Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu tam thất hoàng (panax stipuleanatush t tsai et k m feng) trồng tại sapa lào cai

6 Bảng 7 Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang 10 Bảng 8 Độ ẩm của dược liệu tam thất hoang 27 Bảng 9 Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 10 Tỷ lệ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ HUẾ

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng)

TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƯỢC

Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HUẾ

BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ

DƯỢC LIỆU TAM THẤT HOANG

(Panax stipuleanatusH.T.Tsai et K.M

Feng)TRỒNG TẠI SAPA – LÀO CAI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin gửi lời cám ơn đến toàn thể Ban Giám hiệu Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Bộ môn Dược lý - Dược lâm sàng đã tạo điều kiện cho tôi được làm khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt, giúp đỡ tôi hoàn thành chương trình học tập suốt 5 năm qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến PGS.TS Đỗ Thị Hà,

PGS.TS Dương Thị Ly Hương, DS Phạm Thị Thúy, những người đã luôn tận

tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ nghiên cứu Khoa Hoá Thực vật - Viện Dược liệu, các thầy cô ở Bộ môn Thực Vật- Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp

đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn đề tài cấp Nhà nước: “Ứng dụng các giải pháp khoa

học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai loài cây

thuốc Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatus Tsai & Feng) vùng Tây Bắc”,mã số: KHCN-TB.07C/13-18,

2015-2017 (Chương trình Tây Bắc) đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện nội dung nghiên cứu này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và người thân

đã luôn quan tâm, động viên giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Dù đã rất cố gắng, nhưng lần đầu làm nghiên cứu tôi khó tránh khỏi những thiếu sót Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy cô để khoá luận thêm hoàn thiện

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Huế

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DĐVN IV Dược điển Việt Nam 4

HCT-116 Dòng tế bào ung thư ruột kết người 116

HepG2 Tế bà ung thư gan HepG2

HL-60 Dòng tế bào ung thư bạch cầu người 60

HPLC-MS/MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao – phổ khối/ phổ khối

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SKLM Sắc ký lớp mỏng

STT Số thứ tự

TT Thuốc thử

TTH Tam thất hoang

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Phân bố của các loài thuộc chi Panax L 2

Bảng 2 Saponin dẫn chất của protopanaxadiol và

Bảng 3 Saponin khung dammaran khác 5 Bảng 4 Saponin dẫn chất ocotillol 5 Bảng 5 Saponin dẫn chất acid oleanolic 6 Bảng 6 Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L 6 Bảng 7 Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang 10 Bảng 8 Độ ẩm của dược liệu tam thất hoang 27 Bảng 9 Tỷ lệ tro toàn phần của dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 10 Tỷ lệ tro không tan trong acid của dược liệu tam thất hoang 28 Bảng 11 Hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu tam thất hoang 30 Bảng 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng tới mật độ quang 32 Bảng 13 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang 32 Bảng 14 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 33 Bảng 15 Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloeric 34 Bảng 16 Độ hấp thụ quang của dãy dung dịch chuẩn 36 Bảng 17 Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp đo quang 37 Bảng 18 Kết quả xác định độ đúng của phương pháp 38 Bảng 19 Kết quả định lượng saponin tổng trong một số mẫu tam thất

Hình 12 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới mật độ quang 32 Hình 13 Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới mật độ quang 33 Hình 14 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin 34 Hình 15 Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử acid perchloric 35 Hình 16 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ

chất chuẩn tại bước sóng 550 nm 36

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 2

1.1.Tổng quan về chi Panax 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Thành phần hóa học 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 8

1.2.Tổng quan về dược liệu tam thất hoang 9

1.2.1 Thực vật học 9

1.2.2 Thành phần hóa học 10

1.2.3 Tác dụng dược lý và công dụng 12

1.3.Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu 13

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1.Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị 16

2.2.Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Mô tả 17

2.2.2 Vi phẫu 17

2.2.3 Soi bột 17

2.2.4 Độ ẩm 17

2.2.5 Tro toàn phần 17

2.2.6 Tro không tan trong acid 17

2.2.7 Định tính 18

2.2.8 Định lượng 19

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Đặc điểm vi phẫu và bột 22

3.1.1 Đặc điểm vi phẫu 22

3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 25

3.2.Độ ẩm 27

3.3.Tro toàn phần 28

3.4.Tro không tan trong acid 28

3.5.Định tính 29

3.6.Định lượng 30

3.6.1 Định lượng theo phương pháp cân 30

3.6.2 Định lượng theo phương pháp đo quang 30

3.7.Bàn luận 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

Kết luận 41

Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC I: PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC i

PHỤ LỤC II: DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CƠ SỞ DƯỢC LIỆU

