Nghiên cứu khả năng phân huỷ hợp chất thơm của các chủng vi khuẩn tạo màng sinh học, nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước ô nhiễm dầu

Đánh giá khả năng phân hủy PAH của màng sinh học biofilm do các chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành .... BẢNG CHỮ VIẾT TẮT BaP : Benzo[a]pyren BOD : Biological oxigen demand Nhu cầu oxy si

MỤC LỤC

MỤC LỤC 1

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG 4

DANH MỤC HÌNH 5

MỞ ĐẦU 7

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9

1.1 Tình trạng nước ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Việt Nam 9

1.2 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocacbon vòng thơm đa nhân 10

1.2.1 Tính chất hóa lý 10

1.1.2 Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới môi trường và sức khỏe con người 13

1.2 Nguồn gốc phát sinh 16

1.2.1 Nguồn tự nhiên 16

1.2.2 Nguồn do hoạt động của con người: 17

1.3 Các biện pháp xử lý ô nhiễm PAH 18

1.3.1 Phương pháp hóa lý 18

1.3.2 Phương pháp phân hủy sinh học 20

1.3.2.1 Phân hủy sinh học PAH 21

1.3.2.2 Công nghệ sử dụng màng sinh học trong xử lý nước thải 23

1.3.2.3 Ứng dụng biofilm trong xử lý nước thải ở nước ta 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng 26

2.1.1 Nguyên liệu 26

2.1.2 Hóa chất, môi trường nuôi cấy 26

2.1.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Thu thập mẫu 28

2.2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH 28

2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt nhất trên môi

trường có chứa cơ chất PAH 30

2.2.4 Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn 30

2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý và nồng độ cũng như loại PAH đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn 32

2.2.6 Đánh giá khả năng phân hủy PAH của màng sinh học (biofilm) do các chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành 32

2.2.6.1 Quy trình tạo biofilm đa chủng 32

2.2.6.2 Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocacbon thơm bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường chứa PAH 35

3.2 Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học (biofilm) từ các chủng đã lựa chọn 38

3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý và nồng độ cũng như các loại PAH đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn 41

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 41

3.3.2 Ảnh hưởng của pH 44

3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl 46

3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ và loại PAH 48

3.4 Đánh giá khả năng phân hủy PAH của màng sinh học do các chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

KIẾN NGHỊ 56

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Phụ Lục 63

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

BaP : Benzo[a]pyren

BOD : Biological oxigen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa)

DNA : Deoxyribonucleic Acid

EPS : Extracellular Polymeric Substance (Polyme ngoại bào)

GAC : Granular activated carbon (Than hoạt tính dạng hạt)

GC-MS : Gas chromatography Mass Spectroscopy (Sắc ký khí khối phổ)

HAAs : Haloacetic acids

HKTS : Môi trường hiếu khí tổng số

LB : Luria Bertani

LC50 : Lethal Concentration (Nồng độ của hóa chất có thể tiêu diệt 50% các

loài động vật thử nghiệm trong một thời gian nhất định)

MPA : Môi trường Meat-Peptone-Agar

NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông

tin Công nghệ Sinh học Quốc gia)

NOMs : Natural Organic Matters (các chất hữu cơ tự nhiên)

OD : Optical Density (Mật độ quang)

PAHs : Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (Hợp chất hydrocarbon thơm đa

vòng)

PAC : Powered activated carbon (Than hoạt tính dạng bột)

PCBs : Polychlorinated biphenyls

ppm : Parts per million (Đơn vị một phần triệu)

RNA : Ribonucleic Acid

rRNA : Ribosomal Ribonucleic Acid

USEPA : United States Environmental Protection Agency (Cơ quan bảo vệ môi

trường Mỹ)

WHO : World Health Organization

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1: Công thức hóa học, trọng lƣợng phân tử và cấu trúc hóa học của một số

loại PAH 10

Bảng 1 2: Tính chất vật lý của một số loại PAH 12

Bảng 2 1: Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài 27

Bảng 3 1: Hình thái khuẩn lạc của 10 chủng vi khuẩn đã sàng lọc đƣợc 37

Bảng 3 2: Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của 5 chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn 40

Bảng 3 3: Kết quả phân loại và định tên của 5 chủng vi khuẩn lựa chọn 41

Bảng 3 4: Sự thay đổi hàm lƣợng naphthalene, anthracene, pyren trong các mẫu nghiên cứu 53

Hình 3 2 Tập đoàn vi sinh vật trên môi trường khoáng Gost và PAH: không chứa

glucose (A), có chứa glucose (B) 36

Hình 3 3 Biofilm của 10 vi khuẩn tuyển chọn tạo thành sau 24 h nuôi cấy được

nhuộm với dung dịch tím tinh thể 0,1% 38

Hình 3 4 Đồ thị mật độ quang phổ đánh giá khả năng hình thành biofilm 39 Hình 3 5 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng B11 và B17 trên

môi trường chứa PAH 42

Hình 3 6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng B21 và B24 trên

môi trường chứa PAH 43

Hình 3 7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng B23

trong môi trường chứa PAH 43

Hình 3 8 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng B11 và

chủng B17 trên môi trường chứa PAH 44

Hình 3 9 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của chủng B21 và chủng B24 45 Hình 3 10 Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng của chủng B23 45 Hình 3 11 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl lên sự sinh trưởng của các chủng vi

Hình 3 14 Ảnh hưởng của nồng độ naphthalene 200 ppm lên sự sinh trưởng của

các chủng vi khuẩn B11, B17, B21, B23, B24 sau 9 ngày nuôi 49

Hình 3 15 Ảnh hưởng của nồng độ anthracene 400 ppm lên sự sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn B11, B17, B21, B23, B24 sau 9 ngày nuôi 50

Hình 3 16 Ảnh hưởng của nồng độ pyren 350 ppm lên sự sinh trưởng của các

chủng vi khuẩn B11, B17, B21, B23, B24 sau 9 ngày nuôi 50

Hình 3 17: Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lựa chọn

trong màng sinh học trên nguồn cơ chất: (A) naphthalene 200ppm, (B) anthracene 450ppm, (C) pyrene 400ppm 52

