Xác định đa dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong một số loại thực phẩm có nguồn gốc từ chè bằng phương pháp sắc ký khí GC

4 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại nhóm độc theo TCYTTG Bảng 3.1 Lựa chọn dung môi chiết Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của các loại cột làm sạch Bảng 3.3 Kết quả khảo

1

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC CÁC BẢNG 4

DANH MỤC CÁC HÌNH 5

MỞ ĐẦU 6

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 7

I.1 Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật 7

I.1.1 Khái niệm về hóa chất bảo vệ thực vật 7

I.1.2 P hân lo ại thuốc bảo vệ thực vật 7

I.2 Sơ lược về một số hóa chất bảo vệ thực vật trong nghiên cứu 10

I.2.1 Nhóm lân hữu cơ 10

I.2.2 Nhóm Clo hữu cơ 12

I.2.3 Nhóm Pyrethroid 13

I.3 Tổng quan về Chè 15

I.4 Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu 19

I.4.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng 20

I.4.2 Kỹ thuật chiết pha rắn 21

I.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ 23

I.5.1 Cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ 24

I.5.2 Kỹ thuậ ợ 27

I.5.3 Định tính, định lượng trong phân tích sắc ký khí khối phổ 28

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

II.1 Đối tượng nghiên cứu 31

II.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 32

II.2.1 Hóa chất 32

II.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 32

II.3 Phương pháp nghiên cứu 32

II.4 Lấy mẫu nghiên cứu và bảo quản 33

2

II.5 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 33

II.6 Quy trình xử lý mẫu chè phân tích HC BVTV bằng GC/MS 33

II.7 Thẩm định quy trình xây dựng 34

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36

III.1 Kết quả khảo sát điều kiện phân tích GC/MS 36

III.1.1 Nghiên cứu điều kiện chiết tách, làm sạch, làm giàu 36

III.2 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của quy trình phân tích 42

III.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của thiết bị GC/MS trong ngày 43

III.4 Kết quả xây dựng đường ngoại chuẩn, LOD, LOQ 46

III.6 Kết quả khảo sát độ thu hồi của quy trình phân tích 49

III.7 Kết quả phân tích mẫu chè thực nghiệm 51

CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

KẾT LUẬN 53

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

4

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Phân loại nhóm độc theo TCYTTG

Bảng 3.1 Lựa chọn dung môi chiết

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của các loại cột làm sạch

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ các mảnh phổ, thời gian lưu của HC

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ thu hồi của quy trình phân tích

Bảng 3.10 Kết quả phân tích một số mẫu chè thực tế

5

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Dimethoate

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Diazinon

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Fenitrothion

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Endosulfan sulfat

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Permethrin

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của Cyfluthrin

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của Fenvalerate

Hình 1.8 Công thức cấu tạo của Deltamethrin

Hình 1.9 Chiết lỏng- lỏng trên phễu chiết

Hình 1.10 Các bước tiến hành SPE

Hình 1.11 Sơ đồ cấu tạo của thiết bị sắc ký khí khối phổ GC-MS

Hình 1.12 Hình ảnh cột mao quản

Hình 3.1 Sắc ký đồ mix HC BVTV phân tích theo chế độ SIM

Hình 3.2 Sắc ký đồ của Diazinon có mảnh phổ 179; 137; 152 m/z

Hình 3.3 Sắc ký đồ của Fenitrothion có mảnh phổ 277; 125; 109 m/z

Hình 3.4 Sắc ký đồ phân tích mẫu chè không có HC BVTV

Hình 3.5 Đường ngoại chuẩn của Diazinon

6

MỞ ĐẦU

Chè là thức uống thông dụng, phổ biến nhiều người ưa dùng Chè có tác dụng ngăn ngừa bệnh cao huyết áp, hỗ trợ tim mạch, ngăn ngừa ung thư, diệt khuẩn răng miệng, Những năm gần đây, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật đã làm tăng năng suất cây chè Tuy nhiên, hiện nay, ở nhiều địa phương, các hộ nông dân trồng chè đã sử dụng thuốc bảo vệ thực vật chưa đúng, nên một số lô chè có dư lượng thuốc bảo vệ thực vật vượt quá ngưỡng cho phép, ảnh hưởng đến chất lượng và uy tín chè Việt Nam trên thị trường, sức khỏe người tiêu dùng

ối phổ

ả

HC BVTV

ản phẩm chè bởi 1 lần bơm mẫu sẽ có thể sàng lọc được nhiều chất

ần mềm phân tích sắc ký khí khối phổ có trang bị thư viện phổ, hiện nay khoảng 350 ngàn chất sẽ phục vụ tốt cho công tác phân tích sàng lọc

Phân tích định tính, định lượng chính xác các thành phần của HC BVTV trong mẫu chè bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là việc làm rất cần thiết, giúp cho quá trình lựa chọn sản phẩm có giá trị kinh tế cao có được kết quả xét nghiệm chính xác hơn, nhanh hơn Lượng mẫu phân tích lấy ít hơn do độ nhạy của thiết bị cao

Xuất phát từ lý do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định đa dư lượng hóa

chất bảo vệ thực vật trong một số loại thực phẩm có nguồn gốc từ chè bằng phương pháp sắc ký khí GC-MS” với mục tiêu:

vật trong một số lọai thực phẩm có nguồn gốc từ chè

Ứng dụng quy trình xây dựng được phân tích 10 mẫu chè khác nhau

7

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN I.1 Tổng quan về hóa chất bảo vệ thực vật

I.1.1 Khái niệm về hóa chất bảo vệ thực vật

Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) đã đưa ra định

nghĩa khá hoàn chỉnh về hóa chất bảo vệ thực vật (HC BVTV) như sau:

“HC BVTV là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng HC BVTV còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm.Cũng có thể dùng HC BVTV cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng

trong quá trình bảo quản và vận chuyển” [18]

