẻ 23

2.2.6 Đánh giá khả năng tái sử dụng của nhựa macroporous D101 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp định tính 24

2.3.2 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần 24

2.3.3 Phương pháp định lượng puerarin 26

2.3.4 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây 28

2.3.5 Phương pháp xử lý nhựa 28

2.3.6 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ 28

2.3.7 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình giải hấp phụ 29 2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng tái sử dụng 30

2.3.9 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu 31

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 32

3.1 Xác định isoflavonoid và puerarin trong nguyên liệu 32

3.1.1 Định tính nguyên liệu 32

3.1.2 Định lượng isoflavonoid toàn phần 32

3.1.3 Định lượng puerarin 35

3.2 Khảo sát quá trình chiết xuất 36

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết xuất 36

3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến quá trình chiết xuất 38

3.2.3 Ảnh hưởng của số lần chiết đến quá trình chiết xuất 39

3.3 Khảo sát quá trình hấp phụ isoflavonoid từ dịch chiết lên nhựa macroporous D101 40

3.4 Khảo sát quá trình giải hấp phụ isoflavonoid từ nhựa Macroporous D101 43 3.4.1 Lựa chọn dung môi giải hấp phụ isoflavonoid 43

3.4.2 Khảo sát quá trình giải hấp phụ 44

3.5 Triển khai chiết xuất và phân lập isoflavonoid quy mô 10kg Sắn dây tươi/mẻ 47

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

GOT Glutamic oxaloacetic transaminase

HDL High Density Lipoprotein

(Lipoprotein có tỉ trọng cao) HSCCC High Speed Counter Current Chromatography

(Sắc ký ngược dòng tốc độ cao) HPLC High Performance Liquid Chromatography

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

IF Isoflavonoid

LDL Low Density Lipoprotein

(Lipoprotein có tỉ trọng thấp)

SD Độ lệch chuẩn

RSD Độ lệch chuẩn tương đối

UV-VIS Ultraviolet Visible

(Tử ngoại khả kiến)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 22

Bảng 2.3: Dãy dung dịch chuẩn 27

Bảng 3.1: Độ hấp thụ của dung dịch puerarin với các nồng độ khác nhau tại bước sóng 250nm (n=5) 33

Bảng 3.2: Kết quả định lượng isoflavonoid trong nguyên liệu(n=3) 34

Bảng 3.3: Diện tích pic sắc ký của dãy dung dịch chuẩn(n=5) 35

Bảng 3.4: Hàm lượng puerarin trong nguyên liệu (n=3) 36

Bảng 3.5: Sự thay đổi nồng độ isoflavonoid trong dịch chiết và hàm lượng isoflavonoid trong cắn chiết theo thời gian (n=5, ±SD) 37

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu đến quá trình chiết xuất (n=5, ±SD) 38

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của số lần chiết đến hiệu suất và hàm lượng isoflavonoid trong cắn chiết (n=5, ±SD) 39

Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ isoflavonoid trong dịch nạp đến dung lượng hấp phụ của nhựa macroporous D101(n=3, ±SD) 41

Bảng 3.9: Quá trình rửa tạp chất bằng nước 45

Bảng 3.10: Kết quả chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây tươi (n=3, ±SD) 48

Bảng 3.11: Khối lượng nhựa cần sử dụng cho quy mô 10 kg Sắn dây/mẻ 50

Bảng 3.12: Kết quả phân lập isoflavonoid từ Sắn dây tươi quy mô 10kg/mẻ (n=3) 51 Bảng 3.13: Quá trình làm giàu isoflavonoid Sắn dây 51

Bảng 3.14: Khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ của nhựa sử dụng lần đầu và nhựa tái sử dụng 54

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1: Sắn dây 2

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của một số isoflavonoid trong Sắn dây 4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo isoflavon 7

Hình 1.5 Nhựa hấp phụ macroporous D101 10

Hình 3.1: Sắc ký đồ của puerarin (C) và dịch chiết Sắn dây (T) 32

Hình 3.3: Đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa độ hấp thụ với nồng độ puerarin 34 Hình 3.4: Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic với nồng độ puerarin 35 Hình 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết xuất 37

Hình 3.6: Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết và hàm lượng IF trong cắn chiết vào tỷ lệ dung môi / nguyên liệu 38

Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết ở mỗi lần chiết 40

Hình 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ IF trong dịch nạp cột đến dung lượng hấp phụ của nhựa Macroporous D101 41

Hình 3.9: Quá trình hấp phụ IF của nhựa Macroporous D101 với các nồng độ isoflavonoid khác nhau 42

(A-0,5; B-1,0; C-2,5; D-5,0 mg/ml) 42

Hình 3.10: Khả năng giải hấp phụ của ethanol ở các nồng độ khác nhau 44

Hình 3.11: Đường cong giải hấp phụ bằng nước 46

Hình 3.12: Đường cong giải hấp phụ bằng ethanol 70% 47

Hình 3.13: Cột nhựa D101 dùng cho giai đoạn khảo sát (A) và dùng cho quy mô 10kg/mẻ (B) 50

Hình 3.14: Sắc ký đồ HPLC của isoflavonoid thô (A) và isoflavonoid sau tinh chế (B) 52 Hình 3.15: Hình ảnh sản phẩm IF Sắn dây: A-sản phẩm thô (41,47%), B-sản phẩm sau tinh chế lần 1 (68,67%), C-sản phẩm sau tinh chế lần 2 (84,53%) 53 Hình 3.16: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi khả năng hấp phụ và tỷ lệ giải hấp phụ theo

ĐẶT VẤN ĐỀ

Sắn dây là cây thuộc họ Đậu (Fabaceae) Thành phần chính trong rễ củ Sắn dây là các chất thuộc nhóm isoflavonoid như: Puerarin, daidzin, daidzein, Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng sinh học của chúng như: Làm tăng tuần hoàn máu não, chống oxy hóa [12], [22], [30], chống trầm cảm [28], giải rượu[43], tác dụng kiểu phytoestrogen [11], [29]

Hiện nay, một số tác giả đã đề xuất phương pháp phân lập nhóm hoạt chất này từ Sắn dây như: Phương pháp phân lập của Xueli Cao và cộng sự[39]

sử dụng sắc ký phân bố ngược dòng với hệ dung môi ethyl

acetat/n-butanol/nước (2:1:3); Hua-Neng Xu và Chao-Hong He sử dụng hệ dung môi

n-butanol/nước (1:1)[37] Nhìn chung, các phương pháp này có hạn chế là sử

dụng dung môi độc hại, giá thành cao và khó thực hiện ở quy mô lớn

Nhựa macroporous là một loại vật liệu mới, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong phân lập các hoạt chất từ thiên nhiên Vì nhựa macroporous hạn chế được các nhược điểm của phương pháp phân lập truyền thống và có nhiều ưu điểm như: Làm tăng đáng kể nồng độ của các thành phần hoạt chất, không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, khả năng lặp lại và ổn định tốt, chi phí thấp do có thể tái sử dụng nhiều lần, phù hợp cho sản xuất công nghiệp [9], [18]