MỞ ĐẦU

Công nghiệp dầu khí là một ngành kinh tế-kỹ thuật quan trọng trong chiến lược phát triển kinh tế của đất nước Sau hơn 30 năm xây dựng và phát triển, ngành Dầu khí Việt Nam đã có những bước tiến vượt bậc, tuy nhiên quá trình khai thác, vận chuyển, chế biến và lưu trữ dầu hiện đang phát thải ra môi trường một lượng lớn các chất thải độc hại như: phenol, aldehyte, các hợp chất chứa lưu huỳnh: S2O32-,Na2S và đặc biệt là các hydrocacbon thơm đa vòng (PAHs - Polycyclic Aromatic Hydrocarbons)

PAHs là những hợp chất hữu cơ chứa hai hay nhiều vòng hydrocarbon thơm liên kết với nhau, chúng là thành phần có trong các sản phẩm của dầu mỏ đặc biệt

là dầu FO Khi PAHs bị xả thải vào môi trường chúng phát tán vào đất, không khí, các nguồn nước và các lớp trầm tích, PAHs trong tự nhiên thường tồn tại ở dạng hỗn hợp chúng có thể xâm nhập vào cơ thể con người và ảnh hưởng tới các cơ quan trong cơ thể, ở mức độ gen chúng có thể gây ra đột biến, bởi chúng có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những biến đổi ở mức phân tử Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều phương pháp xử lý khác nhau được đề xuất và áp dụng, đặc biệt là các biện pháp xử lý theo phương pháp phân hủy sinh học do có nhiều ưu điểm như: không đòi hỏi các điều kiện phức tạp, không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân thiện với môi trường, chi phí thấp Tuy nhiên phương pháp này cũng có một số mặt hạn chế như: thời gian xử lý còn kéo dài, quá trình xử lý còn phụ thuộc vào dạng vi sinh vật, hiệu quả xử lý còn phụ thuộc vào khả năng phân hủy và các điều kiện tối ưu của các chủng vi sinh vật

Để khắc phục được những nhược điểm trên, công nghệ phân hủy sinh học đã

và đang được ứng dụng rộng rãi Trong số các công nghệ phân hủy sinh học, công nghệ sử dụng màng sinh học (biofilm) được xem là mới và có hiệu quả trong xử lý

ô nhiễm các hợp chất PAH Biofilm là một tập hợp bao gồm nhiều tế bào vi sinh vật của một hoặc một số loài được tạo thành trên một bề mặt hoặc mặt phân cách của môi trường nước và không khí, các cá thể trong biofilm có thể chịu được các ảnh hưởng khắc nghiệt hoá, lý của môi trường Thêm vào đó, nhờ quá trình hình thành

biofilm, các sinh vật này có thể hấp thụ được các chất dinh dưỡng tốt hơn, tạo được mối liên hệ giữa các tế bào với nhau và hạn chế được sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác trong cùng điều kiện môi trường sống

Từ những yêu cầu thực tiễn nêu ra ở trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu khả năng phân hủy hợp chất thơm của các chủng vi khuẩn tạo màng sinh học, nhằm định hướng ứng dụng trong xử lý nước ô nhiễm dầu”

Với mục đích tìm kiếm ra các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy các PAH tốt và

có khả năng tạo màng cao để gắn vào các giá thể đưa vào hệ thống xử lý nước ô nhiễm dầu

Các nội dung nghiên cứu chủ yếu bao gồm:

1 Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm cao từ hố thu nước thải các bể chứa của kho xăng B12

2 Đánh giá khả năng tạo màng của các chủng vi khuẩn đại diện

3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện hóa lý và nồng độ cũng như các loại PAH đến khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn

4 Đánh giá khả năng phân hủy các PAH của màng sinh học (biofilm) do các chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình trạng nước ô nhiễm dầu trên thế giới và ở Việt Nam

Ngày nay, dầu mỏ là một trong những mối quan tâm hàng đầu đối với tất cả các nước trên thế giới, nó đe dọa nguồn an ninh năng lượng của toàn cầu Hầu như dầu mỏ và các sản phẩm từ dầu mỏ có mặt trong tất cả các hoạt động kinh tế cũng như sinh hoạt hàng ngày của con người Đi đôi với những lợi ích từ việc thu hồi dầu, chúng ta còn phải đối mặt với những nguy cơ ô nhiễm do chúng gây ra Hàng năm có khoảng 10 triệu tấn dầu trên thế giới bị thất thoát gây ô nhiễm môi trường Theo thống kê của ITOPF (International Tanker Owners Pollution Federation) trên thế giới từ năm 1970 đến năm 2011 đã có 5,7 tấn dầu bị thoát ra môi trường do sự

cố tràn dầu và có xu hướng giảm dần qua các năm tuy nhiên các vụ tràn dầu lớn lại xảy ra nhiều hơn Nguyên nhân và sự cố tràn dầu xảy ra rất khác nhau, ảnh hưởng đáng kể đến lượng dầu tràn ra môi trường Các vụ tràn dầu nhỏ (≤ 7 tấn) và trung bình (≤ 700 tấn) chủ yếu do các hoạt động vận chuyển, tháo dỡ và chiếm 95% tổng

số vụ dầu tràn, trong khi đó các vụ tràn dầu lớn (> 700 tấn) chỉ chiếm 5%, dầu tràn

là do hoạt động thăm dò, khai thác và các vụ tai nạn, sự cố gây ra [51]

Việt Nam là nước đứng thứ tư về khai thác dầu khí ở khu vực Đông Nam Á sau Malysia, Indonesia, Philippine và đứng thứ 44 trong danh sách các nước sản xuất dầu lửa trên thế giới Từ năm 1987 đến nay, đã xảy ra hơn 90 vụ tràn dầu, gây

ra tổn thất lớn về sinh thái và kinh tế xã hội Trong đó, có ba nguyên nhân chính dẫn đến sự cố tràn dầu là do va chạm, quá trình bốc dỡ và đắm tàu Lượng dầu tràn gây

