Thiết kế vector và bước đầu biểu hiện interleukin 7 ở cây thuốc lá

Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng. Tuy nhiên, hiện nay con người đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường, SARS, ebola v.v.... Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang tính cầm cự. Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các tế bào bạch cầu. Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukine. Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T 3. Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người. Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp... Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết từ các bộ phận của động vật. Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người. Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết. Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học. Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính 2 tối ưu và thực tiễn cao. Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v.... mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn. Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người. Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu. Căn cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”.

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Huy Hoàng

THÁI NGUYÊN - 2017

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC

THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GENE INTERLEUKIN 7 VÀ BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN PROTEIN Ở CÂY THUỐC LÁ

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Xác nhận của tổ chức chủ trì Chủ nhiệm đề tài

(ký họ tên, đóng dấu) (ký, họ tên)

THÁI NGUYÊN - 2017

Trang 3

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI

I Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu

5 TS Nguyễn Thị Thu Ngà Đại học Sư phạm - ĐHTN

II Đơn vị phối hợp chính

1 Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam PGS TS Chu Hoàng Hà

Trang 4

MỤC LỤC

DANH SÁCH THÀNH VIÊN, ĐƠN VỊ THAM GIA ĐỀ TÀI I MỤC LỤC II DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH VII THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VII

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Interleukine 7 3

1.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các loại cytokine tái tổ hợp trong y học 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước 9

1.3 Nghiên cứu biểu hiện interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá 10

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Vật liệu 15

2.1.1 Vật liệu thực vật 15

2.1.2 Các chủng vi khuẩn 15

2.1.3 Các gene và vector 15

2.1.4 Hó a chất và thiết bi ̣ máy móc 15

2.1.5 Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 16

2.1.6 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật 18

Trang 5

2.2.2 Thiết kế mồi 19

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp 19 2.2.5 Phân tích các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh ho ̣c phân tử 24

2.2.6 Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7 26

2.2.7 Đánh giá hoạt tính protein interleukin 7 tái tổ hợp 28

2.2.8 Phân tích thố ng kê kết quả thực nghiệm 29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 30

3.1 Thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật30 3.2 Thiết kế vector chuyển gene interlukin 7 tái tổ hợp vào cây thuốc lá 32 3.2.1 Thiết kế vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 32

3.2.2 Thiết kế vector chuyển gene pCB301 35S/IL7-histag-cmyc-100xELP 34

3.3 Biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp trong cây thuốc lá bằng phương pháp Agro-infiltration 36

3.4 Đánh giá biểu hiện tạm thời protein IL-7 tái tổ hợp 39

3.5 Phân tích định lượng và tinh sạch protein IL-7 tái tổ hợp 39

3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp 44

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46

4.1 Biểu hiện tạm thời protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá 46

4.2 Tăng cường biểu hiện protein ở thực vật với ELP và tinh sạch mITC 47 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 50

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 68

Trang 6

DANH MỤC NHỮNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

A tumefaciens Agrobacteria tumefaciens

BSA bovine serum albumin Dung dịch protein chuẩn

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

E.Coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Axit ethylenediaminetetraacetic

ELISA Enzym-linked

immunosorbent assay

Kỹ thuật phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

ELP elastin-like peptide

hIL-7 human interleukin 7 interleukin 7 của người

HRP Horseradish Peroxidase Horseradish Peroxidase

IMAC Immobilized Metal ion Affinity

Chromatography Sắc kí ion cố định kim loại

mITC membrane-based Inverse

Transition Cycling Đảo ngược theo màng

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

Trang 7

scFv Single-chain variable fragment

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis

Trang 8

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật 11

Trang 9

DANH MỤC CÁC HÌNH

3.1 Trình tự gene interleukin 7 trước và sau khi thay đổi mã di truyền 31 3.2 Cấu trúc vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP 32

3.3 Hình ảnh điện di các sản phẩm cắt ghép tạo vector chuyển gene

3.7 Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn NcoI 38

3.8 Quá trình biến nạp pCB301 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP vào

Trang 10

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

Đơn vị: Trường Đại học Y Dược

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

Tên đề tài: Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá

Mã số: ĐH2014-TN05-01

Chủ nhiệm: ThS Nguyễn Huy Hoàng

Cơ quan chủ trì: Đại học Y Dược Thái Nguyên

Thời gian thực hiện: 2014 - 2017

2 Mục tiêu:

Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7 tái

tổ hợp

Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7

3 Kết quả nghiên cứu:

Thiết kế được 2 cấu trúc vector chuyển gene và biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật

Biểu hiện thành công protein ở thực vật bằng phương pháp infiltration

Agro-Đã đánh giá được hoạt tính sinh học của protein IL-7 tái tổ hợp

Trang 11

4.3 Sản phẩm ứng dụng

01 quy trình thiết kế vector tái tổ hợp mang gene mã hóa protein interleukin 7 và sản phẩm vector tái tổ hợp

01 quy trình biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium

01 quy trình biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật bằng phương pháp Agro-infiltration

5 Hiệu quả:

Khoa học công nghệ: Đề tài hoàn thành sẽ góp phần hoàn thiện các

phương pháp sản xuất protein interleukin 7 tái tổ hợp phục vụ trong y học

Thông tin: Cung cấp những thông tin về giá trị của các loại cytokin nói

chung và interleukin, trong đó có interleukin 7 nói riêng trong hệ thống miễn dịch của con người

Đào tạo, bồi dưỡng nhân lực: Đào tạo 1 tiến sỹ sinh học

Nâng cao năng lực nghiên cứu của những người tham gia, đặc biệt với

chủ nhiệm đề tài

Bổ sung 01 tài liệu tham khảo phục vụ cho việc nghiên cứu, giảng dạy

và học tập của học viên, sinh viên chuyên ngành Di truyền học

6 Khả năng áp dụng và phương thức chuyển giao kết quả nghiên cứu:

Đề tài đã cung cấp quy trình biểu hiện protein interleukin 7 tái tổ hợp ở cây thuốc lá chuyển gene trong quy mô phòng thí nghiệm, phục vụ cho mục đích nuôi cấy thu sinh khối tế bào

Bước đầu đánh giá được hoạt tính sinh học của protein interleukin 7 tái

tổ hợp thu được sau khi tinh sạch, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn

Trang 12

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

Project title: Research on expressing the recombinant interleukin 7 protein in plant culture systems

Code number: ĐH2014-TN05-01

Coordinator: Nguyen Huy Hoang, MA

Implementing institution: Thai Nguyen university of Medicine and Pharmacy

- Successfully expression of protein in plants by Agroinfiltration

- The recombinant IL-7 protein was evaluated bioactivity

Trang 13

01 process of recombinant protein expression in plants by method Agroinfiltration

5 Effects:

Science and Technology: The completed project will contribute to the

improvement of the methods of recombinant interleukin 7 production in medicine

Information: Provides information on the value of cytokines and

interleukins, including interleukin 7 in particular in human immune systems

Training and retraining of human resources: To train a doctoral in

biology

Improve the research capacity of the participants, especially the leader Additional 01 reference material for the research, teaching and learning

of students, specialized students in Genetics

6 Transfer alternatives of reserach results andapplic ability:

The subject has provided a process for expression of interleukin 7 recombinant protein in transgenic tobacco plants in a laboratory scale for cell culture purposes