TAM THẤT HOANG ii

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhắc đến thảo dược, người ta không thể không nhắc đến “Sâm” Ngày nay,

thuật ngữ“Sâm” không chỉ dùng để chỉ cây nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer),

mà còn để gọi chung cho rất nhiều loài thuộc chi Panax L bởi chúng có những tác dụng quý tương tự Nhiều loài trong chi Sâm (Panax), đặc biệt là các loài nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer), sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen ex C.Y Wu et K.M Feng; syn.: P

pseudoginseng all.), sâm Nhật (Panax japonicus C.A.Meyer), sâm Mỹ (Panax quynquefolius L.), sâm Siberia (AcanthoPanax senticosus (Rupr et Maxim.) Harms;

syn.: Eleutherococcus senticosus Maxim.) , là những cây thuốc quý, được ưa

chuộng, rất nổi tiếng và có giá trị cao[14]

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng) đã được ghi

nhận trong các tài liệu cây thuốc và được sử dụng trong nhiều bài thuốc dân gian, đặc biệt là các dân tộc miền núi Tây Bắc Tuy nhiên, cho đến thời điểm này, ở nước

ta và cả trên thế giới những nghiên cứu về loại sâm này là rất ít và tản mạn.Tam thất hoang được sử dụng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress, kích thích tiêu hóa, an thần [3] nhưng lại là loài quý hiếm có nguy cơ tuyệt chủng cao ở Việt Nam[15] Ngày nay, các nguyên liệu dược liệu đang bị làm giả làm nhái rất nhiều và nhiều chế phẩm từ dược liệu còn kém chất lượng, tam thất hoang càng không phải một ngoại lệ Điều này có thể làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người, cũng như gây mất lòng tin của người sử dụng với thuốc và chế phẩm từ dược liệu

Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu là hết sức cần thiết

Cho đến nay, dược liệu tam thất hoang vẫn chưa được đưa vào dược điển Việt Nam, các dược điển Trung Quốc, Ấn Độ cũng chưa có chuyên luận cho dược liệu này Do vậy, chúng tôi đã thực hiện đề tài : “Bước đầu xây dựng tiêu chuẩn cơ

sở dược liệu Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng)trồng tại

Sapa – Lào Cai” với mục tiêu: Xây dựngđược các tiêu chuẩn cho dược liệu tam thất hoang trồng tại Sa Pa– Lào Cai

Để đạt được mục tiêu trên đề tài thực hiện các nội dung sau:

- Phân tích đặc điểm vi học dược liệu

- Xây dựng phương pháp định lượng dược liệu

- Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu với một số tiêu chí chung trong Dược điển

Việt Nam IV

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Panax

1.1.1 Đặc điểm thực vật

a) Phân loại và phân bố:

Vị trí phân loại của chi PanaxL theo Takhtajan[72]:

Giới: Thực vật - Plantae

Ngành: Ngọc lan- Magnoliophyta

Lớp: Ngọc lan- Magnoliopsida

Bộ: Hoa tán Apiales

Họ: Ngũ gia bì(nhân sâm) Araliaceae

Chi: Sâm Panax L

Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu về các loài

thuộc chi Panax Theo Flora of China (2007)[81], ở Trung Quốc chi Panax có 7

loài

Theo trang The plant list, chi Panax bao gồm 47 tên khoa học của thực vật,

trong đó có 12 loài và 1 thứ được chấp nhận với mức độ tin cậy cao Phân bố của 12 loài như trong bảng sau:

Bảng 1 Phân bố của các loài thuộc chi Panax L

1 Panax bipinnatifidus Seem

Từ dãy Himalaya đến miền trung Trung Quốc, cũng tìm thấy ở Việt Nam

Đông bắc Trung Quốc

3 Panax japonicus (T.Nees) C.A.Mey Nhật Bản, Hàn Quốc

4 Panax notoginseng (Burkill)

F.H.Chen

Miền nam Trung Quốc và một số nơi ở Việt Nam

3

7 Panax sokpayensis Shiva K.Sharma

& Pandit Vùng Sikkim - Ấn Độ

8 Panax stipuleanatus Tsai & Feng Trung Quốc, Việt Nam

10 Panax vietnamensis Ha & Grushv Trung Quốc, Việt Nam

11 Panax wangianus S.C.Sun Miền trung, nam Trung Quốc

12 Panax zingiberensis C.Y.Wu &

Ở Việt Nam, chi PanaxL có 5 loài gồm cây mọc tự nhiên cũng như được

nuôi trồng, với phân bố như sau[3]:

Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.): ở Quảng Nam, Kon

Tum, Gia Lai, Lâm Đồng

Sâm vũ diệp (Panax bipinatifidus Seem.): ở Lào Cai trên dãy Hoàng Liên

Sơn, Sa Pa

Tam thất (Panax pseudoginseng Wall.): ở Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn,