ô nhiễm biển Việt Nam đến năm 1992 là 7.380 tấn, năm 1995 là 10.020 tấn và theo mức độ gia tăng của vận tải biển, khai thác dầu khí và công nghiệp hóa, năm 2000 lên đến 17.650 tấn Dự báo đến năm 2010, lượng dầu tràn gây ô nhiễm biển Việt Nam có thể lên đến trên 21.000 tấn [4] Theo báo cáo của Tổng cục môi trường, hiện trạng ô nhiễm vùng ven biển Việt Nam năm 2010 thì Vịnh Hạ Long là nơi ô nhiễm dầu mạnh nhất cả nước, vùng nước cảng Cái Lân có thời điểm hàm lượng dầu trong nước biển đạt tới 1,75 mg/l gấp 18 lần tiêu chuẩn Việt Nam (tiêu chuẩn nước mặt ven biển

của việt nam là 0,1mg/l), có đến 1/3 diện tích bề mặt vịnh thường xuyên có hàm lượng dầu từ 1 đến 1,73 mg/l [49]

Nước ô nhiễm dầu có ảnh hưởng nghiêm trọng đến hầu hết các sinh vật sinh sống, hoạt động trong khu vực này, do trong nước ô nhiễm dầu có nhiều thành phần độc hại như: benzen, phenol, toluen và đặc biệt là PAHs, đây là những hợp chất hữu cơ chứa vòng thơm độc hại, khó phân hủy và là một trong những tác nhân gây ra mùi khó chịu gây tác động xấu tới môi trường sinh thái, ảnh hưởng tới sản xuất nông nghiệp, gia tăng bệnh tật và tỷ lệ người mắc bệnh ngay cả ở nồng độ rất thấp, nó cũng là tác nhân tiềm ẩn gây ung thư Chính vì vậy, việc loại bỏ PAHs ra khỏi nguồn nước thải là một việc làm cần thiết và cấp bách

1.2 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocacbon vòng thơm đa nhân

1.2.1 Tính chất hóa lý

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons viết tắt là PAHs được sử dụng để chỉ các hợp chất hữu cơ gồm hai hay nhiều vòng benzen liên kết với nhau Có hàng trăm loại PAH khác nhau được tìm thấy trong đó có 17 loại PAH được nghiên cứu tỉ mỉ bởi độ độc hại và khả năng gây ung thư của chúng đối với con người (Bảng 1.1)

Bảng 1 1: Công thức hóa học, trọng lượng phân tử và cấu trúc hóa học của

một số loại PAH [16, 50]

học

Trọng lượng phân tử (g/mol) Cấu trúc hóa học

Thông thường PAH tồn tại ở dạng hỗn hợp, ít thấy ở dạng đơn lẻ Tại nhiệt

độ thường (từ 15-35oC), PAH tinh khiết tồn tại ở thể rắn, không màu hoặc có màu

trắng hay màu vàng chanh và có mùi hăng nhẹ Tùy thuộc vào khối lượng phân tử

mà các PAH có những tính chất vật lý, hoá học khác nhau

PAH là những chất kỵ nước, những đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển của chúng ta Nói chung, PAH tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [19] Khả năng hòa tan của PAH rất đa dạng, từ những chất khó hòa tan nhất như indeno (1,2,3-c,d) pyrene với chỉ số hòa tan là 0, 19 µg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất như naphthalen có thể hòa tan tới 34,4 mg/l Khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích Điều này ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng phân hủy sinh học của vi sinh vật đối với hợp chất này [14] Một số đặc tính cơ bản của PAH được

mô tả trong bảng 1.2

Bảng 1 2: Tính chất vật lý của một số loại PAH [16]

PAH Độ tan trong nước

(mg/l) LogKow Áp suất hơi (Pa)

Perylene 0,00040 6,50 5,31 x10-9

Dibenzo(a,h)anthracene 0,00050 7,19 1,33 x10-8

Benzo(g,h,i)perylene 0,00026 6,85 1,39 x10-8

Kow: là hệ số phân ly octanol trong nước

Hệ số Kow tỷ lệ nghịch với độ hòa tan trong nước của PAH, khi hệ số Kowcao khả năng hòa tan của PAH giảm, các PAH có xu hướng tăng khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn tương ứng với sự giảm khả năng phân hủy sinh học

Áp suất hơi cũng có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các địa điểm ô nhiễm, nó ảnh hưởng đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH bởi khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi cũng tăng [31]

PAH là hợp chất tương đối trơ về mặt hoá học, do được cấu tạo từ những vòng benzene nên PAH có tính chất của hydrocacbon thơm: chúng có thể tham gia phản ứng thế và phản ứng cộng PAH còn tham gia phản ứng quang hóa trong không khí Sau sự quang phân của PAH trong không khí, nhiều sản phẩm ôxi hóa

đã được hình thành, bao gồm quinon và endoperoxit PAH có thể phản ứng với oxit nitơ, axit nitric để hình thành các dẫn xuất nitơ của PAH và phản ứng với oxit lưu huỳnh, axit sulfuric trong dung dịch để hình thành sulfinic và axit sulfonic PAH cũng có thể tham gia phản ứng với ozon và gốc hydroxyl trong không khí

1.1.2 Tính độc và ảnh hưởng của PAH tới môi trường và sức khỏe con người

PAH sau khi hấp thụ vào cơ thể qua đường hô hấp, đường tiêu hóa và da chúng đi vào hệ tuần hoàn máu và được vận chuyển trong vòng tuần hoàn máu bằng nhiều cách khác nhau như: hòa tan trong huyết tương, hấp thụ trên bề mặt hồng cầu hoặc gắn với các thành phần khác của hồng cầu Sau đó chúng được phân bố vào các mô của các cơ quan khác nhau trong cơ thể nhờ hệ tuần hoàn, ở đây các PAH chịu tác động của những chuyển hóa sinh học khác nhau sản phẩm của chúng là những dẫn xuất có thể đào thải được và những dẫn xuất độc có hoạt tính mạnh và độc hơn so với PAH

Tính độc của PAH có thể biểu hiện qua:

- Nhiễm độc cấp tính: Các tế bào hồng cầu bị phá hủy nếu ngửi một lượng lớn hơi naphtalen [39]

- Nhiễm độc mãn tính: Với hỗn hợp chứa PAH như benzo[a]pyrene, chrysene, benz[a]anthracene, benzo[b]fluoranthene, và dibenz[a,h]anthracene có thể gây ung thư phổi đối với những người làm việc trong hầm lò than đá, hầm lò phát

xạ lộ thiên và khói thuốc lá [13]