Initial evaluation of the bioactivity of the recombinant interleukin 7 protein obtained after purification, is the premise for further research

Trang 14

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Ngày nay, khi chất lượng cuộc sống được nâng cao thì vấn đề chăm sóc sức khỏe ngày càng được quan tâm, coi trọng Tuy nhiên, hiện nay con người đang phải đối mặt với rất nhiều bệnh nguy hiểm như HIV, AIDS, tiểu đường, SARS, ebola v.v… Trong khi đó, việc điều trị chủ yếu là sử dụng thuốc theo từng giai đoạn diễn biến của bệnh nên tính hiệu quả không cao và chỉ mang tính cầm cự

Interleukine là một nhóm các cytokine được tìm thấy đầu tiên trong các

tế bào bạch cầu Chức năng của hệ thống miễn dịch ở người phụ thuộc chủ yếu vào các Interleukine Trong đó, nhóm Interleukine 7 (IL-7) là một cytokine có vai trò chính trong sự tăng trưởng của các dòng tế bào B và T [3] Đây là những dòng tế bào có chức năng quan trọng trong hệ miễn dịch của con người, cũng

là những tế bào đích tấn công của các virus, mầm bệnh khi xâm nhập vào cơ thể con người

Trong y học ngày nay, các protein có hoạt tính sinh học được sử dụng rộng rãi để làm thuốc điều trị như các loại hormone, enzyme tái tổ hợp Trước đây, nguồn nguyên liệu để sản xuất các loại protein này chủ yếu là tách chiết

từ các bộ phận của động vật Tuy nhiên, do nhu cầu ngày càng cao trong khi nguồn cung từ động vật rất hạn chế, giá thành lại đắt và dễ nhiễm các mầm bệnh nguy hiểm cho con người Do đó, việc tổng hợp protein tái tổ hợp được đặt ra một cách cấp thiết

Trong những thập niên gần đây, với những bước tiến lớn trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử, việc tổng hợp protein không còn khó khăn như trước nhờ phương pháp tổng hợp sinh học Mặc dù một số protein có thể tổng hợp bằng con đường hoá học song phương pháp tổng hợp sinh học thể hiện tính

Trang 15

tối ưu và thực tiễn cao Thực tế hiện nay phương pháp này đã được áp dụng rộng rãi không những để tổng hợp một số loại protein làm thuốc như insulin, hormone tăng trưởng v.v… mà còn để tổng hợp rất nhiều hợp chất khác trong khi nguồn nguyên liệu hạn chế hoặc con đường tổng hợp hoá học gặp khó khăn

Hiện nay, biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật đang được quan tâm nghiên cứu vì những ưu điểm vượt trội so với các hệ thống biểu hiện khác như chúng có thể sinh trưởng trên môi trường tương đối đơn giản, protein được tiết

ra môi trường nhiều hơn phần tích luỹ trong tế bào nên việc thu hồi và tinh sạch

dễ thực hiện, đặc biệt protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật an toàn cho con người hơn so với các protein có nguồn gốc từ các hệ thống nuôi cấy khác do các mầm bệnh và virus thực vật không phải là tác nhân gây bệnh ở người

Nhằm mục đích nâng cao chất lượng điều trị bệnh theo hướng sử dụng liệu pháp sinh học và góp phần hoàn thiện các phương pháp nghiên cứu sản xuất các cytokine nói chung và interleukine 7 nói riêng một cách tối ưu Căn

cứ vào điều kiện phòng thí nghiệm cho phép và với phương pháp khả thi, chúng

tôi quyết định lựa chọn thực hiện đề tài luận án: “Thiết kế vector chuyển gene interleukin 7 và bước đầu đánh giá biểu hiện protein ở cây thuốc lá”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thiết kế được vector chuyển gene thực vật mang gene interleukin 7 Tạo được cây thuốc lá biểu hiện protein interleukin 7

3 Nội dung nghiên cứu

Tối ưu mã di truyền gene interleukin 7 biểu hiện ở thực vật

Thiết kế gen mã hóa interleukine 7 tái tổ hợp vào vector chuyển gen phù hợp với hệ thống nuôi cấy thực vật

Chuyển cấu trúc gen vào cây thuốc lá

Phân tích, đánh giá chất lượng interleukine 7 tái tổ hợp thu được

Trang 16

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Interleukine 7

IL-7 gồm một chuỗi glycoprotein xoắn 4α, có khối lượng phân tử 17,4 kDa và được ổn định bằng gốc N - glycosyl hóa hoặc O - glycosyl hóa và cầu

nối disulfide nội phân tử [102] Ở người, gen hIL-7 có kích thước 33Kb, gồm

có 6 exon và 5 intron nằm trên nhiễm sắc thể số 8, ở vị trí 8q21.13 Cấu trúc

phân tử của hIL-7 được giữ vững ngay cả khi nồng độ pH có sự biến động mạnh (2,1 - 8,0) [18] Tuy nhiên, hIL-7 sẽ mất hoạt tính sinh học khi bổ sung 2-

mercaptoethanol, điều này cho thấy tầm quan trọng của các liên kết disulfide

có trong cấu trúc phân tử hIL-7 [7]

Hình 1.1 Cấu trúc protein hIL-7

(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98]

hIL-7 lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1988 bởi công ty Immunex

[58] và cDNA được nhân bản đầu tiên vào năm 1989 [59] hIL-7 có vai trò quan trọng trong hệ bạch huyết do có khả năng thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu lympho ở chuột bị nhiễm bệnh [54], [55]

hIL-7 chủ yếu được sản xuất bởi tuyến ức [58], [99] Ngoài ra, các tế bào khác như các tế bào tủy [26], nội mạc ruột [97] và tế bào sừng trên da [31] cũng

có thể sản xuất IL-7 Gần đây, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIL-7 còn được

Trang 17

sản xuất bởi các tế bào nguyên bào sợi lưới (FRC) trong vùng tế bào T của hạch bạch huyết [47]

hIL-7 có hai thụ thể (IL-7 receptor) là IL-7Rα và thụ thể γc Trong đó,

thụ thể IL-7R (CD127) cũng là thụ thể của các lymphopoietin mô đệm tuyến

ức (TSLP) [107] và chuỗi  (CD132) là thụ thể của IL-2, IL-9, IL-15 và IL-21 [15], điều này cho thấy mối quan hệ chặt chẽ giữa các cytokine trong hệ miễn dịch người [22] Trong khi thụ thể c thường thấy ở các tế bào tạo máu thì IL-7R lại thấy ở trên bề mặt các tế bào bạch huyết Gen mã hóa cho protein thụ thể hIL-7 nằm ở vị trí 5p13 trên nhiễm sắc thể số 5, gần với vị trí của thụ thể hormone tăng trưởng prolactin và một gen ức chế ung thư tế bào bạch cầu có đặc điểm tín hiệu tương tự như thụ thể IL-7 [31]

Trọng lượng phân tử của protein thụ thể IL-7 là 80 kDa Chuỗi γc là thành phần chức năng và có vai trò góp phần làm tăng liên kết giữa hIL-7 và IL-7 receptor Protein IL-7Rα tồn tại ở hai dạng: dạng liên kết với màng và dạng hòa tan Các đồng vị màng (p64) cũng được liên kết với IL-2Rγc [31]

