Nghiên cứu bào chế phytosome rutin

Một số phương pháp chiết xuất thường dùng như: - Chiết bằng nước sôi: phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong nước sôi và nước lạnh, có thể chiết bằng áp suất thường hoặ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI

ThS NGUYỄN VĂN KHANH

HÀ NỘI – 2017

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới:

PGS TS Nguyễn Thanh Hải ThS Nguyễn Văn Khanh

Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận Đồng thời thầy cũng luôn động viên để tôi vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình thực hiện, giúp tôi hoàn thiện được khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô bộ môn Bào chế và Công nghê dược phẩm cùng các thầy cô các bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng, Dược cổ truyền, Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong quá trình làm khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên Khoa Y Dược - ĐHQGHN, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã động viên, giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Tƣ Đạt

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Rutin 2

1.1.1 Lịch sử phát triển 2

1.1.2 Tên gọi – công thức phân tử 2

1.1.3 Tính chất chung 3

1.1.4 Định tính Rutin 3

1.1.5 Định lượng Rutin 3

1.1.6 Tác dụng của rutin 4

1.1.7 Một số nguồn dùng để chiết xuất rutin 5

1.1.8 Một số phương pháp chiết xuất rutin từ cây hoa hòe 6

1.1.9 Ứng dụng của Rutin 6

1.1.10 Một số dạng bào chế của rutin 7

1.2 Phytosome 7

1.2.1 Khái niệm 7

1.2.2 Thành phần của phytosome 7

1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome 8

1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome 8

1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome 9

1.2.6 Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước phytosome 10

1.2.7 Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid trong phytosome 11

1.2.8 Đánh giá về các thông số vật lý, hóa học và sinh học của phytosome 12

1.2.9 Sự khác nhau giữa phytosome và liposome 12

1.2.10 Một số nghiên cứu về phytosome 14

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị, đối tượng nghiên cứu 17

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 17

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.2.1 Chiết xuất, định lượng rutin từ hoa hòe 18

2.2.2 Bào chế phytosome rutin và đánh giá một số đặc tính của phytosome bào chế được 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Chiết xuất rutin từ hoa hòe 18

2.3.2 Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang 22

2.3.3 Bào chế phytosome rutin 22

2.3.4 Xác định độ tan, hệ số phân bố của rutin, phytosome rutin vừa bào chế 22

2.3.5 Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân 24

2.3.6 Phương pháp đánh giá 1 số đặc tính của phytosome 24

2.3.7 Phương pháp đánh giá khả năng tạo phức giữa dược chất và phospholipid 25

2.3.8 Nghiên cứu độ ổn định của phytosome rutin 25

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Chiết xuất rutin từ hoa hòe 26

3.1.1 Chiết xuất 26

3.1.2 Định lượng rutin trong hoa hòe 26

3.2 Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang 27

3.3 Khảo sát hệ số phân bố dầu nước và độ tan trong các môi trường của rutin 28

3.4 Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp siêu âm 29

3.5 Bào chế phytosome Rutin 30

3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 30

3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng 33

3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol rutin:phospholipid 35

3.6 Đánh giá khả năng tạo phức hợp giữa rutin và phospholipid trong phytosome 39

3.6.1 Phổ hồng ngoại (FTIR) 39

3.6.2 Phân tích nhiễu xạ tia X 40

3.6.3 Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) 40

3.7 Nghiên cứu sự ổn định của phytosome rutin 42

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Ký hiệu Nội dung

(Hydrogenated Soy Phosphatidylcholin)

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU STT Tên bảng Trang

Bảng 3.5 KTTP, PDI, thế zeta của phytosome rutin theo thời gian siêu

Bảng 3.7 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo nhiệt

Bảng 3.11 KTTP, PDI, thế zeta của hỗn dịch phytosome rutin theo tỷ lệ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, xu hướng sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên trong phòng và chữa bệnh ngày càng tăng Rutin hay còn gọi là vitamin P,là một flavonoid tự nhiên, phân bố rộng rãi trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong cây hòe, được trồng

và mọc hoang nhiều ở Việt Nam và đặc biệt hàm lượng rutin trong hoa hòe ở Việt Nam cao hơn nhiều lần so với các nước khác [11] Rutin mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe như là chất chống oxi hóa, tăng độ bền thành mạch, chống viêm, hạ huyết

áp, giảm mỡ máu… [28] Tuy nhiên, rutin lại có độ tan và sinh khả dụng của thấp Nguyên nhân của vấn đề này là do dược chất có kích thước phân tử lớn và kém tan trong nước nên khó được hấp thu vào cơ thể

Để khắc phục nhược điểm này, các nghiên cứu trên thế giới gần đây đã thực hiện theo nhiều hướng khác nhau như tạo phức hợp với cylcodextrin, phức hợp với phospholipid, nano polyme Một trong những dạng bào chế được quan tâm gần đây là bào chế phytomsome Phytosome rutin là phức hợp giữa rutin và phospholipid có ưu điểm làm tăng sinh khả dụng đường uống và tăng tính thấm của dược chất qua da Ở nước ta chưa có công trình nào nghiên cứu về phytosome rutin

Do vậy nhằm góp phần vào nên công nghệ dược phẩm nước ta, nâng cao hiệu quả điều trị các dược chất có nguồn gốc dược liệu thì việc bào chế phytosome có ý nghĩa hết sức quan trọng, hứa hẹn là tiềm năng trong việc điều trị một số bệnh qua

da như thấp khớp, viêm khớp, đau nhức

Để góp phần bước đầu ứng dụng công nghệ phytosome cho các dược chất ít

tan có nguồn gốc dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu bào chế

phytosome rutin” với hai mục tiêu chính:

1 Bào chế được phytosome rutin bằng phương pháp bốc hơi dung môi

2 Đánh giá một số đắc tính của phức hợp phytosome rutin bào chế được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về Rutin

1.1.1 Lịch sử phát triển

Năm 1842, lần đầu tiền rutin được phân lập từ lá cây cửu lý hương – Ruta Graveolens L bởi dược sĩ người Đức – Weyb Nhưng phải 100 năm sau, rutin mới bắt đầu được sử dụng nhiều trong y học [2]

Hlasiwetz và nhiều người khác đã bắt đầu nghiên cứu về cấu trúc của rutin

đường gắn vào vị trí số 3 của quercetin Charaux là người đầu tiên phân lập được phân đường của rutin là 1 disaccharid và gọi nó là rutinose Sau đó, Zemplés và Gerecs đã thủy phân rutin lấy từ hạt Rhammus Utilis bằng enzym và thu được rutin [3]