I.1.2 Phân loại thuốc bảo vệ thực vật

Có nhiều cách phân loại TBVTV[31], trong đó có 4 cách phân loại chủ yếu sau

đây:

I.1.2.1 Phân loại theo mục đích sử dụng:

* Nhóm các chất trừ sâu, trừ nhện, trừ côn trùng gây hại:

+ Nhóm các chất trừ sâu có chứa Clo ( organnochlorine):

+ Nhóm các chất trừ sâu có chứa Photpho (organophosphorus):

+ Nhóm các hợp chất Cabamat:

+ Nhóm Pyrethroid

+ Nhóm Neonicotinoid:

8

* Nhóm các chất trừ nấm, trừ bệnh, trừ vi sinh vật gây hại:

+ Các hợp chất chứa đồng :

+ Các hợp chất chứa Lưu huỳnh:

+ Các hợp chất chứa Thủy ngân :

* Nhóm các chất trừ cỏ dại, làm rụng lá, kích thích sinh trưởng:

+ Các hợp chất chứa Phenol (2,4-D)

+ Các hợp chất của axit propyonic ( Dalapon)

+ Triazole, benimidazol

I.1.2.2 Phân loại theo độ độc của tổ chức Y tế thế giới

Các chuyên gia về độc học đã nghiên cứu ảnh hưởng của chất độc lên cơ thể động vật ở cạn (chuột nhà) và đã đưa ra 5 nhóm độc theo tác động của độc tố tới cơ thể qua miệng và da như sau:

Bảng 1.1: Phân loại nhóm độc theo TCYTTG

IV Độc rất nhẹ > 2000 >3000

9

Ghi chú: LD50 là kí hiệu chỉ độ độc cấp tính của thuốc qua đường miệng hoặc qua da Trị số của nó là liều gây chết trung bình được tính bằng miligam (mg) hoạt chất có thể gây chết 50% số động vật thí nghiệm (tính bằng kg) khi tổng lượng thể trọng của số động vật trên bị cho uống hết hoặc phết vào da Gía trị LD50 càng nhỏ thì hóa chất đó càng độc

Có thể nhận biết tính độc của thuốc bảo vệ thực vật theo dấu hiệu màu trên bao bì thuốc như sau:

+ Vạch màu đỏ trên bao bì là thuốc độc nhóm I, thuộc loại rất độc và độc

+ Vạch màu vàng trên bao bì là thuốc độc nhóm II, thuộc loại trung bình

+ Vạch màu xanh trên bao bì da trời là thuốc độc nhóm III, ít độc

+ Vạch màu xanh lá cây trên bao bì thuộc nhóm độc thứ IV, độc nhẹ

I.1.2.3 Phân loại theo độ bền vững

Các HC BVTV có độ bền vững rất khác nhau, nhiều chất có thể lưu đọng trong môi trường đất, nước, không khí và trong cơ thể động, thực vật Dựa vào độ bền vững của chúng, có thể sắp xếp chúng vào các nhóm sau:

+ Nhóm chất không bền vững: nhóm này gồm các hợp chất photpho hữu cơ,

cacbamat Các hợp chất nằm trong nhóm này có độ bền vững kéo dài trong vòng từ 1-12 tuần

+ Nhóm chất rất bền vững: Đó là các hợp chất kim loại hữu cơ, loại chất này có

chứa các kim loại nặng như Thủy ngân (Hg), Asen (As) không bị phân hủy theo thời gian, chúng bị cấm sử dụng tại Việt Nam

I.2 Sơ lƣợc về một số hóa chất bảo vệ thực vật trong nghiên cứu

I.2.1 Nhóm lân hữu cơ

- Dimethoate[ 12,13]

Theo IUPAC, Dimethoate có tên gọi khác là O,O – dimethyl S-methylcarmaoyl phosphorodithioate, 2- dimethoxyphosphiniothio-N-methylacetamide Dimethoate

có khối lượng phân tử là 229,3 g/mol, công thức phân tử : C5H12NO3PS2

Hình 1.1: Công thức cấu tạo Dimethoate

Dimethoate nguyên chất có dạng tinh thể, trắng, nhiệt độ nóng chảy 450-480C Dimethoate tan nhiều trong nước và trong các dung môi hữu cơ phân cực, Tan ít trong dung môi kém phân cực và không phân cực

Dimethoate tương đối bền trong môi trường acid và trung tính (pH=2-7), thủy phân nhanh trong môi trường kiềm

Trong động vật cũng như trong thực vật, cơ chế biến đổi của Dimethoate là giống nhau Nó bị oxy hóa thành O,O- dimethyl- phosphorothioate và hydro hóa thành O,O- dimethyl-phosphorodithioate, - phosphorothioate, - phosphate Sự oxi hóa thành dimethoate tạo nên hợp chất omethoate, một chất độc và là chất ức chế enzyme cholinesterase mạnh

11

Độc tính của Dimethoate được đánh giá ở mức độ trung bình, thuộc nhóm II,

LD50 qua miệng chuột đực là 387mg/kg, chuột cái là 160 mg/kg, thỏ là 300mg/kg,

lợn 350mg/kg, gà 108 mg/kg, chim cút là 84 mg/kg [13]

- Diazinon

Theo IUPAC, Diazinon có công thức phân tử C12H21N2O3PS, khối lượng phân tử

là 304,35g/mol

Hình 1.2: Công thức cấu tạo Diazinon

Diazinon có dạng lỏng, màu nâu sẫm

Tan trong nước ở 200

C là 40mg/l Nhiệt độ sôi: 210,80C

Nhiệt độ đông đặc: 5,70C

Diazinon là một thuốc trừ sâu thuộc nhóm lân hữu cơ được sử dụng rộng rãi để kiểm soát gián, cá bạc, kiến, bọ chét trong các tòa nhà dân cư, hoặc

sử dụng cho lúa, cây ăn quả, ngô, mía, thuốc lá, khoai tây[17]

