Nghiên cứu phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm và beta agonist

Xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong thực phẩm bằng phương pháp CE – C 4 D .... Tóm tắt một số nghiên cứu xác định các acid hữu cơ, chất tạo n

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHỤ GIA THỰC PHẨM VÀ

BETA-AGONIST

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN

SỬ DỤNG DETECTOR ĐỘ DẪN KHÔNG TIẾP XÚC XÁC ĐỊNH MỘT SỐ PHỤ GIA THỰC PHẨM VÀ

BETA-AGONIST

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 62440118

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Phạm Thị Ngọc Mai

2 TS Nguyễn Thị Ánh Hường

XÁC NHẬN NCS ĐÃ CHỈNH SỬA THEO QUYẾT NGHỊ

CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ LUẬN ÁN

Luận án Tiến sĩ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành với sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của các Thầy

Cô, gia đình và bạn bè, đồng nghiệp

Với tình cảm chân thành, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PSG.TS Phạm Thị Ngọc Mai và TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã nhiệt tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tâm huyết truyền dạy kiến thức và động viên tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu tại đây

Tôi xin cảm ơn công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) đã cung cấp

Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã phối hợp và hỗ trợ tôi hoàn thành nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự cộng tác, giúp đỡ của PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo cùng các cán bộ của Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè, lãnh đạo cùng các đồng nghiệp trong Khoa Công nghệ Hóa học và Môi trường, trường Đại học Sư phạm Kỹ thuật Hưng Yên, các học viên và sinh viên trong bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội đã ủng hộ, giúp đỡ, động viên tôi trong cả quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tác giả

Nguyễn Thị Quỳnh Hoa

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC HÌNH xiv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1.1 Một số chất phụ gia và beta-agonist trong sản xuất thực phẩm 4

1.1.1 Khái quát chung về một số nhóm phụ gia thực phẩm 5

1.1.1.1 Acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric điều chỉnh

độ acid, bảo quản thực phẩm 5

1.1.1.2 Chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin 8

1.1.2 Các chất beta-agonist 11

1.1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm beta-agonist 11

1.1.2.2 Vai trò và tác dụng phụ của các beta-agonist 12

1.1.2.3 Vấn đề sử dụng beta-agonist trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.2 Các phương pháp xác định chất phụ gia và beta-agonist trong

thực phẩm và mẫu sinh học 16

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.2.1.1 Các phương pháp sắc ký 16

1.2.1.2 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV – Vis xác định các chất

tạo ngọt 21

1.2.1.3 Phương pháp điện hóa xác định các beta-agonist 21

1.2.1.4 Phương pháp sinh học xác định các beta-agonist 22

1.2.1.5 Phương pháp điện di mao quản xác định phụ gia thực phẩm và beta-agonist 23

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 31

1.3 Phương pháp điện di mao quản 32

1.3.1 Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản 32

1.3.2 Nguyên tắc và cấu tạo của một hệ điện di mao quản cơ bản 33

1.3.3 Cơ sở lý thuyết của điện di mao quản 34

1.3.4 Dòng điện di thẩm thấu và sự di chuyển của ion chất phân tích

trong mao quản 35

1.3.5 Các detector thông dụng trong phương pháp điện di mao quản 37

1.3.5.1 Detector quang học 37

1.3.5.2 Detector khối phổ 38

1.3.5.3 Detector điện hóa 39

1.3.5.4 Detector độ dẫn không tiếp xúc (C 4 D) 40

1.3.6 Ứng dụng của phương pháp điện di mao quản CE –C4D 43

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 Thiết bị và hóa chất 44

2.1.1 Thiết bị 44

2.1.1.1 Thiết bị CE – C 4 D 44

2.1.1.2 Các thiết bị khác và dụng cụ 45

2.1.2 Hóa chất 46

2.1.2.1 Chất chuẩn 46

2.1.2.2 Hóa chất và dung môi 46

2.1.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 47

2.2 Phương pháp nghiên cứu 48

2.2.1 Phương pháp CE – C4D 48

2.2.2 Phương pháp khảo sát xác định các điều kiện thích hợp 48

2.2.2.1 Khảo sát dung dịch đệm điện di 49

2.2.2.2 Khảo sát thế tách 50

2.2.2.3 Khảo sát thời gian bơm mẫu 50

2.2.3 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu thực phẩm 51

2.2.4 Phương pháp lấy mẫu, xử lý, làm giàu mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn 51

2.2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý sơ bộ mẫu nước tiểu, mẫu thịt lợn 51