1.1.2 Tên gọi – công thức phân tử

Rutin là 1 loại vitamin P Chữ P là chữ đầu của chữ perméabilité, tiếng Pháp

có nghĩa là tính thấm

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Rutin

- Trọng lượng phân tử 610,51 DvC, trong đó phần trăm về khối lượng của C,

O, H lần lượt là 53,11%, 41,94%, 4,95%

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-methyloxan-2-yl]oxy}methyl)oxan-2-yl]oxy}-4H-chromen-4-on

{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-({[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6-Hoặc: D-glucopyranosyloxy]-4H-chromen-4-one

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β Tên gọi khác: Quercetin2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β 32-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β rutosid, Eldrin, Oxerutin, Quercetin2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β 32-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β rhamnoglucosid, Rutosise, Sclerutin, Sophorin

(1/200), khó tan trong cồn (1/650), tan trong cồn sôi (1/60) [34]

- Tính tan

+ Tan trong pyridin, formamid

+ Ít tan trong acetol, etyl acetat

+ Không tan trong cloruafom, eter, benzen [4]

- Do cấu trúc là 1 glycosid nên rutin dễ bị thủy phân bởi các men có sẵn trong dược liệu hoặc các acid Với dung dịch kiềm thì nó ít bị ảnh hưởng, chỉ ở điều kiện dung dịch kiềm đặc và có nhiệt độ cao thì cấu trúc của rutin mới bị phá vỡ, cụ thể là rutin sẽ mở vòng C tạo thành 1 dẫn chất acid thơm và 1 dẫn chất phenol [10]

- Phương pháp đo iod

- Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [2]

1.1.6 Tác dụng của rutin

Rutin có nhiều đặc tính dược lý (ví dụ như hoạt động chống oxy hóa) đã được khai thác trong y học của con người và dinh dưỡng Thông thường, nó được sử dụng như một kháng sinh, kháng nấm, và chất chống dị ứng Tuy nhiên, nghiên cứu hiện nay đã cho thấy tác dụng dược lý của nó trong điều trị các bệnh mãn tính khác nhau, chẳng hạn như ung thư, tiểu đường, cao huyết áp và tăng cholesterol [27]

Rutin ức chế kết tập tiểu cầu, cũng như giảm tính thấm mao mạch, tăng độ bền thành mạch làm loãng máu và cải thiện lưu thông máu, có tác dụng làm giảm tính thẩm thấu của mao mạch do chúng có khả năng làm co mạch cũng như có sự ảnh hưởng của rutin đối với chuyển hóa Adrenalin Rutin phục hồi sự đàn hồi của mao mạch bị tổn thương, tăng sức đề kháng, duy trì tình trạng bình thường của mao mạch, đảm bảo mao mạch giữ được chức năng trao đổi chất Rutin có thể cải thiện chức năng nội mô bằng cách gia tăng sản xuất oxit nitric trong các tế bào nội mô của con người Oxit nitric có vai trò làm giãn nở các mạch máu, nó giúp kiểm soát

sự lưu thông máu đến các bộ phận của cơ thể

Các nghiên cứu gần đây cho thấy rutin có thể giúp ngăn ngừa cục máu đông, do

đó có thể được sử dụng để điều trị bệnh nhân có nguy cơ bị các cơn đau tim và đột quỵ [27]

Rutin có thể sử dụng như là một tác nhân tiềm năng để kiểm soát đường huyết thông qua tăng cường hoạt tính của thụ kinase phụ thuộc insulin, do đó tăng khả năng kết hợp giữa đường và insulin và do đó gây tăng vận chuyển đường và tăng sự hấp thu glucose

Rutin có tác dụng trong hoạt động trị đái tháo đường, bằng cách ức chế viêm cytokin matory và cải thiện các cấu chống oxy hóa và lipid huyết tương ở chế độ ăn uống nhiều chất béo kết hợp với streptozotocin gây ra đái tháo đường type 2 Do đó Rutin có thể sử dụng hữu ích khi phối hợp cùng với các thuốc chữa đái tháo đường chuẩn Ngoài ra, rutin cũng có tác dụng điều trị biến chứng đục thủy tinh thể trong đái tháo đường [27]

Rutin có thể dùng để điều trị các bệnh viêm thông qua sự ức chế của protein HMGB1, được tiết ra bởi các tế bào miễn dịch, có tác dụng như 1 cytokin trung gian làm giảm viêm Hoạt tính kháng viêm của rutin có thể là do tác dụng của nó

trong những biểu hiện phức tạp ASC (là các protein dạng hạt giống apoptosis) làm trung gian viêm

Rutin gây hiệu ứng chống viêm trong tia cực tím da chuột B-chiếu xạ bằng cách

ức chế sự biểu hiện của cyclooxygenase-2 và cảm ứng nitric oxit synthase Dạng muối natri của rutin có tác dụng làm giảm nhẹ phù nề của tĩnh mạch khi bị viêm [27]

Rutin bảo vệ, chống lại những ảnh hưởng suy thoái thần kinh tích lũy prion bằng cách tăng sản xuất các yếu tố neurotropic và ức chế apoptosis kích hoạt con đường trong các tế bào thần kinh Rutin có thể có những lợi ích lâm sàng cho bệnh prion

và các rối loạn thoái hóa thần kinh khác Oxit nitric có thể có khả năng được tham gia trong các tác dụng bảo vệ thần kinh của rutin chống thâm hụt đầu chấn thương gây ra nhận thức, viêm thần kinh, và apoptosis Rutin là một tác nhân đầy hứa hẹn cho việc điều trị bệnh Alzheimer vì có hoạt tính chống oxy hóa, chống viêm, và các hoạt động oligomer-giảm β-amyloid Rutin có nhiều tiềm năng điều trị cho thiếu hụt nhận thức gắn với điều kiện liên quan đến hypoperfusion não mãn tính, chẳng hạn như chứng mất trí mạch máu và bệnh Alzheimer

Rutin có thể bảo vệ chống lại suy giảm trí nhớ không gian gây ra bởi trimethyltin Synaptophysin và hệ dopaminergic có thể liên quan đến tổn thương thần kinh trimethyltin gây ra trong vùng hippocampus [27]

1.1.7 Một số nguồn dùng để chiết xuất rutin

trong đó có 70 loài thuộc 28 họ có chứ rutin ở dạng vết [13]

