Nghiên cứu phân lập và định lƣợng cryptotanshinon từ cây đan sâm (salvia miltiorrhiza bunge ) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan sâm

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập được 28 Bảng 3.2 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế được 29 Bảng 3.3 Kết quả phân tích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG

CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza

Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG

DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM ( Salvia miltiorrhiza

Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG

DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dìu dắt em trong quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp Nhờ có sự chỉ bảo của thầy mà

em đã trưởng thành và cố gắng học hỏi thêm nhiều để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận này

Em xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED)- Đề tài mã số 106-YS.05-2015.05 đã tài trợ cho em trong quá trình làm thực nghiệm đề tài

Cảm ơn những thành viên của lớp K57 Dược học đặc biệt là các bạn Bích, Huệ, Hào - những người đã đồng hành cùng mình trong suốt thời gian qua

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người đã luôn giúp đỡ, động viên, chia sẻ với con, giúp con có thêm động lực cố gắng mỗi ngày

Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2017

Đặng Thị Ngần

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR Carbon (13) Nuclear magnetic resonance

ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun mù electron

(Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry)

1

H-NMR Proton nuclear magnetic resonance

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectrum)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV Tử ngoại (Ultraviolet)

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.3 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L 5

cryptotanshinon

35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập được 28 Bảng 3.2 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế được 29 Bảng 3.3 Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế được 31

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng

Bảng 3.9 Kết quả phân tích định lượng cryptotanshinon trong đan sâm ở Sa Pa 37

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN……… 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học của cây đan sâm 2

1.1.3 Tác dụng sinh học của cây đan sâm 5

1.1.4 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 6

1.2 TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON 8

1.3 TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU 9

1.3.1 Phương pháp sắc ký 9

1.3.2 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 12

1.3.3 Phương pháp phân tích khối phổ (MS) 13

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 14

1.3.5 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy 18

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 19

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Dung môi, hóa chất 19

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 20

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 20

2.2.2 Xây dựng phương pháp HPLC 21

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24

3.1.1 Chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm 24

3.1.2 Xác định cấu trúc của cryptotanshinon 27

3.1.3 Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất 29

3.1.4 Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC 31

3.1.5 Sử dụng phương pháp phân tích HPLC đã khảo sát vào phân tích định tính, định lượng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai 37

3.2 THẢO LUẬN 38

3.2.1 Phân lập và xác định cấu trúc cryptotanshinon 38

3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích định lượng cryptotanshinon 38

3.2.3 Phân tích cryptotanshinon trong mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Lào Cai 39

KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

MỞ ĐẦU

Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge (họ Lamiaceae), là một

cây thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc hiện nay được trồng nhiều và sinh trưởng tốt ở

vùng Tây Bắc nước ta Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô

hoặc sấy khô của cây đan sâm, thường được dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, mất ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm là thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ở ngực và bụng, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ [7,14,20] Nghiên cứu y học hiện đại cho thấy đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm giãn mạch và tăng lưu lượng động mạch vành, cải thiện vi tuần hoàn, phòng chống tích cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành mảng xơ vữa động mạch [1]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng dụng dược liệu quý này Các kết quả nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy đan sâm có các thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester, trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA và tanshinon I… Trong đó, cryptotanshinon (1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl- (R) -phenanthro (1,2-b) furan-10,11-dion) là một trong các thành phần tanshinon chính của đan sâm [25] Cryptotanshinon màu nâu, không hòa tan trong nước nhưng tan trong một số dung môi hữu cơ; có nhiều hoạt tính sinh học và dược lý như kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm, chống ung thư, [3]

Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đan sâm đã được công bố trong nước và quốc

tế, với mục tiêu xây dựng cơ sở khoa học về thành phần hoạt chất dược liệu đan sâm,

đề tài “Nghiên cứu phân lập và định lƣợng cryptotanshinon từ cây đan sâm

(Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan

sâm” được tiến hành với mục tiêu chiết xuất, phân lập và phân tích cryptotanshinon

trong dược liệu đan sâm bao gồm các nội dung nghiên cứu như sau:

- Chiết xuất, phân lập và xác minh cấu trúc cryptotanshinon từ rễ đan sâm thu hái ở Lào Cai

- Xây dựng và thẩm định được phương pháp phân tích cryptotanshinon sử dụng HPLC

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM

1.1.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) thuộc chi Salvia, họ Bạc hà

(Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm; cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80

cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính 0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu Thân vuông trên có các gân dọc Lá kép, mọc đối 3-5 lá chét, đặc biệt có thể có 7 lá Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả Lá kép có cuống dài, cuống lá chét ngắn có dìa Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm Mép lá chét có răng cưa tù Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh tro, cũng có lông nhưng dài hơn Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi nhỏ Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2 môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5

mm [1,14]

Salvia miltiorrhiza Bunge được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc Nó

cũng có mặt tại Nhật Bản [33] Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc thích hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [1,6] Cây trồng ở trại thuốc Sa

Pa (Viện Dược liệu) thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao Cây sinh trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm Một số cây đưa xuống trại thuốc Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng kém hơn Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để đến tháng 11-12 thu hoạch [1] Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9 [14] Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6]

1.1.2 Thành phần hóa học của cây đan sâm

Thành phần hóa học chính trong cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) là

acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác Bộ phận trên mặt đất của loài này có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và

lá Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [31]

3

Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của đan sâm đã được chia thành hai nhóm là tanshinon tan trong lipid và acid phenolic tan trong nước Đến nay, hơn 20 acid phenolic phân lập từ rễ cây đan sâm đã được nghiên cứu Các chất có hoạt tính thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon,

và vv Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và sinh tổng hợp [36]

a Diterpenoid

Các hợp chất diterpenoid là các chất tan trong nước và có hơn 30 loại diterpenquinon Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon như tanshinon I, II, III, sau đó đến isotanshinon I, II, isocryptotanshinon và cryptotanshinon Tỉ lệ các tanshinon quinon là tanshinon I từ 0,12-0,32%, tanshinon IIA từ 0,02-0,32%, methylen tanshinquinon là 0,05-0,15% [26] (hình 1.1)

Hình 1.1 Cấu trúc một số abietane diterpenoid

b Các dẫn xuất của acid phenolic

Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của

rễ cây đan sâm Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid salvianolic từ A- K [30]

4

Hình 1.2 Cấu trúc một số acid phenolic

Acid caffeic đóng vai trò trung tâm trong tác dụng sinh hóa của họ Lamiaceae, trong đó dạng dimer là quan trọng nhất như acid rosmarinic

7-5

- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong các

hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L

1.Acid ursolic 2 Acid oleanolic 3 Anagadiol 4 Taraxerol 5.Germanicol

Hình 1.3 Cấu trúc một số triterpen oid có trong chi Salvia L

1.1.3 Tác dụng sinh học của cây đan sâm

Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia miltiorrhiza

Bunge Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:

- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ Các tác dụng này

do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B, militron và salvinon Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác dụng chống đau thắt ngực [12,26,35]

- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [34]

- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [11, 28]

- Tác dụng an thần do thành phần miltiron, do đó được sử dụng điều trị chứng mất ngủ [5,28]

6

- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn Staphylococus kháng

thuốc Các thành phần như dihydrotanshinon I, hydroxytanshinon II-A, tanshinon II-B, cryptotanshinon và methyl tanshinat được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn

Staphylococus aureus [1,33,39]

- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mày đay [26]

- Hoạt tính chống viêm do thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ miễn dịch[20]

- Hoạt tính chống oxy hóa mạnh gây bởi dihydrotanshinon I [26], acid salvinolic A, B, acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [27]

- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [26]

- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [29,31]

- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các huyết quản nhỏ [23]

- Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục, làm tăng nhẹ estrogen và androgen trên chuột [29]

1.1.4 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: vị đắng, tính hàn

- Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can

- Tác dụng và công dụng:

+ Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng kinh,

bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn thương mà cơ gân sưng tấy đau đớn [6]

+ Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh; dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [6,14] Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt [30]

7

+ Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng Khi dùng với tính chất bổ huyết thì dùng đan sâm dạng không qua chế biến

+ Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp trùng đều có hiệu quả [4,6]

+ Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [6]

+ Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [14,30] + Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính, tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [34]

- Liều dùng: 8- 20 g [6]

Chú ý: không dùng chung với Lê lô [23]

8

1.2 TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON

Cryptotanshinon còn được gọi là cryptotanshinone hoặc tanshinon C, là một

diterpene quinon có nguồn gốc từ rễ của cây Salvia miltiorrhiza Bunge.,

Hình 1.4 Cấu trúc cryptotanshinon

+ Tên IUPAC: 10,11-dione

1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl-(R)-phenanthro(1,2-b)furan-+ Công thức phân tử: C19H20O3 + Khối lượng phân tử: 296,36 g/mol