2.2.4.2 Phương pháp chiết pha rắn salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn 52

2.2.5 Phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 56

2.2.5.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 56

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 60

3.1 Xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric bằng phương pháp CE–C 4 D 60

3.1.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 61

3.1.1.1 Khảo sát dung dịch đệm điện di 61

3.1.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thế tách 63

3.1.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của chiều cao và thời gian bơm mẫu 65

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn cho các chất phân tích và đánh giá phương pháp 68

3.1.2.1 Xây dựng đường chuẩn 68

3.1.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 70

3.1.2.3 Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 71

3.1.3 Phân tích đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong mẫu thực phẩm 72

3.1.3.1 Xác định đồng thời acid formic, acid acetic, acid propionic,

acid butyric trong thực phẩm bằng phương pháp CE – C 4 D 72

3.1.3.2 Kết quả phân tích đối chứng acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong thực phẩm bằng phương pháp tiêu chuẩn HPLC 73

3.2 Xác định đồng thời chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam,

cyclamat natri, saccharin trong thực phẩm bằng phương pháp CE–C 4 D 74

3.2.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 75

3.2.1.1 Khảo sát dung dịch đệm điện di 75

3.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thế tách 78

3.2.1.3 Khảo sát thời gian bơm mẫu 79

3.2.2 Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp nghiên cứu 81

3.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn 81

3.2.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 83

3.2.2.3 Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 84

3.2.3 Phân tích chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri,

saccharin trong thực phẩm 85

3.2.3.1 Phân tích chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin trong thực phẩm bằng phương pháp CE – C 4 D 85

3.2.3.2 Phân tích đối chứng hàm lượng các chất tạo ngọt bằng

phương pháp CE – C 4 D và phương pháp HPLC 87

3.3 Khảo sát các điều kiện thích hợp phân tích salbutamol, metoprolol và

ractopamin trong mẫu thức ăn chăn nuôi, nước tiểu lợn và thịt lợn

bằng phương pháp CE–C 4 D 88

3.3.1 Khảo sát các điều kiện thích hợp 89

3.3.1.1 Khảo sát dung dịch đệm điện di 89

3.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thế tách 93

3.3.1.3 Khảo sát thời gian bơm mẫu 95

3.3.2 Đường chuẩn phân tích và đánh giá phương pháp phân tích 97

3.3.2.1 Đường chuẩn phân tích 97

3.3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 98

3.3.2.3 Đánh giá độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp 99

3.3.3 Xác định đồng thời salbutamol, metoprolol và ractopamin trong mẫu thức ăn chăn nuôi 101

3.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các cation kim loại trong việc xác định đồng thời salbutamol, metoprolol và ractopamin trong mẫu thức ăn chăn nuôi 101

3.3.3.2 Xác định đồng thời salbutamol, metoprolol và ractopamin trong mẫu thức ăn chăn nuôi 102

3.3.4 Xây dựng quy trình chiết pha rắn salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn nhằm xác định bằng phương pháp CE – C4D 104

3.3.4.1 Khảo sát lựa chọn cột chiết 104

3.3.4.2 Ảnh hưởng của pH dung dịch mẫu đến khả năng chiết salbutamol 106

3.3.4.3 Khảo sát dung môi rửa tạp chất 107

3.3.4.4 Khảo sát dung môi rửa giải 110

3.3.4.5 Đánh giá phương pháp phân tích salbutamol trong mẫu nước tiểu lợn bằng phương pháp CE – C 4 D kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu phân tích 111

3.3.4.6 Phân tích mẫu nước tiểu thực tế 114

3.3.5 Nghiên cứu phương pháp chiết pha rắn (SPE) làm giàu salbutamol

trong mẫu thịt lợn 115

3.3.5.1 Khảo sát lựa chọn cột chiết 115

3.3.5.3 Đánh giá phương pháp phân tích salbutamol trong mẫu thịt

bằng phương pháp CE – C 4 D sử dụng chiết pha rắn xử lý mẫu phân tích 120

3.3.5.4 Kết quả phân tích mẫu thịt lợn 122

3.3.6 Kết quả phân tích đối chứng với phương pháp LC/MS/MS 123

KẾT LUẬN 124

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 126

TÀI LIỆU THAM KHẢO 127

PHỤ LỤC 139

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Ace – K Acesulfame potassium