- Trong cây, rutin chủ yếu phân bố ở hoa (cây hòe, cây tam giác mạch), lá (cây bạch đằng, cây tam giác mạch)

- Tuy có nhiều loài thực vật chứa rutin nhưng rutin chỉ được tách chiết từ

những cây nguyên liệu có hàm lượng rutin cao như Ruta graveolens L có khoảng 2%, Fagopyrum esculentum Moench có khooảng 4%, Fagopyrum tataricum L có khoảng 6%, Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell có khoảng 8%, Sophora japónica

L có khoảng 18%

- Các vùng nguyên liệu chính để sản xuất rutin trên thế giới là: Sophora

japónica L., Eucalyptus macrorrhyncha F.Muell, Fagopyrum tataricum L và Fagopyrum esculentum Moench [9]

một số dược liệu khác như tam giác mạch (2-3%), bạch đàn (10%) thì hàm lượng

rutin chứa trong hoa hòe là rất nhiều [12] Mặt khác, cây hoa hòe mọc hoang khắp nơi và được trồng nhiều ở Nam Định, Thái Bình, Hà Nam, Ninh Bình, Nghệ An Vì vậy, nguồn chiết xuất rutin của nước ta chủ yếu là hoa hòe

1.1.8 Một số phương pháp chiết xuất rutin từ cây hoa hòe

Phương pháp chiết xuất rutin chủ yếu dựa trên tính tan khác nhau của rutin trong các dung môi khác nhau Một số phương pháp chiết xuất thường dùng như:

- Chiết bằng nước sôi: phương pháp này dựa vào độ tan khác nhau của rutin trong nước sôi và nước lạnh, có thể chiết bằng áp suất thường hoặc áp suất cao Dùng nước sôi để chiết rutin trong hoa hòe, dịch chiết để nguội sẽ có tủa rutin, lọc lấy tủa thu được rutin

- Chiết bằng kiềm loãng: dựa vào cấu trúc nhóm chức –OH phenol tự do ở vị trí thứ 3’, 4’ tạo muối dễ tan trong môi trường kiềm Dùng nước kiềm để chiết rutin, sau đó acid hóa lại dịch chiết để rutin kết tủa, lọc lấy tủa thu được rutin

- Chiết bằng cồn: phương pháp này dựa trên độ tan khác nhau của rutin vào cồn sôi và cồn lạnh Dùng cồn sôi để chiết rutin, dịch chiết đem cô đặc sau đó để nguội rutin sẽ kết tủa, lọc lấy tủa thu rutin [5]

xạ, làm cho vết thương chóng lành sẹo [12]

- Trong khoa mắt, rutin có thể được dùng cho các trường hợp viêm võng mạc

có xuất hiện xuất huyết, chảy máu ở đáy mắt [10]

- Rutin có thể sử dụng đơn độc hoặc kết hợp với các thuốc khác để nâng cao điều trị như:

- Vitamin C: làm tăng cường tác dụng của vitamin C đặc biệt là khả năng hấp thụ thuốc vào các cơ quan khác nhau Thường được dùng trong biểu hiện tổn thương mao mạch, xuất huyết dưới da, cao huyết áp

- Vincamin: dùng để chữa các chứng rối loạn tâm thần, cải thiện trí nhớ, chức năng thần kinh giác quan ở người già

- Nicotinamid: dùng trong các biểu hiện chức năng hay tổn thương thực thể của suy tĩnh-bạch mạch, giãn tĩnh mạch nguyên phát hay các cơn đau trĩ

- Ngoài ra còn có thể phối hợp với cholin, khellin, papaverin

1.1.10 Một số dạng bào chế của rutin

Rutin được bào chế dưới dạng viên hay dạng hòa tan trong nước dùng uống, ở dạng đơn độc hay phối hợp với nhiều dược chất khác nhau

- Dạng viên: viên bao phim: Rutin Mevon 500, Ido rutin, Vinca rutin (phối hơp vincamin và rutin), viên bao đường: Rutin C (phối hợp Rutin và vitamin C)

- Dạng hòa tan trong nước: rutin thường được chuyển thành dạng muối hoặc chất dẫn dễ tan trong nước như morpholylethylrutosid, rutosid, natripropylsulionat [12]

1.2 Phytosome

1.2.1 Khái niệm

Phytosome là phức hợp của cao chiết hoặc dược chất dược liệu chuẩn hóa gắn với phospholipid ở mức độ phân tử, nó có cấu trúc tương tự màng tế bào sinh học, tương hợp sinh học cao và được vận chuyển vào nội bào một cách dễ dàng [28,33] Thuật ngữ "Phyto" nghĩa là “thực vật” trong khi “some” có nghĩa là “giống như tế bào”, thường được gọi là herbosome trong nhiều tài liệu khác Thế hệ phytosome đầu tiên được ra đời bằng việc kết hợp giữa hợp chất polyphenol với phospholipid trong dung môi không phân cực [21]

Hình 1.2: Cấu tạo của phytosome

1.2.2 Thành phần của phytosome

Phytosome là phức hợp được tổng hợp bởi một phân tử phospholipid tự nhiên hay tổng hợp (phosphatidylcholin, phosphatidylethanolamin hay phosphatidyiserin) phản ứng với một hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết từ dược liệu [16] Cấu tạo của phytosome gồm 2 thành phần: hoạt chất dược liệu ít tan trong nước và phospholipid Trong phức hợp, các nhóm phân cực của dược chất tương tác với nhóm phosphat của phospholipid thông qua liên kết hydro, hình thành sự sắp xếp không gian đặc trưng có thể được chứng minh bằng các loại phổ [18]

- Phospholipid là các phân tử lipid nhỏ cấu tạo bởi một glycerol trong đó, hai gốc rượu gắn với hai acid béo, gốc còn lại gắn với nhóm phosphat [16]

bộ phận cấu tạo của màng và có sự hình thành các liên kết hydro giữa hydroxyl phenol của hoạt chất và nhóm phosphat trên nhánh phospholipid cho từng phân tử hoạt chất

1.2.3 Phân loại, vai trò phospholipid trong phytosome

Phospholipid gồm 3 loại:

- Phospholipid tự nhiên: Hay dùng nhất là phosphatidylcholin (PC) từ lecithin của trứng hoặc đậu tương, ngoài ra còn có phosphatidylethanolamin (PE), phosphatidylserin (PS), phosphatidylglycerol (PG),…