Phó Bảng, Hà Giang, Lai Châu

Nhân sâm (Panax ginseng Meyer.): phân bố rải rác ở các khu vực rừng núi

trong cả nước, mọc tập trung nhiều tại các khu vực vùng núi cao, có khí hậu mát lạnh

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M Feng): có ở Lai

Châu, Lào Cai

b) Đặc điểm thực vật

Theo Seemann (1868), chi Panaxlà nhóm thảo mộc có lá kép hình chân vịt

có răng cưa, mọc ở đỉnh thân, cụm hoa mang một tán đơn ở tận cùng, hoa nhỏ có 5 cánh, bầu nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2 – 5 hạt Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng[68] Quả mọng, hình cầu có khi hơi dẹt, hạt dẹt, có nội nhũ mịn[81]

4

1.1.2 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học trong các loài thuộc chi Panax rất phong phú[13]:

saponin, polyacetylen, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ, đường khử và một số hợp chất mới được phát hiện như glycosphingolipid, saccharose [6] …Trong đó saponin và polyacetylen là hai thành phần chính

a) Hợp chất saponin

Saponin được xem là thành phần chính quyết định hoạt tính của các loài

thuộc chi Panax Đến cuối năm 2012, ít nhất 289 saponin đã được báo cáo từ mười một loài Panax khác nhau[79] Các saponin thuộc 4 phân nhóm phổ biến nhất là

protopanaxadiol, protopanaxatriol, acid oleanolic, octrilol Các loại saponin được trình bày trong các bảng dưới đây:

Bảng 2 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol và

1 Ginsenosid Rb1 (A) G1C2-G1C G1C6-G1C P ginseng [60];

1 Majonosid F4 (A) Glc H H Glc P vietnamensis [45]

2 Chikusetsusaponin L9a (A) H OH H H P japonicus [70]

HO

OR

O OH OH

D

C

6

1 PseudoginsenosidF11 (A) Glc2-Rha P quinquefolius [78]

2 Pseudoginsenosid RT4 (B) Glc P japonicus [49]

3 Majonosid-R1 (B) Glc2-Glc P japonicus [45]

4 Majonosid-R2 (B) Glc2-Xyl P japonicus [45]

Bảng 5 Saponin dẫn chất acid oleanolic

Glc P stipuleanatus [83]

b) Hợp chất polyacetylen

Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon với những nhóm chất liên kết Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo) heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu còn lại của hợp chất là chuỗi C7H15[25,52,66]

Bảng 6 Các polyacetylen trong một số loài thuộc chi Panax L

- notoginsenic acid β-sophoroside

- 10-hydroxydeca- 4,6-diynoic acid

10-O-β-D-glucopyranosyl (1 -> 2)-β-Dglucopyranoside

[77]

a) Nhân sâm

Nhân sâm đã được nghiên cứu và chứng minh có các tác dụng: tăng lực, hồi phục sức khỏe [76]; cải thiện trí nhớ [59,85]; chống stress, giải lo âu và chống trầm cảm [46,65,76,80]; chống oxy hoá và chống lão hoá [39,54]; bảo vệ gan [35,36,47]; điều hòa miễn dịch[40,41]; chống ung thư [57,69]; hạ cholesterol và lipid máu [23,61]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [29-31]; hạ glucose huyết [44]

b) Tam thất

Tam thất cũng thể hiện các tác dụng dược lý tương tự nhân sâm, như: tác dụng chống oxy hóa [75]; tác dụng điều hòa miễn dịch [51]; tác dụng bảo vệ tế bào não trong trường hợp thiểu năng tuần hoàn não [43]; hạ lipid máu và phòng chống huyết khối [32]; tác dụng bảo vệ gan [24,53]; tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục [63]

c) Sâm Mỹ

Sâm Mỹ có tác dụng chống oxy hoá, chống stress[50]; tăng cường miễn dịch [28]; gây độc tế bào ung thư [22,64]; chống đái tháo đường [21]

d) Sâm Việt Nam

Các công trình nghiên cứu dược lý và lâm sàng cho thấy sâm Việt Nam có những tác dụng tương tự nhân sâm Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâm Việt Nam có tác dụng cải thiện trí nhớ [8,18]; chống stress và trầm cảm [9,19,58]; chống oxy hóa

[19]; tác dụng bảo vệ gan [7,73,74]; kháng khuẩn trên các chủng Streptococcus,

Staphylococcus[4,52]; kích thích miễn dịch [10]; gây độc tế bào ung thư [71]; tác

dụng kiểu nội tiết tố sinh dục, chống đái tháo đường, giảm đau chống viêm [4]

Tên khoa học: Panax stipuleanatusH.T Tsai et K.M Feng, thuộc họ Ngũ gia

bì (Nhân sâm) Araliaceae

lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô Quả mọng, gần hình cầu dẹp, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ Quả gồm 1 hoặc 2 hạt màu xám trắng