Hình 1.2 Thụ thể interleukin 7

(Nguồn: Wikipedia, 2017) [98]

Trang 18

Janus kinase-3 (Jak3) gắn chọn lọc với các chuỗi c [89] trong khi Jak1 gắn với IL-7R [76] Sự đột biến ở chuỗi c [13], [20], [64] hoặc Jak3 [9], [62], [70] gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải trầm trọng ở người, đặc trưng bởi sự thiếu hụt lympho T và NK [63] Khi hIL-7 gắn với IL-7R mang theo chuỗi c liên kết với Jak1 và Jak3, điều này làm hoạt hoá kinase và phosphoryl hoá các vị trí Y449 quan trọng trên IL-7R [33] Sau đó, các thụ thể trở thành điểm bám cho protein Stat5 qua sự tương tác SH2-phosphothyrosine để thực hiện các chức năng Các tiểu đơn vị p85 của PI3Kinase liên kết trực tiếp với Y449 phosphoryl hoá thông qua vùng SH2 Các

PI3K được đưa qua màng tế bào và hoạt hoá các gen PDK1 và Akt [85] Akt

sau đó sẽ phosphoryl hoá gen điều tiết chuyển hoá tế bào, sự tiến triển của chu

kì tế bào như GSK3, P27 hIL-7 điều khiển quá trình này bằng việc phosphoryl hoá GSK3, làm ngăn cản quá trình phosphoryl hoá các phân tử tín hiệu của tế bào -catein, cản trở sự suy thoái và kết hợp với các yếu tố phiên mã khác như TCF/LEF-1, giúp một số gen được biểu hiện [57]

hIL-7 có tính đặc hiệu cao với IL-7 receptor Sweeney và cộng sự đã chứng minh yếu tố DAB389 gây độc tế bào chỉ hoạt động với tế bào có IL-7 receptor, điều này rất có ý nghĩa trong vấn đề trị liệu nhằm chống lại các khối

u ác tính mang IL-7 receptor Sự biểu hiện của IL-7 receptor cũng có thể được coi là mục tiêu điều trị trong các khối u ác tính [90]

Tuy nhiên, hIL-7 cũng được chứng minh có khả năng tạo ra các tín hiệu khác khi truyền thông tin trong các tế bào không có sự xuất hiện của IL-7R bởi khả năng đặc hiệu với các thụ thể bề mặt khác như Flt-3 và c-kit [26]

Hoạt tính sinh học của hIL-7

hIL-7 có chức năng chủ yếu là hỗ trợ cho sự tăng trưởng và chống lại các yếu tố phá hủy các tế bào lympho B và lympho T, thúc đẩy sự tăng trưởng của

tế bào lympho B gốc [104] và kích thích tế bào lympho B và lympho T phát

Trang 19

triển [7], [18] hIL-7 giúp tăng cường sự phát triển của tế bào thực bào tự nhiên

và thúc đẩy sự tăng trưởng và khác biệt của các dòng tế bào lympho T [71], [75], [86], đồng thời tăng cường hệ thống, kích thích sự hoạt động của bạch cầu đơn nhân máu ngoại vi [7] hIL-7 có thể tăng tốc độ sản sinh bạch huyết trong trạng thái giảm bạch cầu lympho như ở những bệnh nhân AIDS [26], [64] hoặc sau khi hóa trị liều cao hoặc xạ trị [57, [57]

Morrissey (1991) đã chỉ ra rằng tế bào lympho T đáp ứng với phorbal myristate acetate trong thụ thể của hIL-7 thay vì trải qua quá trình apoptosis Apoptosis hay quá trình chết của tế bào theo một chu trình là một quá trình phức tạp của các hoạt động thông qua trung gian hoặc mất yếu tố tăng trưởng cytokine cần thiết hoặc do sự tham gia của một thụ thể chết với TNF Ví dụ khi loại bỏ p53 ở gen ức chế khối u trong Rag-1-/- ở chuột, quá trình apoptosis bị chặn lại, tế bào lympho T ban đầu sẽ sống sót lâu hơn mà không có một chức năng TCR cụ thể [54] Do đó, nhiều khả năng đây là một chức năng quan trọng của hIL-7 để ngăn chặn tế bào gốc từ tuyến ức trải qua quá trình apoptosis Cytokine sử dụng chuỗi γc trong các thụ thể của chúng, chẳng hạn như IL-2, IL-4, IL-9 và IL-15 để có thể tồn tại trong điều kiện nhất định hIL-7 có thể duy trì khả năng tồn tại của tế bào bằng cách ngăn cản yếu tố “gây chết” hoặc kích hoạt yếu tố “thúc đẩy sự sống” [55]

Mặt khác, hIL-7 có thể hoạt hóa các tế bào T chống lại quá trình apoptosis bằng cách nâng cao mức độ hoạt động của các protein chống apoptosis như Bcl-2 và Bcl-XL [7], [22] Ngoài ra, hIL-7 ngăn chặn tế bào chết bằng cách ức chế một số protein pro-apoptosis như Bid, Bad hoặc Bax [57, [37], [67] và có thể hoạt động như một đồng yếu tố với gen V, D, J tái tổ hợp

để thực hiện các phản ứng của các chuỗi TCR trong sự hiện diện của hIL-7 tái

tổ hợp [97] Đặc biệt, hIL-7 cũng đóng góp vào quá trình cân bằng nội môi của

tế bào T CD8+ ở các tế bào lymphopenic và có thể thay thế cho sự thiếu hụt của IL-15 [83]; làm tăng khả năng sinh kháng thể chống ung thư [72]

Trang 20

Hiện nay, hIL-7 được nghiên cứu ứng dụng nhiều trong điều trị bệnh như bệnh bạch cầu lymphoblastic cấp tính [35], [80], bệnh cúm A [4], một số bệnh

tự miễn [14]; được sử dụng là yếu tố chỉ thị một số bệnh như viêm đường mật cấp tính [88], ung thư đại trực tràng (CRC) [44], bệnh viêm gan B [105] v.v…

đã thu được nhiều kết quả khả quan

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CÁC LOẠI CYTOKINE TÁI TỔ HỢP TRONG Y HỌC

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới

Cytokine đầu tiên được phát hiện là interferon vào năm 1957, là một cytokine có hoạt tính chống virus Trong những thập niên vừa qua, các nghiên cứu và hiểu biết về vai trò sinh lý cũng như sinh lý bệnh của cytokine đã đạt được những thành tựu đáng kể Cytokine tham gia vào rất nhiều quá trình sinh học trong cơ thể như tạo phôi, sinh sản, tạo máu, đáp ứng miễn dịch, viêm Ngoài ra, các phân tử này cũng đóng vai trò quan trọng trong các bệnh lý như: bệnh tự miễn, nhiễm trùng huyết, ung thư, các bệnh lý viêm mạn tính (viêm đại tràng mạn, bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp, bệnh vảy nến ), viêm gan siêu vi, nhiễm HIV v.v Các cytokine cũng được sử dụng là các tác nhân trị liệu (yếu tố tạo khóm tế bào hạt được sử dụng trong huyết học) hay là các đích điều trị (như TNF trong bệnh Crohn, viêm đa khớp dạng thấp v.v )