- Phospholipid tổng hợp: Phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC), disteroyl phosphatidylcholin (DSPC), dioleyl phosphatidylcholin (DOPC), dioleyl phosphatidylethanolamin (DOPE),…

sphingosin,…)

Phospholipid được sử dụng chủ yếu là từ đậu nành và trứng, đặc biệt là phosphatidylcholin là một phospholipid chính trong màng tế bào

- Do phospholipid là hợp chất hai chức có chứa một nửa phosphatidyl ưa dầu

và một nửa cholin ưa nước nên có khả năng cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất tự nhiên Phần nửa ưa nước (nhóm cholin) gắn với hợp chất tự nhiên, trong khi nửa phần phosphatidyl tan trong lipid dạng đuôi và bao bọc các thành phần liên kết cholin [11]

- Ngoài vai trò là một chất mang thuốc, phosphatidylcholin là thành phần quan trọng của màng tế bào, là phân tử gốc để xây dựng nên các lipoprotein và màng tế bào, ngoài ra nó cũng là nguồn cung cấp cholin thiết yếu cho các tế bào trong cơ thể

dịch tiêu hóa, bằng cách đó phytosome dễ dàng được vận chuyển vào màng, mô, thành tế bào trong cơ thể [20,31,32]

1.2.4 Ưu nhược điểm phytosome

 Ƣu điểm

- Phytosome dễ tan trong dung môi dầu và nước nên tăng khả năng hấp thụ dược chất, gia tăng sinh khả dụng, dẫn đến giảm liều dùng và tăng được hiệu quả điều trị

- Phospholipid vừa là chất mang, vừa có tác dụng bảo vệ gan Cholin có trong phospholipid giúp bổ sung cholin cho gan, bảo vệ gan khỏi nhiễm mỡ

- Do phytosome cải thiện được độ tan của dược chất trong muối mật nên tăng tác dụng của thuốc tại gan

- Giữa các phân tử phosphatidylcholin và các hoạt chất có hình thành các liên kết hóa học nên dạng bào chế phytosome có ổn định cao

- Hướng hoạt chất đên mô đích hiệu quả hơn và tăng vận chuyển nội bào

mỹ phẩm Đặc biệt, do phytosome có đặc tính thân dầu nên hoạt chất dễ vượt qua lớp màng sinh học giàu lipid

gian tác dụng của hoạt chất trong cơ thể, tăng tác dụng sinh học của hợp chất [12,28,33]

 Nhƣợc điểm

- Hầu hết các phương pháp bào chế phytosome đều sử dụng các dung môi hữu

cơ độc hại như: diclomethan, methanol… để hòa tan lipid gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường

- Bào chế phytosome bằng phương pháp siêu tới hạn có thể khắc phục được nhược điểm này, nhưng đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và yêu cầu áp suất cao 3000-4500 psi [23]

1.2.5 Một số phương pháp bào chế phytosome

Các phương pháp bào chế phytosome là:

Phương pháp bào chế phytosome bằng phương pháp bốc hơi dung môi được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu bào chế phytosome vì tính tiện lợi, dễ thực hiện, không yêu cầu công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến và nâng cấp quy mô

Phospholipid, dược chất và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ thích hợp Yêu cầu của hỗn hợp dung môi là phải có khả năng hòa tan tốt dược chất, tá dược và dễ bay hơi Sau đó, dung dịch này được đưa vào cốc có

mỏ hoặc bình đáy tròn của máy cất quay; tiến hành khuấy trộn, cách thủy hồi lưu

trong một khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp để hình thành liên kết trong phức hợp Kết thúc quá trình này, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách bốc hơi, và thu được lớp màng phytosome Từ lớp màng phytosome này, có thể hydrat hóa trực tiếp trong bình cất quay tương tự như phương pháp Bangham tạo hỗn dịch phytosome thô hoặc cũng có thể lấy phức hợp phytosome ra dưới dạng bột khô và tiến hành hydrat hóa ngoài bình cất quay

1.2.6 Phương pháp làm giảm và đồng nhất kích thước phytosome

Mục đích của quá trình này là tạo ra phytosome có kích thước nhỏ và phân bố kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức và

độ tan cho dược chất Những tiểu phân có kích thước càng nhỏ sẽ có diện tích bề mặt tiếp xúc càng lớn; từ đó, khả năng giải phóng dược chất nhanh hơn cũng như độ

ổn định cao hơn so với những tiểu phân kích thước lớn hơn

Phytosome được làm giảm KTTP bởi các tác dụng của lực cắt Các phương pháp được sử dụng để làm giảm và đồng nhất kích thước là siêu âm, đùn ép qua màng, đồng nhất hóa áp suất cao…

thước tiểu phân phytosome Nguyên tắc là sử dụng sóng siêu âm để làm giảm và đồng nhất kích thước tiểu phân Quá trình siêu âm phụ thuộc nhiều yếu tố ảnh hưởng như: cường độ, tần số siêu âm, thời gian, thể tích mẫu, kiểm soát nhiệt độ trong quá trình siêu âm Trong đó, cường độ và tần số là hai thông số rất quan trọng của siêu âm [36] Nhược điểm của phương pháp này là làm tăng nhiệt cục bộ, từ đó tăng quá trình thủy phân và oxy hóa phospholipid cũng như ảnh hưởng đến dược chất không bền với nhiệt Siêu âm que giải phóng kim loại ở đầu que siêu âm (titan) vào sản phẩm, nên cũng có ảnh hưởng đến độ ổn định của phytosome bào chế [24,25,26]

khí trơ, nén hỗn dịch qua một khe hẹp có kích thước xác định trong thiết bị đồng nhất hóa Nén tuần hoàn nhiều vòng cho đến khi thu được kích thước mong muốn

Ưu điểm của phương pháp này là dễ nâng cấp quy mô, kích thước thu được khá đồng nhất [7]

có kích thước lỗ màng xác định, thu được hỗn dịch có kích thước tiểu phân gần với kích thước của lỗ màng Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch phức hợp được đùn qua màng có các lỗ màng hình trụ, xếp đồng trục và kích thước xác định, ở áp suất vừa phải và với số lần thích hợp Các tiểu phân có kích thước

lớn hơn lỗ màng sẽ đi qua màng, các tiểu phân nhỏ thì hầu như không thay đổi kích thước khi qua màng, do đó hỗn dịch sau đùn ép có kích thước đồng nhất Ưu điểm của phương pháp này là có tính lặp lại cao giữa các lô mẻ

