Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá cây lá diễn (dicliptera chinensis (l ) nees)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯỢC PHẠM KIM THOA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY LÁ DIỄN Dicliptera chinensis L... ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI KHOA Y DƯ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

PHẠM KIM THOA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ CÂY LÁ DIỄN

(Dicliptera chinensis (L.) Nees)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: PHẠM KIM THOA

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LÁ CÂY LÁ DIỄN

(Dicliptera chinensis (L.) Nees)

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH DƯỢC HỌC KHÓA: QH.2012.Y

Người hướng dẫn: TS VŨ ĐỨC LỢI

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, bên cạnh sự nỗ lực và

cố gắng của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm ân cần, nhiệt tình giúp

đỡ của mọi người Thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn, động viên và giúp

đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Lời đầu tiên tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Đức Lợi - Chủ nhiệm Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Khoa

Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các giảng viên, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Bộ môn Bào chế và Công nghệ dược phẩm, Bộ môn hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện khóa luận, cũng như xin gửi lời cảm ơn đến tất cả quý thầy cô trong trường đã dạy dỗ, trang bị kiến thức cho tôi trong suốt 5 năm theo học tại trường

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn theo sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 6 năm 2017

Sinh viên

Phạm Kim Thoa

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT STT Kí hiệu, viết tắt Tên đầy đủ

3 DCP Dicliptera Chinensis polysaccharid

11 H&E Hematoxylin & Eosin

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của hợp chất HD1-CDCl3-1H 27 Hình 3.7 Phổ ESI-MS của hợp chất HD1-CDCl3-1H 28 Hình 3.8 Phổ 13

C-NMR của hợp chất HD1-CDCl3-1H 29 Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của hợp chất HD1-CDCl3-13CCPD 30 Hình 3.10 Phổ 13

C-NMR của hợp chất HD1-CDCl3-13CCPD 31 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất

HD1-CDCl3-13CCPD

31

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố 3

1.1.1 Vi ̣ trí phân loa ̣i chi Dicliptera 3

1.1.2 Đă ̣c điểm thực vâ ̣t của ho ̣ Acanthaceae 3

1.1.3 Đặc điểm các loài thuô ̣c chi Dicliptera 3

1.1.4 Đă ̣c điểm thực vâ ̣t của cây Lá diễn 5

1.2 Thành phần hóa ho ̣c của Lá diễn 6

1.3 Tác dụng dược lý của Lá diễn 8

1.3.1 Tác dụng được chứng minh khoa học 8

1.3.2 Tác dụng cổ truyền 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên vật liệu 12

2.1.2 Hóa chất sử du ̣ng 12

2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ 12

2.2 Phương pháp nghiên cứu 13

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật 13

2.2.2 Nghiên cứu về hóa ho ̣c 14

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 Kết quả nghiên cứu thực vật 21

3.2 Kết quả định tính hóa học từ lá cây Lá diễn 26

3.3 Kết quả phân lập hợp chất 26

3.3.1 Hợp chất HD1-CDCl3-1H 26

3.3.2 Hợp chất HDl-CDCl3-Cl3CPD 30

3.4 Bàn luận 31

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

Tài liệu Tiếng Anh

PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Sự phát triển của ngành Dược có ảnh hưởng rất lớn tới sức khỏe của con người Đời sống của con người càng nâng cao thì nhu cầu sử dụng dược phẩm ngày càng lớn, trong đó phải kể đến nhu cầu sử dụng dược phẩm có nguồn gốc thực vật

Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiều loại địa hình nên

có nguồn động thực vật đa dạng Vậy nên nguồn thực vật có hoạt tính sinh học cũng rất dồi dào và phong phú Ngay từ xa xưa, ông cha ta đã sử dụng nguồn tài nguyên thực vật này làm thuốc chữa bệnh như bôi ngoài da, sử dụng trực tiếp hay sắc uống… Ngày nay, các nhà khoa học đã dựa vào khoa học kĩ thuật