Nhằm tìm ra một phương pháp mới, hiệu quả để phân lập isoflavonoid

từ Sắn dây, đề tài: “Ứng dụng nhựa macroporous trong phân lập

isoflavonoid từ Sắn dây” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất, phân lập isoflavonoid trong củ Sắn dây bằng nhựa macroporous

2 2 Điều chế isoflavonoid Sắn dây hàm lượng trên 40% bằng nhựa

macroporous

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về sắn dây

1.1.1 Tên gọi

Tên khoa học: Pueraria thomsonii Benth Một số tài liệu Trung Quốc

thì ghi loài P lobata (Will) Ohwi hoặc P pseudohirsuta Tang et Wang [4]

Tên khác: Bạch cát, Khau cáu (Tày), Bẳn mắm kéo (Thái)

Tên nước ngoài: Kudzu bean, Kudzu vine (Anh), Koudzou (Pháp) Họ: Đậu (Fabaceae)

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Sắn dây là loài dây leo, dài có thể đến 10m, lá kép gồm 3 lá chét Cuống

lá chét giữa dài, cuống lá chét 2 bên ngắn Lá chét có thể phân thành 2-3 thùy

Về mùa hạ trổ hoa màu xanh tím, mọc thành chùm ở kẽ lá Quả loại đậu có nhiều lông Củ dài to, nặng có thể tới 20kg, nhiều xơ (Hình 1.1)

Hình 1 1: Sắn dây

Muốn trồng Sắn dây người ta đào các hố sâu 50 cm, đổ rác và mùn rồi lấp đất xốp lại Đến tháng 1-2, giâm cành vào các hố đó Nhiều nơi ở nước ta thường kết hợp làm giàn lấy bóng mát Cũng có những vùng chuyên trồng để chế tinh bột, ví dụ: Làng Cao Xá thuộc huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh mỗi

năm sản xuất khoảng 20 tấn tinh bột [4]

1.1.3 Bộ phận dùng

Rễ củ thu hoạch từ tháng 10 đến tháng 3 - 4 năm sau

Để chế vị Cát căn, người ta rửa sạch, bóc bỏ lớp vỏ dày bên ngoài củ, cắt thành khúc dài 10-15 cm Nếu củ to, bổ dọc để có những thanh dày khoảng 1

cm Sau đó, xông diêm sinh, phơi hoặc sấy khô Loại trắng ít xơ là loại tốt Muốn chế tinh bột Sắn dây, người ta bóc vỏ, đem giã nhỏ hoặc mài trên tấm sắt tây có đục thủng lỗ, hoặc xay bằng máy, cho thêm nước rồi nhào lọc qua rây thưa, loại bã Sau đó, lọc lại 1 lần nữa qua rây dày hơn, để lắng gạn lấy tinh bột rồi đem phơi hoặc sấy khô[4]

1.1.4 Thành phần hóa học

Hàm lượng tinh bột trong củ tươi khoảng 12-15% Ngoài tinh bột ra còn

có các Isoflavonoid Các Isoflavonoid chính trong sắn dây là puerarin, daidzin, daidzein Ngoài ra, còn có formonetin, các pueraria glycosid 1-6 và

puerarol[4] Trong Sắn dây, người ta xác định được 7 isoflavonoid chính là:

3′-hydroxypuerarin, puerarin, 3′-methoxypuerarin, daidzin, genistin, formononetin-7-glucosid và daidzein[7] Cấu trúc hóa học của một số Isoflavonoid trong Sắn dây được mô tả ở Hình 1.2

Yue Hong-wen và cộng sự đã thực hiện một thí nghiệm trên tim chó ngừng đập kéo dài (140 phút ở điều kiện lạnh) và tổn thương do thiếu máu Dung dịch puerarin (2 mg/kg) được truyền qua tim chó trên nhóm thử và so sánh với nhóm chứng Kết quả cho thấy: Sự hồi phục chức năng tâm thất trái

O

O

R3 R2

R1

R4

R5

ở nhóm được điều trị tốt hơn đáng kể so với nhóm chứng (81±11% so với 39±7%, P <0,01) So sánh các giá trị tiền lâm sàng, sự gia tăng lưu lượng máu động mạch vành sau khi tim ngừng đập ở nhóm điều trị bằng puerarin cao hơn nhóm đối chứng (214±11 so với 177±4 ml/phút, P<0,01) Dữ liệu cho thấy rằng puerarin có tác dụng bảo vệ chức năng tim sau khi bị ngừng đập kéo dài và tổn thương do thiếu máu[41]

 Tác dụng hạ huyết áp của cao sắn dây

Cao Sắn dây tiêm tĩnh mạch với liều 5-30 mg/kg trên chó, mèo có tác dụng

hạ huyết áp Cao Sắn dây với liều 750 mg/kg tiêm tĩnh mạch có khả năng đối kháng với tác dụng kích thích tim của isoprenalin[5]

Tác dụng hạ huyết áp có thể sảy ra cả trên động vật bình thường và động vật có huyết áp cao Cao Sắn dây được dùng đường uống trên chó có huyết áp cao với liều 2g/kg gây hạ huyết áp, gây suy yếu hoặc loại bỏ hoàn toàn tác

động của adrenalin[20]

 Tác dụng chống loạn nhịp tim

So sánh tác dụng chống loạn nhịp tim của puerarin, daidzein và dạng chiết cồn từ sắn dây trên chuột cống trắng và chuột nhắt trắng cho thấy tác dụng của daidzein tương đối mạnh, cho hiệu quả rõ rệt Dạng chiết cồn có tác dụng giống với daidzein Điều này chứng tỏ: Daidzein là thành phần chủ yếu

có tác dụng chống loạn nhịp tim Puerarin với liều tương đương có tác dụng kháng rõ rệt với loạn nhịp tim do aconitin và bari clorid gây nên, giảm nhẹ mức độ loạn nhịp do thiếu máu cơ tim, tác dụng đối kháng với rung thất

Các isoflavonoid sắn dây cững có tác dụng ức chế đối với các dòng tế bào ung thư vú như: HS578T, MDA-MB-231, và MCF-7 Dạng chuyển hóa của daizein là các muối sulfat hoặc glucuronic gây tác ức chế đối với 50% tế

bào ung thư vú ở nồng độ 2,35µM[24]

 Tác dụng chống oxy hóa

Thí nghiệm trên chuột gây tiểu đường bằng cách tiêm phúc mạc streptozotocin Thí nghiệm sử dụng cao sắn dây chứa khoảng 10,42% puerarin và một vài chất liên quan, với liều 500 mg/kg, dùng đường uống trong 3 tuần, kết quả cho thấy nồng độ malondialdehyd trong huyết tương-được sử dụng như một dấu hiệu của chất béo bị oxy hóa, đã giảm xuống mức tương tự như ở chuột khỏe mạnh và giống như trong nhóm được điều trị tích cực hàng ngày bằng tocopherol acetat với liều 50 mg/kg [5] Các tác dụng chống oxy hóa, dọn các gốc tự do, ức chế enzym lypoxygenase cũng được báo cáo bởi M Jun và công sự[17]