Diazinon có tác động tiếp xúc, vị độc, thấm sâu, hiệu lực trừ sâu rất cao, nhanh và kéo dài, là chất độc đối với con người và côn trùng thông qua tác động của nó vào các enzim thần kinh Diazinon kết hợp hóa học với các enzym acetylcholinesterase và bất hoạt nó Người bị ngộ độc diazinon thường có các triệu chứng chính là đau đầu, buồn nôn, chóng mặt, mờ mắt, tức ngực, khó thở, hoặc co

giật cơ bắp yếu, khó khăn trong việc đi bộ, nôn mửa, đau bụng, và tiêu chảy[16]

- Fenitrothion[26]

12

Theo IUPAC, Fenitrothion có công thức phân tử C9H12NO5PS, khối lượng phân

tử 277,23 g/mol, có công thức cấu tạo như hình vẽ

Hình 1.3: Công thức cấu tạo Fenitrothion

Fenitrothion tồn tại dạng chất lỏng màu vàng nâu, nóng chảy ở 3,40C , nhiệt độ sôi 1180C, tan trong nước, môi trường kiềm, thủy phân chậm và tan tốt trong nhiều dung môi hữu cơ phân cực như dichoromethane, 2- propanol, toluene, rất khó tan trong dung môi không phân cực như n- hexan

Liều gây độc LD50 đối với thỏ là 500mg/kg, đối với chuột là 1416 mg/kg.[32]

I.2.2 Nhóm Clo hữu cơ

- Endosulfan sulfat

Công thức phân tử C9H6Cl6O3S, có khối lượng phân tử 406, 9g/mol, công thức cấu tạo như hình vẽ:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của Endosulfan sulfat

Endosulfan sulfat có dạng kem màu nâu đất, có mùi giống của nhựa thông nhưng không cháy, và tan rất ít trong nước 0,33 mg/l

Endosulfan Sulfat là một chất ức chế thần kinh cực kì nghiêm trọng ở cả côn trùng và động vật có vú Liều gây độc được thử trên chuột cái LD50 là 30 mg/kg,

theo tổ chức EPA của Mỹ được coi là chất độc cực kì nguy hiểm[ 27,28]

Hình 1.5: Công thức cấu tạo Permethrin

Pemethrin ở dạng tinh thể không màu, nóng chảy ở 340C, sôi ở 2000C hầu như không tan trong nước, tan tốt trong các dung môi không phân cực như Hexan, xylen Bền trong môi trường axit, thủy phân trong môi trường kiềm

Permethrin là một hóa chất diệt côn trùng thông dụng, sinh vật ký sinh.Hóa chất này như là một chất gây độc tố cho thần kinh, làm tăng độ thấm của của Na qua màng tế bào thần kinh, kết quả gây nên sự lặp đi lặp lại và kéo dài xung động thần kinh trong cơ quan cảm giác và làm đình trệ xung động trong sợi thần kinh.Hóa chất này không gây hại nhanh động vật có vú và chim, nhưng là hóa chất rất độc đối

với mèo và cá [27]

-Cyfluthrin

Cyfluthrin có công thức phân tử: C22H18Cl2FNO3

Khối lượng phân tử: 434,29g/mol

Công thức cấu tạo:

Hình 1.7: Công thức cấu tạo của Fenvalerate

Fenvalerate có dạng chất lỏng sệt, màu vàng nâu, nhiệt độ nóng chảy 59-600C Tan tốt trong các dung môi ethylacetate, chloroform, acetone, methanol ở 200C Liều gây độc LD50 đối với chuột là khoảng 100 – 300mg/kg [29]

-Deltamethrin

Deltamethrin có công thức phân tử: C22H19Br2NO3, khối lượng phân tử: 505,2 g/mol

và công thức cấu tạo:

15

Hình 1.8: Công thức cấu tạo của Deltamethrin

Deltamethrin có dạng bột tinh thể màu trắng, bền ở điều kiện bình thường, phân hủy ở nhiệt độ > 1900

C Deltamethrin không tan trong nước, tan nhiều trong dung môi hữu cơ: Dioxan; cyclohexanone; dicloromethane; Acetone; Benzen Bền trong môi trường acid hơn môi trường kiềm, tương đối bền dưới tác động của không khí, nhưng dưới tác động của ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại bị phân huỷ

Liều gây độc LD50 = 5000mg/kg (đối với chuột), LD50 = 29040 mg/kg (đối với thỏ), diệt được nhiều loại côn trùng y học, trừ được ve, bét, chấy rận hại vật nuôi

Vùng chè Việt Bắc – Hoàng Liên Sơn

16

Đây là một vùng chè rất quan trọng của Việt Nam, có hai trình độ sản xuất quảng canh và thâm canh khác nhau rõ rệt Đó là tiểu vùng chè rừng dân tộc và tiểu vùng chè đồi công nghiệp với trình độ thâm canh cao hơn

Sản lượng búp chè tươi chiếm 31.15% tổng sản lượng chè búp tươi cả nước Giống chè chủ yếu là chè Shan và Trung du, hiện nay đã có một số giống mới như: Bát Tiên, Đại Bạch trà, TR777, LDP1, … đang được trồng khảo nghiệm

Vùng chè Tây Nguyên

Giống chè chủ yếu của vùng này là chè Shan, chè Ấn Độ gieo bằng hạt Sản phẩm chủ yếu là chè đen (OTD và CTC) xuất khẩu, chè xanh xuất khẩu và nội tiêu Sản lượng chè búp tươi chiếm 31% tổng sản lượng chè búp tươi cả nước, trong