Hình 1 Tam thất hoang

Sinh học và sinh thái: Mùa hoa tháng 4-5, quả tháng 5-9 (10) Nhân giống tự nhiên chủ yếu bằng hạt Quả chín thường bị chim ăn, hạt rơi xuống đất lại bị loại sóc nhỏ ăn nhân hạt Cá biệt trong tự nhiên, quả chín tồn tại đến tháng 9 hoặc tháng

10 Cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, quả chín rụng ngay xuống đất, xung quanh gốc cây mẹ, nếu không bị tác động, hạt sẽ nảy mầm vào tháng 3 năm sau [16] Phần thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ, vào đầu mùa xuân năm sau Khi thân rễ bị gãy, phần đầu mầm còn lại có khả năng tiếp tục tái sinh Cây đặc biệt ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán

1.2.2 Thành phần hóa học

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ ra rằng phần thân rễ TTH chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với hàm lượng thấp Năm 1985, nhóm các nhà nghiên cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ TTH [83]

OR

R1O

COOR2

Hình 2 Saponin dẫn chất acid oleanolic

Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của TTH được thu hái ở Trung Quốc [86]

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun L đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu TTH thu hái ở Việt Nam [26] Năm 2013, nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin khác nữa [27] Các saponin mà nhóm tác giả trên phân lập được từ TTH đều là các saponin dẫn chất của acid oleanolic

Bảng 7 Các hợp chất saponin đã phân lập được từ tam thất hoang

11 Spinasaponin A methyl este (11) [26]

12 Stipuleanosid R2 methyl este (12) [26]

19 Stipuleanosid R1 methyl este (19) [27]

20 Acid oleanolic 28-O-β-D-glucopyranosyl este (20) [27]

Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất khác từ TTH gồm 3 polyacetylen (trong đó stipudiol và stipuol là 2 chất mới, (3R,9R,10R)- panaxytriol là chất đã biết), và các hợp chất khác: spathulenol (serquiterpen) và 9-docosenoic acid methyl ester (acid béo) [25]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về thành phần hóa học của TTH vẫn còn mới mẻ Năm 2002, Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng[11] Đồng thời bằng cách thủy phân saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic[13]

Nhóm nghiên cứu của Chun L (2010) [26] đã thử tác dụng gây độc tế bào trên các dòng tế bào HL-60 (bệnh bạch cầu) và HCT-116 (ung thư ruột kết) của các hợp chất saponin từ 2 đến 12 (theo bảng 7), thấy rằng các chất đều có tác dụng gây độc tế bào ở mức độ khác nhau Chất 11biểu hiện rõ ràng tác dụng gây độc tế bào HL-60 và HCT-116 với giá trị IC50 là 4,44 và 0,63 µM tương ứng; chất 5 có tác dụng gây độc tế bàotrung bình với giá trị IC50 là 41,45 và 6,50 µM Sau khi các dòng tế bào HL-60 và HCT-116 được xử lý với các chất 11 và 5, thấy có sự chết tế bào theo chu trình Chất 4, 8 có tác dụng gây độc tế bào với giá trị IC50 là 75,94 và 78,11 µM lên tế bào HCT-116 Các chất 3, 6, 9, 10, 12 đều có tác dụng gây độc tế bào với các giá trị IC50 lần lượt là 63,44; 67,08; 72,99; 76,23; 83,90; 91,16 µM lên dòng tế bào HL-60 và có tác dụng lên dòng HCT-116 với các giá trị IC50 lớn hơn

100 µM

Năm 2011, nhóm nghiên cứu tiếp tục thử tác dụng gây độc tế bào ung thư máu (HL-60) và ruột kết (HCT-116) của hai hợp chất polyacetylen là stipudiol và stipuol Kết quả cho thấy cả 2 chất đều ức chế sự tăng sinh tế bào HL-60 và HCT-

116 với giá trị IC50tương ứng là 0,13 và 0,28 μM ;0,5 và 0,8 μM [25]

Trong một công bố khác năm 2013, nhóm nghiên cứu của Chun L chỉ ra rằng các saponin 2, 3, 4, 8, 9, 12 (theo bảng 7) có tác dụng ức chế NF-κB với giá trị

IC50 từ 3,1 đến 18,9 μM Ba hợp chất 3,4,9 ức chế hoạt động của NF-κBbằng cách giảm nồng độ của tác nhân gây viêm trên tế bào HepG2 [27]

b) Công dụng

Tam thất hoang có tác dụng tán ứ, định thống

Sách đỏ Việt Nam (2007) ghi: “tất cả các bộ phận của cây đều có công dụng làm thuốc; thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục,

13

chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần”[3]