Trong y học cổ truyền, sắn dây dùng chữa các bệnh cảm sốt phong nhiệt,

cổ gáy cứng đau, sởi mọc không đều, viêm ruột, kiết lị kèm theo sốt, khát nước Lá sắn dây vò với nước gạn lấy nước uống chữa ngộ độc nấm Lá già giã nát với lá tía tô thêm nước gạn uống, bã đắp chữa rắn cắn Hoa sắn dây với liều 4-10 g sắc uống chữa say rượu, tiêu chảy ra máu, trĩ

Bột sắn dây được dùng để pha với nước có đường uống vào mùa hè, có tác dụng giải nhiệt, làm mát cơ thể Ngoài ra, nó còn được dùng làm tá dược dính trong bào chế thuốc[5]

1.1.8 Ứng dụng của isoflavonoid Sắn dây

Ở nhiều nước trên thế giới, isoflavonoid Sắn dây được sử dụng phổ biến trong lĩnh vực chăm sóc sức khỏe hoặc mỹ phẩm Chúng có thể được sử dụng

ở dạng isoflavonoid toàn phần với mục đích làm đẹp, chống oxy hóa, tăng tuần hoàn máu, giải độc gan hoặc sử dụng từng isoflavonoid riêng Ví dụ như puerarin tiêm tĩnh mạnh để điều trị bệnh mạch vành

Ở Việt Nam, các ngành công nghiệp phân lập và hóa dược còn kém phát triển nên nhóm hoạt chất này còn chưa được quan tâm nhiều Sản phẩm xuất hiện trên thị trường có thể kể đến như chức năng gan Bảo Nguyên Một trong các thành phần của sản phẩm này là isoflavonoid 40%, được sử dụng với mục đích cải thiện chức năng gan, hỗ trợ điều trị các bệnh lý về gan

1.2 Isoflavonoid

1.2.1 Công thức hóa học

Hình 1.3: Công thức cấu tạo isoflavon

Isoflavonoid (IF) là một phân nhóm của flavonoid, có cấu tạo khung

cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua dị vòng có oxy C, vòng

B gắn với vòng C tại vị trí số 3 (như hình 1.3) Dựa trên mức độ oxy hóa của vòng C, flavonoid được phân loại thành các nhóm: isoflavan, isoflav-3-en, isoflavan-4-ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3-arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihydroisochalcon,

3 4 5

6 7

aryl benzofuran, homoisoflavon Trong đó, isoflavon là nhóm lớn nhất của flavonoid Có 364 chất đã biết (năm 1986) Daidzin, daidzein, puerarin và một

số chất khác có trong Sắn dây là ví dụ[4q], [26]

1.2.2 Tính chất lý hóa

Các chất thuộc nhóm isoflavonoid thường không có màu vì không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl Độ tan các chất không giống nhau Thông thường thì dạng glycosid là hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước, tan tốt nhất là trong hỗn hợp cồn nước Các aglycon tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước Các dẫn chất isoflavon có nhóm 7-hydroxy thường dễ tan trong dung dịch kiềm loãng

Isoflavonoid là một phân nhóm của flavonoid Vì vậy, các chất thuộc phân nhóm này cũng có thể thể hiện các tính chất của flavonoid, tùy thuộc vào từng chất cụ thể Có thể kể một vài tính chất của flavonoid như sau:

 Tính chất nhóm OH phenol: Trong cấu trúc của isoflavonoid có

2 vòng benzen, các nhóm OH trong cấu trúc sẽ thể hiện tính chất của OH phenol Tùy theo nhóm và tùy theo số lượng nhóm OH phenol mà mức độ thể hiện tính chất khác nhau Chúng có thể cho phản ứng với FeCl3, phản ứng với kiềm, phản ứng với chì acetat Các dẫn chất có nhóm OH ở vị trí

số 7 có thể phản ứng với muối diazoni tạo thành chất màu azoic vàng cam

đến đỏ

 Tác dụng với NaOH đậm đặc và đun nóng: Đun isoflavonoid

với dung dịch NaOH 30% thì sẽ mở vòng C tạo thành dẫn chất acid thơm

và dẫn chất phenol[4]

1.2.3 Tác dụng sinh học

Trong những năm gần đây, isoflavonoid ngày càng được quan tâm nhiều hơn do tác dụng kiểu estrogen và kháng estrogen của chúng Các tác

dụng này dẫn đến việc giảm tỷ lệ ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt, bệnh tim mạch hay bệnh loãng xương Ngoài ra, chúng còn thể hiện nhiều tác dụng tốt khác như: Tính chống oxy hóa, điều hòa quá trình phiên mã gen và ức chế các enzyme, tác dụng điều trị ung thư[26], tác dụng trên tim mạch [11]

1.2.4 Một số nghiên cứu phân lập isoflavonoid từ Sắn dây

Cho đến nay, nhiều phương pháp khác nhau để phân lập isoflavonoid

đã được phát triển, bao gồm: Kỹ thuật sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) [39], chiết dung môi[38], dùng gel agarose[15], chiết bằng dung môi CO2 siêu tới hạn[36] và chiết phân bố[6], [37] Để cải thiện tính chọn lọc của cột chất nền đối với puerarin – một isoflavonoid từ Sắn dây, Tan và cộng

sự đã tổng hợp nhiều vật liệu dựa trên cyclodextrin, chẳng hạn như cyclodextrin gắn với gel agarose[14], nhựa gắn oligo-b-cyclodextrin[20], [40]

b-Năm 1999, Xueli Cao và cộng sự đã sử dụng sắc ký ngược dòng tốc độ cao với hệ dung môi ethyl acetat – n-butanol – nước theo tỷ lệ 2:1:3 (v/v/v) tách được 6 hợp chất tinh khiết từ 80 mg cắn chiết trong một lần chạy sắc ký Các hợp chất tinh chế được gồm: 3’-hydroxyl-puerarin, puerarin, 3’-methoxy-puerarin, puerarin-xylosid, puerarin-xylosid, daidzin Các chất tinh chế được

có độ tinh khiết cao trên 90%, đáng kể nhất là puerarin có độ tinh khiết trên 98%[39]

Năm 2004, Xiangling He và cộng sự sử dụng sắc ký hấp phụ trên epichlorohydrin liên kết với -cyclodextrin Pha động là dung dịch acid acetic 10% Dung lượng phân tích khoảng 1,2 mg cắn chiết thô trên 1ml gel Puerarin thu được có độ tinh khiết khoảng 98% [14]

Tuy nhiên, các phương pháp này cũng có nhiều hạn chế như: Thiết bị tốn kém, tiêu thụ một số lượng lớn các dung môi hữu cơ, hiệu suất thấp, không phù hợp quy mô công nghiệp