để tìm hiểu và phân tích các hoạt chất có tác dụng sinh học trong thực vật, dược liệu và tìm các câu trả lời về thành phần hoạt chất và cơ chế tác dụng của chúng

Cây Lá Diễn có tên khoa học là Dicliptera chinensis (L.) Nees thuộc chi

Dicliptera họ Acanthaceae là một cây thuốc quý, được sử dụng từ lâu đời

Trong đời sống, ngoài việc sử dụng cây Lá diễn để nhuộm thực phẩm thì trong

Y học Việt Nam và Trung Quốc, toàn cây lá diễn được dùng để chữa cảm ma ̣o, sốt cao, lên sởi, giảm niê ̣u; dùng ngoài tri ̣ lở, sưng, rôm sẩy, mu ̣n nho ̣t…[1,2,4-6,11] Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện thấy tác dụng hiệu quả trong điều trị gan bị tổn thương do viêm, xơ gan,… [17,19,22,26] Hiện các nhà khoa

học đang tiếp tục nghiên cứu các loài thuộc chi Dicliptera để tìm ra các tác

dụng mới ứng dụng trong điều trị bệnh

Việc nghiên cứu xác định thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài cây thuốc là cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, an toàn và hiệu quả Sử dụng các phương pháp chiết xuất, phân lập để xác định thành phần hóa học của cây thuốc

Tuy nhiên, ở Việt Nam cho tới thời điểm này chưa có nhiều nghiên cứu

về thành phần hóa học của cây Lá diễn Nhằm mục đích góp phần vào việc tìm

hiểu về cây Lá diễn thu hái ở Trực Ninh, Nam Định, luận văn với đề tài “Nghiên

cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của lá cây Lá diễn (Dicliptera

chinensis (L.) Nees)” có các mục tiêu:

1 Xác định được đặc điểm thực vật và xác định được tên khoa học của cây

Lá diễn trồng ở huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định

2 Chiết xuất, phân lập và xác định được cấu trúc của một số hoạt chất phân lập từ cây Lá diễn

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố

1.1.1 Vi ̣ trí phân loa ̣i chi Dicliptera

Theo “Hê ̣ thống phân loa ̣i về ngành Ngo ̣c lan (Magnoliophyta)” của tác

giả A.Takhtajan, chi Dicliptera có vi ̣ trí phân loa ̣i như sau [22]:

Giới thực vâ ̣t: Plantae

Ngành Ngo ̣c Lan: Magnolipphyta

Lớp Cỏ Tháp Bút: Equisetopsida C Agardh

Phân lớp Mô ̣c Lan: Magnoliidae Novák ex Takht

Bô ̣ Hoa Môi: Lamiales

Ho ̣ Ô Rô: Acanthaceae

Chi: Dicliptera

1.1.2 Đă ̣c điểm thực vâ ̣t của ho ̣ Acanthaceae

Ho ̣ Ô rô phần lớn là cây thân cỏ, cây bu ̣i hay dây leo, mô ̣t số bì sinh Lá đơn, mo ̣c đối, chéo chữ thâ ̣p; không có lá kèm Lá có thể chứa các chùm đá, nhìn thấy dưới da ̣ng các so ̣c trên bề mă ̣t Hoa đầy đủ, đối xứng hai bên tới gần như đối xứng tỏa tròn Cu ̣m hoa bông, chùm hoă ̣c xim Thường có lá hoa nhiều màu sắc đối diê ̣n với mỗi hoa Đài thường 4-5 thùy; tràng có hình ống, 2 môi hay 5 thùy; nhi ̣ đực 2 hay 4 xếp thành că ̣p và lồng vào tràng; bầu lớn, 2 lá noãn, đính noãn tru ̣ Quả nang mở 2 ô Ha ̣t không nô ̣i nhũ, phôi lớn [4,8]