Vì vậy hiện nay, việc nghiên cứu và sử dụng các loại cytokine tái tổ hợp đang mở ra một hướng điều trị tích cực mới trong y học Hàng loạt các cytokine khác nhau đã được nghiên cứu, sản xuất và thử nghiệm trong điều trị lâm sàng như: hIL-2, hIL-7, IFN-, G-CSF, GM-CSF, hIL-11 và EPO [45], [50] Ngoài

ra, còn có một số loại cytokine khác đã được sử dụng nhưng còn hạn chế do chưa kiểm soát được khả năng thải loại cũng như các hiệu ứng phụ khác như TNF-, hIL-12 v.v…

Các loại cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

và không đặc hiệu, do đó các hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào tác dụng

Trang 21

điều trị của cytokine như là một tác nhân dược lý hoặc đích tác động theo bốn hướng chính:

Dùng các chất đối vận với các cytokine được xem là có vai trò gây bệnh

Sử dụng các kháng thể kháng cytokine như kháng thể kháng TNF  trong điều trị nhiễm trùng huyết hoặc ức chế hIL-6 trong viêm đa khớp dạng thấp v.v…

Dùng các cytokine để kích thích các hoạt động sinh lý của cơ thể: erythropoietin trong điều trị thiếu máu, các yếu tố kích thích tạo khóm trong điều trị giảm bạch cầu v.v…

Sử dụng cytokine trong liệu pháp điều hoà miễn dịch, tự miễn dịch

hIL-6, hIL-7 được xác định như một yếu tố biệt hóa tế bào B, đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của các tế bào B huyết tương sản xuất kháng thể hIL-

6 kích hoạt tế bào B qua hoạt tính của chúng trên các nguyên bào huyết tương

và gần đây đã cho thấy gián tiếp kích hoạt tế bào B sản xuất kháng thể bằng cách hoạt hóa các tế bào T CD4 có đặc tính hỗ trợ tế bào B thông qua sự sản xuất IL-21 v.v…

Dùng cytokine trong điều trị nhiễm virus, bệnh ung thư: điều trị viêm gan bằng interferon, hIL-12 [27], [38], điều trị ung thư bằng hIL-2 v.v…

Một số thành tựu trong nghiên cứu và ứng dụng cytokine trong điều trị bệnh như: hIL- 11 và hIL-3 được sử du ̣ng để điều trị bệnh thrombocytopenia

do chúng có khả năng kích thích sự ta ̣o thành tiểu cầu [82] hIL-2 được sử dụng

để điều trị một số bệnh ung thư như ung thư biểu mô, ung thư mạch bạch huyết, đặc biệt là ung thư thận và da; hIL-7 được ứng dụng giúp hồi phục mạch bạch huyết sau khi phẫu thuật, sử dụng trong các bệnh suy giảm hệ miễn dịch như HIV/AIDS do có khả năng bảo vệ và thúc đẩy sản sinh các tế bào bạch cầu lympho T CD4+ và T CD8+ hIL-12 được sử dụng để làm tá chất cho sản xuất vaccine [6], [8]

Interferon là một nhóm trong số các nhóm chính của cytokine cũng có nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học Từ năm 1991, FDA đã đồng ý cho

Trang 22

sử dụng một số loại IFN để chữa một số bệnh do virus như HBV, HCV Những sản phẩm này gồm có interferon 2b (Intron A), interferon 2b (Roferon, infergen) và peginterferon (PEG-IFN) Đặc biệt, IFN có thể được đưa vào cơ thể bằng đường miệng với một liều lượng thấp hơn nhưng cho hiệu quả cao hơn đường tiêm [11]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng trong nước

Trong bối cảnh hiện nay, Bộ Y tế rất khuyến khích việc nghiên cứu tự sản xuất thuốc trong nước với giá thành rẻ và chất lượng tốt để chữa bệnh Cùng với những ưu điểm của các loại cytokine nói chung cũng như IL nói riêng, ở Việt Nam đã và đang có một số công trình nghiên cứu, chuyển giao công nghệ về việc sản xuất và ứng dụng các loại cytokine trong điều trị bệnh cho con người

Trong đó, nổi bật nhất là công trình nghiên cứu và sản xuất

interleukin-2 ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư năm interleukin-2010 do PGS TS Trương Nam Hải, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện đã thu được protein hIL-2 tái tổ hợp có độ tinh sạch 95% và có hoạt tính tốt, đang được triển khai sản xuất ở quy mô công nghiệp [1] Điều này

mở ra triển vọng rất lớn đối với bệnh nhân ung thư, khi theo đánh giá của tổ chức y tế thế giới WHO thì Việt Nam hiện đứng trong 50 nước top 2 của bản

đồ ung thư thế giới khi mỗi ngày có khoảng 315 người chết vì ung thư [100]

Ngoài ra, trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM đang tiến hành các nghiên cứu về cytokine hIL-33, thuộc họ cytokine tiền viêm hIL-1 (IL-1β, IL-1α, IL-1Ra, hIL-18, hIL-33) được phát hiện vào năm 2005 Cytokine hIL-33 giữ vai trò kích hoạt hệ thống miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng của

cơ thể chống lại tác nhân xâm nhiễm Ức chế hoạt động của hIL-33 có thể là liệu pháp tiềm năng cho việc điều trị các bệnh tự miễn như thấp khớp, hen suyễn, dị ứng quá mẫn v.v…, hIL-33 là một cytokine ít được nghiên cứu trên thế giới nhưng Việt Nam đã thành công trong việc thử nghiệm ứng dụng điều

Trang 23

trị hen suyễn ở chuột Hiện nhóm nghiên cứu của trung tâm Công nghệ sinh học TP HCM đang hướng đến mục tiêu tạo ra thuốc trị bệnh tự miễn như các loại thuốc ngoại nhập đang có mặt trên thị trường, từng bước tiến đến tự sản xuất thuốc phục vụ cho nhu cầu trong nước [2]

1.3 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN INTERLEUKIN 7 TÁI TỔ HỢP TRONG CÂY THUỐC LÁ

Sự phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp và thực vật chuyển gen đã tạo nền tảng cho việc sản xuất protein từ thực vật hoặc tế bào thực vật Những kết quả đầu tiên đã được công bố từ thập niên 80 của thế kỷ 20 [5] Việc sản xuất thành công hormone tăng trưởng của người trong cây thuốc lá và hạt hướng dương [10]; albumin trong thuốc lá và khoai tây [87] đã cho thấy hệ thống nuôi cấy thực vật có thể được sử dụng để sản xuất các protein của động vật có vú, trong đó có con người

Erythropoietin là một trong những cytokine đầu tiên được sản xuất bằng

tế bào thực vật cDNA mã hóa erythropoietin của người được biểu hiện qua promoter 35S của virus khảm súp lơ (CaMV) trong tế bào thuốc lá BY2, tuy nhiên năng suất còn thấp, chỉ đạt 0,0026% tổng số protein tan [51]