- Gây độc tế bào, gây độc gen và gây ung thư: Trong các nghiên cứu gần đây, một số PAH đã được chứng minh là gây tổn hại tới DNA và là nguyên nhân gây ra đột biến mà trong một số trường hợp có thể dẫn đến ung thư Tuy nhiên, PAH không phải là hợp chất ban đầu phản ứng với DNA, chúng là tác nhân kích hoạt trao đổi chất và chuyển đổi để hiển thị tác nhân gây ung thư genotoxic, chính các tác nhân này sẽ phản ứng với DNA, cơ chế này thường xảy ra ở sinh vật chuyển hóa bậc cao [36] Mặt khác khi PAH xâm nhập vào cơ thể chúng không tích lũy như một số hợp chất hữu cơ tan trong mỡ khác, ví dụ PCBs Thay vào đó, chúng chuyển đổi sang dạng hợp chất có thể hòa tan trong nước nhiều hơn, chính điều này cũng có thể dẫn đến sự hình thành các chất trung gian có thể phản ứng với các DNA làm rối loạn hoạt động bình thường của gen, gây những đột biến trên gen và làm ảnh hưởng đến nhiều chức năng khác nhau của tế bào [27]

Một trong những ví dụ điển hình nhất về khả năng gây ung thư của PAH là Benzo[a]pyren (BaP) BaP là một thành phần trong khói thuốc lá, và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi do thuốc lá [13, 26] Có rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh BaP có thể chuyển hóa thành các loại epoxyd với sự xúc tác của phức hệ enzyme Cytochrom P450 có nhiều trong gan và ruột non (hình 1.1), mà những epoxyd này có thể phản ứng với các DNA gây đột biến [27]

Hình 1 1 Quá trình chuyển hóa của Benzo[a]pyren dưới sự xúc tác của phức hệ

Cytochrom P450 [27]

Mức độ gây độc của PAH còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: liều lượng, thời gian tiếp xúc, loại PAH, qua đường hấp thụ (ăn, uống, tiếp xúc qua da, v.v…), các hợp chất khác mà người đó đang bị nhiễm, các yếu tố sinh học, ví dụ như tuổi, giới tính, yếu tố di truyền, tình trạng sức khỏe và chế độ dinh dưỡng [23]

Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ đã đưa ra mức nồng độ an toàn của PAH trong quá trình tiếp xúc không gây hại cho sức khoẻ Ví dụ: Không nên tiếp xúc với một số chất PAH tại những nồng độ lớn hơn những mức sau: 0,3 mg anthracene/kg

cơ thể người, 0,06 mg acenaphthene/kg cơ thể người, 0,04 mg fluoranthene/kg cơ thể người, 0,03 mg pyrene/kg cơ thể người v.v…

Hàm lượng từng PAH đơn lẻ được giải phóng ra môi trường theo EPA có thể gây ung thư trên người là: 1 pound (tương đương với 2,2 kg) đối với benzo[b]fluoranthene, benzo[a]pyrene hoặc dibenz[a,h]anthracene; 10 pounds đối với benz[a]anthracene; 100 pounds đối với acenaphthene, chrysene, fluoranthene hay indeno[ 1,2,3-c,d]pyrene; hay 5000 pounds đối với acenaphthylene, anthracne, benzo[k]fluoranthene, benzo[g,h,i]perylene, fluorene, phenanthrene hoặc pyrene [43]

Một vài nghiên cứu khác cũng đã được tiến hành trên đối tượng động, thực vật Kết quả cho thấy động vật nếu tiếp xúc với naphtalen ở nồng độ cao, thì chỉ trong thời gian ngắn cũng có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải Hiệu ứng mạnh hơn, có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với chim, cá, động vật và thực vật Ngưỡng độc của naphtalen cho loài cá vược đã xác định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm) Người ta cũng thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracen với lượng 1,8 mg Kết quả thu được sau hai tuần gây nhiễm là 40% chuột thấy có khối u [26, 38] Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [44, 47]

Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã liệt PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn Để phòng tránh sự xâm nhập của PAH, chúng ta cần hạn chế và kiểm soát sự phát sinh của những hợp chất này trong sản xuất và sinh hoạt Ví dụ như giảm thiểu việc sử dụng những nguồn nguyên, nhiên liệu có thể sản sinh ra PAH trong giao thông và công nghiệp, kiểm soát nghiêm ngặt các quá trình đốt để tránh các quá trình cháy không hoàn toàn của một số lò đốt rác thải, hạn chế hút thuốc và ăn các sản phẩm nướng cháy [41]

1.2 Nguồn gốc phát sinh

PAH được hình thành chủ yếu từ 2 nguồn: nguồn tự nhiên và nguồn xuất phát từ hoạt động của con người liên quan đến quá trình nhiệt phân ở nhiệt độ cao, quá trình đốt cháy không hoàn các hợp chất hữu cơ [37]

1.2.1 Nguồn tự nhiên

Các vụ cháy rừng, các phản ứng địa nhiệt, quá trình hóa thạch, các vụ núi lửa phun trào,và các chất hữu cơ trong tự nhiên phân hủy cũng là nguồn tự nhiên quan trọng, góp phần phát thải PAH vào môi trường Mức độ phát thải PAH phụ

thuộc vào điều kiện khí tượng, chẳng hạn như gió, nhiệt độ, độ ẩm và đặc điểm của nguồn phát thải như: độ ẩm, loại gỗ và theo mùa…

1.2.2 Nguồn do hoạt động của con người:

- Các sinh hoạt hàng ngày của con người như: Sử dụng quá trình đốt cháy

nhiên liệu: gỗ, than, dầu, khí để sưởi ấm và nấu ăn Theo báo cáo của Tổ chức Y tế

Thế giới (WHO) gần đây cho biết hơn 75% người dân ở Trung Quốc, Ấn Độ và Đông Nam Á và 50-75% dân số của Nam Mỹ và châu Phi sử dụng nhiên liệu rắn như gỗ, để nấu ăn hàng ngày và PAH phát thải do quá trình này chiếm 32,8% tổng

số PAH phát thải do quá trình sinh hoạt [45, 48]