1.1.3 Đăc điểm cá c loài thuô ̣c chi Dicliptera

- Trên thế giới

Chi Dicliptera (họ Acanthaceae) bao gồm hơn 150 loài vùng nhiê ̣t đới và câ ̣n nhiê ̣t đới Chi này phân bố ở Châu Á: Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Châu Phi, Châu Úc và U.S.A [2,4,8]

Bảng 1.1 Mô ̣t số đă ̣c điểm chính của các loài thuô ̣c chi Dicliptera [2,4]

1 D brachiate Spreng Lá bắc hình trứng hay hình mác

2 D clinopodia Nees Lá bắc hình chữ nhâ ̣t, tràng hoa màu tím

3 D suberecta UFP Lá bắc hình trứng, hoa hình ống màu đỏ

4 D foetida (Forssk) Blatt Hoa đơn dộc, tràng hoa màu tím nha ̣t

5 D resupinata Juss Lá bắc hình trứng mỏng, hoa màu hồng

6 D ciliate Decne Lá bắc dài 25mm

7 D spicata Decne Cu ̣m hoa nhỏ go ̣n, hình trứng

8 D trifurca Juss Lá bắc dài 20mm, tràng hoa hình ống màu tím

9 D squarrosa Lá bắc dài 15mm, hoa hình ống màu vàng cam

10 D sexangularis Juss Lá bắc dài 7mm, hoa hình ống màu hồng

 Ở Viê ̣t Nam

Chi Dicliptera gồm 4 loài [4,8]

 Loài D Bupleuroides Nees in Wall (Lưỡng thiê ̣t):

Cây cỏ cứng cao 30cm; thân vuông, thường đen khi khô, có khi nâu đâ ̣m, không có lông, lóng dài 3-4cm Lá mo ̣c đối, phiến lá hình trái xoan, mă ̣t trên nâu đen, mă ̣t dưới nâu Hoa hình môi mo ̣c thành chùm ít hoa mo ̣c ở nách lá; đài 6-8mm; vành cao 1,5mm

 Loài D.chinensis Nees in DC (Cửu căn):

Cây cỏ thân có bốn ca ̣nh, có lông mịn Lá mo ̣c đối hình bầu du ̣c thon, có lông mi ̣n Hoa hình môi be ̣t, môi trên nguyên Quả nang, ha ̣t có ít lông Cây được phân bố ở các khu vực: Cao Bằng, Bắc Ca ̣n (chơ ̣ Đồn), Thái nguyên, Hà Giang, Yên Bái, Hòa Bình, Nam Định, Hà Nô ̣i, Huế, Sài Gòn…

 Loài D Leonotis Dalz Ex C B Clarke (lưỡng thiê ̣t):

Cây cỏ nằm rồi đứng, thân tròn, có lông lúc còn non Lá có phiến thon

to 2- 6 x 2 cm, nhọn hai đầu, mỏng, dài 2-10cm Hoa mo ̣c thành chùm ở kẽ lá, hình môi; môi trên hình xoan nho ̣n, môi dưới ba rang Quả nang có lông Ha ̣t hình tròn hoă ̣c de ̣t Cây được phân bố ở các khu vực: huyê ̣n miền núi Chiêm

Hóa, Na Hang tỉnh Tuyên Quang, huyê ̣n miền núi tỉnh Quảng Nam, huyê ̣n Hòa Vang thành phố Đà Nẵng và mô ̣t số tỉnh khác (Vĩnh Phúc, Phú Tho ̣, Thái Nguyên)

 Loài D Vestita R Ben (Ha ̣ mái phủ):