đó tỉnh Lâm Đồng có sản lượng chè búp tươi lớn nhất nước

Vùng chè Duyên Hải miền Trung

Phần lớn các vườn chè dọc theo duyên hải Trung Bộ, điều kiện khí hậu nắng nóng gây ảnh hưởng xấu tới việc thực hiện quy trình công nghệ chế biến chè đen, nên chỉ tập trung vào sản xuất chè xanh tiêu thụ trong nước là chính, chất lượng trung bình, sản lượng không nhiều

Thành phần hóa học của chè

17

Nước

Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè Trong búp chè (1 tôm + 3 lá) hàm lượng nước thường có từ 75 ÷ 82% Hàm lượng nước trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn

hái…[10]

Polyphenol

Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong chè Cá cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C, EC, EGCG, EGC, ECG, …) Ngoài ra trong thành phần polyphenol của chè còn có một số chất khác với tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferon, rutin, …), các dẫn xuất glucosid, các

leucoanthocyanin, theaflavin, thearubigin.[10]

Alkaloid

Trong chè có các alkaloid sau: cafein, theobromin, theophilin, adenin, guanin Trong đó nhiều nhất là cafein, hàm lượng từ 3 ÷ 5% tổng lượng chất khô trong chè

tươi, thường nhiều hơn cafein trong lá cà phê từ 2 ÷ 3 lần.[10]

Protein và axit amin

Protein trong búp chè phân bố không đều, chiếm khoảng 15% tổng lượng chất khô của lá chè tươi Các axit amin cơ bản trong lá chè bao gồm: aspartic, arginin, alutamic, serin, glutamin, tyrosin, valin, phenylalanin, leucin, isoleucin và theanin

… Trong đó theanin chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50 ÷ 60% tổng hàm lượng

axit amin tự do, theanin là axit amin đặc trưng của cây chè.[10]

nó bị oxy hóa, còn trong chè xanh thì nó giảm đi không đáng kể.[10]

Emzym

Trong búp chè non có hầu hết các loại men, chủ yếu gồm hai nhóm chính:

Nhóm thủy phân: men amylaza, glucoxidaza, proteaza và một số men khác

Nhóm oxy hóa khử: chủ yếu là hai loại peroxidaza và polyphenol oxidaza.[10]

Các hợp chất khác[10]

Tinh dầu: Thành phần tinh dầu chè chiếm tỉ lệ rất thấp trong tổng khối lượng của

lá chè (<0,01%) Các thành phần đã được nhận diện trong tinh dầu chè bao gồm linalol, delta-cardinene, geraniol, nerolidol, alpha-terpineol, cis-jasmone, indone, beta-ionone, 1-octanal, indole-3-carbinol, beta-caryophyllene…

Chất béo và các axit béo tự do: Các hợp chất lipid, phospholipid và các axit béo

chiếm khoảng 5 ÷ 6% trong lá chè Các axit béo tự do tìm thấy trong lá chè có linolenic, linoleic, oleic và palmitic…

Carotenoid:β-caroten, lutein, violaxanthin và neoxanthin có trong lá chè

Axit hữu cơ: Trong chè có các axit như citric, tartaric, malic, oxalic, fumaric,

cafeic, quinic, succinic, clorogenic, neo-clorogenic, p-coumarylquilic, ellagic…

Kim loại: Các chất vô cơ chiếm khoảng 5 ÷ 6% khối lượng khô của chè, biến đổi

khá nhiều tùy theo thổ nhưỡng vùng đặc trưng

Hiện trạng chè tại Việt Nam hiện nay:

19

Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (NN&PTNT), năm

2014, xuất khẩu chè chính ngạch của nước ta đạt 133.000 tấn, thu về 230 triệu USD

và là nước đứng thứ 5 trên thế giới về xuất khẩu chè (sau Trung Quốc, Ấn Độ, Kenya và Sri Lanka) Mặc dù lượng xuất khẩu lớn như vậy, nhưng do chè Việt Nam chủ yếu xuất thô nên kim ngạch xuất khẩu chưa cao, giá chè xuất khẩu của nước ta lại chỉ bằng một nửa so với giá chè bình quân trên thế giới 6 tháng đầu năm 2015, xuất khẩu chè ước đạt 54 nghìn tấn với giá trị đạt 90 triệu USD, giảm 6,7% về khối lượng và giảm 4,1% về giá trị so với cùng kỳ năm 2014

Tuy nhiên, những năm gần đây, sản xuất chè hiện nay vẫn năng suất thấp, hiệu quả kinh tế không cao Phân tích nguyên nhân của thực trạng này, các nhà quản lý

và chuyên gia cho rằng, đó là do sản xuất còn manh mún, tổ chức sản xuất chè chưa tốt, thiếu liên kết với thị trường; người dân thiếu kiến thức; quản lý thuốc BVTV còn nhiều bất cập; tổ chức theo dõi và kiểm tra đánh giá ATTP còn lỏng lẻo, không quản lý tận gốc

Ông Phạm Đồng Quảng, Cục trưởng Cục Trồng trọt thẳng thắn nhìn nhận: Ngành chè quy mô sản xuất nhỏ, bình quân khoảng 0,2 ha/hộ nên rất khó tiếp cận các thiết bị kỹ thuật mới và chứng nhận chè an toàn Nhiều cơ sở chế biến được cấp giấy phép sản xuất, nhưng không có vùng nguyên liệu; trình độ tay nghề chế biến thấp, chất lượng chè không cao

Hơn nữa, trong bối cảnh hội nhập kinh tế thế giới có thể giúp cho việc xuất khẩu trở nên dễ dàng hơn do các hàng rào thuế quan dần được gỡ bỏ, nhưng đồng thời lại

bị hạn chế bởi việc xuất hiện thêm nhiều hàng rào kỹ thuật khắt khe, đặc biệt là vấn