- Các quá trình công nghiệp như: Khí thải từ các ngành công nghiệp được sản xuất bằng nhiên liệu đốt cháy như xăng, dầu và than, PAH cũng có thể được phát thải trong quá trình chế biến nguyên liệu như: nhôm, than cốc, hoặc quá trình sản xuất như: công nghiệp hóa dầu, lốp xe cao su, xi măng, nhựa đường và các ngành công nghiệp nhựa, bảo quản gỗ, sản xuất nhiệt điện và tiêu huỷ chất thải, hoặc các sự cố trong các ngành công nghiệp dầu khí, hóa chất, thuốc trừ sâu Chen

và cs (2007) đã nghiên cứu phát thải PAHs từ nhiệt phân lốp xe phế liệu Tổng số PAH ô nhiễm trong khí thải từ một nhà máy xử lý lốp xe phế liệu thông qua nhiệt phân là 42,3 g / ngày [20]

- Các phương tiện giao thông: khói thải từ các phương tiện giao thông như: ô

tô, tàu hỏa, máy bay và các loại xe có động cơ khác là nguồn ô nhiễm PAH chính trong khu vực đô thị PAH được hình thành trong khói thải do quá trình nhiệt phân chất bôi trơn, cặn lắng được tích lũy trong động cơ và trong nhiên liệu, quá trình tổng hợp các phân tử nhỏ và các hợp chất thơm có trong nhiên liệu [17, 32] Tuy nhiên lượng PAH phát thải còn phụ thuộc vào từng loại động cơ và nhiên liệu mà các phương tiện sử dụng, Zhu và cs (2009) đã chỉ ra rằng động cơ diesel sử dụng diesel sinh học có thể giảm 13,1% tổng lượng PAH phát thải và 15% benzo[a]pyren

so với việc sử dụng diesel thông thường [48]

- Các quá trình nông nghiệp: PAH phát sinh từ quá trình sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc diệt bướm, quá trình đốt cháy không hoàn toàn sinh khối là các phụ phẩm

trong nông nghiệp như: rơm, rạ, lạc, đỗ…quá trình sấy các sản phẩm nông nghiệp Nồng độ PAH phát thải phụ thuộc vào loại gỗ, loại lò và nhiệt độ đốt cháy, theo Lu

và các cộng sự (2009) chỉ ra rằng lượng PAH phát thải do việc đốt rơm thay đổi từ

9,29-23,6 µg / g khi nhiệt độ tăng 200-700 0C [30]

1.3 Các biện pháp xử lý ô nhiễm PAH

Do có cấu trúc vòng thơm và tính kỵ nước cao, PAH là những hợp chất rất bền về mặt hóa học, khó bị phân hủy trong môi trường tự nhiên Đến nay, trên thế giới đã có một số phương pháp để phân hủy PAH tạo ra các sản phẩm ít độc hoặc không độc cho con người và môi trường như: phân hủy sinh học, xử lý hóa học, lý học, đốt ở nhiệt độ cao, chôn lấp v.v…

1.3.1 Phương pháp hóa lý

PAH có thể được xử lý bằng phương pháp thiêu đốt thông thường nhưng phương pháp này đòi hỏi nhiệt độ lò đốt rất cao (1000 - 1200 0C) Hơn nữa, phương pháp này còn sinh ra một lượng khí thải thứ cấp lớn như NOx, các sản phẩm cháy không hoàn toàn và các sản phẩm tái kết hợp của khí thải từ các lò thiêu đốt…

Phương pháp quang hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao để phân hủy PAH cũng mang lại hiệu quả nhất định Tuy nhiên, những phương pháp này có nhược điểm là chỉ xử lý được trên bề mặt [40]

Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng đối với nhiều chất thải, rác thải, kể

cả các chất thải nguy hại trong đó có chất độc hóa học Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém nhưng nhược điểm là các chất độc vẫn nằm trong đất chứ không được phân hủy, các chất độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường

Phương pháp hấp phụ, phổ biến nhất vẫn là công nghệ hấp phụ bằng than

hoạt tính Than hoạt tính đã được áp dụng lâu đời trong xử lý nước để loại bỏ các

chất ô nhiễm hữu cơ tự nhiên (NOMs), các chất ô nhiễm vô cơ, các chất hữu cơ tổng hợp khó phân hủy như phenols, PAH, thuốc trừ sâu, chất tẩy rửa, Than hoạt tính được chế tạo từ nhiều nguồn vật liệu như gỗ, gáo dừa, nhựa than đá, Những nguyên liệu này được hóa than từ từ ở nhiệt độ cao trong chân không, sau đó được

hoạt hóa ở nhiệt độ 700-1200oC (tùy thuộc vào vật liệu) trong điều kiện không có oxy Quá trình này tạo nên loại vật liệu hấp phụ xốp, với rất nhiều lỗ, hang nhỏ li ti,

bề mặt gồ ghề, với diện tích bề mặt tiếp xúc lớn, có tác dụng hấp phụ và giữ các tạp chất trong nước Than hoạt tính lọc nước nhờ hai cơ chế chính: (1) lọc cơ học, giữ lại các hạt cặn trong những lỗ rỗng nhỏ; (2) hấp phụ các tạp chất hòa tan trong nước bằng cơ chế hấp phụ bề mặt hoặc trao đổi ion Sau một thời gian sử dụng (thời gian này tùy thuộc vào loại và lượng chất ô nhiễm), than hoạt tính được hoàn nguyên bằng nhiệt hay hóa chất (quá trình oxy hóa hay điện hóa) [2]

Than hoạt tính xử lý nước gồm hai dạng chính: than hoạt tính dạng bột (PAC) và than hoạt tính dạng hạt (GAC):

- Than hoạt tính dạng bột (PAC) được đưa vào nước trong quá trình keo tụ -

lắng Trong quá trình keo tụ, thường kết hợp với hóa chất keo tụ (phèn), bông cặn PAC được hình thành, tiếp xúc và hấp phụ các chất ô nhiễm hữu cơ trong nước, sau

đó các bông keo tụ được loại bỏ ra khỏi nước nhờ quá trình lắng cặn và lọc Hạn chế của phương pháp này là đối với nguồn nước bị ô nhiễm hữu cơ cao, lượng PAC cần cho vào nước lớn, tốn kém, và nếu sử dụng biện pháp này thường xuyên sẽ tạo

ra lượng cặn lắng lớn Do đó, phương pháp này chỉ nên áp dụng trong trường hợp khẩn cấp, khi lượng chất ô nhiễm hữu cơ trong nước nguồn tăng đột biến, như là quá trình xử lý sơ bộ