Cây cỏ có thân mảnh, lóng dài 4-7cm Lá hình bầu du ̣c hay hình trái xoan, to 4- 7 x 3 cm có lông sáp mi ̣n Hoa hình môi, môi trên xon rô ̣ng (hia rang) to hơn môi dưới (ba rang) mo ̣c ở nách lá có nhiều lông, lá đài hình kim Quả nang nhỏ, có lông Cây mo ̣c hoang và được trồng nhiều ở đi ̣a phương các tỉnh miền núi và trung du phía bắc như: Cao Bằng (Tha ̣ch An), La ̣ng Sơn (Văn Quan), Bắc Ka ̣n (chơ ̣ Đông), Thái Nguyên, Tuyên Quang, Quảng Ninh, Sơn La…[2,8]

1.1.4 Đă ̣c điểm thực vâ ̣t của cây Lá diễn

1.1.4.1 Đặc điểm thực vật

Tên khoa ho ̣c: Dicliptera chinensis (Linnaeus) Nees, họ Ô rô

(Acanthaceae) [12]

Tên đồng nghĩa: Dicliptera javanica Nees [12]

Tên khác: cửu căn, cây gan heo, can thái [12]

Tên nước ngoài: Dicliptère (Pháp) [12]

Ho ̣: Ô rô (Acanthaceae)

Lá diễn là cây thảo, cây nửa bu ̣i hoă ̣c bu ̣i sống mô ̣t hay vài ba năm, cao 30-80 cm Thân và cành non có 4 cạnh, có lông tơ, các mấu phình to tựa như đầu gối Lá mo ̣c đối màu xanh lu ̣c, phiến lá hình trứng thuôn dài 2-7 cm, rô ̣ng 2-4 cm, đầu và gốc đều nho ̣n, có lông rải rác [2,4]

Hoa màu trắng hồng Cu ̣m hoa mo ̣c ở kẽ lá xim, bao gồm những lá bắc không bằng nhau, hình trứng thuôn; lá bắc con hình chỉ; đài có răng đều, rời nhau, hình rải he ̣p; tràng hoa hai môi, môi dưới hơi xẻ ba thùy, môi trên hình trứng nguyên; nhi ̣ hai đính ở ho ̣ng tràng, bao phấn hai ô; bầu nhẵn Mùa hoa tháng 12-5 Quả nang ngắn, có lông tơ ở đầu, ha ̣t de ̣t [4]

1.1.4.2 Phân bố cây Lá diễn

Tìm thấy tại phía Nam Trung Quốc, Viê ̣t Nam, Lào [4]

Phân bố tương đối phổ biến ở các tỉnh thuô ̣c vùng núi thấp và trung du phía Bắc gồm Cao Bằng, La ̣ng Sơn, Quảng Ninh, Nam Định, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Ca ̣n, Thái Nguyên…[2,8,12]

1.2 Tha ̀nh phần hóa ho ̣c của Lá diễn

Trên thế giới đã có mô ̣t số những nghiên cứu về thành phần hóa ho ̣c của

các loài thuô ̣c chi Dicliptera như sau:

Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của Yinggang Luo, Chun Feng

và cộng sự năm 2002 cho thấy lá của D riparia có chứa các hợp chất thuộc

nhóm glycosid, flavonoid, monoterpenoid: diclipariside A, diclipariside B,

diclipariside C, acid vanillic, β – sitosterol, 2,5 – Dimethoxy – bezoquinone,

daucosterol, lugrandoside và poliumonside [25]

Trong nghiên cứ u của Gao YT, Yang XW và cô ̣ng sự la ̣i cho thấy loài

D chinensis có chứa bảy hợp chất được phân lập từ dịch chiết ethyl acetate [11] Các hợp chất được tách bằng sắc ký cột silica gel, sắc ký lớp mỏng (TLC)

và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), cấu trúc của chúng đã được xác định bằng các phương pháp phổ UV, NMR và MS Cấu trúc của chúng được xác