Năm 2014, Phạm Thị Phương Dung và nhóm nghiên cứu đã chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây bằng ethanol 60% Quá trình loại tạp được tiến hành bằng cách cô thu hổi ethanol và để lắng qua đêm Dịch chiết được lọc và cô đến thể chất cao khô Sản phẩm có hàm lượng isoflavonoid 10,41%[3]

Năm 2013, Pengyue Li và cộng sự đã phân lập các flavonoid trong rễ

củ Sắn dây bằng nhựa macroporous HPD200A 2BV dịch nạp có nồng độ 0,25g/ml (tính theo khối lượng dược liệu khô) được hấp phụ lên nhựa và giải hấp phụ bằng 2BV nước và 4BV ethanol 30% Hàm lượng isoflavonoid và puerarin trong sản phẩm lần lượt là 75% và 32%[19]

Năm 2015, Hai-Dong Guo và cộng sự đã dùng nhựa macroporous H103 để phân lập puerarin từ Sắn dây Dịch chiết từ 100g dược liệu được hấp phụ trên nhựa macroporous H103 và giải hấp phụ bằng ethanol 75% Kết quả thu được 11,65g sản phẩm có hàm lượng isoflavonoid và puerarin lần lượt là 69,25% và 41,78%[13]

1.3 Nhựa hấp phụ macroporous

1.3.1 Giới thiệu chung về nhựa hấp phụ macroporous

Hình 1.5 Nhựa hấp phụ macroporous D101

Thuật ngữ "nhựa hấp phụ macroporous" được sử dụng để chỉ các loại nhựa mang nhiều liên kết chéo, không có khả năng ion hóa, đặc trưng bởi số lượng lớn các lỗ xốp trên bề mặt có đường kính lỗ rỗng trên 50 Å và có thể tiếp cận được với các đại phân tử Nguồn gốc của chúng có thể được bắt nguồn từ các polyme tổng hợp, trước đó được tạo ra bởi sự đồng trùng hợp của formaldehyd với phenol và các dẫn xuất amin thơm vào những năm 1930 bởi

B A Adams và E L Holmes[18] Trong những năm tiếp theo, nhiều cuộc điều tra tổng hợp đã được tiến hành và sản xuất loại nhựa mới này đã trở thành một ngành công nghiệp phát triển

Mặc dù các nhựa trao đổi ion đã sớm ứng dụng cho tinh chế đường và tạo nước khử khoáng, nhưng chúng cũng sớm được nhận ra là không có độ xốp đầy đủ và khung cấu trúc không đủ ổn định để hoạt động trong các môi trường khắc nghiệt Sau đó, G F Mills và cộng sự đã tạo ra nhựa trao đổi ion phenolic macroporous, được coi là tiền thân của các loại nhựa macroporous hiện nay Các nhựa này đóng một vai trò quan trọng trong quá trình khử ion hoá tinh bột ngô thủy phân cho sản xuất glucose và fructose Ngoài ra, chúng còn được sử dụng làm chất hấp phụ để cải thiện màu sắc và hương vị của các loại rượu vang Vào thời điểm đó, một thuật ngữ khác - "nhựa macroreticular"

đã được giới thiệu để mô tả các nhựa trao đổi ion được tổng hợp theo sáng chế của Adam Cho đến năm 1950, các loại “nhựa macroreticular” đã sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, nó vẫn được cho là có cấu trúc macroporous, nghi ngờ này được khẳng định sau khi phát triển các công cụ phân tích thích hợp gần 20 năm sau Khi đó, một số sửa đổi đã được thực hiện trên cấu trúc của nhựa trao đổi ion phenol-formaldehyd để tạo ra các cấu trúc polyme tốt hơn gọi là nhựa gel Nó được tổng hợp bằng cách tạo các liên kết chéo giữa các polystyren Việc đồng trùng hợp styren với một lượng nhỏ divinylbenzen lần đầu tiên được báo cáo bởi Staudinger và Huseman để tạo ra một loại nhựa gel

có khả năng trương nở nhưng không hòa tan trong dung môi Trước đó, các

đồng polyme như styrendivinylbenzen và các chất khác nhau đã tìm ra và ứng dụng, mức độ trương nở của chúng có thể được điều chỉnh theo tỉ lệ divinylbenzen trong quá trình đồng trùng hợp

Vào những năm 1960, các nhà khoa học đã bắt đầu nhận ra rằng một số đồng polyme có thể được sử dụng hiệu quả như các chất dẻo hấp phụ và ngay sau đó các loại nhựa này đã bắt đầu xuất hiện trên thị trường Vào thời điểm

đó, các loại nhựa hấp phụ không ion hóa này được sử dụng để thu hồi các hợp chất hữu cơ không phân cực hoặc ít phân cực từ dung dịch nước Một phương pháp chung để tạo ra các nhựa macoporous không phân cực được mô tả trong các bằng sáng chế của Davankov và Tsyurupa[18] Ngày nay, các loại nhựa này thường được sản xuất từ các polyme gốc styrendivinylbenzen hoặc acrylic Trong hỗn hợp monome được thêm một lượng nhất định một dung môi trơ, không polyme hóa như các hợp chất như toluen, n-heptan, iso-octan

và isobutanol Trong quá trình trùng hợp, các phân tử dung môi xâm nhập vào không gian cấu trúc của hỗn hợp monome và cuối cùng được loại bỏ bằng cách bay hơi khi hoàn thành quá trình trùng hợp, làm tăng các lỗ xốp trong suốt quá trình tạo hạt Nhựa này có đặc điểm mờ đục đặc trưng, trái ngược với các loại nhựa gel trong suốt, do chúng có thể chứa đến 20%(w/w) divinylbenzen trong cấu trúc của chúng và có mức độ liên kết chéo lớn hơn 10% Hàm lượng cao của divinylbenzen tạo ra một cấu trúc tương đối cứng nhắc và ổn định có thể chịu được các điều kiện khắc nghiệt như áp suất thẩm thấu cao, quá trình oxy hóa và ứng suất cơ học Tuy nhiên, cấu trúc này cũng làm giảm độ rỗng của hạt

Như vậy, giai đoạn quyết định trong quá trình sản xuất các cấu trúc 'macroporous' là bước phân tách Quá trình tách pha có thể diễn ra trên vĩ mô hoặc vi mô là cần thiết cho sự hình thành cấu trúc macroporous trong quá

trình đồng trùng hợp, tạo ra thêm các liên kết chéo để ổn định cấu trúc hai pha

Diện tích bề mặt bên trong, đường kính lỗ rỗng và độ phân cực bề mặt là

ba thông số quan trọng để đánh giá tính chất một loại nhựa hấp phụ macroporous Diện tích bề mặt bên trong của nhựa khô thường từ 100 đến

1000 m2/g, với đường kính lỗ rỗng từ 100 đến 300 Å Độ phân cực của nhựa

có thể thay đổi tùy theo sự lựa chọn monome sử dụng trong quá trình tổng hợp hoặc bằng cách xử lý hóa học bổ sung sau quá trình trùng hợp Sự hấp phụ của nhựa macroporous phụ thuộc vào cấu trúc hình học của nó và có thể được kiểm soát bằng cách thay đổi thành phần hóa học của hỗn hợp polyme hóa trong quá trình tổng hợp