- Than hoạt tính dạng hạt (GAC) được sử dụng rộng rãi như một loại vật

liệu lọc Có thể sử dụng GAC trong bể lọc riêng biệt, đặt sau bể lọc cát thông thường, để loại bỏ các chất hữu cơ còn lại trong nước sau bể lọc cát Thời gian sử dụng của cột lọc GAC phụ thuộc vào loại và lượng chất ô nhiễm trong nước Thông thường, tuổi thọ GAC dùng để xử lý các sản phẩm phụ của Clo hóa (THMs và HAAs) khoảng 6 – 12 tháng, để xử lý thuốc trừ sâu, các chất hữu cơ tổng hợp khoảng 1 – 2 năm, để xử lý mùi và vị (từ các gốc aldehytes, phenols, …) khoảng 2 –

5 năm [10]

Các phương pháp này mặc dù có hiệu quả cao trong việc loại bỏ PAH tuy nhiên không được triệt để vì sau khi xử lý vẫn còn tồn dư của PAH và các sản phẩm

trung gian có tính độc cao đồng thời mất khá nhiều thời gian Trong những năm gần đây, phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa vòng thơm ngày càng được quan tâm và ứng dụng Phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, tạo ra sản phẩm không độc hại, thân thiện với môi trường, giá thành lại rẻ hơn nhiều so với các phương pháp truyền thống do làm phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng các enzyme cắt vòng do chính các chủng vi sinh vật tại khu vực ô nhiễm Trong quá trình xử lý này, con người không tác động trực tiếp các biện pháp lý hóa vào quy trình khép kín, do đó lượng nước thải sau khi xử lý được đưa vào tự nhiên sạch hơn

mà không bị biến đổi thành phần tính chất

1.3.2 Phương pháp phân hủy sinh học

Hiện nay, phương pháp phân hủy sinh học được xem là an toàn, có thể xử lý triệt để, không gây ô nhiễm thứ cấp và thân thiện với môi trường Một trong các mục tiêu của phương pháp này là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất nhằm nâng cao hiệu quả xử lý và kết quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc

Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành trong điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ [19, 24] Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học có thể được tiến hành theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học

- Tăng cường sinh học: là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa

đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào các nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân như: sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật

- Kích thích sinh học: là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như độ pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v Tuy nhiên, nó chỉ có hiệu quả với một số vùng và có thể không thu được kết quả như mong muốn

Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời bổ sung các nguồn dinh dưỡng để tạo điều kiện tối ưu cho tập đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động tốt nhất Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh vật bản địa cùng với hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cường hiệu quả của quá trình xử lý [29]

Phương pháp phân hủy sinh học không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều kiện ở nước ta Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn ra với tốc độ chậm, thời gian xử lý kéo dài, khó khăn trong việc giám sát khi đưa các vi sinh vật từ nơi này sang nơi khác để xử lý ô nhiễm ở khu vực lớn, nhất là với các vi sinh vật đã được chuyển gen việc lên men

vi sinh vật với khối lượng lớn cũng là điều không dễ dàng và vô cùng tốn kém trong việc xử lý ô nhiễm [18]

1.3.2.1 Phân hủy sinh học PAH

Hiện nay có nhiều nghiên cứu về khả năng sử dụng các PAH của vi sinh vật, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, sau đó thay đổi cấu trúc về di truyền để hướng đến việc phân hủy PAH Hầu hết các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH đều phân lập được từ các địa điểm ô nhiễm [8, 25]

Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể chuyển sang dạng không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2 Phân hủy PAH bởi vi sinh vật có thể diễn ra theo một số con đường trao đổi chất sau (Hình 1.2):

Hình 1 2 Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật [42]

- Chuyển hóa PAH bởi vi nấm Hiện nay người ta đã biết đến các enzym cytochrom P450 monooxygenaza được sinh ra bởi một số loài vi nấm Các enzym này tham gia chuyển hóa PAH đến dạng aren oxit, sau đó dạng hợp chất trung gian này được hydrat hóa bởi enzym epoxyt hydrolaza đến dạng trans-dihydrodiols hoặc được tái sắp xếp không có sự tham gia của enzym tạo thành dạng phenol và được chuyển hóa thành dạng dễ hòa tan trong nước hơn tạo điều kiện cho quá trình chuyển hóa tiếp theo của chúng Trong trường hợp các vi sinh vật chỉ có thể thực hiện theo cách chuyển hóa này thì chúng sẽ không sử dụng PAH như nguồn cacbon

mà chỉ có thể loại bỏ tính độc của PAH mà thôi

- Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm mốc trắng Một số loại nấm mốc trắng phân huỷ lignin và cellulo có trong gỗ sẽ chuyển hoá PAH đến quinon mà không qua cis hoặc trans-dihydrodiol, quá trình chuyển hoá này có sự tham gia của enzyme lignin peroxydaza

- Chuyển hóa PAH bởi vi khuẩn Các vi khuẩn này sinh ra enzyme

dioxygenase, enzyme này sẽ tấn công lên một trong các vòng thơm tạo thành dihydrodiol, hợp chất này được chuyển hóa tiếp nhờ enzym cis-dihydrodiol

cis-dehydrogenase tạo thành các catechol đây là một chất trung gian quan trọng để cắt

vòng Sự cắt vòng thơm có thể xảy ra giữa hai nhóm hydroxyl, ở vị trí ortho nhờ hệ enzyme intradiol hay vùng kế cận của hai nhóm hydroxyl ở vị trí meta nhờ hệ

enzyme catechol 2,3-dioxygenaza [42]

1.3.2.2 Công nghệ sử dụng màng sinh học trong xử lý nước thải

a Giới thiệu về chung về màng sinh học (biofilm)

- Định nghĩa: biofilm là một tập hợp các vi sinh vật bám trên một bề mặt của

vật thể rắn hoặc bề mặt chất lỏng, tạo thành lớp màng bao phủ bề mặt đó Phần lớn các vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường bán lỏng đều có khả năng tạo ra màng sinh học Khu hệ vi sinh vật trong biofilm có khả năng chống chịu các điều kiện khắc nghiệt của môi trường tốt hơn, hỗ trợ trao đổi chất tốt hơn và hạn chế sự cạnh tranh của các vi sinh vật khác [34]

- Thành phần: biofilm gồm 2 thành phần chính:

+ Thành phần tế bào: Bao gồm tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác nhau như vi nấm, vi tảo, xạ khuẩn, vi khuẩn Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là giai đoạn đầu bởi nó quy định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật, đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi, lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể

+ Thành phần mạng lưới các hợp chất ngoại bào (EPS):Thành phần EPS rất đa dạng tùy loài vsv, dạng biofilm và điều kiện hình thành Nhưng về cơ bản đều bao gồm các thành phần chính sau: 3 – 37% là proteins, 9 – 50% là nucleic acid, 3 – 21% là carbohydrate [15] Các hợp chất này thay đổi theo không gian và thời gian tồn tại của biofilm Về cơ bản biofilm càng dày và thời gian tồn tại càng lâu thì có hàm lượng

EPS càng nhiều Mật độ tế bào tập trung cao nhất ở lớp đỉnh của biofilm và giảm dần theo độ sâu nhưng thành phần EPS lại phong phú hơn ở vùng phía trong biofilm

- Cấu trúc: Biofilm có cấu trúc không đồng nhất, bao gồm nhiều lớp vi

khuẩn hiếu khí bên trên và nhiều lớp vi khuẩn kỵ khí bên dưới Cấu trúc biofilm có

tổ chức, đặc thù và phản ánh các chức năng nhất định của biofilm Trong biofilm có các kênh vận chuyển, qua đó, cung cấp nước, các chất dinh dưỡng cho vsv tồn tại trong chúng và đem chất thải đi Giữa các tế bào vi khuẩn diễn ra sự trao đổi thông tin liên tục đảm bảo cho biofilm được hình thành một cách chính xác Chiều dày của biofilm thay đổi từ một vài μm thậm chí đến vài cm tùy thuộc vào loài vsv, tuổi biofilm, lượng dinh dưỡng và áp lực dòng chảy [21, 28]

b Quá trình làm sạch nước của màng sinh học

Cơ chất ô nhiễm từ nước tiếp xúc với bề mặt màng sau đó được vận chuyển vào bên trong màng theo cơ chế khuếch tán phân tử Trong màng diễn ra quá trình

tiêu thụ cơ chất và quá trình trao đổi cơ chất của vi sinh vật, theo thời gian màng

phát triển dày hơn bên trong màng hình thành một lớp kỵ khí nằm dưới lớp hiếu khí lớp màng này có vai trò hóa lỏng những chất rắn do màng sinh ra Đối với những loại cơ chất ở thể rắn, dạng lơ lửng hoặc có phân tử khối lớn không thể khuếch tán vào sâu trong màng được chúng sẽ phân hủy thành dạng có phân tử khối nhỏ hơn tại

bề mặt màng sau đó mới tiếp tục được vận chuyển và tiêu thụ bên trong màng Sản phẩm cuối cùng của màng được vận chuyển ra khỏi màng vào trong nước

Khi tốc độ phát triển của màng cân bằng với tốc độ suy giảm bởi sự phân hủy nội bào, phân hủy theo dây chuyền thực phẩm, hoặc bị rửa trôi bởi lực cắt của dòng chảy màng đạt trạng thái cân bằng Trong quá trình phát triển của màng khi một trong những thành phần cần thiết cho vi sinh vật tiêu thụ bị thiếu, tại đó những phản ứng sinh học có liên quan đến cơ chất này sẽ không xảy ra, và cơ chất này được gọi là cơ chất giới hạn quá trình Ngoài chất hữu cơ các nguyên tố vết như nitơ, photpho, kim loại và vi lượng nếu không có đủ trong nước thải theo tỉ lệ của

phản ứng sinh học cũng sẽ trở thành yếu tố giới hạn của phản ứng [5, 7]

1.3.2.3 Ứng dụng biofilm trong xử lý nước thải ở nước ta

Sử dụng biofilm là một biện pháp xử lý ô nhiễm tương đối mới ở Việt Nam Năm

2009, Đỗ Khắc Uẩn và cs đã sử dụng thành công hệ thống màng lọc vật lý gồm các đơn nguyên màng vi lọc (kích thước lỗ 0,22 µm) để xử lý nitơ, phốt pho và các chất hữu cơ trong nước thải đô thị[12] Phạm Thị Hồng Đức và Lê Văn Cát (2010) đã sử dụng màng lọc sinh học (biofilter) để loại bỏ nitơ trong hệ xử lý sinh học nhằm mục đích tái sử dụng nước nuôi giống thủy sản [6] Trong nghiên cứu gần đây, Lê Thị Nhi Công và cộng sự (2011) đã đánh giá khả năng tạo biofilm một số chủng vi khuẩn và nấm men phân huỷ dầu, phân lập từ các mẫu nước biển bị ô nhiễm dầu ở

Thanh Hoá và Vũng Tàu Kết quả đã xác định được các chủng như Candida,

Acinetobacter, Bacillus, Rhodococcus là những chủng vừa tạo biofilm vừa có khả

năng phân huỷ và chuyển hoá các thành phần dầu mỏ rất tốt Hơn thế nữa, sau 24 giờ nuôi cấy, ở dạng tạo biofilm chúng còn có khả năng phân huỷ dầu tốt hơn ở dạng tế bào planktonic[3] Điều này cho thấy tiềm năng phong phú về chủng loại vi sinh vật vừa tạo biofilm vừa phân huỷ và chuyển hoá hydrocarbon trong các mẫu đất và nước bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam Như vậy, nghiên cứu về biofilm sẽ mở ra khả năng ứng dụng vai trò của các vi sinh vật đối với các hệ sinh thái và đời sống con người

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng

2.1.1 Nguyên liệu

Mẫu nước nhiễm dầu được lấy tại các cống thoát nước tại Công ty xăng dầu B12 và dọc bờ biển cột 5 tới cột 8 TP Hạ Long – Quảng Ninh; tại một số vùng ven biển Đồ Sơn, Hải Phòng; tại khu công nghiệp Nghi Sơn, Thanh Hóa Mẫu được lưu trữ ở Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam trong vòng 24 h để phân tích

2.1.2 Hóa chất, môi trường nuôi cấy

 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất nhập ngoại của các hãng có uy tín trên thế giới như Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic,.v.v

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar 18-20 g/l) Môi trường trước khi sử dụng được khử trùng ở 121oC (không có glucose) và ở

115oC (có glucose), 1 atm trong 30 phút Bao gồm:

- Môi trường hiếu khí tổng số (HKTS): Môi trường nuôi cấy đặc trưng cho nhóm vi khuẩn hiếu khí