Theo Đông y: tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm Có tác dụng tư

bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu

Theo sách "Trung Quốc dược thực chí": tam thất hoang có tác dụng chữa thương tổn, cầm máu, có thể sử dụng để thay thế tam thất.Trên lâm sàng rễ củ tam thất hoang dược dùng để cầm máu các loại vết thương và xuất huyết Cũng được dùng như tam thất làm thuốc bổ chữa thiếu máu, xanh xao gầy còm, nhất là đối với phụ nữ sau khi sinh đẻ, còn có tác dụng kích thích sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh Liều dùng 4-8g thuốc bột hoặc rượu thuốc

Một số bài thuốc có tam thất hoang:

- Chữa thống kinh (đau bụng trước kỳ kinh): Ngày uống 5 g bột TTH, uống 1

lần, chiêu với cháo loãng hoặc nước ấm

- Phòng và chữa đau thắt ngực: Ngày uống 3-6 g bột TTH (1 lần), chiêu với

nước ấm

- Chữa thấp tim: Ngày uống 3 g bột TTH, chia 3 lần (cách nhau 6-8 giờ),

chiêu với nước ấm Dùng trong 30 ngày

- Chữa các vết bầm tím do ứ máu (kể cả ứ máu trong mắt): Ngày uống 3 lần

bột TTH, mỗi lần từ 2-3 g, cách nhau 6-8 giờ, chiêu với nước ấm

- Chữa đau thắt lưng: Bột TTH và bột hồng nhân sâm lượng bằng nhau trộn

đều, ngày uống 4 g, chia 2 lần (cách nhau 12 giờ), chiêu với nước ấm Thuốc cũng

có tác dụng bồi bổ sức khỏe cho người suy nhược thần kinh, phụ nữ sau sinh, người mới ốm dậy

1.3 Tổng quan về tiêu chuẩn dược liệu

Hiện tại, các nghiên cứu về tiêu chuẩn chất lượng của tam thất hoang còn rất hạn chế, chưa có tiêu chuẩn chất lượng cụ thể

Những quy định chung về tiêu chuẩn dược liệu[5]:

 Mô tả: bao gồm những mô tả về hình thái, kích thước, màu sắc, mùi vị,cácđặc điểm của bề mặt, vết bẻ hay mặt cắt của dược liệuhoặc đặc điểm thể chất của dược liệu

 Định tính dược liệu bằng phương pháp vi học, bao gồm:

- Vi phẫu: Cấu tạo giải phẫu của các cơ quan thực vật là một đặc điểm quan

trọng trong kiểm nghiệm dược liệu Trong phần lớn các trường hợp, hình dạng và cấu trúc của vách tế bào có ý nghĩa quan trọng nhất trong khảo sát vi học Vì vậy, khi quan sát các mẫu người ta thường loại bỏ tế bào chất, nhuộm màu màng tế bào

để việc quan sát dễ dàng hơn

- Soi bột: mỗi một dược liệu đều có đặc điểm mô học đặc trưng, chúng được

thể hiện một phần qua bột dược liệu Khảo sát bột dược liệu bằng kính hiển vi để tìm ra những đặc điểm vi học đặc trưng của bột dược liệu, có vai trò trong việc địnhdanh, xác định độ tinh khiết, phân biệt dược liệu này với dược liệu dễ nhầm lẫn, phát hiện giả mạo nếu có và xây dựng tiêu chuẩn dược liệu

 Định tính lý học là việc xác định các chỉ số như độ tan, tỉ trọng, chiết xuất, năng suất quay cực… của các dược liệu

 Định tính hóa học là phép thử một vài thành phần trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học Phương pháp tiến hành được trình bày ở các chuyên luận dược liệu cụ thể

 Định tính sắc ký là việc sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, sắc ký lỏng hiệu năng cao… để phát hiện một số thành phần có trong dược liệu; so sánh với chất chuẩn hay thành phần trong dược liệu chuẩn

 Định tính hu nh quang là quan sát sự phát hu nh quang của bề mặt hay mặt cắt dược liệu hoặc của dịch chiết dược liệu ở điều kiện thườnghay sau khi cho tác dụng với acid, kiềm hay thuốc thử Trừ khi có quyđịnh riêng trong chuyên luận, mẫu thử được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách nguồn sáng khoảng 10 cm

 Định tính vi thăng hoa thường được tiến hành như sau: Đặt một vòng kim loại đường kính khoảng 2 cm, cao khoảng 8 mm lên một tấm kim loại mỏng có kích thước hơi lớn hơn Trải một lớp mỏng bột dược liệu trong vòng kim loại và đậy kín