1.2.7 Một số phương pháp đánh giá tương tác giữa dược chất và phospholipid

trong phytosome

Để xác định cấu trúc của phytosome cũng như đánh giá tương tác phân tử giữa dược chất – phospholipid, tiến hành quét một số phổ như phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR, C-NMR, P-NMR), phổ hồng ngoại chuyển đổi (FTIR), phân tích nhiệt quét vi sai (DSC), phổ nhiễu xạ tia X (XRD)

Nguyên tắc: trong phân tử, các nguyên tử ở mỗi liên kết sẽ dao động với một tần

số đặc trưng nằm trong vùng hồng ngoại Khi bị chiếu một chùm tia, liên kết đó sẽ hấp thụ bức xạ có bước sóng đúng bằng dao động giữa các nguyên tử của liên kết [14] Các nhóm có cấu tạo khác nhau sẽ dao động ở những số sóng khác nhau và đặc trưng cho nhóm đó

Mục đích: Sau khi quét phổ và giải được phổ IR của phytosome, phân tích sự thay đổi số sóng của các nhóm chức đặc trưng trên phổ đồ để chỉ ra các liên kết mới hình thành và các nhóm cũ mất đi, từ đó có thể chứng minh liên kết tạo phức giữa phospholipid và dược chất

Phân tích nhiệt vi sai là phương pháp đánh giá nhanh và tin cậy để sàng lọc sự tương hợp hoạt chất và tá dược và cung cấp các thông tin tối đa về sự tương tác giữa các chất Với các dữ liệu về dòng nhiệt thay đổi theo nhiệt độ, trên phổ DSC có thể thu được các pic tương ứng với điểm thu nhiệt-nóng chảy hoặc toả nhiệt - kết tinh

Nguyên tắc: mẫu chuẩn và mẫu thử được đặt trong buồng kín và gia nhiệt để chúng có cùng nhiệt độ Sự chênh lệch nhiệt lượng cần thiết để duy trì nhiệt độ của

2 mẫu bằng nhau cho biết thông tin về quá trình nhiệt của mẫu thử xảy ra trong thời gian quét Nhiệt lượng chênh lệch này được xác định như một hàm của sự chênh lệch nhiệt độ tức thời giữa 2 mẫu Khi dược chất và tá dược có tương tác với nhau

sẽ làm các quá trình nhiệt bị thay đổi, điều đó được thể hiện bằng những thay đổi trên đồ thị DSC [22]

Mục đích: Từ những phân tích về sự thay đổi trên đồ thị DSC có thể chứng minh được sau khi tạo thành phức hợp, có sự thay đổi về nhiệt chuyển pha của

phytosome, về mức độ tinh thể của dược chất cũng như trạng thái tồn tại của phức hợp

 Phương pháp bột nhiễu xạ tia X

Nguyên tắc: Khi chiếu tia X vào vật liệu tinh thể, các nguyên tử sẽ hấp thụ và tái bức xạ tia X (tán xạ) Các sóng tán xạ này giao thoa tăng cường với nhau tạo ra hiện tượng nhiễu xạ tia X Sự nhiễu xạ tia X xảy ra khi góc tới mặt phẳng tinh thể θ ứng với cực đại giao thoa, do cường độ nhiễu xạ là rất nhỏ nếu không phải cực đại Trong phương pháp bột nhiễu xạ tia X, mẫu ở dạng bột nhằm mục đích trong mẫu

có nhiều tinh thể, có định hướng ngẫu nhiên để phần lớn hạt có định hướng thỏa mãn điều kiện nhiễu xạ Vulf – Bragg Góc giữa phương chiếu tia X với mặt phẳng

là θ, với tia nhiễu xạ là 2θ, do đó giản đồ nhiễu xạ tạo nên theo hình học này gọi là giản đồ quét θ-2θ Nguồn tia X được giữ cố định, mẫu quay với tốc độ θ và detector quay quanh với tốc độ 2θ Cường độ nhiễu xạ theo 2θ được ghi lại thành giản đồ nhiễu xạ tia X [37]

Mục đích: Phổ nhiễu xạ tia X được sử dụng để phân tích sự thay đổi về cấu trúc tinh thể của phytosome khi so sánh với giản đồ tia X của dược chất ban đầu Đối với giản đồ tia X của một chất ở dạng tinh thể có nhiều pic hẹp, còn với dạng vô định hình có pic rộng

1.2.8 Đánh giá về các thông số vật lý, hóa học và sinh học của phytosome

tử truyền qua (TEM) và bằng cách quét qua kính hiển vi điện tử quét (SEM)

- Kích thước hạt và phân bố kích thước có thể được xác định bởi sự tán xạ ánh sáng động học (DLS) sử dụng một hệ thống kiểm tra máy vi tính và photon quang

phổ tương quan (PCS)

loại bỏ dược chất tự do tự lắng xuống, định lượng phần dược chất còn lại trong dung dịch

bằng cách sử dụng phân tích quét nhiệt vi sai (DSC)

nhiều mô hình Các mô hình in vitro và in vivo đánh giá được lựa chọn trên cơ sở

các hoạt động điều trị dự kiến của phytoconstituents có hoạt tính sinh học hiện diện trong phytosome

1.2.9 Sự khác nhau giữa phytosome và liposome

Sự khác biệt cơ bản giữa liposome và phytosome là với liposome, hình thành do nhiều phân tử phospholipid có thể mang được các phân tử dược chất mà không có liên kết, các phân tử phospholipid bao quanh nhân nước chứa hoạt chất tan trong nước, trong khi ở phytosome lại tạo thành một phức hợp giữa hoạt chất và phospholipid Ở trong liposome hoạt chất được nằm trong khoang nước hoặc xen phủ trong lớp lipid, không tạo thành phân tử với dược chất Một liposome được hình thành bằng cách trộn một chất tan trong nước hoặc đệm với phosphatidylcholin Các phân tử phospholipid sẽ gắn kết lại và bao quanh các phân

tử dược chất Từ đó dược chất sẽ thấm qua lớp thượng bì ở da và bị giữ lại Vì thế liposome được dùng để cung cấp dược chất cho da Ngược lại, phytosome được hình thành bằng cách trộn một dược chất và phospholipid vơi các dung môi có điện dung thấp như aceton, dioxan Với kỹ thuật phytosome thì phospholipid phản ứng với các phytoconstituent theo tỷ lệ 1:1 hoặc 2:1 phụ thuộc vào từng chất Sự khác biệt này làm cho phytosome được hấp thu tốt hơn và sinh khả dụng cao hơn nhiều

so với liposome Đặc biệt, phytosome là sản phẩm vượt trội so với các liposome trong các sản phẩm chăm sóc da [22]