Bảng 1.2 Công thức cấu ta ̣o các hợp chất đã phân lâ ̣p được từ chi Dicliptera

STT Tên Công thức cấu ta ̣o

OH O

3

5-methoxy-4,4’-di-O-methyl

secoisolariciresimol

O O

OH OH H

H

O CH3O

CH3

O C

H3

5 Loliolide

O O

CH3C

H3

O H

CH3

6 Beta-sitosterol

3-O-beta-D-glucopyranoside

1.3 Tác dụng dược lý của Lá diễn

1.3.1 Tác dụng được chứng minh khoa học

1.3.1.1 Ta ́ c du ̣ng gây đô ̣c tế bào

Trong họ Acanthanceae có 20 loài sau khi được chiết xuất bằng CH2Cl2

và MeOH đã phát hiê ̣n thấy các dịch chiết có tác du ̣ng gây đô ̣c tế bào, chống

sốt rét, chống oxi hóa và loa ̣i bỏ các gốc tự do

Trong 20 loài thực vâ ̣t đó thì có 9 loài cây bao gồm: Dicliptera burmanni,

Hygrophila ringens, Justicia balansae, J procumbens, L incurve, Peristrophe lanceolaria, P.dorsiflora, Strobilanthes corrugate va ̀ S maxwellii đươ ̣c chiết

bởi CH2Cl2 cho ra di ̣ch chiết có khả năng gây đô ̣c tế bào với IC (50) trong

khoảng nồng đô ̣ 3,5 – 46,0 µg/ml [17]

1.3.1.2 Tác dụng trên gan

Cây gan heo có nhiều tác du ̣ng dược lý khác nhau nhưng các nghiên cứu chủ yếu tâ ̣p trung vào tác du ̣ng trên gan

 Tác dụng ngăn cản sự phát triển của bệnh xơ gan:

Các polysaccharid của Dicliptera chinensis tác dụng vào TGF-β / Smad

và ức chế hoạt động của tế bào hình sao ở chuột đã bị làm xơ gan bởi

dimethylnitrosamine Nghiên cứu này nhằm nghiên cứu tác động của Dicliptera

chinensis polysaccharide (DCP) trên bệnh xơ gan (HF) và sự hoạt động các tế

bào hình sao gan (HSC) Trong kết luận, nghiên cứu này cho thấy rằng DCP làm suy giảm sự tiến triển của bệnh xơ gan thông qua ức chế TGF-β / Smad DCP là một polysaccharide thực vật tiềm năng cho bệnh xơ gan [28]

Các phân đoạn n-butanol và nước có thể ngăn chặn sự gia tăng của ALT, AST và MDA (P < 0.01; P < 0.05), và tăng SOD ở chuột được gây tổn thương gan bởi CCl4 chiết xuất từ dịch chiết EtOH của Dicliptera chinensis [27]

 Tác dụng bảo vệ gan của Lá diễn:

Chuột thí nghiệm dược chẩn đoán xơ gan sau khi tiêm DMN Sau đó, chuột được điều trị bằng DCP và phân tích các chỉ số sinh học, nhận thấy: Sự thay đổi các chỉ số enzym huyết thanh ALT, AST, ALB, TBIL có giá trị lâm sàng trong chẩn đoán chức năng gan Sự ức chế chuyển hóa collagenic như là

một biện pháp đối phó hiệu quả để điều trị xơ gan

Kết quả của nghiên cứu cho thấy DCP có thể làm giảm độc tính của DMN, giảm hàm lượng collagen, cải thiện chức năng tế bào gan và ức chế hình thành viêm [26]

 Tác dụng chống lại tổn thương gan:

Các DCP có tác dụng làm giảm tổn thương gan ở chuột khi cho chuột sử dụng thuốc chống lao isoniazid và rifampicin