+ Màu sắc: bột màu cam nâu

+ Điểm nóng chảy: 183°C

+ Độ tan: cryptotanshinon không hòa tan trong nước, nhưng tan trong dimethyl sulfoxide, methanol, ethanol, cloroform và ether, và chuyển sang màu đỏ khi tương tác với acid sulfuric đậm đặc Cryptotanshinon thuộc dẫn xuất phenanthraquinon, khi tiếp xúc với ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng quang hóa Ngoài ra, độ hòa tan của cryptotanshinon thay đổi chút ít giữa pH từ 2 đến pH 8

+ Độ ổn định : cryptotanshinon cần được bảo vệ tránh ánh sáng và dưới điều kiện khô mát (2- 8°C)

Cryptotanshinon đã được tổng hợp bởi Hiroshi Kakisawa và Yoshinobu Inouye, hai nhà hóa học Nhật Bản, vào năm 1969 Tổng hợp các cryptotanshinon mất nhiều bước, liên quan đến phản ứng của sản phẩm cộng Diels-Alder giữa 3 methylbenzofuran-4,7-quinon và 6,6-dimethyl-1-vinylcyclohexene trong ethanol ở

O

O O

18

O

O O 1 2 3

7 8

9 10 11

12 13

14

15 16 17

18 19

O

O O 1 2

5 6 7 8

9 10 11

12 13

14

15 16 17

18 19

1.3 TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU

1.3.1 Phương pháp sắc ký

Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ silica gel pha thường, pha đảo Sắc ký lớp mỏng được dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu [31]

a Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển Pha tĩnh là những hạt

có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn

ra của cột Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn ¾ Các bước thực hiện sắc ký cột gồm:

- Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau Với 2 phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân

tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân cực

Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa (etyl acetat)

- Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ khoá ở bên dưới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becker trống để bên dưới cột, dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất

- Nạp mẫu: mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu dạng rắn thì hoà tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký

- Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy tinh Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp mỏng [3,9,21,24]

b Sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Nguyên tắc

Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động

và pha tĩnh Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion) trên pha tĩnh, pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích Dựa vào hệ số phân

bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành phần trong hỗn hợp phân tích Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer (một thiết bị

11

đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích) Tuỳ thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích

- Các đại lượng đặc trưng

+ Hệ số lưu giữ Rf

Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu giữ Rf Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R f M

=d R

d (1)

Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động

(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1

+ Hệ số lưu giữ tương đối Rr:

R,x r R,c

=d R

d (2)

Trong đó: dR,x : là đường đi của chất phân tích (cm)

dR,c : là đường đi của chất chuẩn (cm)

(Giá trị R r càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)

- Ứng dụng

+ Định tính

Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều kiện Đôi khi do sắc ký không liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động, người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rr để đặc trưng cho chất phân tích

12

+ Thử tinh khiết

Dùng TLC để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ

+ Định lượng: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:

Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp Sau khi làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp như phổ hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ Phương pháp này hiện nay ít dùng vì có nhiều trở ngại lại mất nhiều thời gian

Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng, đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:

Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ huỳnh quang

Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Xử

mau : tần số của mẫu phân tích

TMS : là tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane

may : là tần số làm việc của máy

- Hằng số tương tác spin

Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J) Trị số J phụ thuộc vào tương quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác

- Diện tích dưới tín hiệu

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó Đường cong tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu

- Ứng dụng của phổ NMR

Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diện tích dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các loại phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [2,3,22]

1.3.3 Phương pháp phân tích khối phổ (MS)

14

được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối

b Ứng dụng của MS

- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử khác nhau Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố trong mẫu

- Định tính

+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)+, (M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học Bên cạnh đó xem xét thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của các mảnh ion

có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích

+ Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu

- Xác định công thức cấu tạo: Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR và phổ IR

- Định lượng: Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác định nồng độ [2,3,22]

1.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

a Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ

15

b Một số thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký

Hình 1.5 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trƣng

-Thời gian lưu :

tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó

t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký

tR’(Thời gian lưu thực): tR’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định)

W : là chiều rộng đáy pic

W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ

lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân bằng Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm

R,A 0 A

' t -tk

' t -tk

bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng Mỗi tầng được giả định như

một pha tĩnh có chiều cao H

2 R

tN=16

1/2

t N=5,54

17

a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối

- Độ phân giải (resolution)

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện

sắc ký Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

Rs = 1,0 : Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%

RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau

18

+ Phương pháp chuẩn nội: Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống với thời gian lưu và đáp ứng của chất cần phân tích Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội Từ những dữ kiện về diện tích (hoặc chiều cao ) pic của chuẩn, chuẩn nội, mẫu thử và lượng (hoặc nồng độ) của chuẩn, chuẩn nội sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử

+ Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng

độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao pic)

+ Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ Phương pháp này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện; tất cả các thành phần đều có đáp ứng detector như nhau [3,13,17,24]

1.3.5 Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy

- Mỗi chất khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau

- Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng Điểm chảy là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của một chất Nếu điểm chảy của 2 loại tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau 0,5oC thì có thể xem sản phẩm kết tinh đã tinh khiết

- Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa hơn so với điểm chảy lý thuyết chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết còn phải tiếp tục kết tinh và tinh chế lại

- Có hai cách xác định điểm chảy:

+ Đo điểm chảy bằng ống mao quản

+ Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp [9]

19

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm thu hái tại vườn dược liệu Sa Pa

Đối tượng : Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sa Pa (Lào Cai) tháng 9/2016 và được TS Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu,

Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge., họ Bạc hà

(Lamiaceae) Tiêu bản của mẫu cây (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược liệu và Khoa

Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

2.1.2 Dung môi, hóa chất

- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol (MeOH), n-hexan, dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc), n-Butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp

20

- Dung môi dùng cho phân tích:

+ Methanol (Merck, Đức), acetonitrile (Merck, Đức), nước cất, acid acetic (Merck) + Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nacalai Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản) + Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức)

+ Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter: đo năng suất quay cực

- Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy

- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ):

đo phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS)

- Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều, sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS)

- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ): phân tích định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

a Phương pháp xử lý và chiết xuất

Tiến hành chiết xuất cryptotanshinon theo nguyên tắc chung về chiết xuất dẫn xuất phenanthraquinon Lựa chọn quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:

- Phương pháp chiết: đun hồi lưu cách thủy

- Dung môi chiết xuất: ethanol 80%

- Số lần chiết: 3 lần

- Thời gian chiết: 4 giờ/ lần

21

b Phương pháp phân lập và tinh chế

Tiến hành phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký cột

- Cột nhồi silica gel, hệ dung môi hexan – EtOAc

- Sắc ký cột pha đảo C18, hệ dung môi pha động là MeOH-H2O

c Phương pháp xác định cấu trúc hóa học

Trên cơ sở các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo, hợp chất được xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý gồm:

- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR

- Phương pháp phổ khối ESI-MS

2.2.2 Xây dựng phương pháp HPLC

Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo dược điển Trung Quốc năm 2010 [8]

a Lựa chọn điều kiện sắc ký

Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng cryptotanshinon trong trong rễ cây đan sâm Cụ thể, khảo sát điều kiện sắc ký như sau:

- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo

- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng khác nhau

- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD

để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm

- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất

b Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích cryptotanshinon theo chương trình khảo sát trên

Chuẩn bị một dãy dung dịch cryptotanshinon pha trong MeOH có nồng độ 1 –

200 µg/ml Tiến hành phân tích các mẫu, xây dựng phương trình hồi quy và xác định

hệ số tương quan r

e Độ chính xác

Độ chính xác (accuracy) của phương pháp được đánh giá bằng độ đúng và độ lặp lại: + Độ đúng (trueness) là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Độ đúng thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn Lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng nồng độ lượng hoạt chất có trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyển tính của phương pháp

Tỷ lệ thu hồi (%) = (hàm lượng tìm thấy / hàm lượng thực cho vào) x 100

+ Độ lặp lại (repeatability): độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD (%) kết quả phân tích các mẫu độc lập trong cùng điều kiện phân tích

f Khảo sát vào phân tích định tính, định lƣợng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai

Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để phân tích hàm lượng cryptotanshinon trong mẫu dược liệu thu hái ở Sa Pa, Lào Cai

x x

n1

(11)

23

Độ lệch chuẩn: S n 1

1 i

: giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính

xi : giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i

n : số thử nghiệm được sử dụng để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất chính

S : độ lệch chuẩn

RSD : độ lệch chuẩn tương đối