đề an toàn thực phẩm đối với các mặt hàng nông sản

I.4 Tổng quan về các kỹ thuật xử lý mẫu

Xử lý mẫu là định nghĩa thường dùng để chỉ các bước tách chiết, làm sạch chất

phân tích ra khỏi nền mẫu.[4,5,6]

*Tách chiết:

* Làm sạch:

Yêu cầu của bước tách chiết mẫu trong phương pháp phân tích đa dư lượng các thuốc BVTV phải tách chiết được nhiều loại thuốc BVTV cùng một lúc Tuy nhiên, trong quá trình chiết suất có rất nhiều tạp chất đi kèm theo vào dịch chiết, bước làm sạch được thực hiện với mục đích loại bỏ các tạp chất đi kèm mà vẫn giữ được chất cần phân tích Có hai phương pháp làm sạch thường được sử dụng:

I.4.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng

Chiết lỏng - lỏng là kỹ thuật đã được sử dụng từ rất lâu trong phòng thí nghiệm

Là kỹ thuật được dùng rất phổ biến để chuyển chất phân tích hòa tan trong một dung môi hoặc mẫu dạng lỏng sang dung môi hoặc hỗn hợp dung môi khác Dung môi dùng để chiết không hòa tan với mẫu hoặc dung môi chứa chất cần chiết Lựa chọn dung môi chiết phụ thuộc vào tính tan của chất phân tích ở trong dung môi đó

và vào sự dễ dàng tách được chất cần tách ra khỏi mẫu

Các dung môi thường sử dụng để chiết các hoạt chất BVTV là ethylacetat, chloroform, diclomethan, aceton…hoặc có thể kết hợp dung môi theo tỷ lệ thích hợp làm tăng hiệu suất chiết Tuy nhiên trong mẫu chè thường hay sử dụng dung môi chiết là n- hexan

21

Hiệu quả của phương pháp chiết phụ thuộc vào hệ số phân bố và tỉ số thể tích của mẫu với dung môi chiết Hệ số phân bố có thể được cải thiện nhờ thay đổi pH mẫu,

khử muối hoặc sử dụng ion đối [2,14,15]

Hình 1.9: Chiết lỏng-lỏng trên phễu chiết (a) trước khi chiết, 100% chất phân tích trong pha 1 (b) Sau khi chiết, hầu hết chất cần phân tích trong pha 2

Chiết lỏng lỏng không nhất thiết phải thực hiện bằng phễu chiết, có thể tiến hành chiết lỏng lỏng bằng cách thêm dung môi chiết vào ống nghiệm đựng mẫu

I.4.2 Kỹ thuật chiết pha rắn

Chiết pha rắn là quá trình chiết bao gồm một pha rắn và một pha lỏng Các cấu tử

cần chiết và các chất cản trở (tạp chất) nằm trong pha lỏng[19,24] Trong trường

hợp lý tưởng, khi cho chảy qua cột nhồi chất hấp phụ chuyên dụng, các cấu tử cần chiết được lưu giữ lại trên chất hấp phụ, còn các tạp chất không bị lưu giữ, được thải loại ra khỏi cột theo dòng chảy, hoặc ngược lại các chất cản trở được lưu giữ trên chất hấp phụ, còn các cấu tử cần chiết không bị lưu giữ chảy ra khỏi cột Trong

đa số các trường hợp, các cấu tử cần chiết và tạp chất cùng bị lưu giữ trên chất hấp phụ Khi đó cần rửa chọn lọc bằng những dung môi (dung dịch) đủ mạnh để loại các tạp chất, nhưng lại đủ yếu để các cấu tử cần chiết nằm lại sau, hoặc rửa giải chọn lọc chất cần chiết trong dung môi và để các tạp chất bị lưu giữ mạnh trên chất hấp phụ

22

Chiết pha rắn làm việc dựa trên nguyên tắc của sắc ký lỏng Nhờ những tương tác mạnh nhưng bất thuận nghịch giữa chất phân tích (chất cần chiết) và bề mặt của pha tĩnh (chất hấp phụ), còn sự tương tác giữa pha tĩnh và các tạp chất trong mẫu có thể không xảy ra hoặc xảy ra ở mức độ khác với chất phân tích Do sự khác nhau trong tính chất hóa học và vật lý giữa chất phân tích và tạp chất mà chúng được lưu giữ lại ở những phạm vi khác nhau Điều này cũng có thể đạt được nhờ thay đổi pH hoặc lực ion của dung dịch mẫu

Kỹ thuật này dùng để chiết trực tiếp mẫu lỏng hoặc làm sạch chất phân tích đã được chiết bằng dung môi theo kỹ thuật khác Kỹ thuật SPE cũng được dùng để làm giàu mẫu Thông thường nếu nồng độ chất phân tích trong mẫu quá thấp làm thiết bị phân tích khó phát hiện, cần phải sử dụng kỹ thuật SPE để làm giàu chất phân tích

để thiết bị có thể phát hiện đồng thời cũng loại bỏ tạp chất ra khỏi chất phân

tích.[19,25,27,30]

Chất hấp phụ[34]

Chất hấp phụ được chia thành pha tĩnh đảo, pha tĩnh thuận và nhựa trao đổi ion Các chất hấp phụ pha đảo là pha tĩnh không phân cực, khi cho mẫu phân tích chảy qua sẽ giữ lại các chất phân tích không phân cực và cho các chất phân cực chảy qua cột Nhờ vậy, các chất hấp phụpha đảo được dùng để chiết các chất phân tích không phân cực và phân cực vừa từ các mẫu nước