Chuột bị tổn thương gan trước và sau khi điều trị với DCP đã được lấy mẫu máu và gan để xét nghiệm các chỉ số ALT, AST, AKP, NO, TNF-α, IL-6, xét nghiệm miễn dịch ELISA Kết quả cho thấy bệnh lý trên gan ở chuột đã được cải thiện, số lượng các tế bào viêm đã giảm, các chỉ số xét nghiệm đều giảm nên có thể kết luận rằng DCP có hiệu quả điều trị trên gan bị tổn thương gây ra bơi thuốc kháng lao và có cơ chế liên quan tới tác dụng kháng viêm của

nó [19]

1.3.1.3 Tác dụng chống OXH

Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Ahmad cùng cộng sự đã nghiên cứu

dịch chiết các thành phần trên mặt đất của Dicliptera roxburghiana (DR) trong

MeOH, n-hexane, chloroform, EtOAc, n-butanol để đánh giá khả năng chống OXH của chúng

Kết quả cho thấy: các dịch chiết có khả năng chống OXH là: dịch chiết

từ MeOH, chloroform, EtOAc, n-butanol Còn lại, dịch chiết n-hexan không có khả năng chống OXH [14]

1.3.1.4 Ảnh hưởng tới thông số chuyển hóa trên chuột cái

 Ảnh hưởng tới thông số sinh lý, sinh hóa trên chuột cái chưa trưởng thành

Dân gian đã sử dụng dịch chiết của hỗn hợp lá có tên khoa học là Aloe

buettneri, Justicia insularis, Macranthus hibiscus và Dicliptera verticillata để

điều chỉnh chu kì kinh nguyệt, đau bụng kinh và vô sinh ở phụ nữ Theo đó, năm 1998 nhóm tác giả Telefo PB, Moundipa PF, Tchana AN, Tchouanguep Dzickotze C, Mbiapo FT đã nghiên cứu tác dụng dịch chiết của hỗn hợp lá này

trên chuột cái chưa trưởng thành bằng đường uống

Kết quả cho thấy: nồng độ protein buồng trứng, tử cung, nồng độ estradiol huyết thanh đều tăng cao khi sử dụng liều 49-94 mg/ngày Trong khi

đó, nồng độ cholesterol buồng trứng lại giảm

Dựa vào kết quả trên, rất có thể trong hỗn hợp dịch chiết chứa oestrogen

[23]

 Hỗn hợp dịch chiết của Dicliptera verticillata làm thay đổi nồng độ

estradiol (hormone nữ) và ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa gan trên chuột cái chưa trưởng thành:

Năm 2002, nhóm tác giả gồm Telefo PB, Moundipa PF, Tchouanguep

FM nghiên cứu tác dụng của hỗn hợp dịch chiết từ lá của các loài Aloe buettneri,

Justicia insularis, Hibiscus macranthus và Dicliptera verticillata Nhận thấy

khi cho chuột cái chưa trưởng thành uống hỗn hợp dịch chiết, ở liều 13, 49 và

94 mg/kg mỗi ngày trong 15 ngày gây ra một sự gia tăng đáng kể nồng độ estradiol trong buồng trứng, trong huyết thanh và trọng lượng tử cung cũng tăng Đồng thời cũng phát hiện sự giảm hoạt động của N-demethylase aminopyrine ở chuột điều trị [24]

1.3.2 Tác dụng cổ truyền

Tính vi ̣: Lá diễn có vi ̣ ngo ̣t, nha ̣t, tính mát [2,10]

Quy kinh: Can, phế, thâ ̣n [10]

Công năng: thanh nhiê ̣t, tiêu viêm, lơ ̣i tiểu, làm mát máu, sinh tân di ̣ch [2]

Toàn cây được dùng làm thuốc, dùng ngoài, sắc uống, có thể làm phẩm

nhuô ̣m màu Lá non, ngo ̣n cây làm thực phẩm [4,5,10-12,27]