Tiếp sau erythropoietin thì yếu tố GM-CSF của người cũng được tập trung nghiên cứu, biểu hiện ở thực vật Ban đầu, chúng được biểu hiện trong thuốc lá [21],[46] và dịch treo tế bào lúa [39], [40], [84] Để tăng năng suất, các loại muối khoáng hoặc 5% (w/v) gelatin đã được bổ sung vào môi trường nuôi cấy, giúp sản lượng của hệ thống đạt 129 mg/l Ngoài biểu hiện trên cây thuốc

lá và tế bào lúa thì yếu tố GM-CSF còn được biểu hiện trên một số cây trồng khác như: trong lá mía chuyển gen là 0,02% [95], trong lá thuốc lá khoảng 0,22% của protein tan tổng số [28], trong hạt giống lúa chuyển gen GM-CSF tái tổ hợp tích lũy lên tới 1,3% của protein tan tổng số [79], đặc biệt hàm lượng GM-CSF biểu hiện cao nhất là ở khoai tây lên tới 2% protein tổng số với lớp

vỏ protein biến đổi [106] Trong hầu hết các trường hợp, các hoạt tính sinh học

Trang 24

của GM-CSF tái tổ hợp đã được chứng minh ở mức độ phòng thí nghiệm, và trên cơ thể sống trong mô hình chuột [61]

Bảng 1.1 Một số cytokine tái tổ hợp biểu hiện ở thực vật

Cytokine Cây

biểu hiện

Đặc điểm của cassette biểu hiện

Hàm lượng protein thu được

GM-CSF Mía Promoter Mubi-1 của ngô hoặc

Scubi-9 của mía

0,02% protein tan tổng số [92]

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1, Gt3 (glutelin) và tín

hiệu peptide, nos terminator

0,005 - 0,03% protein tan tổng số [77]

GM-CSF Thuốc lá Promoter Gt1 và tín hiệu peptide,

nos terminator

1,3% protein tan tổng

số [78]

GM-CSF Lúa Promoter Gt3α, tín hiệu peptide

glutelin, nos terminator

0,5 - 14 µg/hạt [41], [60]

IL-2 Khoai tây Promoter patatin, nos terminator 115 U/mg protein

IL-10 Thuốc lá

Promoter 35S cùng trình tự tăng cường, ELP, KDEL, nos

terminator

0,27% protein tan tổng số [68]

IL-10 Thuốc lá (A) Promoter 35S CaMV, có hoặc

không có his tag, peptide lục lạp

(A) 7 ng/mg protein tổng số (không có his

Trang 25

(B) Promoter 35S CaMV, his tag, peptide ty thể

tag); 43 ng/mg (có his tag)

(B) Không biểu hiện [52]

IL-12 Thuốc lá Promoter 35S và terminator 40 ng/g [29]

IL-12 Cà chua Promoter 35s cùng trình tự

tăng cường, 35S terminator

IL-18 Thuốc lá Promoter 35S, nos terminator

0,004 - 0,051% protein tổng số, 351 ng/g [103]

IFN-α2b

IFN-α2b Cà rốt

(A) Promoter 35S, nos terminator,

tín hiệu mục tiêu calreticulin (B) Promoter MLL, nos

terminator, tín hiệu mục tiêu calreticulin

(A) 26,8 x 103 U/g

FW của lá tươi (B) 8,56 x 103 U/g

Promoter 35S, nos terminator 3,1 x 104 IU/ml [34]

TNF-α Khoai tây Promoter 35S, trình tự SEKDEL 15 µg/g mô [66]

FGF8b Thuốc lá

Promoter 35S cùng hai trình tự tăng cường, 35S terminator, c-myc, his, KDEL

4,1% protein tổng số [73]

Trang 26

Ngoài ra, một số loại cytokine khác cũng được nghiên cứu biểu hiện như: IL-12 [29], [30], [77], [84], IL-13 [94], cardiotrophin 1 [42], IL-18 [103], yếu

tố hoại tử khối u TNF-α được biểu hiện trong khoai tây với hàm lượng tích lũy đạt khoảng 15 µg/1g mô thực vật [66]

Những kết quả này mở ra hướng nghiên cứu sử dụng thực vật như các bioreactor để sản xuất các protein có hoạt tính sinh học ổn định [32], ứng dụng trong y học

Ở Việt Nam, năm 2012, Phan Tường Lộc và cộng sự đã chuyển thành

công gen HIV-1 p24 và gen aadA vào lục lạp cây thuốc lá Virginia (V2), là

giống thuốc lá được nhập nội và thuần hóa ở Việt Nam cho năng suất cao

Gen HIV-1 p24 mã hóa cho protein p24 kháng nguyên vỏ của HIV Protein tái

tổ hợp p24 được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu như điều chế vaccine đa

thành phần và kit chẩn đoán HIV Gen aadA quy định tính kháng hai loại

kháng sinh spectinomycin và streptomycin, được dùng làm marker chọn lọc cây chuyển gen [3]

Hiện nay, ngoài phương thức biến nạp tạo cây chuyển gen, còn có thể sử dụng phương pháp biểu hiện tạm thời để biểu hiện protein ở thực vật

Hệ thống biểu hiện tạm thời cho thấy là một phương pháp thuận lợi để phân tích khả năng biểu hiện của protein đích trong thực vật do phương pháp này không bị ảnh hưởng bởi vị trí gắn gen đích trong hệ gen của thực vật, thời gian thực hiện ngắn, cho kết quả nhanh và đặc biệt là có thể biểu hiện được tốt ngay cả trên những mô đã biệt hóa hoàn toàn như lá [24] Hiện nay có hai phương pháp để biểu hiện tạm thời là sử dụng virus thực vật làm vector và phương pháp Agro-infiltration Tuy nhiên, phương pháp Agro-infiltration tỏ ra chiếm ưu thế hơn do mức độ biểu hiện protein cao, quy trình thực hiện đơn giản

và có thể chuyển những đoạn gen có kích thước lớn hơn so với phương pháp

sử dụng virus thực vật làm vector chuyển gen

Trang 27

Phương pháp Agro-infiltration đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

biểu hiện và sản xuất kháng nguyên của virus cúm gia cầm H5N1 với hàm

lượng cao tới 200 mg HA/kg lá tươi [101], 675 mg HA/kg lá tươi [56], 400 mg

NA/kg lá tươi [53] … Bằng cách sử dụng hệ thống biểu hiện tạm thời này,

Vaquero và đồng tác giả đã biểu hiện thành công scFv; chuỗi nặng, chuỗi nhẹ

của kháng thể [93] Phân tử kháng thể đầy đủ có thể biểu hiện bằng cách tiêm

đồng thời hai chủng vi khuẩn Agrobacterium mang riêng biệt chuỗi nặng và

chuỗi nhẹ vào lá cây Phương pháp biểu hiện tạm thời này phù hợp để kiểm tra

sự biểu hiện của protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật, đồng thời cũng để kiểm

tra sự hoạt động của cấu trúc vector vừa thiết kế trước khi tiến hành tạo cây

chuyển gen [23]

Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy thực vật là hệ thống có nhiều ưu

điểm để biểu hiện protein trong đó có protein interleukin 7 tái tổ hợp

Trang 28

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Vật liệu thực vật

Cây thuốc lá N benthamiana được cung cấp bởi phòng Công nghệ tế bào

thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

2.1.2 Các chủng vi khuẩn

Ca ́ c chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu được cung cấp từ Viện Công nghệ sinh ho ̣c - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam gồm:

Chủ ng vi khuẩn E coli DH-5α, A tumefaciens C58C1/pGV2260 mang

yếu tố phiên mã FUS3 được ứng dụng để đồng biểu hiện tạm thời với vector

đích chứa trong vi khuẩn Agrobacterium cho sự biểu hiện của protein tái tổ hợp

dưới sự kiểm soát của promoter CaMV 35S

Dòng tế bào 2E8 do Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC cung cấp được sử dụng để đánh giá bước đầu hoạt tính sinh học của interleukin 7

Vector chuyển gene pCB301 chứa gene kháng kháng sinh kanamycin

2.1.4 Ho ́a chất và thiết bi ̣ máy móc

Thang DNA 1kb (Fermentas), marker protein, Master Mix 2X (Promega), Kit tinh sạch DNA AccuPrep® Gel Purification, kit tách chiết plasmid (Bioneer)

Trang 29

Các loại hoá chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, agarose, trypton, KCl, HCl, EDTA, SDS Các loa ̣i kháng sinh kanamycin, chloramphenicol, carbenicillin, spectinomycin củ a các hãng Fermentas, Invitrogen, … Các loa ̣i enzyme sử du ̣ng của hãng Fermentas: BamHI, NcoI, HindIII, T4 ligase…

Tris-Thiết bị sử du ̣ng trong nghiên cứu: máy nghiền mẫu (Retsch), máy nuôi lắc, máy ly tâm la ̣nh (Hettich), máy PCR (Thermo Scientific), bộ điện di DNA(Biorad), bộ điện di protein, máy chu ̣p ảnh gel (Cleaver Scientific), thiết bi ̣ hấp khử trùng (Hirayama), máy đo quang phổ (Shimadzu), máy khuấy từ gia nhiệt (Velp), máy đo pH (Horiba), cân kỹ thuật, cân phân tích (Sartorius), buồng

an toàn sinh học cấp II (Esco), máy sấy Speed-Vac, ELISA reader …

2.1.5 Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.1 Trình tự mồi sử dụng trong đề tài

Sản phẩm (bp)

2.1.6 Đi ̣a điểm và thời gian nghiên cứu

Các thí nghiệm trong đề tài được thực hiện ta ̣i Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng du ̣ng, Phòng thí nghiệm tro ̣ng điểm về Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa ho ̣c và Công nghệ Việt Nam

Trang 30

2.2 PHƯO ̛ NG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

Trang 31

2.2.1 Phương pháp thay đổi mã di truyền gene interleukin 7 tối ưu biểu hiện ở thực vật

Cơ sở lý thuyết

Mã di truyền là phần mật mã quy định thông tin về trình tự các acid amin được mã hóa dưới dạng các trình tự nucleotide trên gene, trong đó ba nucleotide liên tiếp sẽ quy định một loại acid amin nhất định Acid amin có thể được quy định bởi nhiều bộ ba mã di truyền khác nhau [10], [43] Do đó, để phù hợp và tăng khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp của gene interleukin 7 trong hệ thống thực vật, chúng tôi tiến hành thay đổi những mã di truyền hiếm của gene ngoại lai interleukin 7 thành mã di truyền phổ biến trong thực vật mà không làm thay đổi trình tự acid amin của protein

Phương pháp

Quá trình thay đổi mã di truyền của gene interleukin 7 gồm các bước: Bước 1: Khai thác thông tin trình tự nucleotide gene interleukin 7 trên

Ngân hàng Gene quốc tế, mã số 3574 [28] và trình tự mRNA, mã số J04156.1

Bước 2: Thay thế các codon hiếm trong gene interleukin 7 bằng các

codon phổ biến ở thực vật bằng phần mềm Codon Optimization 2.0 dựa trên thông tin tần suất các codon phổ biến ở thực vật trong cơ sở dữ liệu mã di truyền Codon Usage Database [18] Ngoài ra, trình tự ATTTA được loại bỏ và sử dụng phần mềm Invitrogene để tối ưu nhằm giảm thiểu sự hình thành mRNA thứ cấp

Bước 3: Bổ sung các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn SacI, NcoI, HindIII, BamHI vào trình tự gene nhằm phục vụ cho quá trình cắt và ghép nối

gene khi thiết kế vector chuyển gene

Bước 4: Thêm đoạn trình tự mã hoá cho epitope c-Myc tag và His-tag

vào đầu 3’ của gene interleukin 7 để kiểm tra sự biểu hiện của protein interleukin 7 tái tổ hợp trong thực vật thông qua các phương pháp lai miễn dịch Western blot và phân tích ELISA

Trang 32

Bước 5: Sử dụng phần mềm BioEdit để kiểm tra và so sánh trình tự

nucleotide và trình tự acid amin suy diễn của gene interleukin 7 trước và sau khi đổi mã Gene interleukin 7 tái tổ hợp được đặt tổng hợp nhân tạo tại hãng Epoch Life Science (Mỹ) và được nhân dòng trong vector pBSK-IL7

2.2.2 Thiết kế mồi

Sử dụng phần mềm BioEdit và trình tự gene interleukin 7 tái tổ hợp cùng trình tự gene đã công bố trên Ngân hàng Gene quốc tế để thiết kế các cặp mồi phục vụ nghiên cứu trong luận án, thể hiện tại bảng 2.1

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gene mang gene interleukin 7 tái tổ hợp

Quá trình thiết kế vector chuyển gen gồm các bước chính sau: Bước 1 Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng lai; Bước 2 Ghép nối các đoạn gene tạo plasmid tái tổ hợp; Bước 3 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli DH-5 để nhân dòng; Bước 4 Chọn dòng khuẩn lạc bằng phương pháp colony-

PCR và kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme cắt giới hạn

a Nhân dòng gene IL-7

Đoạn gene IL-7 được nhân lên bằng phản ứng PCR sử dụng khuôn là plasmid pBSK-IL7 với cặp mồi đặc hiệu IL7_BamHI_F và IL7_BamHI_R Phản ứng PCR được tiến hành trong điều kiện: 50 µl hỗn hợp phản ứng gồm 0,3 µM mồi, 0,2 µM dNTPs, 5 µl đệm 10X Pwo SuperYield PC, 2,5U Pwo SuperYield DNA polymerase, 20 ng khuôn Chu trình nhiệt: 940C/5 phút, 30 chu kỳ lặp lại các bước 940C/30 giây, 500C/30 giây, 720C/1 phút 30 giây Sau

đó giữ 720C/10 phút và sản phẩm được giữ bảo quản ở 150C Kết quả PCR được kiểm tra trên gel agarose 0,8%

b Ghép nối gene IL-7 vào vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP

* Phản ứng cắt enzyme giới hạn

Enzyme giới hạn nhận biết các vị trí cắt đặc hiệu trên phân tử DNA Chúng phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA nhưng không làm ảnh hưởng

Trang 33

tới bases Các liên kết hóa học ở các gene bị enzyme giới hạn cắt có thể nối lại nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau cùng sự xúc tác của enzyme ligases