15

bằngmột phiến kính bên trên có đặt một miếng bông tẩm nước lạnh Đặt tấm kim loại đã có dược liệu này lên một lưới amiant có 1 lỗ tròn đường kính khoảng 2 cm sao cho vòng kim loại có dược liệu nằm trên lỗ này Đun nóng nhẹ phía dưới lỗ cho đến khi bột dược liệu bị cháy xém Nhấc phiến kính ra và để nguội Quan sát hình dạng và màu sắc của tinh thể chất được thăng hoa đọng lại trên phiến kính bằng kính hiển vi và/hoặc tiến hành phản ứng hóa học thích hợp đối với chất đã được thăng hoa

 Thử tinh khiết: là cách kiểm tra độ tinh khiết của dược liệu, có thể bao gồm một số hay tất cả các chỉ tiêu sau:

 Mất khối lượng do làm khô

 Tro toàn phần và tro không tan trong acid hydrochloric

 Các tạp chất hữu cơ, các bộ phận khác của dược liệu, các dược liệu bị biến màu, hư thối

 Tỉ lệ vụn nát của dược liệu

 Hàm lượng kim loại nặng

 Dư lượng các chất bảo vệ thực vật

 Xác định chất chiết được là xác định hàm lượng các chất trong dược liệu có thể chiết được bằng dung môi (nước, ethanol hay một dung môi khác)

 Định lượng: là việc xác định hàm lượng một hay một số chất có trongdược liệu bằng phương pháp hóa học, lý học hoặc sinh học Định lượngbao gồm cả việc xác định hàmlượng chất béo, tinh dầu và xác định hoạt lực bằng các phép thử sinh học

16

CHƯƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và máy móc, thiết bị

Mẫu tam thất hoang được thu hái tại Sa Pa, Lào Cai cóđộ tuổi 4-6 năm đã được xác định tên khoa học, được lưu tại Phòng Tiêu bản của Khoa Tài nguyên Dược liệu – Viện Dược liệu với số hiệu: DL-020816 (Phụ lục 1)

Xử lý nguyên liệu: sau khi thu hái, nguyên liệu được rửa sạch, sấy khô ở 50ºC đến khi đạt độ ẩm dưới 10% Sau đó được cắt miếng mỏng, xay nhỏ làm mẫu nghiên cứuvà được bảo quản trong túi kín

Hình 3 Nguyên liệu tam thất hoang (Panax stipuleanatus

H.T Tsaiet K.M Feng) tươi

Chất đối chiếu: stipuleanosid R1, stipuleanosid R2, acid oleanolic được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu Viện dược liệu

Dung môi hoá chất:methanol, ethanol, n-hexan,n-butanol, acid acetic băng,

acid perchloric, vanillin,nước cất hai lần…dùng cho phân tích

Máy móc, thiết bị: máy siêu âm Power sonic 405; máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (BUCHI); tủ sấy Memmert, Binder-FD115; bếp điện, bếp đun cách thủy; tủ sấy chân không Heraeus VT6025, Châu Âu; cân kĩ thuật Precisa

BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SMA-FR, cân xác định độ ẩm Precisa HA 60; máy đo quang Shimadzu UV-1800 UV-Vis Spectrophotometer

17

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Xây dựng tiêu chuẩn dược liệu Tam thất hoang dựa trên các chỉ tiêu chung được qui định tại phụ lục 12.2 DĐVN IV[5]gồm: Mô tả, soi bột, vi phẫu, độ ẩm dược liệu, tro toàn phần, định tính, định lượng,…

M: khối lượng mẫu thử (g);

A: độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.6 Tro không tan trong acid

Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.7.Mẫu nghiên cứu là bột phần thân rễ đã được sấy khô

18

Tỷ lệ % tro không tan trong acid của dược liệu được tính theo công thức:

Trong đó:m: khối lượng tro (g);

M: khối lượng mẫu thử (g);

A: Độ ẩm của mẫu thử (%)

2.2.7 Định tính

a) Dựa trên tính chất tạo bọt

Lấy 1 g bột thân rễ, thêm 15 ml ethanol 70% (TT) đun trên cách thủy 10

phút, lọc Lấykhoảng 1 ml dịchlọc pha loãng với nước cất thành 10 ml Lắc mạnh

Dung dịch đối chiếu: hòa tan 1 mg mỗi loại chất đối chiếu stipuleanosid R1

và stipuleanosid R2 trong 1 ml methanol

- Điều kiện sắc ký:

Pha động: hệ dung môi n-butanol : acid acetic : nước (4:5:1, lớp trên) với

SKLM pha thường, aceton : nước (2:1) với SKLM pha đảo

Pha tĩnh: Silica gel 60F 254 (Merck) đã được hoạt hóa ở nhiệt độ 105°C

trong 60 phúttrước khi dùng

- Phương pháp phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10% trong ethanol, ánh sáng

tử ngoại UV 254 nm và UV 366 nm

- Cách tiến hành: Trên bản mỏng silica gel 60F 254 tráng sẵn (Merck), đã hoạt

hóa ở 105°C trong 1 giờ, chấm riêng biệt 10 µl mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu, tiến hành sắcký theo DĐVN IV, phụ lục 5.4 Sau khi triển khai hệ dung môi được khoảng 8 cm, lấy bản mỏng ra, để bay hơi hết dung môi, phun thuốc thử Sấy bản mỏng ở 105°C trong 5 phút Quan sát bản mỏng dưới UV 254 nm, UV 366nm

và ánh sáng thường

19

2.2.8 Định lượng

a) Định lượng theo phương pháp cân

Cân chính xác 10 g bột dược liệu phần thân rễđã rây qua rây số 335 (đã được

đo độ ẩm) chiết Soxhlet với khoảng 100 ml n-hexan (TT) để loại chất béo (khoảng 8 giờ), lấy bã bay hết hơi n-hexan.Sau đó chiết bằng 100 ml methanol (TT) Cất thu

hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn Hòa tan cắn trong 20 ml nước rồi lắc

với n-butanol bão hòa nước (TT) đến khi lớp n-butanol nhạt màu Gộp

dịchn-butanol, rửa 3 lần bằng nước cất Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm đến cắn, hòa tan cắn bằng 2 ml ethanol 80% rồi chuyển vào một cốc đã được xác định khối lượng trước Bốc hơi trên cách thủy được cắn Sấy khô cắn ở 105ºC trong 3 giờ Cân cắn[5]

Tính hàm lượng saponin tổng theo dược liệu khô kiệt theo công thức:

Trong đó: X: hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu (%);

Mc: là khối lượng cao thu được (g);

Mt: là khối lượng mẫu thử (g);

A: là hàm ẩm dược liệu (%)

b) Định lượng theo phương pháp đo quang

 Xây dựng phương pháp đo quang

Căn cứ vào các tài liệu tham khảo [2,20,87,88]và quy trình thực nghiệm, chúng tôi tiến hành xây dựng phương pháp định lượng như sau:

 Chuẩn bị thuốc thử, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và môi trường

- Chuẩn bịthuốc thử vanillin trong acid acetic băng 50mg/ml: Cân 0,5g

vanillin tinh thể pha trong acid acetic băng vừa đủ 10ml thu được thuốc thử có nồng

độ 50mg/ml

- Thuốc thử: acid perchloric

- Môi trường: acid acetic băng

- Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác khoảng 5,0 mg chất chuẩn acid oleanolic

pha trong ethanol tuyệt đối vừa đủ 50,0ml thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1mg/ml

20

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 5,0 g bột phần thân rễ, chiết hồi lưu

với ethanol 50% (tỉ lệ dung môi : dược liệu = 10 : 1) ở 70ºC trong 3 lần, mỗi lần 0,5 giờ Lọc, gộp dịch chiết và loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn toàn phần Cân chính xác khoảng 5,0 mg cắn pha trong ethanol tuyệt đối vừa đủ 10ml thu được dung dịch thử có nồng độ 0,5 mg/ml (nếu cắn không tan hết thì bổ sung thêm vài giọt nước và siêu âm)

 Khảo sát và tìm điều kiện đo quang

- Khảo sát cực đại hấp thụ quang

Tiến hành quét phổ với 3 dung dịch: dung dịch chuẩn, dung dịch thử sau khi tiến hành phản ứng với thuốc thử acid perchloric và vanillin trong acid acetic băng

và dung dịch thử không tiến hành phản ứng với các thuốc thử Sau đó quét phổ trên máy đo quang phổ trong khoảng bước sóng từ 300 –800nm Cuvet thạch anh có bề dày 1cm.Dung dịch so sánh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ không chứa chất nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng

Nhiệt độcủa phản ứng được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng ởcác nhiệt độ khác nhau (điều chỉnh nhiệt độ bằng bể điều nhiệt)

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng

Thời gian của phản ứng được được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng trong các khoảng thời gian khác nhau tại nhiệt độ đã xác định Phản ứng tạo màu được cho là ổn định khi giá trị độ hấp thụ của nó ít dao động

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin

Nồng độ thuốc thử vanillin được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử vanillin khác nhau trong cùng điều kiện phản ứng đã chọn

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric

Nồng độthuốc thử acid perchloric được khảo sát bằng cách tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử acid perchloric khác nhau trong cùng điều kiện phản ứng đã chọn

 Thẩm định và đánh giá phương pháp

 Xác định khoảng nồng độ tuyến tính

21

Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định, được biểu thị bằng phương trình y = ax + b và hệ số tương quan tuyến tính R

Cách xác định: khảo sát trên 1 dãy chất chuẩn có nồng độ biến thiên Xác định sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và mật độ quang bằng phương trình hồi quy tuyến tính.Yêu cầu đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan R ≥ 0,99 [1,20]