Bảng 1.1 Sự khác nhau cơ bản giữa phytosome và liposome

Phytosome Liposome Tài liệu

tham khảo

Liên kết Có sự liên kết giữa các phân

tử dược chất và phospholipid

Nó là một tổng hợp của nhiều phospholipid Các phân tử bao quanh các dược chất mà không có liên kết với họ

phụ thuộc vào từng chất

Trong liposome, hàng trăm và hàng ngàn phân

tử phosphatidylcholin bao quanh phân tử tan trong nước

[35]

Hình 1.3: Sự khác nhau giữa phytosome và liposome

1.2.10 Một số nghiên cứu về phytosome

 Nghiên cứu về phytosome rutin

Năm 2014, Malay K Das và cộng sự đã tiến hành nghiên bào chế phytosome rutin bằng phương pháp bốc hơi dung môi Nghiên cứu đã sử dụng rutin và phospholipid theo nhiều tỷ lệ mol khác nhau, trong dung môi là methanol và diclomethan Phytosome rutin bào chế được sau đó sẽ đem đi đánh giá các thông số hóa lý bằng các phương pháp khác nhau như: độ tan, kích thước hạt, quét nhiệt vi sai (DSC), nhiễu xạ tia X (XRPD), kính hiển vi điện tử quét (SEM), phổ hồng ngoại (FT-IR), kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kết quả chụp TEM chỉ ra các phytosome có cấu trúc túi rời rạc, hình ảnh phổ hồng ngoại, biểu đồ nhiệt đã chứng minh sự hình thành phức hợp phyto-phospholipid, phổ nhiễu xạ tia X cho thấy rutin khi tạo phức với phopsholipid đã chuyển từ trạng thái kết tinh sang dạng vô định hình Nghiên cứu chỉ ra rằng, tỷ lệ mol rutin: phospholipid là 1:1 có độ tan, kích thước phân tử tốt hơn các tỷ lệ khác Nghiên cứu đã so sánh khả năng thấm thuốc qua da giữa rutin và phức hợp phytosome (tỷ lệ mol rutin:phospholipid là 1:1) Kết quả cho thấy sau 20 giờ, rutin nguyên liệu chỉ hấp thu được 13± 0,87% trong khi của phytosome hấp thu được 33

nghiên cứu này là phosphatidylcholin (PC) và cholesterol (CH) Phytosome sau khi bào chế được làm giảm kích thước tiểu phân bằng phương pháp siêu âm Kết quả cho thấy phytosome bào chế với tỷ lệ mol quercetin:PC:CH là 1:2:0,2 cho kích thước tiểu phân nhỏ (80 nm) và hiệu suất phytosome hóa cao (98 %) Sự kết hợp hai phospholipid CH và PC đã cải thiện một cách đáng kể độ ổn định vật lý của phytosome trong thời gian 3 tuần Từ biểu đồ DSC cho thấy pic hấp thụ nhiệt của phytosome giảm, góp phần kết luận có tương tác giữa dược chất và phospholipid, đồng thời cải thiện độ tan cũng như tăng sinh khả dụng [37]

Năm 2016, Đào Hoàng Bá Tùng đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp bốc hơi dung môi Phospholipid là lecthin và HSPC Quy trình và công thức bào chế được lựa chọn như sau: thời gian phối hợp dược

vòng/phút, tỷ lệ mol quercetin:phospholipid là 1:1 Với quy trình trên, nguyên liệu HSPC sản phẩm thu được phytosome thu được có KTTP: 357,1 ± 2,7 nm; PDI: 0,303 ± 0,006, hiệu suất phytosome hóa 41,01 %, cải thiện độ tan 11-12 lần so với dược chất ban đầu, khả năng giải phóng quercetin nhanh hơn so với bột nguyên liệu

NMR, XRD và DSC để chỉ ra tương tác giữa phospholipid và dược chất [15]

H-Năm 2016, Vũ Thị Thu Hà tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome quercetin bằng phương pháp kết tủa trong dung môi Nguyên liệu phospholipid được lựa chọn

là HSPC, tỷ lệ lựa chọn là 1:1 Nghiên cứu đã khảo sát và lựa chọn được các yếu tố thuộc về quy trình như sau: trong giai đoạn hình thành phức hợp tốc độ khấy từ là

400 vòng/phút, nhiệt độ là 80°C, thời gian khuấy từ 16 giờ; tốc độ nhỏ dung dịch hexan là 5ml/phút; tốc độ khuấy từ giai đoạn kết tủa là 100 vòng/phút Các phương pháp FTIR, XRD và DSC được sử dụng để chứng minh sự tương tác giữa dược chất

n-và phospholipid Kết quả cho thấy được phytosome quecertin vừa bào chế được có kích thước tiểu phân 203,5 nm; PDI là 0,239; giá trị tuyệt đối thế zeta >30; hiệu suất phytosome hóa 79,92% [6]

- Phytosome naringenin

Vào năm 2010, Ajay Semalty và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome naringenin với dung môi là diclomethan với tỷ lệ là 1:1 phospholipid

là phosphatidylcholin Phức hợp tạo thành đem đi đánh giá 1 số đặc tính vật lý

khác nhau qua phổ nhiễu xạ tia X, DSC, SEM, độ tan và so sánh với 1 số thuốc in

vitro được phát hành Kết quả là có tương tác giữa dược chất và phospholipid

Hiệu suất phytosome hóa cao 91,7% Độ tan trong nước của naringenin được cải thiện từ 43,83 đến 79,31 μg/mL Sau 10h naringenin ở dạng tự do chỉ giải phóng đươc 27% trong khi ở phức hợp Naringenin đã giải phóng tới 99,80% Từ kết quả nghiên cứu có thể kết luận rằng phức hợp phospholipid của naringenin có SKD rất cao, có thể thay thế naringenin [36]