Các chất hấp phụ pha thuận là pha tĩnh phân cực, khi cho mẫu phân tích chảy qua

sẽ giữ lại các chất phân tích phân cực và cho các chất không phân cực chảy qua cột Nhờ vậy, các chất hấp phụ pha thuận được dùng để chiết các chất phân tích phân cực từ các mẫu không phân cực

Chất hấp phụ là nhựa trao đổi ion được sử dụng hoặc là hệ pha thường hoặc là hệ pha ngược, các chất phân tích là ion tích điện ngược dấu với ion trên nhựa trao đổi ion được giữ lại trong cột Các dung môi hữu cơ hoặc dung dịch chứa các ion đối có

ái lực ion mạnh hơn được sử dụng để rửa giải chất cần phân tích ra khỏi cột Các

23

chất hấp phụ nhựa trao đổi ion cho phép tách các chất phân tích ion từ các mẫu phân cực và không phân cực

Để làm sạch mẫu bằng SPE thường sử dụng các bước sau

Bước 1- Điều kiện hoạt hóa cột (luyện cột): Luyện cột chiết pha rắn nhằm hoạt hóa

cột chuẩn bị nhận mẫu

Bước 2-Chuyển mẫu vào cột chiết: Chuyển mẫu chiết lên cột, sau đó sử dụng áp

suất giảm hoặc để mẫu tự chảy với tốc độ khoảng 1-3 ml/phút tùy thể tích cột

Bước 3- Loại tạp chất: Sử dụng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi thích hợp để rửa

giải tạp chất bẩn ra trước,

Bước 4-Rửa giải hợp chất cần phân tích: Sử dụng lượng nhỏ dung môi hữu cơ mà

nó chỉ rửa giải hay chiết các hợp chất quan tâm và để lại tạp chất không loại được trong quá trình rửa

I.5 Tổng quan về phương pháp sắc ký khí khối phổ

Phương pháp phân tích sắc ký khí detector khối phổ là một phương pháp phân tích hóa lý được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học hiện nay như y dược học, hóa học, hình sự, môi trường, Đây là phương pháp phân tích hiện đại, có độ

Hoạt hoá Nạp mẫu Loại tạp chất Rửa giải

Hình 1.10: Các bước tiến hành SPE

là ngoài việc cho thông tin về thời gian lưu, diện tích píc của chất thì còn cho thông tin về phổ khối lượng của chất, từ đó sẽ giúp cho định tính các chất chính xác hơn

hay so sánh với thư viện phổ để phát hiện ra các chất cần thiết khác [3]

Như vậy đề tài sử dụng phương pháp sắc ký khí khối phổ sẽ giúp cho việc định tính, định lượng các HC BVTV một cách chính xác dựa vào kỹ thuật phân tích lựa chọn các mảnh phổ khối của từng chất (SIM), mảnh phổ lựa chọn để phân tích phải

có tính chất đặc trưng và là mảnh có tín hiệu cao nhất Kỹ thuật phân tích Scan của khối phổ cho phép thu nhận toàn bộ các mảnh phổ khối của chất phân tích thể hiện trên từng píc, dựa vào so sánh thư viện phổ sẽ cho chúng ta biết được píc đó là chất

gì

I.5.1 Cấu tạo của hệ thống sắc ký khí khối phổ

Cấu tạo của thiết bị sắc ký khí (GC) khối phổ (MS) gồm có các bộ phận như sau:

[3,21]

1: Nguồn khí mang 2: Bơm chân không 3: Buồng bơm mẫu

5: Cột tách sắc ký 6: Detector MS 7: Thiết bị thu nhận và xử lý tín hiệu

25

Hình 1.11:

ết bị sắc ký khí khố Nguồn khí mang: Thiết bị sắc ký khí kết nối detector khối phổ chỉ sử dụng khí

trơ là heli hoặc hydro Các khí này có độ tinh khiết cao (99,999%), nguồn khí phải

có van điều chỉnh áp suất và phải được nối với các hệ thống lọc khí trước khi vào thiết bị sắc ký Với khí hydro hiện nay thường có máy sinh khí, còn khí heli vẫn được nạp trong chai Nguồn khí mang này dùng để tách các cấu tử trong cột sắc ký

và tốc độ dòng khí được điều khiển bằng điện[20]

Bơm chân không: Có nhiệm vụ tạo môi trường chân không trong buồng ion hóa

mẫu đạt khoảng 10-5 torr trong MSD Thiết bị sắc ký trước đây sử dụng 2 bơm gồm

sơ cấp và thứ cấp do đó thời gian đạt được áp suất làm việc mất dài hơn 2 giờ Hiện nay các nhà sản xuất sử dụng bơm turbo do đó thời gian đạt được áp suất làm việc nhanh hơn rất nhiều

Cột sắc ký khí: Là bộ phận rất quan trọng của thiết bị sắc ký, được thể hiện thông

qua khả năng lưu giữ và tách các chất trong mẫu phân tích Cột phân tích hay được

ví như là trái tim của hệ thống sắc ký khí Có hai loại cột phổ biến là cột nhồi và cột mao quản Cột nhồi thường có kích thước đường kính lớn hơn nhưng độ dài lại ngắn hơn cột mao quản, do đó khả năng tách chất cũng như hiệu quả phân tích của

ệt của lò Lò điều nhiệt được điều khiển bằng

Detector khối phổ (MSD): Hoạt động của detector khối phổ dựa trên nguyên tắc

bẻ gẫy phân tử chất phân tích thành các mảnh ion có tỷ số m/z xác định và đặc trưng cho chất phân tích Có hai loại kỹ thuật ion hóa mẫu là ion hóa điện tử (EI) và ion hóa hóa học.Kỹ thuật EI được sử dụng phổ biến, đơn giản hiện nay