Sự phát triển nhanh chóng của nhựa hấp phụ macroporous dẫn đến việc

mở rộng khả năng sử dụng nó Các ứng dụng chủ yếu là tinh chế đường, hấp phụ khí, xử lý nước thải, tách và làm giàu các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính dược học và thanh lọc các sản phẩm sinh học khác Quá trình hấp phụ bằng nhựa macroporous đã thu hút sự chú ý ngày càng tăng do đặc tính hấp phụ và các ưu điểm khác bao gồm chi phí vận hành thấp, tiêu thụ dung môi thấp hơn,

dư lượng hóa chất không mong muốn trong sản phẩm, cùng với sự sẵn có của nhựa

1.3.2 Phân loại nhựa macroporous

Việc lựa chọn loại nhựa cho phương pháp phân lập cần dựa vào nhiều yếu

tố Thông thường, mức độ phân cực và trọng lượng phân tử của hợp chất cần phân lập được xem là cơ sở chính để lựa chọn loại nhựa Dựa trên mức độ phân cực, các nhựa macroporous có thể được chia thành hai nhóm chính: Nhóm không hoặc ít phân cực: D101, H103, H107, X-5, AB-8, các nhựa HPD như: HPD722, HPD450,

Nhóm phân cực trung bình và mạnh: ADS-17, CAD-40, NKA-II, S-8,

1.3.3 Ứng dụng của nhựa macroporous trong phân lập các hoạt chất thiên

nhiên

a Phân lập các flavonoid / polyphenol

Inga edulis là một loài cây có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ, đặc biệt

phát triển rộng rãi bởi người Amazon bản địa Lá của nó có tác dụng chống viêm Epicatechin và myricitrin là hai polyphenol chính của loài này Silva và cộng sự đã tối ưu hóa điều kiện hấp phụ cho bốn loại nhựa hấp phụ macroporous (XAD-7, XAD-16, EXA-90, EXA-118) bằng các biến khác nhau Ảnh hưởng của ba biến độc lập: Nồng độ dịch chiết nước, giá trị pH và loại nhựa đã được nghiên cứu Kết quả cho thấy: Hai biến, nồng độ dịch chiết nước và loại nhựa sử dụng, ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả hấp phụ còn giá trị

pH không có ảnh hưởng Trong các loại nhựa được thử nghiệm, XAD-7 có khả năng hấp phụ cao nhất (239 mg/g) và XAD-16 cho thấp nhất (16 mg/g) [31]

b Phân lập Glycosid

Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum) là một loại thảo dược được sử

dụng rộng rãi, có tác dụng trẻ hóa cơ thể Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, SG (2,3,5,40-tetrahydroxystilben-2-O-β-glucopyranosid), là stilben glycosid chính được phân lập từ Hà thủ ô Nó có nhiều tác dụng chữa bệnh như: Làm giảm cholesterol, giảm lão hóa bằng cách tác động như một chất chống oxy hoá và dọn gốc tự do Với mục đích phát triển một phương pháp mới và nhanh chóng dựa trên nhựa macroporous để tách SG khỏi dịch chiết

Hà thủ ô, Lv và cộng sự khảo sát hiệu suất hấp phụ của 15 nhựa macroporous (AB-8, NKA, NKA-II, NKA-9, HPD-100, HPD-500, HPD-700, HPD-800, D-

101, DM-11, DM-130), DM-301, HZ-801, Z-841 và DA-201) và phát hiện ra rằng HPD-100 là loại cho kết quả tốt nhất Việc tối ưu hóa các thông số ảnh hưởng đến sự hấp phụ như: Nồng độ mẫu, giá trị pH và tốc độ dòng chảy

được thực hiện trên cột nhựa HPD-100 Sản phẩm cuối cùng có độ tinh khiết 81,9% (w/w) và tỷ lệ thu hồi 74,7%[25]

c Phân lập Saponin

Tam thất (Panax pseudoginseng) là một loại dược liệu được trồng phổ

biến ở nhiều nước, có tác dụng điều trị rối loạn máu và thiếu máu Hai saponin steroid là 20(S)-protopanaxatriol và 20(S)-protopanaxadiol, có trong

rễ của Tam thất có khả năng chống ung thư, bảo vệ tim mạch và mạch máu não Wan và cộng sự đã xây dựng một phương pháp đơn giản để phân lập hai chất này từ dịch chiết rễ củ Tam thất Họ nghiên cứu tính chất hấp phụ của bốn nhựa macroporous (D-101, DA-201, DM-301 và DS-401) đối với hai chất nói trên và thấy rằng: DS-401 có hoạt tính hấp phụ tốt nhất Vì vậy, DS-

401 được sử dụng để tối ưu hóa quá trình hấp phụ trên cột Sau đó, cột nhựa được giải hấp phụ bằng dung dịch ethanol 30 và 80% (v/v) Sau khi phân lập, 20(S)-protopanaxatriol và 20(S)-protopanaxadiol thu được có độ tinh khiết lần lượt là 88,2% và 92,6%, hiệu suất thu hồi tương ứng là 80,2 và 82,3%[35]

d Phân lập taxol/taxoid

Thông đỏ Trung Quốc (Taxus chinensis) là một cây gỗ lớn được trồng

phổ biến ở Trung Quốc và có chứa Taxoid Fu và cộng sự nghiên cứu mức độ hấp phụ và và giải hấp phụ của 10-DAB III và 7-xylosyl-10-deacetyl paclitaxel tinh khiết đối với 7 loại nhựa macroporous (AB-8, ADS-17, ADS-

21, ADS-31, ADS-8, H1020 và NKA -II) Kết quả cho thấy: AB-8 có khả năng hấp phụ tốt nhất cho cả hai hợp chất này Điều kiện phân lập này có hiệu quả tốt trong việc phân lập và làm giàu 10-DAB III và 7-xyl-10-DAT Hàm lượng hoạt chất trong sản phẩm phân lập tăng lần lượt là 62,4 lần và 8,5 lần so với trước đó, hiệu suất thu hồi tương ứng là 85,9 và 52,8% Phương pháp làm giàu hoạt chất bằng nhựa macroporous trong nghiên cứu này có hiệu quả cao hơn phương pháp chiết lỏng-lỏng thông thường Các điều kiện tối ưu cho các quá trình hấp phụ và xử lý được đưa ra Mới đây, Sun và cộng sự đã làm giàu

bốn hợp chất 10-DAB III, 7-xyl-10-DAT, cephalomannin và paclitaxel được

chiết xuất từ lá kim của loài Taxus chinensis bằng phương pháp sắc ký cột

nhựa So sánh 7 loại nhựa macroporous trên, kết quả cho thấy: AB-8 có hiệu quả tốt nhất cho cả bốn taxoid Sản phẩm thu được có hàm lượng tăng 7,63, 3,68, 6,18 và 6,55 lần so với ban đầu Hiệu suất thu hồi của bốn thành phần lần lượt là 95,0, 77,3, 88,1 và 95,3% [32]

e Một số chuyên luận trong dược điển Trung Quốc

Trung Quốc là quốc gia có nền y dược học cổ truyền rất phát triển Phương pháp được dùng phổ biến để chế biến thuốc từ xưa đến nay là “sắc thuốc” Theo sự phát triển của nền y dược học hiện đại, phương pháp này đã

lộ ra rất nhiều nhược điểm như: sử dụng nhiệt độ cao, thời gian kéo dài, sản phẩm thu được lẫn quá nhiều tạp chất, Sự ra đời của nhựa macroporous và phương pháp phân lập, làm giàu hoạt chất bằng loại nhựa này đã tạo một cơ hội cho ngành y học cổ truyền Ở Trung Quốc, rất nhiều các nghiên cứu ứng dụng nhựa macroporous để phân lập các hoạt chất thiên nhiên đã được tiến hành và rất nhiều trong số đó đã được đưa vào sản xuất thực tế Một vài ví dụ tiêu biểu đã được quy định trong dược điển Trung Quốc 2010 như sau:

Cao lá bạch quả: Được sản xuất bằng cách nghiền nhỏ lá và chiết hồi lưu bằng ethanol Dịch chiết được lọc, cất thu hồi ethanol và cô đặc đến tỉ lệ thích hợp Một cột nhựa macroporous được sử dụng để hấp phụ dịch chiết sau khi cô đặc Cột này tiếp tục được rửa bằng nước và dung dịch ethanol trong nước Phân đoạn nước được bỏ đi, phân đoạn ethanol được thu lấy, cô đặc, sấy khô đến thể chất quy định

Cao lá sơn tra: Lá cây sơn tra được nghiền nhỏ thành bột, chiết nóng ở 55-60oC bằng ethanol 50% Mỗi mẻ chiết 2 lần, lần đầu dùng 10 lần dung môi, lần hai dùng 6 lần dung môi so với nguyên liệu Dịch chiết được lọc và cất thu hồi ethanol rồi hòa tan với nước ở tỉ lệ thích hợp Dung dịch này được

nồng độ khác nhau Phân đoạn nước rửa bằng ethanol được thu lấy, cất thu hồi ethanol và cô đặc đến tỷ trọng 1,1 g/ml rồi đem phun sấy để thu được cao khô

Saponin toàn phần từ tam thất: Được sản xuất từ củ tam thất Ban đầu, chúng được nghiền nhỏ, đun hồi lưu với ethanol 70%, lọc, thu hồi ethanol và

cô đặc bằng cất chân không Dịch chiết sau đó được cho qua một cột chứa nhựa macroprous loại không phân cực hoặc ít phân cực Cột này được rửa bằng nước và ethanol 80% Phân đoạn nước rửa bằng ethanol được thu lấy, cô đặc, loại màu, tinh chế, cô chân không đến cao mềm và mang sấy khô

Saponin triol từ tam thất: 1kg bột củ tam thất được ngâm trong ethanol 60% trong 24 giờ và ngấm kiệt với tốc độ 5-8ml/phút Quá trình ngấm kiệt dừng lại khi thể tích dịch gấp 6 lần khối lượng dược liệu Dịch chiết được cô đặc rồi hòa thêm nước, lọc để loại tạp Dịch sau lọc cho chảy qua cột chứa nhựa macroporous D101 Cột được rửa bằng nước và ethanol 40% Phân đoạn nước được bỏ đi, thu lấy phân đoạn rửa bằng ethanol 40%, lọc, cô đặc, sấy khô và nghiền thành bột mịn

Ginsenosid toàn phần từ củ nhân sâm: Củ nhân sâm được thái thành các lát mỏng và đun với nước 2 lần, lần đầu 2 giờ, lần sau 1,5 giờ Các dịch chiết được gom lại và lọc Dịch sau lọc được hấp phụ bằng một cột nhựa macroporous D101, rửa cột bằng nước đến hết màu Cột nhựa tiếp tục được rủa bằng ethanol 60%, thu lấy phân đoạn rửa bằng ethanol, lọc, cô đặc đến cao đặc có tỉ trọng 1,06-1,08 g/ml ở 80o

C; sấy khô rồi nghiền nhỏ[34]

1.4 Quá trình hấp phụ

1.4.1 Bản chất của lực hấp phụ

a Lực van der Waals trong hấp phụ vật lý

Lực van der Waals bao gồm:

Lực phân tán: Là lực tương tác giữa phân tử chất bị hấp phụ không phân cực

và phân tử của bề mặt không phân cực

Lực cảm ứng: Là lực tương tác giữa phân tử chất bị hấp phụ và phân tử bề mặt khi một là phân cực và chất còn lại không phân cực

Lực định hướng: Là lực tương tác giữa phân tử chất bị hấp phụ phân cực với phân tử của bề mặt phân cực

b Lực liên kết hóa học trong hấp phụ hóa học

Lực liên kết hóa học trong hấp phụ tạo ra hợp chất bề mặt Tuy nhiên, lớp hợp chất bề mặt này không được coi là chất mới riêng biệt hoặc một pha mới, bởi vì ngoài liên kết với phân tử bị hấp phụ, các nguyên tử của bề mặt vẫn giữ liên kết với các nguyên tử khác Liên kết mới của hợp chất bề mặt không đủ mạnh để cặt đứt liên kết giữa các nguyên tử chất hấp phụ trên bề mặt Sự cắt đứt này xảy ra khi nâng cao nhiệt độ, phản ứng tạo liên kết bề mặt chuyển thành phản ứng dị thể thông thường khi đó mới hình thành pha mới

1.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hấp phụ chất tan

a Dung môi

Trong dung dịch luôn có sự hấp phụ cạnh tranh của dung môi và chất tan lên bề mặt rắn Nếu dung môi có ái lực yếu với bề mặt chất tan sẽ dễ được hấp phụ hơn Ái lực của dung môi với bề mặt rắn được xác định dựa trên sức căng bề mặt và nhiệt thấm ướt: ái lực càng yếu khi sức căng bề mặt rắn-dung môi càng lớn, nhiệt thấm ướt bề mặt bởi dung môi càng bé

b Chất hấp phụ

Chất hấp phụ có dung lượng hấp phụ và tốc độ hấp phụ khác nhau tùy thuộc vào bản chất, nguồn gốc nguyên liệu và công nghệ sản xuất ra nó Chất hấp phụ có nhiều lỗ xốp mao quản, đường kính mao quản càng nhỏ, khả năng hấp phụ càng lớn

c Chất bị hấp phụ

Trong dung dịch chất tan có độ tan càng lớn, sự hấp phụ lên bề mặt rắn càng yếu Điều này được giải thích do lực tường tác liên kết giữa chất tan và dung môi lớn làm đứt gãy một phần các liên kết do lực hấp phụ sảy ra Các chất hữu cơ chứa mạch hydrocarbon khi tang độ dài mạch carbon của dãy đồng đẳng, độ tan trong nước giảm, sự hấp phụ trong dung dịch nước sẽ tang Như vậy, các chất tan không phân cực trong dung môi phân cực sẽ hấp phụ mạnh trên bề mặt không phân cực, ngược lại sẽ khó bị hấp phụ lên bề mặt phân cực trong dung môi không phân cực

d pH của dung dịch

pH của dung dịch ảnh hưởng đến sự hấp phụ gián tiếp qua ảnh hưởng đến độ tan và độ phân ly của chất tan Chất tan càng phân lý tốt trong nước càng hấp phụ yếu Chất tan lưỡng tính sẽ có độ hấp phụ cực đại ở điểm đẳng điện vì ở