Phương pháp

Vector pRTRA 35S-TBAG-100xELP và gene IL-7 được cắt đồng thời

bằng enzyme giới hạn BamHI theo bảng 2.2

Phản ứng được ủ ở 370C trong vòng 2 - 4 giờ

* Phản ứng lai ghép đoạn gene IL-7 với pRTRA 35S-100xELP

Sản phẩm tinh sạch - đoạn gene IL-7 được ghép nối vào vector pRTRA 100xELP tạo plasmid tái tổ hợp mang gene IL-7 (ký hiệu pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP)

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 220C trong 1 giờ 30 phút

Đặt phản ứng trong đá và chuẩn bị thực hiện quá trình biến nạp vào tế

bào khả biến E.coli DH-5α

Trang 34

c Biến nạp sản phẩm ghép nối gene vào tế bào khả biến E.coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt

* Chuẩn bị tế bào khả biến

Phương pháp tạo tế bào khả biến

Tế bào khả biến E coli DH-5α được tạo theo phương pháp của Sambrook

và cộng sự (1998) có cải tiến ở bước rửa cặn khuẩn trong CaCl2 0,1M sau khi ly tâm Bước này được lặp lại ba lần, để trong đá lần đầu và thứ hai 30 phút, lần thứ ba 45 phút

* Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli DH-5α

Vector pRTRA 35S/IL7-cmyc-histag-100xELP được biến nạp vào tế bào

khả biến E.Coli DH-5α bằng phương pháp sốc nhiệt Quá trình biến nạp được

thực hiện như sau:

• Bổ sung 5 µl vector vào tế bào khả biến và đảo nhẹ

• Ủ trong đá 15 - 30 phút

• Sốc nhiệt ở 420C trong 1 phút 30 giây

• Để trong đá 15 - 30 phút

• Bổ sung 200 µl LB lỏng

• Nuôi lắc 200v/phút ở 370C trong 1giờ

• Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc carbenicillin 50 mg/L

• Nuôi qua đêm ở 370C

Trang 35

* Kiểm tra khuẩn lạc dương tính bằng kỹ thuật colony PCR

Kỹ thuật colony-PCR cũng giống như PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc Ở nhiệt độ cao (94-950C), màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp Plasmid tái tổ hợp này sẽ làm khuôn cho

phản ứng PCR nhân gene bằng cặp mồi đặc hiệu

* Tách chiết plasmid từ tế bào vi khuẩn

Dưới tác dụng của NaOH và SDS, thành tế bào vi khuẩn sẽ bị phá vỡ giải phóng DNA genome, các phân tử protein và DNA genome sẽ bị biến tính Khi thay đổi độ pH của dịch tách chiết tế bào bằng kali acetae, các phân tử protein và DNA genome sẽ bị kết tủa Phần protein còn sót lại, cùng với các mảnh vỡ của tế bào sẽ được tủa bằng hồn hợp chloroform : isoamylalcohol (24:1 v/v), sau ly tâm sẽ được tách khỏi phần dung dịch DNA plasmid DNA plasmid nằm ở pha trên được thu lại bằng cách tủa trong isopropanol và rửa lại bằng cồn 70% Sau đó, sử dụng nước deion khử trùng có bổ sung RNase 10µg/µl để hòa tan DNA plasmid và loại bỏ RNA có trong dung dịch

Phương pháp tách plasmid

Chúng tôi tiến hành nuôi cấy khuẩn lạc mang vector pRTRA cmyc-histag-100xELP đã được kiểm tra colony PCR trong môi trường LB

35S/IL7-lỏng có bổ sung carbenicillin 50 mg/L ở 370C qua đêm Các tế bào E.coli mang

plasmid sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng được cho vào ống eppendorf 2ml ly tâm thu cặn Bổ sung sol I (Glucose 50 mM, TrisHcl 25 mM; EDTA 10 mM

pH 8,0), voltex để hòa tan và ổn định tế bào Tiếp tục bổ sung sol II (NaOH 0,2N; SDS 1%), đảo nhẹ để phá vỡ thành và màng tế bào bằng kiềm và chất tạo sức căng bề mặt Tiếp tục bổ sung sol III (CH3COOK 3M, CH3COOH 5M), đảo nhẹ để biến tính và tủa DNA hệ gen và protein, phần tủa bị loại bỏ khỏi dung dịch chứa DNA plasmid bằng ly tâm, thu 800 µl dịch nổi Bổ sung 800 µl chloroform : isoamylalcohol (24 : 1 v/v), đảo nhẹ, ly tâm 13.000 rpm trong 10

Trang 36

phút, thu 500 µl dịch nổi phía trên, chuyển sang ống epppendorf 1,5 ml Bổ sung 1 ml isopropanol, ủ 30 phút trong -200C, ly tâm thu cặn Bổ sung 1ml ethanol 70%, ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, thu cặn Làm khô cặn bằng máy Speed-vac trong 2 phút Hòa tan DNA bằng 30 µl nước deion khử trùng có bổ sung RNase 10 µg/µl Bảo quản ở -200C

* Thiết kế cấu trúc tối ưu biểu hiện chuyển gen pCB301_IL7/ELP

Thực hiện phản ứng cắt vector pRTRA 35S-IL7-cmyc-histag-100xELP

và vector pCB301 bằng enzyme HindIII và loại bỏ gốc phosphate bằng enzyme SAP Sản phẩm ghép nối DNA vào vector pCB301 được biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH-5α và chọn lọc trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/l Plasmid tái tổ hợp pCB301_IL7/ELP sau khi được chọn

dòng bằng PCR và cắt kiểm tra bằng enzyme NcoI sẽ được biến nạp vào vi

khuẩn A.tumefaciens C58C1/pGV2260 bằng xung điện để phục vụ cho nghiên

cứu biểu hiện tạm thời

2.2.4 Biểu hiện tạm thời interleukin 7 ở cây thuốc lá

Quá trình biểu hiện tạm thời protein IL-7 gồm các bước chính sau: Bước 1: Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn: Chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector pCB301_IL7/ELP mã hóa cho protein IL-7 và chủng A.tumefaciens mang vector chứa gene mã hóa cho protein HcPro ức chế câm

gene hoạt động trong cây được nuôi cấy riêng trong 200ml môi trường YEB có

bổ sung kháng sinh kanamycin 50 mg/ml và rifamycin 50 mg/ml, nuôi lắc qua

đêm ở 280C, 140 rpm Sau 24 giờ, chuyển 50 ml dịch khuẩn sang bình lớn, bổ sung 500 ml môi trường LB với kháng sinh thích hợp vào hai bình nuôi cấy, nuôi thêm 24 giờ, ở 280C, 140 rpm Ly tâm 4000 rpm, 10 phút, 40C để thu cặn khuẩn, hòa trong buffer (10 mM 2 - N - morpholimo MES acid ethanesulphonic, 10 mM MgSO4, pH 5,6) Trộn lẫn 2 dịch khuẩn, pha loãng trong đệm để nồng độ khuẩn cuối cùng OD600 0,5 chuẩn bị cho quá trình biến

nạp vào cây thuốc lá N.benthamiana

Trang 37

Bước 2 Chuẩn bị cây thuốc lá N benthamiana

Cây con sau giai đoạn nuôi cấy invitro khoảng 4 tuần tuổi được tiến hành

ra cây bầu nhỏ Sau 1 - 1,5 tuần chuyển cây từ bầu nhỏ sang bầu lớn, mỗi ngày tưới 1 - 2 lần nước Khi cây 4 - 6 tuần và có từ 8 đến 12 lá sẽ được sử dụng để biến nạp infiltration