Hình 1.12 (a) Hình ảnh cột mao quản; (b) cấu tạo cắt ngang của cột mao quản

27

Khi mẫu ở dạng khí đi vào vùng ion hóa, tại đây mẫu tương tác với chùm electron có nguồn năng lượng cao cỡ 70 eV để tạo ra các electron thứ cấp mang điện tích dương và một số phân mảnh nhỏ hơn của phân tử Sau quá trình ion hóa, các ion sẽ được thu nhận bởi một lăng kính mang điện dẫn vào trong bộ phân tích khối Các ion khác nhau sẽ được phân tách do sự khác nhau về tỷ số khối lượng hạt trên điện tích (m/z) Sau khi các ion tạo thành đã được tách, detector (thường là bộ nhân điện tử loại dynod liên tục), được sử dụng để "đếm" các ion, hình thành nên phổ khối Ion từ bộ phân tích khối va chạm vào bề mặt bán dẫn của detector giải phóng các điện tử, cứ như thế sẽ nhân lên thành dòng thác điện tử, dẫn tới hệ số khuếch đại có thể tới 1 triệu lần

Có hai chế độ trong phân tích GC/MS là quét toàn bộ các ion như SCAN hoặc chỉ lựa chọn một số ion giàu hay đặc trưng để quét (SIM) Chế độ SCAN thường dùng để định tính các chất chưa biế

ịnh thời gian lưu của chất Hiện tại, các thiết bị GC/MS sử dụng máy tính có thể cập nhật trong thư viện phổ trên 350.000 chất Do mất một khoảng thời gian nhất định để quét toàn bộ các ion, độ nhạy trong chế độ SCAN thường thấp hơn chế độ SIM Ở chế độ SIM, chỉ vài ion xác định được lựa chọn để quét, tốc độ thu thập số liệu sẽ nhanh hơn, tương ứng với khoảng thời gian của một píc sắc ký (1 giây), như vậy kết quả định lượng sẽ tốt hơn và độ nhạy được cải thiện

nhiều.[3,21]

Ứng dụng:GC/MS thường được sử dụng để phân tích các chất hữu cơ có khả

năng bay hơi ở nhiệt độ dưới 350o

C, có khối lượng phân tử nhỏ hơn 600đvC [1,21]

Ưu điểm: Kết hợp ưu điểm của cả GC và MS, tính năng phân tích nhanh và độ

phân giải cao của sắc ký khí được bảo toàn MS cung cấp độ nhạy cả phân tích định tính và định lượng ở mức ppb đến ppt Dữ liệu phân tích được lưu giữ đầy đủ ở dạng phổ khối

khí nếu sử dụng detector khối phổ (MSD) thì ngoài dấu hiệu định tính được sử dụng

là thời gian lưu, còn sử dụng thêm dấu hiệu thứ 2 là so sánh sự có mặt và tỷ lệ mảnh phổ của chất chuẩn với chất cần tìm trong mẫu Như vậy, khi sử dụng phương pháp phân tích GC/MS thì độ chính xác của kết quả phân tích là cao hơn và phương

pháp này thường được sử dụng để khẳng định kết quả phân tích cuối cùng.[1,3]

Đề tài nghiên cứu sử dụng phương pháp phân tích là GC/MS Do đó việc định tính sự có mặt của HC BVTV trong mẫu phân tích dựa vào 2 dấu hiệu là so sánh thời gian lưu của HC BVTV trong mẫu chuẩn với mẫ ảnh phổ của HC BVTV trong mẫu chuẩn với mẫu phân tích Sơ đồ phổ khố ảnh phổ

HC BVTV được xác định sau khi phân tích mẫu trên GC/MS ở chế

độ Scan Hiện nay việc định tính thông thường chỉ sử dụng khoảng 3 mảnh phổ cho mỗi chất phân tích

lượng trong phân tích sắc ký khí có độ chính xác hơn cả Kỹ thuật này loại trừ được sai số trong quá trình bơm mẫ

mảnh phổ dùng để định lượng là mảnh phổ có tín hiệu mạnh nhất tức là cho diện tích pic lớn nhất Mảnh phổ này được xác định sau khi phân tích mẫu trên GC/MS ở chế độ Scan

Trong nghiên cứu củ ịnh lượng HC BVTV dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được đưa ra sau khi xây dựng đường chuẩn trên 6 điểm nồng độ Đường chuẩn được xây dựng dựa trên mối tương quan giữa tỷ lệ diện tích píc với nồng độ của của từng HC BVTV

Nồng độ của từng HC BVTV

ợc tính theo công thức:

HC BVTV trong mẫu = , (µg/g)

m(chè)

N v R

30

Trong đó:

- N: Nồng độ HC BVTV tính được dựa vào đường chuẩn đã dự

- v (ml) : Thể tích dung dịch trước khi bơm mẫu

- m(chè) : Khối lượng mẫu chè lấy phân tích

- R : Độ thu hồi của quy trình phân tích

31

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Đối tượng nghiên cứu

-Đối tượng nghiên cứu là 8 hóa chất bảo vệ thực vật gồm: dimethoate, diazinon, fenitrothion, endosulfan sulfat, permethrin, cyfluthrin, fenvalerate, deltamethrin -10 mẫu chè khác nhau được bán và tiêu thụ trên thị trường Hà Nội và được mã hóa từ 1 đến 10

+ M1: Trà hoa nhài Thái Nguyên; HSD: 30/07/2016; ĐKCL: 10TCN

259-96 Địa chỉ mua: Siêu thị Tea Mart - 46 Tăng Bạt Hổ, Hà Nội

+ M2: Chè Tân Cương Thái Nguyên; HSD: 30/8/2016 Địa chỉ mua: Siêu thị Tea

Mart - 46 Tăng Bạt Hổ, Hà Nội

+ M3: Chè Thái Nguyên đặc biệt (loại tự do không tem nhãn) Địa chỉ mua: Lò Đúc

+ M4: Chè Thái Nguyên (loại tự do không tem nhãn) Địa chỉ mua: Lò đúc

+ M5: Trà Ô long HSD: 15/6/16 Địa chỉ mua: Siêu thị Tea Mart - 46 Tăng Bạt

II.2.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

Dụng cụ nghiên cứu gồm có bình định mức, ống đong các loại, micropipet, ống nghiệm 10ml, vial 2ml, kim bơm mẫu và các dụng cụ cần thiết khác