- Môi trường muối khoáng Gost: Môi trường phân lập và kiểm tra khả năng phân hủy PAH

2.1.3 Máy móc và thiết bị nghiên cứu

Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ sinh học (Bảng 2.1)

Bảng 2 1: Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài

Tên thiết bị Nhà sản xuất Nước sản xuất

Bể điện di ELITE 300 PLUS WEALTEC Đài Loan

Lò vi sóng NN-S215WF PANASONIC Trung Quốc Máy chuẩn pH-CyberScan pH 620 EUTECH Singapore Máy đo quang phổ UV-1601-220V SHIMADZU Nhật Bản

Máy ly tâm eppendorf 5417R HAMBURG Đức

Tủ ấm và tủ lắc nuôi cấy NB205QF N – Biotek Hàn Quốc

Tủ lạnh sâu -80oC MDF-192 SANYO Nhật Bản

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu thập mẫu

Mẫu nước nhiễm dầu được lấy tại Công ty xăng dầu B12 và dọc bờ biển cột 5 tới cột 8 TP Hạ Long – Quảng Ninh; tại một số vùng ven biển Đồ Sơn, Hải Phòng; tại khu công nghiệp Nghi Sơn, Thanh Hóa, mẫu được lấy ở 2 vị trí: tầng nước mặt

và tầng bùn đáy Mẫu lấy về được phân tích ngay trong vòng 24h lấy mẫu và được bảo quản ở tủ lạnh 4oC tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đảm bảo tính chất và thành phần mẫu không bị thay đổi để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo

2.2.2 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH

 Làm giàu vi sinh vật

- Nguyên tắc:Tạo môi trường thích hợp làm gia tăng số lượng vsv từ mẫu

thu thập ban đầu trên nguồn cơ chất quan tâm

- Tiến hành:Hút 10 ml đối với mẫu nước và 3g đối với mẫu bùn vào bình

tam giác thể tích 250 ml có chứa 50 ml môi trường muối khoáng Gost dịch, 0,1% vitamin, 50 ppm hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene) và 1 bình có bổ sung thêm 0,5% glucose Nuôi lắc các bình ở 200 vòng/phút, ở 30oC, sau

7 ngày nuôi, chuyển 10% dịch làm giàu lần 1 sang bình nuôi cấy thứ 2 chứa các thành phần giống như ở lần làm giàu thứ nhất, quá trình nuôi cấy làm giàu được tiến hành 3 lần

 Phương pháp pha loãng tới hạn

- Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng

rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật Việc pha loãng mẫu ở các nồng

độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh vật

- Tiến hành: Dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước

cất, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1, hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất ta sẽ được độ pha loãng 10-2

Tiếp tục như vậy đến nồng độ 10-8

 Tìm kiếm tập đoàn vsv và phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử PAH được tuyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn

- Dùng que trang trải đều mẫu khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que này

để trải đều khắp bề mặt thạch ở đĩa thứ 2, thứ 3

- Các đĩa sau khi cấy gạt được bao gói cẩn thận và nuôi ở tủ ấm 30oC cho tới khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ

- Đánh dấu các khuẩn lạc khác nhau dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc

2.2.3 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trưởng tốt nhất trên môi trường có chứa cơ chất PAH

Nguyên lý:

Khi nuôi vsv trong môi trường muối khoáng Gost nghèo dinh dưỡng có bổ sung hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene), vsv sẽ sử dụng PAH như là nguồn carbon và năng lượng duy nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng Sự phát triển của vsv được đánh giá định tính thông qua sự thay đổi độ đục của môi trường nuôi cấy và lượng sinh khối bám trên thành bình

Tiến hành:

- Nuôi qua đêm vsv trong môi trường HKTS dịch để làm tươi mới chủng, ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối hai lần bằng nước cất, hòa tan sinh khối, đo OD dịch sinh khối ở bước sóng 600 nm, tính lượng sinh khối đầu vào cho 20 ml môi trường bằng 0,3 khi đo OD ở bước sóng 600 nm để khảo sát khả năng sử dụng PAH của chủng

vi khuẩn

- Bổ sung dịch sinh khối đã tính toán của mỗi chủng vào bình tam giác dung tích 100 ml, có chứa 20 ml Gost dịch, 0,1% vitamin, 50ppm PAH Đem nuôi ở tủ lắc 30oC, ở 200 vòng/phút và quan sát sự thay đổi màu, lượng sinh khối bám trên thành bình trong quá trình nuôi khoảng 7 đến 9 ngày Đo OD tại bước sóng 600nm theo từng ngày để theo dõi sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh vật trong môi trường có chứa PAH

- Chọn những chủng có khả năng phát triển tốt nhất ở nồng độ 50ppm để tiến hành nuôi ở điều kiện môi trường có chứa nồng độ PAH cao hơn nhằm tìm kiếm những chủng có khả năng sử dụng PAH tốt nhất

2.2.4 Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn

Tiến hành theo phương pháp của O’Toole và Kolter (1998); Morikawa và cộng sự (2006) [33, 35]

 Làm tươi mới chủng tạo biofilm:

Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường MPA dịch Sau 14 - 16 h nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4.000 rpm, 4oC trong

vòng 10 phút và rửa nước cất 2 lần với thể tích tương ứng) Bổ sung nước cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở bước sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối bằng nước cất để đạt OD là 0,3 Bổ sung 1% dịch này vào các eppendorf chứa 297 μl môi trường MPA Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày Các mẫu được nuôi ở tủ ấm 30oC và đánh giá khả năng tạo biofilm sau 24, 48 và 72 h

 Kiểm tra khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn

Tiến hành:

Cứ sau 24 h lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tương ứng với 3 eppendorf cho mỗi ngày và tiến hành kiểm tra khả năng tạo biofilm theo các bước sau:

- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy ra 1 cách nhẹ nhàng (không làm vỡ màng)

- Rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 500 μl nước cất Quá trình này được lặp lại 2 lần

- Cho 300 μl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf ở nhiệt độ phòng

- Đợi 10 phút để cố định màng

- Hút bỏ dung dịch tím tinh thể

- Rửa bằng 500 μl nước cất, 2 lần

- Bổ sung 300 μl dung dịch acetic acid 33%

- Đảo trộn hỗn hợp này, pha loãng tới hạn rồi đo OD ở bước sóng 570 nm