- Phytosome curcumin

Tại Việt Nam, năm 2015, Phạm Thị Minh Huệ và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu bào chế phytosome curcumin bằng phương pháp bốc hơi dung môi, với dung môi hòa tan là ethanol, phospholipid là phosphatidylcholin đậu nành được hydrogen hóa (HSPC) Phức hợp curcumin-phospholipid sau bào chế được đánh giá một số đặc tính vật lý như kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu phân, thế zeta, độ tan Kết quả nghiên cứu cho thấy dạng bào chế phytosome làm tăng độ tan của curcumin trong cả pha nước và pha dầu, đây là một đặc điểm nổi bật của phytosome nhằm tăng SKD của dược chất đặc biệt là những dược chất được chiết xuất từ dược liệu Kích thước phytosome dưới 500 nm cũng là một trong các lợi thế về SKD khi dùng qua đường uống và ngoài da Bằng phương pháp DSC, bước đầu nghiên cứu

đã chứng minh có phản ứng liên kết hoá học giữa curcumin và HSPC [8]

1 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị, đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất

Hoa hoè được thu hái ở tỉnh Thái Bình

Bảng 2.1: Hóa chất nghiên cứu STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Máy đo quang UV-2600 Shimadzu (Nhật Bản)

- Hệ thống thiết bị phân tích kích thước thế zeta Horiba SZ100 (Nhật Bản)

- Máy ly tâm EBA 21 (Đức)

- Hệ thống cất quay Rovapor R- 210, Buchi (Đức)

- Tủ sấy Binder (Đức)

- Cân phân tích AY 129, Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR-600 (Mỹ)

- Máy đo phổ nhiễu xạ tia X D8 Advance, Brucker (Đức)

- Máy phân tích nhiệt quét vi sai Mettle Toledo AB 204S (Thụy Sĩ)

- Cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, ống nghiệm, bình định mức

- Phễu Buchner, bình chiết soxhlet, đĩa petri

- Pipet, pipet bầu, micro pipet

- Giấy lọc, sinh hàn, giá đỡ, bình định mức, bể điều nhiệt

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Phytosome Rutin

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Chiết xuất, định lượng rutin từ hoa hòe

- Định lượng rutin trong hoa hòe bằng phương pháp đo quang

- Chiết xuất rutin từ hoa hòe bằng phương pháp chiết với cồn nóng

- Xác định hàm lượng rutin, quecetin trong sản phẩm thu được bằng phương pháp đo quang

2.2.2 Bào chế phytosome rutin và đánh giá một số đặc tính của phytosome bào chế được

- Xây dựng phương pháp định lượng rutin bằng phương pháp đo quang phổ

hấp thu UV-VIS

- Khảo sát độ tan của rutin trong các môi trường và hệ số phân bố của rutin

- Xây dựng phương pháp làm giảm KTTP phức hợp phytosome

- Đánh khá một số đặc tính của phytosome: hình thức, độ tan trong các môi trường, hệ số phân bố, KTTP, phân bố KTTP, thế zeta, hiệu suất phytosome hóa

- Đánh giá khả năng tạo phức giữa rutin và phospholipid qua các phổ hồng ngoại (FT-IR), phân tích nhiệt vi sai (DSC), nhiễu xạ tia X (XRD)

- Nghiên cứu độ ổn định của phytosome rutin

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết xuất rutin từ hoa hòe

 Định lượng rutin trong hoa hòe

Phương pháp được tham khảo từ dược điển Việt Nam III [5]

- Dung dịch chuẩn

Cân chính xác 0,2 g rutin chuẩn đã sấy khô tới khối lượng không đổi vào bình định mức 100 ml Hòa tan trong 70 ml methanol bằng cách làm ấm trong bình cách thủy Để nguội, thêm đủ 100ml, lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịch này vào bình định mức 100 ml khác Thêm nước tới vạch, lắc kỹ

- Xây dựng đường cong chuẩn

Lấy chính xác lần lượt 1,0 – 2.0 – 3,0 – 4.0 – 5,0 – 6,0 ml dung dịch chuẩn cho vào các bình định mức 25 ml riêng biệt, thêm nước để đủ 6 ml ở mỗi bình rồi thêm

10% trộn kỹ lại để yên 6 phút Thêm 10 ml dung dịch NaOH 10%, thêm nước tới vạch, trộn kỹ, để yên 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm Vẽ đồ thị với trục tung là nồng độ, trục hoành là độ hấp thụ

- Dung dịch thử

Soxhlet Thêm 120 ml ether, chiết tới khi dịch chiết không màu Đề nguội, gạn bỏ ether Thêm 90 ml methanol và chiết tới khi dịch chiết không màu Chuyển dịch chiết vào bình định mức 100 ml, dùng methanol rửa lại bình chiết, định mức bằng methanol đến vừa đủ, lắc kỹ Lấy chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100ml, thêm nước tới vạch, lắc kĩ Lấy chính xác 3 ml dung dịch thu được cho

phút Thêm 10 ml NaOH 10%, thêm nước tới vạch, trộn kỹ, để yên 15 phút Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 nm Tính khối lượng rutin của dung dịch thử từ nồng độ đọc được trên đường chuẩn

- Chiết xuất rutin được tham khảo từ nghiên cứu của Lê Thị Mai [11] Tiến hành chiết xuất rutin như trong hình 2.1

Hình 2.1: Sơ đồ chiết xuất rutin từ hoa hòe

Cô quay thu hồi dung môi

Kết tinh qua đêm Lọc qua phễu Buchner

Sấy ở 600C qua đêm Đun hồi lưu với cồn 90 0

Cô quay thu hồi dung môi

Cắn Kết tinh qua đêm

Rutin

Kiểm nghiệm

Lọc qua phễu Buchner Sấy ở 600C

Quy trình tiến hành

- Xử lí nguyên liệu: Hoa hòe được xát qua cho sạch bụi bẩn, sấy qua đêm ở

- Chiết xuất: Cân 100g nguyên liệu đã xử lí cho vào bình chiết, thêm 500 ml

khi chiết, cô quay bốc hơi dung môi Dịch đặc thu được để kết tinh qua đêm ở nhiệt

được để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng, lọc qua phễu Buchner thu cắn Sấy cắn

- Định lượng rutin trong sản phẩm chiết được:

Hòa tan khoảng 75,0 mg chế phẩm trong vài chục ml ethanol nóng Lọc dung dịch qua phễu thủy tinh xốp G4 vào một bình định mức 100 ml Rửa phễu lọc bằng ethanol nóng, để nguội và pha loãng đến vạch bằng ethanol, lắc đều Lấy chính xác