2.2.5 Phân ti ́ch các dòng chuyển gen bằng kỹ thuật sinh ho ̣c phân tử

2.2.5.1 Ky ̃ thuật PCR

DNA tổng số từ các dòng chuyển gene được tách chiết và sử du ̣ng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu IL7_F và IL7_R Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%

2.2.5.2 Lai Western blot

Wertern blot hay còn gọi là protein immuno blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (kháng nguyên - kháng thể) Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang Phương pháp này sử dụng điện di trên gel acrylamide để phân tách các protein theo độ dài của mạch polypeptide Sau đó, chuyển lên màng lai (thường dùng màng nitrocellulose hoặc màng PVDF), ở đó chúng được gắn bằng các kháng thể đặc hiệu để phát hiện protein mục tiêu

Trang 38

Phương pháp

Ta ́ ch chiết protein tan tổng số

Thu 1 gam sinh khố i nghiền thành bột mi ̣n trong nitơ lỏng bằng cối chày

sứ , bổ sung đệm PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X Thu di ̣ch nghiền vào ố ng eppendorf 2ml, ly tâm 10.000 rpm ở 4oC, thu dịch protein ở phía trên Protein tổng số đươ ̣c đi ̣nh lươ ̣ng bằng phương pháp so màu của Bradford (1976) [20] dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự đổi màu xảy ra khi CBB (Coomasie Brilliant Blue) liên kết với protein trong dung dịch acid

Điện di protein tổng số và chuyển màng

Protein được phân tách bằng điện di SDS-PAGE 12% trong điều kiện không khử , sau đó chuyển lên màng nitrocellulose bằng máy chuyển màng Fast blotter G2 (Thermo Scientific Pierce) ở 25V, 1,3A trong 20 phút Tháo màng, tráng bằng nước deion trong 5 phút

* Tris HCl 1,5M; pH 8,8 cho gel tách

Tris HCl 0,5M, pH 6,8 cho gel cô

Blocking protein

Protein trên màng lai được blocking bằng sữa tách béo 5% (pha trong PBS 0,05% Tween); ủ với kháng thể 1 anti c-myc nồng độ 180 µg/ml pha loãng

Trang 39

tỷ lệ 1 : 100 qua đêm ở 40C, rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 5 phút; ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hợp HRP (Horseradish Peroxidase) pha loãng tỷ lệ 1 : 10.000 trong 1 giờ Rửa màng bằng dung dịch PBST 3 lần, mỗi lần 10 phút

Hiện màu protein

Sự có mặt của protein interleukin 7 trong mẫu được phát hiện nhờ phản ứng hiện màu bằng cơ chất DAB (Diaminobenzidine) trong 15 phút đến khi hiện băng màu nâu

2.2.5.3 Sử dụng kỹ thuật ELISA để phân tích sự tích lũy IL-7 tái tổ hợp

Kỹ thuật ELISA gián tiếp đi ̣nh lượng protein interleukin 7 thông qua

đi ̣nh lượng protein c-myc được tiến hành theo phương pháp của Sun và cộng sự

với một số cải tiến (2006) [88], gồm các bước chính: Bước 1: Pha loãng dịch chiết protein tổng số củ a các mẫu chứa interleukin 7 đến nồng độ 200 μg/ml,

sử dụng 100 μl mẫu tra vào các ô trên đĩa microplate, mỗi mẫu lặp la ̣i 3 lần;

Bước 2: Ủ qua đêm ở 40C; rử a đĩa 2 lần bằng PBS-T (Tween 0,05%); Bước 3:

Blocking bằng sữa tách béo 5% pha trong PBS trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng;

rử a đĩa 2 lần; Bước 4: Ủ với kháng thể 1 anti c-myc (180μg/ml) pha loãng 1:100

trong 2 giờ ; lặp lại 3 lần; Ủ với kháng thể 2 là kháng thể IgG cộng hơ ̣p HRP (Thermo scientific Pierce) pha loãng 1:10.000 trong 1 giờ và cơ chất hiện màu

là TMB; Bước 5: Dùng HCl 1N để dừng phản ứng màu; Đo màu ở bước sóng

630nm

2.2.6 Tinh sạch protein tái tổ hợp interleukin 7

Để loại bỏ ảnh hưởng của các protein không đặc hiệu, đồng thời làm tăng

độ tinh sạch qua đó làm tăng hoạt tính và khả năng sử dụng của protein, chúng tôi tiến hành tinh sạch protein IL-7 Dựa trên cấu trúc gene interleukin 7 tái tổ hợp đã thiết kế, chúng tôi sử dụng phương pháp tinh sạch sử dụng cột sắc ký ái lực Ni-NTA (IMAC) và phương pháp tinh sạch đảo chiều thuận nghịch qua màng mITC

Trang 40

2.2.6.1 Phương pháp tinh sạch IMAC

Đây là phương pháp sử dụng ái lực giữa cấu tử gắn (ligand) và protein cần tách Cột sắc ký ái lực có chứa các hạt gel Sepharose có gắn ion Ni2+ trên bền mặt Khi tiến hành sắc ký, protein cần tách do có histidine nên sẽ gắn với các ion Ni2+ trong khi các loại protein khác sẽ bị rửa trôi Sau khi rửa sạch tạp chất, protein cần tách được thu nhận lại bằng cách sử dụng Imidazole, chất này

sẽ cạnh tranh vị trí gắn với ion Ni2+ Kết quả giúp thu nhận được protein đích với độ tinh sạch cao

Phương pháp

* Chuẩn bị cột

Lắc đều lọ đựng Pro BondTM resin Hút 2ml dung dịch cho vào cột tinh sạch, để lắng dần hoặc ly tâm 800 rpm trong 1 phút, hút bỏ dịch

Bổ sung 6 ml nước deion khử trùng, đảo đều Để lắng hoặc ly tâm, hút

bỏ dịch Bổ sung 6 ml Native binding buffer, đảo đều, ly tâm bỏ dịch, thực hiện

2 lần

* Tinh sạch

Thêm dung dịch đã siêu âm và lọc vào cột, đảo đều trong 30 - 60 phút

Ly tâm, thu cặn; phần dịch để riêng Tiếp tục bổ sung 8 ml Native wash buffer vào cột Ly tâm thu cặn; phần dịch để riêng Lặp lại 4 lần

Bổ sung 8 - 12 ml Native Elution buffer, thu từng phân đoạn 1 ml để điện

di kiểm tra

2.2.6.2 Phương pháp tinh sạch mITC

Nghiền 100 g lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ Bổ sung 200 ml HCl 50 mM (pH 8) lạnh Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC Bổ sung NaCl đến nồng độ 2M Ly tâm 25.000 rpm trong 30 phút ở 4oC Dung dịch đưa qua màng polyethersulfone (PES) 0,22 µm ở 40C để thu dịch chiết trước xử lý Dịch chiết được làm ấm đến nhiệt độ phòng và lọc qua màng cellulose acetate 0,2 µm

Định dạng
Số trang	82
Dung lượng	2,12 MB
File đính kèm	Bao cao tong ket de tai cap DH 2014.pdf.zip (2 MB)