 Độ lặp lại

Độ lặp lại của một phương pháp pháp phân tích là mức độ thống nhất giữa các kết quả riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trên cùng một mẫu đồng nhất [20] Độ lặp lại được biểu thị bằng RSD[1]

Tiến hành: Phân tích 1 mẫu 6 lần song song Xác định kết quả định lượng tiến hành trong cùng điều kiện và tính RSD

 Độ đúng

Là mức độ sát gần các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực Để xác định độ đúng, thực hiện với một dung dịch mẫu đối chiếu acid oleanolic có nồng độ chính xác 10,0 µg/ml Sau đó tiến hành phân tích mẫu lặp lại 6 lần

k: hệ số pha loãng;

A: hàm ẩm dược liệu (%);

B: Hàm ẩm cao (%);

mcao: khối lượng cao chiết được (g);

mcân: khối lượng cao dùng định lượng (g);

mdl: khối lượng dược liệu dùng định lượng (g)

Quan sát trên tiêu bản vi phẫu lá (Hình 4)nhận thấy:

Phần gân lá:Mặt trên và mặt dưới đều lồi Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào hình đa giác hoặc chữ nhật tương đối đều, mặt trên tế bào biểu bì hơi to hơn ở mặt dưới Lớp cutin dày có răng cưa nhỏ Mô dày phiến (2) gồm nhiều tế bào hình đa giác đều nhau, xếp thành 1-2 lớp tế bào ở cả hai mặt, mô dày góc (3) ở đỉnh lồi lên của mặt trên dưới mô dày phiến, tế bào hình đa giác không đều, xếp lộn xộn Mô mềm(4) gồm các tế bào thành mỏng, hình đa giác, kích thước không đều, chiếm khoảngphần lớn vi phẫu Trong mô mềm rải rác tế bàochứa tinh thể calci oxalate (7) Bó libe gỗ (5) nằm trong khối mô mềm, xếp thành từng vùng làm thành hình vòngcung, mặt lõm hướng lên trên Trong bó libe gỗ, vòng gỗ (5)nằm trong, vòng libe (6) nằm ở ngoài Phía trong và ngoài bó libe gỗ đều có ống tiết ly bào (8) tạo bởi 5-7 tế bào

Phần phiến lá:Tế bào biểu bì hình chữ nhật, biểu bì trên (9) to hơn biểu bì dưới (11) Mô mềm (10) gồm các tế bào nằm kích thước không đều, thành mỏng, uốn lượn, hình chữ nhật hoặc hình đa giác bên trong chứa nhiều lục lạp Rải rác trong mô mềm có các bó gân phụ

23

A Gân lá: 1 Biểu bì, 2 Mô dày phiến, 3 Mô

dày góc, 4 Mô mềm, 5 Libe, 6 Gỗ, 7 Mô mềm

chứa tinh thể calci oxalat, 8 Ống tiết ly bào

B Phiến lá: 9 Biểu bì trên,

10 Mô mềm, 11 Biểu bì

dưới

Hình 4 Vi phẫu lá

b) Đặc điểm vi phẫu thân

Quan sát trên tiêu bản vi phẫu thân (Hình 5), nhận thấy:

Phần thân trên cao có tiết diện đa giác nhiều cạnh, phần thân sát thân rễ tiết diện hình bầu dục Thân từ ngoài vào trong thấy gồm các phần: ngoài cùng là biểu

bì (1) gồm một lớp tế bào hình chữ nhật hoặc đa giác xếp đều đặn, bên ngoài có phủ lớp cutin dày có răng cưa Mô dày phiến (2) gồm nhiều tế bào hình đa giác không đều nhau, xếp thành 2-4 lớp Mô mềm (3) gồm các tế bào hình trứng kích thước không đều nhau, tăng dần từ ngoài vào trong Ở phần thân trên cao (A), mô mềm hóa gỗ (4) tạo thành một vòng nối các bó libe gỗ Trên các bó libe gỗ, mô mềm hóa

mô cứng (5) tạo thành dải phủ bên trên libe Ở phần thân sát thân rễ (B) không có hiện tượng này, mô mềm có chứa rải rác tinh thể calci oxalat (10) Mô mềm chiếm hầu hết vi phẫu Tiếp theo là bó libe gỗ tập trung thành từng vùng hình bầu dục xếp cách đều dưới mô dày, mạch gỗ (6) tạo thành tia hướng tâm nằm trong mô mềm gỗ không hóa gỗ, libe (7) tạo thành vòng bao quanh các mạch gỗ Trong cùng là mô mềm ruột (8) Ngoài ra còn có các ống tiết ly bào (9) trong mô mềm , thường ở trong và ngoài bó libe gỗ