Bộ chiết pha rắn 10 vị trí của Agilent

Bộ làm khô mẫu bằng khí nitơ Máy ly tâm Rotina 380, tốc độ max 14000rpm Cân phân tích Satorius độ chính xác 10 - 4

g

Thiết bị phân tích sắc ký khí 6890N và detector khối phổ 5973i của hãng Agilent Cột mao quản DB-5, dài 60m, đường kính 0,25mm, độ dày lớp film 1,0µm (pha tĩnh tẩm 5% Phenyl Methyl Siloxane)

II.3 Phương pháp nghiên cứu

33

II.4 Lấy mẫu nghiên cứu và bảo quản

- Mẫu chè nghiên cứu được nghiền nhỏ, bọc trong túi kín, bảo quản lạnh ở nhiệt

độ 0 - 4o

C ( TCVN 1456-83)

II.5 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu

* Chuẩn bị mẫu chuẩn phân tích tìm điều kiện phân tích và đánh giá độ ổn định của GC/MS trong cùng một ngày

-Pha từng mẫu chuẩn đơn chất trong dung môi Ethylacetate từ nồng độ gốc thành dung dịch có nồng độ là 20µg/ml

-Pha mẫu chuẩn hỗn hợp 8 chất BVTV nghiên cứu trong dung môi ethylacetate

có nồng độ 2500; 20000ng/ml

* Chuẩn bị mẫu chuẩn xây dựng đường ngoại chuẩn

Từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha hỗn hợp các chuẩn HC BVTV trong dung môi ethylacetate có các nồng độ 625; 1250; 2500; 5000; 1000; 20000ng/ml

*Chuẩn bị mẫu chè thêm chuẩn đánh giá độ thu hồi và độ lặp lại của quy trình

-Mẫu thêm chuẩn: Thêm 3ml dung dịch hỗn hợp HC BVTV trong dung môi ethylacetate có nồng độ mỗi chất là 500; 5000ng/ml vào bình tam giác thể tích 100ml có sẵn 3g chè đã nghiền nhỏ, trộn đều, để khô được mẫu chè thêm chuẩn HC BVTV

-Mẫu đối chứng: là mẫu chè cùng loại không thêm chuẩn

II.6 Quy trình xử lý mẫu chè phân tích HC BVTV bằng GC/MS

Bước 1: Chiết HC BVTV trong mẫu chè

Sử dụng phương pháp chiết lạnh bằng sóng siêu âm Cân khoảng 3g mẫu chè cần nghiên cứu đã nghiền nhỏ, thêm 20ml dung môi n-hexan vào bình chiết, đặt vào máy siêu âm chiết trong thời gian là 45 phút Lấy bình chiết ra gạn và lọc dịch chiết qua phễu lọc thủy tinh có 1g Na2SO4 khan, dịch lọc được hứng vào một bình nón

100ml Chiết lặp lại 3 lần

34

Bước 2: Làm bay hơi dung môi chiết

Dung môi chiết trong bình nón được làm bay hơi bằng khí nitơ đồng thời cho khí nóng thổi bên ngoài bình nón để làm tăng tốc độ bay hơi dung môi Dịch chiết được

II.7 Thẩm định quy trình xây dựng

Nội dung thẩm định gồm có các yếu tố sau:

+ Khảo sát độ lặp lại của hệ thống sắc ký khí detector khối phổ

Độ lặp lại của hệ thống sắc ký khí được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn của thời gian lưu và diện tích pic bằng cách bơm 5 lần lặp lại của cùng một mẫu (Đề tài đánh giá độ lặp lại trong một ngày)

+ Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình phân tích

Độ đặc hiệu được thí nghiệm trên mẫu chè không có chứa các hoá chất cần nghiên cứu Các bước tiến hành như quy trình đã nêu

+ Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Khoảng tuyến tính được khảo sát thông qua việc phân tích 6 điểm nồng độ Khoảng tuyến tính khảo sát nhằm đảm bảo sự chính xác của phép định lượng LOD là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trong mẫu thử có thể phát hiện được Tùy thuộc vào phương pháp phân tích và điều kiện thí nghiệm có thể tính

Giới hạn định lượng (LOQ) là lượng nhỏ nhất của chất phân tích trong dung môi

mà thiết bị có thể định lượng được Dựa vào tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu (S/N), giới hạn định lượng được xác định bằng nồng độ của đáp ứng mà tại đó có chiều cao pic của nó bằng khoảng 10 lần chiều cao của nhiễu (S/N)

+ Khảo sát độ đúng của quy trình phân tích

Độ đúng của quy trình được tiến hành nhằm đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị được coi là thực Độ đúng của quy trình được đánh giá thông qua tỷ lệ thu hồi (R%), xác định dựa trên phương pháp thêm chuẩn vào mẫu chè và so sánh với mẫu chè không thêm chuẩn Sau đó tiến hành phân tích mẫu như quy trình đưa ra Tiến hành sắc ký như điều kiện đã chọn, lặp lại thí nghiệm 5 lần cùng một nồng độ Giá trị R cho phép trong mẫu là 80 đến 120%

+ Khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích

Độ lặp lại của quy trình phân tích được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn tương đối của 5 phép thử riêng biệt trên cùng một mẫu Quá trình thực hiện theo đúng quy trình, điều kiện sắc ký đã trình bày Giá trị RSD cho phép 15%