Toàn cây dùng để chữa cảm ma ̣o, sốt cao, lên sởi; viêm phổi nhe ̣, viêm ruô ̣t thừa cấp, viêm gan cấp, viêm kết ma ̣c, viêm ruô ̣t, kiết ly ̣, viêm khớp, giảm niê ̣u, đái ra dưỡng chấp Ngày dùng 30-60 g dược liê ̣u là toàn cây khô hoă ̣c dùng 60-120 g cây tươi sắc lấy nước uống [2,4]

Dùng ngoài tri ̣ lở, sung, rôm sẩy, mu ̣n nho ̣t; dùng lá tươi giã nát xoa hoă ̣c đắp Ngoài ra nhân dân còn dùng lá nấu canh ăn với thịt lợn, ngon như rau ngót với tác du ̣ng mát gan [2,4,8]

Ở Trung Quốc, lá diễn được dùng để lương huyết, chữa nhiê ̣t bê ̣nh, sốt, cảm ma ̣o, ban chân, bình can, minh mu ̣c, tri ̣ tiểu tiê ̣n ra máu, bí đái, ung sang thũng đô ̣c Nước sắc chữa khó tiêu, sốt cao Lá tươi giã nát đắp lên mắt hoă ̣c nấu nước rửa mắt Ở Indonesia lá tươi được dùng để tri ̣ táo bón [2]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên vật liệu

Mẫu cây lá diễn được thu hái vào tháng 5 năm 2016 tại thị trấn Cổ Lễ huyện Trực Ninh, tỉnh Nam Định Mẫu thực vật gửi đến là mẫu tiêu bản dạng cây tươi ( có ảnh chụp chi tiết dạng sống, hoa, lá ) Mẫu thực vật đã được Viện

Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giám định tên khoa học là: Dicliptera chinensis

(L.) Nees, họ Ô rô-Acanthaceae, mẫu được lưu giữ tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN

Mẫu khô: Cây Lá Diễn được rửa sạch, làm khô và thái nhỏ, bảo quản để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết xuất, phân lập

2.1.2 Ho ́ a chất sử du ̣ng

 Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như: nước cất, EtOH, Cloroform, n-hexan, EtOAc, DCM… đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp và được chưng cất lại trước khi dùng

 Các dung môi phân tích gồm: MeOH, n-hexan, EtOAc, H2O dùng để phân tích sắc ký đều đạt tiêu chuẩn phân tích Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silicagel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nicalai Tesque Inc, Nhật Bản), YMC ODS-A (50μm, YMC Co Ltd., Nhật Bản) Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254

nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % hơ nóng để phát hiện vết chất

 Các thuốc thử: dragendoff, mayer, bouchardat, ninhydrin, lugol, acid sulfuric, acid acetic, gelatin, xanh methylene, javen, muối FeCl3, bột Na2CO3, NaOH

để quan sát phân tích đặc điểm lá, thân và chụp ảnh

- Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích, kính hiển vi

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu về đặc điểm thực vật

 Quan sát và mô tả hình thái thực vâ ̣t, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây: thân, lá, hoa,

 Phương pháp làm tiêu bản tạm thời để nghiên cứu cấu tạo giải phẫu:

- Nhuộm vi phẫu bằng xanh metylen khoảng 10 giây rồi rửa bằng nước

- Nhuộm đỏ son phèn trong 30 phút rồi đem rửa lại bằng nước

- Đặt vi phẫu vào 1 giọt nước trên phiến kính, đậy lá kính, soi trên kính hiển vi

 Phương pháp làm tiêu bản cố định: Tiêu bản sau khi đã nhuộm xanh methylene và đỏ son phèn xong, rửa lại với nước và tiếp tục được làm như sau:

- Loại nước lần lượt bằng cồn 300, 500, 700, 950 và cồn tuyệt đối

- Lắc vi phẫu ba lần trong xylen

- Đặt vi phẫu vào một giọt bôm Canada trên phiến kính, đậy lá kính, để chỗ

thoáng 3 tuần

 Giám đi ̣nh tên khoa ho ̣c của mẫu nghiên cứu: Đối chiếu với mô tả trong tài liệu chuyên sâu về thực vật như:

- Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam [2]

- Từ điển thực vâ ̣t thông du ̣ng, tâ ̣p I [4]

- Cây cỏ Việt Nam, tâ ̣p III [8]

- Cây thuốc và đô ̣ng vâ ̣t làm thuốc ở Viê ̣t Nam, tâ ̣p III [3]

2.2.2 Nghiên cư ́ u về hóa ho ̣c

- Định tính glycosid tim bằng các phản ứng Liebermann- Burchardt, Phản

ứng Legal Phản ứng Baljet và Phản ứng Keller kiliani

- Chiết xuất dịch chiết EtOH để định tính flavonoid và coumarin Định tính flavonoid với các phản ứng Cyanidin, phản ứng với NH3, NaOH và phản ứng với FeCl3 Định tính coumarin bằng phản ứng đóng mở vòng lacton

- Chiết xuất dịch chiết nước để làm các phản ứng định tính tanin, acid hữu

cơ, acid amin, đường khử Định tính tannin bằng các phản ứng với FeCl3 5%, gelatin 1% và chì acetat 10% Định tính acid hữu cơ bằng phản ứng với Na2-

CO3 Định tính acid amin bằng phản ứng với thuốc thử Ninhydrin Định tính

đường khử bằng phản ứng với thuốc thử Fehling

- Chiết xuất dịch chiết hexan để làm các phản ứng định tính, chất béo,

- Dịch chấm sắc ký: chuẩn bị dịch chiết toàn phần (ngâm dược liệu trong EtOH rồi cô quay chân không lấy cao, thu được dịch chiết tổng) Hòa tan dịch chiết tổng vào EtOH, sau đó lọc, thu được dịch chấm sắc ký

 Hệ 4: Cloroform- Methanol- Nước (6,5:3,5:1)

 Hệ 5: Ethylacetat- Methanol- Nước (10:1,7:1,3)

 Hệ 6: Ethylacetat- Methanol- Nước (10:2:5)

 Chấm mẫu:

 Thể tích chấm: 5µ

 Các vết chấm dài 8mm, cách cạnh dưới bản mỏng 10mm, cách cạnh bên 15mm

 Triển khai: Bão hòa cốc đựng dung môi triển khai trong 30 phút bằng 10ml dung môi pha động Đặt cốc ở nơi kín gió và đậy kín Sau khi khai triển xong, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi trong tủ hút

 Phát hiện: bằng cách quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366nm Chụp lại sắc ký đồ bằng máy chụp Camag TLC Visualier

2.2.2.2 Chiết xuất và phân lập

- Chiết xuất:

Mẫu lá cây lá diễn được phơi khô, nghiền thành bột (6,5 kg), sau đó chiết trong EtOH (3×8 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (50oC,3 h) Dịch chiết được lọc qua giấy lọc, gộp dịch chiết lại và cất loại dung môi ở áp suất giảm thu được 630,0 g cặn chiết ethanol Lấy 120 g cặn chiết này phân tán vào 1,2 lít nước cất

và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexan và EtOAc (mỗi loại 3×1,5 lít) Các dịch chiết n- hexan, ethylacetat được cất thu hồi dung môi thu được các cặn dịch tương ứng n- hexan (H, 31,0 g) và (E, 56,0 g) và lớp nước (N, 33,0 g)

( Sơ đồ chiết xuất hình 2.1)

HDl –CDCl3 –H1 (55 mg) Phân đoạn H2.2 phân tách trên cột silicagel pha

thường với hệ dung môi rửa giải n-hexan: ethylacetat (2/1) thu được chất sạch

HDl –CDCl3 –Cl3CPD (62 mg) (Hình 2.2)

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất dược liệu

Cao n-hexan (30g)

H1(9,4g) ))))

Phân lập 1 n-hexan: axeton (25/1)

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập chất