đó độ tan thấp nhất Cần xem xét các yếu tố ảnh hưởng đến hấp phụ trong mối quan hệ cảu dung môi, chất hấp phụ và chất bị hấp phụ trong từng trường hợp

cụ thể

e Nhiệt độ

Hấp phụ vật lý thường là quá trình tỏa nhiệt, hấp phụ giảm khi nhiệt độ tăng Hấp phụ hóa học thường là quá trình thu nhiệt, hấp phụ tăng khi nhiệt độ tăng Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hấp phụ được biểu diễn bởi phương trình:

Trong đó ΔH hấp phụ có dấu (+) hoặc (-) tùy theo hấp phụ tỏa nhiệt hay thu nhiệt Sự hấp phụ trong dung dịch nước thường có ΔH nhỏ nên sự thay đổi nhỏ về nhiệt độ không ảnh hưởng nhiều đến độ hấp phụ[2]

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất

+ Củ Sắn dây được thu vào tháng 1 năm 2015 tại Tam Đảo, Vĩnh Phúc Sau

đó, củ được rửa sạch, thái lát, sấy khô ở 60o

C trong 6h Xay nhỏ đến kích thước nhỏ hơn 1mm, làm đồng nhất, bảo quản khô trong túi nilong buộc kín

+ Chất chuẩn: Puerarin 82,31% (Trung Quốc-HPLC)

+ Nhựa macroporous: Nhựa hấp phụ macroporous D101 (Trung Quốc) có

đặc tính được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Đặc tính nhựa hấp phụ macroporous D101

Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

1 Cloroform Việt Nam DĐVN IV

2 Ethanol 96% Việt Nam DĐVN IV

3 Methanol Merck (Đức) Phân tích; HPLC

4 Nước cất Việt Nam DĐVN IV

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ

 Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)

 Máy cất quay Buchi B480 (Thuỵ Sỹ)

 Cân phân tích Mettler Toledo AB204S (Thuỵ Sỹ) có độ chính xác 0,1mg

 Cân kỹ thuật Sartorius BP2001S (Đức)

 Máy quang phổ UV-VIS HITACHI U-1900 (Nhật Bản)

 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), gồm:

+ Bộ phân loại khí DGU – 14A

+ Bơm cao áp LC – 10ADVP

+ Buồng chứa cột CTO – 10AVP

+ Bộ điều khiển SCL – 10AVP

+ Detector dãy diod quang SPD – M10AVP

 Các dụng cụ khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Xác định hàm lượng isoflavonoid trong Sắn dây

- Định tính nguyên liệu bằng sắc ký lớp mỏng

- Xác định hàm lượng isoflavonoid trong nguyên liệu bằng phương pháp quang phổ UV-VIS

- Xác định hàm lượng puerarin trong nguyên liệu bằng phương pháp HPLC

2.2.2 Chiết xuất các isoflavonoid từ Sắn dây

Khảo sát sự ảnh hưởng của 3 thông số: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian, số lần chiết đến quá trình chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây

2.2.3 Khảo sát quá trình hấp phụ

Đánh giá ảnh hưởng của các thông số đến quá trình hấp phụ: Nồng độ dịch nạp, thể tích dịch nạp

2.2.4 Khảo sát quá trình giải hấp phụ

Đánh giá khả năng giải hấp phụ isoflavonoid Sắn dây từ nhựa macroporous D101 của các dung môi: nước, Ethanol 10, 20, 30, 40, 50, 60,

70, 80, 90 và 96%

Xác định thể tích dung môi cần thiết cho quá trình giải hấp phụ

2.2.5 Phân lập isoflavonoid từ Sắn dây quy mô 10kg nguyên liệu/mẻ

Tiến hành và đánh giá hiệu suất của quá trình, chất lượng sản phẩm thu được ở quy mô 10kg nguyên liệu/mẻ

2.2.6 Đánh giá khả năng tái sử dụng của nhựa macroporous D101

- Xử lý nhựa macroporous D101 sau khi sử dụng

- Đánh giá khả năng hấp phụ và giải hấp phụ ở trạng thái tĩnh sau khi xử

lý

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp định tính

Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng theo chuyên luận Sắn dây trong Dược điển Việt Nam IV [1], cụ thể:

 Điều kiện sắc ký lớp mỏng

- Bản mỏng: Silicagel 60F254, hoạt hoá ở 110 oC trong 1 giờ

- Dung môi khai triển: Cloroform-methanol-nước (7:2,5:0,25)

 Dung dịch thử:

- Mẫu thử dạng lỏng: Lấy một thể tích mẫu tương đương 1 mg isoflavonoid

toàn phần, cô cách thủy đến cắn Hoà cắn trong 1 ml ethanol

- Mẫu thử dạng rắn: Hòa tan hoặc chiết mẫu bằng ethanol 96% để được dung

dịch có nồng độ isoflavonoid khoảng 1 mg/ml

 Dung dịch đối chiếu:

- Hòa tan puerarin (82,31%) trong methanol để có nồng độ puerarin khoảng 1 mg/ml

Sau khi khai triển sắc ký, lấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ở nhiệt

độ phòng Quan sát bản mỏng dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.2 Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần

 Nguyên tắc

Định lượng bằng phương pháp quang phổ dựa trên khả năng hấp thụ ánh sáng cực đại tại bước sóng 250nm [19], [21], [42]

a Xây dựng đường chuẩn

Pha dãy dung dịch chuẩn: Cân chính xác 24,3mg Puerarin 82,31%

(tương đương 20,0mg puerarin) vào bình định mức 100ml, thêm ethanol 96%, hòa tan, thêm tiếp dung môi đến vạch, lắc đều được dung dịch A Lấy chính xác 20ml dung dịch A vào bình định mức 100ml, thêm ethanol 96% vừa đủ,

lắc đều được dung dịch B Lần lượt lấy 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0ml dung dịch B vào 5 bình định mức 50ml, thêm lần lượt vào các bình định mức 8,0, 6,0, 4,0, 2,0, 0,0ml ethanol 96%, sau đó thêm nước cất đến vừa đủ, lắc đều