2 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm 1 ml dung dịch acid acetic 0,02 M, thêm ethanol đến vạch, lắc đều Xác định độ hấp thụ của dung dịch thu được bằng cuvette thạch anh dày 1 cm, ở bước sóng lần lượt là 362,5 nm và 375 nm

so với mẫu trắng là ethanol có chứa acid acetic 0,02 M 1% Gọi độ hấp thụ quang

chế phẩm thu được được xác định theo công thức:

Trong đó : A (1%, 1cm) của rutin ở 362,5 là 325,5

P là lượng chế phẩm khan trong mẫu thử đem đi định lượng (g)

được xác định theo công thức sau:

Khi đó lượng quercetin trong sản phẩm được tính như sau

Trong đó: P lượng chế phẩm khan trong mẫu thử đem đi định lượng (g)

2.3.2 Định lượng rutin bằng phương pháp đo quang

Phương pháp định lượng rutin bằng phương pháp đo quang được tham khảo

và xây dựng lại theo nghiên cứu của Malay và các cộng sự [26]

 Tìm bước sóng hấp thụ cực đại

Cân chính xác khoảng 25 mg rutin chuẩn, hòa tan vào vừa đủ 100 ml methanol Lấy 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 100 ml, thêm methanol tới vạch, thu được dung dịch A có nồng độ 25 mg/L Tiến hành quét độ hấp thụ quang của dung dịch A ở dải bước sóng từ 800-200 nm Từ đó xác định được bước sóng hấp thụ cực đại của rutin dựa vào hình ảnh quang phổ

- Mẫu chuẩn: Từ dung dịch A ở trên, pha loãng với methanol thành các dung dịch có nồng độ lần lượt là 5 mg/L; 10 mg/L; 12,5 mg/L; 15 mg/L; 20 mg/L Đo độ hấp thu quang của các mẫu với mẫu trắng là methanol ở cực đại Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ rutin để tính toán

- Mẫu trắng: dung dịch methanol

loãng bằng methanol ở tỷ lệ nhất định để được nồng độ dung dịch thử trong khoảng

5 đến 20 mg/L Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử ở bước sóng cực đại

2.3.3 Bào chế phytosome rutin

Phytosome rutin được bào chế bằng phương pháp bốc hơi dung môi với quy trình như sau:

- Cân 1 lượng khối lượng rutin và 1 lượng tương ứng phospholipid

- Hòa tan rutin trong 80 ml methanol, phospholipid trong 80 ml diclomethan, phối hợp hai dung dịch trên vào bình cầu 500ml

độ quay khuấy từ 150 vòng/phút

- Sau đó cô quay dung dịch đến hỗn hợp đậm đặc Thêm n-hexan vào bình cô quay, sản phẩm thu được đem lọc qua phễu Buchner thu cắn Để dung dịch bốc hơi qua đêm ở nhiệt độ phòng

C

2.3.4 Xác định độ tan, hệ số phân bố của rutin, phytosome rutin vừa bào chế

 Xác định độ tan của rutin, phytosome rutin trong các môi trường

- Chuẩn bị:

Các hệ đệm 1,2; hệ đệm 4,5; hệ đệm 6,8 và nước cất

Tham khảo từ DĐVN IV, tiến hành pha hệ đệm như sau:

+ Hệ đệm 1,2: cho 7 ml dung dịch acid clohyric đặc vào bình định mức

1000 ml, thêm nước cất đến vừa đủ, lắc đều

định mức 1000ml, điều chỉnh pH lại bằng dung dịch NaOH 0,1 N Định mức lại bằng nước cất đến vừa đủ, lắc đều

khoảng 900 ml nước trong bình định mức 1000ml, điều chỉnh pH lại bằng dung dịch NaOH 0,1N Định mức lại bằng nước cất đến vừa đủ, lắc đều

- Tiến hành:

Hòa tan 1 lượng rutin, phytosome dư trong 20 ml các hệ đệm 1,2; 4,5; 6,8 và nước cất vào cốc có mỏ Khuấy từ qua đêm ở nhiệt độ phòng sau đó đem ly tâm ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 30 phút Lọc dung dịch qua màng lọc cellulose acetat 0,45 μm thu được dịch thử Pha loãng dịch thử với methanol đến nồng độ phù hợp, sau đó đem đo hấp thụ quang ở bước sóng cực đại

 Xác định hệ số phân bố dầu nước của rutin và phytosome rutin

Phương pháp xác định hệ số phân bố dầu nước được tham khảo và xây dựng lại

từ nghiên cứu của Berthod và các cộng sự [19]

- Chuẩn bị pha octanol và nước:

Lấy 200 ml nước và 200 ml octanol trộn vào cốc có mỏ 1000ml, đem khuấy từ qua đêm Chuyển vào ống đong 500ml, để yên hỗn hợp qua đêm để tách riêng 2 pha octanol và nước

- Chuẩn bị mẫu:

Cân chính xác khoảng 50 mg rutin hoặc 1 lượng phytosome rutin tương đương vào cốc có mỏ, hòa tan với 40 methanol trong bình định mức 50ml Định mức lại vừa đủ bằng methanol, lắc đều Hút chính xác 1 ml dung dịch thu được cho vào cốc

có mỏ Tiến hành bốc hơi dung môi đên khô thu được cắn Cho 20ml nước, 20ml octanol đã chuẩn bị vào, khuấy từ qua đêm ở nhiệt độ phòng Lấy riêng từng phần nước và phần octanol, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 μm, pha loãng dung dịch đến nồng độ thích hợp Đo độ hấp thụ quang từng phần ở bước sóng cực đại

 Kết quả

Hệ số phân bố dầu nước được tính theo công thức:

2.3.5 Phương pháp làm giảm kích thước tiểu phân

Phytosome sau bào chế được siêu âm để làm giảm KTTP và mẫu đồng nhất hơn: hòa tan 1 lượng nhỏ phức hợp vào 50 ml nước, siêu âm liên tục 50 ml hỗn dịch phytosome trên trong vòng 15 phút, 20 phút, 25 phút bằng bể siêu âm, quá trình siêu âm ở công suất C = 150W

2.3.6 Phương pháp đánh giá 1 số đặc tính của phytosome

 Độ tan phytosome trong các môi trường, hệ số phân bố phytosome

Tương tự như phương pháp mô tả ở mục 2.3.4 đã trình bày ở trên

 Xác định hiệu suất phytosome hóa

Phương pháp xác định hiệu suất phytosome hóa được tham khảo và xây dựng lại

từ nghiên cứu của Malay và các cộng sự [26]

Hiệu suất phytosome hóa được tính theo công thức