Mẫu trắng: lấy 10,0ml ethanol 96% vào bình định mức 50ml, thêm nước

vừa đủ, lắc đều

Các mẫu sau khi pha được lọc qua màng lọc 0,45µm Đo độ hấp thụ tại bước sóng 250 nm Đo lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình để xây dựng đường chuẩn

b Phương pháp định lượng isoflavonoid toàn phần

 Chuẩn bị dung dịch thử

+ Mẫu thử dạng rắn: cân chính xác một lượng mẫu thử có chứa khoảng

4,0mg isoflavonoid, hòa tan hoặc chiết bằng ethanol 70%, chuyển vào bình định mức 100ml, thêm tiếp ethanol 70% để được khoảng 70ml, siêu âm 30 phút Bổ sung dung môi đến vạch, lắc đều, để lắng qua đêm, gạn lấy phần trong Lấy chính xác 5,0ml dịch vừa gạn vào bình định mức 50ml, thêm nước cất vừa đủ, lắc đều

+ Mẫu thử dạng lỏng: Lấy chính xác một thể tích mẫu thử tương đương

khoảng 4,0mg isoflavonoid vào bình định mức 100ml Thêm ethanol 70% đến vạch, lắc đều Lấy chính xác 5,00ml dịch vừa pha vào bình định mức 50ml, thêm nước cất vừa đủ, lắc đều

 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

+ Cân chính xác khoảng 24,3mg puerarin (82,31% ) vào bình định mức 100ml, hòa tan và thêm vừa đủ bằng ethanol 96%, lắc đều (dung dịch C) Lấy chính xác 10ml dung dịch C vào bình định mức 50ml, thêm ethanol 96% đến vừa đủ, lắc đều (dung dịch D) Lấy chính xác 5ml dung dịch D vào bình định mức 50ml, thêm nước cất đến vừa đủ, lắc đều

AT, AC: Độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn

CT, CC: Nồng độ isoflavonoid của dung dịch thử và dung dịch chuẩn (µg/ml)

2.3.3 Phương pháp định lượng puerarin

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) được sử dụng để định lượng puerarin trong nguyên liệu, cao dược liệu và sản phẩm tinh chế Dựa trên các thí nghiệm khảo sát ban đầu và tham khảo các tài liệu [23], [38], điều kiện sắc ký được xác định như sau:

 Điều kiện sắc ký

+ Cột sắc ký Altech C18 với kích thước cột 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5 µm

Cân chính xác 121,5mg puerarin có hàm lượng 82,31% (tương đương 100,0mg puerarin) và hòa tan trong khoảng 50ml ethanol 96% Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 ml Thêm ethanol 96% vừa đủ đến vạch được dung dịch A Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch A, pha loãng 10 lần bằng nước cất được dung dịch B

Từ dung dịch A và B pha loãng thành dãy dung dịch chuẩn có nồng độ

Mẫu thử là nguyên liệu: Cân chính xác 10 g bột nguyên liệu, thêm

khoảng 70 ml ethanol 70% trong bình định mức 100 ml, siêu âm 30 phút trong bể siêu âm Thêm tiếp dung môi đến vừa đủ, lắc đều, để lắng qua đêm ở điều kiện phòng, gạn lấy phần dịch trong Lấy chính xác 5 ml dịch trong vừa gạn pha loãng với pha động thành 25ml Lọc dung dịch qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký

Mẫu thử khác (cắn chiết, các sản phẩm phân lập, dịch chiết): Lấy

chính xác một lượng mẫu tương đương khoảng 100mg puerarin Hòa tan bằng ethanol 70% Sau đó, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 96% vừa đủ Pha loãng dung dịch này 10 lần bằng pha động và lọc qua màng 0,45µm trước khi phân tích sắc ký

 Nồng độ puerarin trong mẫu thử được tính theo công thức:

Trong đó:

St, Sc : Diện tích pic puerarin của mẫu thử và mẫu chuẩn

Ct, Cc: Nồng độ puerarin trong mẫu thử và mẫu chuẩn (µg/ml)

2.3.4 Phương pháp chiết xuất isoflavonoid từ Sắn dây

Nước là một dung môi rẻ tiền, sẵn có, không độc hại, có khả nằng chiết xuất tốt các isoflavonoid từ Sắn dây Ngoài ra, việc sử dụng dung môi nước thuận lợi cho các quá trình phân lập sau khi chiết Thí nghiệm sử dụng phương pháp chiết ngâm ở điều kiện thường Trong quá trình chiết có kết hợp khuấy trộn với tốc độ 180 vòng/phút Thay đổi lần lượt các thông số: Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, thời gian chiết, số lần chiết để lựa chọn điều kiện thích hợp cho quá trình chiết xuất

2.3.5 Phương pháp xử lý nhựa

Nhựa macroporous D101 được ngâm ethanol 96% trong 24 giờ Sau đó, ngâm trong HCl 5% rồi đến NaOH 5% trong 4 giờ, để loại bỏ tạp chất Tiếp theo, nhựa được rửa sạch đến pH trung tính bằng nước cất rồi ngâm trong nước cất[13]

2.3.6 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình hấp phụ

Hai yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng hấp phụ của isoflavonoid sắn dây lên nhựa D101 là nồng độ và thể tích dịch nạp

100g nhựa hấp phụ macroporous D101 được nạp vào cột thủy tinh (3x60cm), có thể tích cột nhựa (BV) là 200ml tương ứng với chiều cao cột nhựa 28cm Dịch chiết Sắn dây có nồng độ isoflavonoid 0,5(A); 1,0(B); 2,5(C); 5,0(D) mg/ml được cho chảy qua cột với tốc độ không đổi (4BV/giờ) Xác định nồng độ isoflavonoid trong dịch sau cột sau mỗi thể tích nhất định (1000ml đối với dịch A, 500ml đối với dịch B, 200ml đối với dịch C, 100ml đối với dịch D) bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS[13], [19]

- Tỷ lệ phần trăm isoflavonoid không đƣợc hấp phụ (%khp) và khối lƣợng isoflavonoid đƣợc hấp phụ (mhp) đƣợc xác định bằng công thức sau:

Trong đó:

+ mr , mo lần lƣợt là khối lƣợng isoflavonoid không đƣợc hấp phụ và khối lƣợng isoflavonoid trong dịch nạp ban đầu (mg)

+ mr , mo đƣợc xác định:

Trong đó:

+ Cr ,Co là nồng độ isoflavonoid trong dịch sau cột và dịch ban đầu (mg/ml) + Vr ,V0 là thể tích dịch sau cột và dịch ban đầu (ml)

- Dung lƣợng hấp phụ isoflavonoid của nhựa macroporous D101 là C(mg/g) đƣợc xác định theo công thức:

Trong đó: + C : Dung lƣợng hấp phụ (mg/g)

+ mhp : khối lƣợng isoflavonoid đƣợc hấp phụ (mg)

+ mn : khối lƣợng nhựa macroporous D101 (g)

2.3.7 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình giải hấp phụ

- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến khả năng giải hấp phụ

Qua tham khảo tài liệu[13], [19], thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: Cân 10g nhựa macroporous D101 cho vào cốc có mỏ 500ml Sau đó, thêm vào 300ml dịch chiết có nồng độ isoflavonoid khoảng 3mg/ml (C1), khuấy từ 120vòng/phút trong 3giờ ở nhiệt độ phòng Xác định nồng độ isoflavonoid