Hiệp hội các nhà hoá học phân tích

guanidinopentanoic acid)

Arginin (Acid 2– amino– 5–

guanidinopentanoic)

L– phenylalanin, 1– methyl este)

Aspartam (este N– (L– α–

Aspartyl)– L– phenylalanin, 1– methyl)

Cetyl trimethylammonium bromide

Cyc Cyclamat natri

(N– cyclohexylsulfamat natri)

Cyclamat natri (N–

cyclohexylsulfamat natri)

Phương pháp miễn dịch enzym

ELISA Enzyme– linked immunosorbent

assay

Phương pháp hấp thụ miễn dịch có gắn enzym

detector

Detector tán xạ bay hơi

imidazol– 4– yl) propanoic acid)

Histidin(acid 2– Amino– 3– (1H– imidazol– 4– yl) propanoic)

chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(2methoxyethyl)phenoxy]propan– 2– ol)

electrophoresis

Điện di mao quản sử dụng dung môi không nước

PDA Photodiode array detector Detector mảng diod quang

hydroxyphenyl)– 1–

methylpropyl]amino]methyl] benzenemethanol)

propan– 1,3– diol

2– Amino– 2– hydroxymethyl– propan– 1,3– diol

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Danh mục một số nhóm chất phụ gia và beta-agonist trong sản xuất

thực phẩm 4

Bảng 1.2 Thông tin chung về acid formic, acid acetic, acid propionic,

acid butyric 6

Bảng 1.3 Thông tin chung về acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin 9

Bảng 1.4 Thông tin chung về salbutamol, metoprolol và ractopamin 12

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định các acid hữu cơ, chất tạo ngọt và beta-agonist trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký 18

Bảng 1.6 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định các acid hữu cơ bằng

phương pháp điện di mao quản 24

Bảng 1.7 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định các chất tạo ngọt bằng

phương pháp điện di 27

Bảng 1.8 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định các chất beta-agonist

bằng phương pháp điện di mao quản 29

Bảng 2.1 Tỉ lệ thành phần đệm Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes , Arg/CAPS

và pH 49

Bảng 2.2 Giá trị thế tách được khảo sát 50

Bảng 2.3 Thời gian bơm mẫu được khảo sát 50

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đệm điện di His/Mes đến diện tích píc (Spíc)

và thời gian di chuyển (tdc) của acid formic, acid acetic, acid propionic và

acid butyric 62

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của thế tách đến diện tích píc và thời gian di chuyển

của acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric 64

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến diện tích píc (Spíc) và thời gian di chuyển (tdc) của acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric 66

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích píc(Spíc) và thời gian

di chuyển (tdc) của acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric 67

Bảng 3.5 Điều kiện thích hợp xác định đồng thời acid formic, acid acetic,

acid propionic, acid butyric bằng phương pháp CE – C4D 68

Bảng 3.6 Phương trình đường chuẩn của acid formic, acid acetic,

acid propionic và acid butyric 70

Bảng 3.7 Giới hạn phát hiện acid formic, acid acetic, acid propionic,

acid butyric bằng phương pháp CE – C4D 70

Bảng 3.8 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định

acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong mẫu cà phê hạt 71

Bảng 3.9 Kết quả phân tích hàm lượng acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric trong một số mẫu thực bằng phương pháp CE – C4D và HPLC

(n= 3) 73

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của thế tách đến thời gian di chuyển các chất tạo ngọt

Ace – K, Asp, Cyc, Sac 78

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích píc (Spíc) và

thời gian di chuyển (tdc) các chất tạo ngọt Ace – K, Asp, Cyc, Sac 79

Bảng 3.12 Điều kiện thích hợp xác định đồng thời chất tạo ngọt Ace – K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp CE – C4D 81

Bảng 3.13 Phương trình đường chuẩn của Ace – K, Asp, Cyc, Sac 82

Bảng 3.14 Giới hạn phát hiện Ace – K, Asp, Cyc, Sac bằng phương pháp

CE – C4D 83

Bảng 3.15 Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định

Ace – K, Asp, Cyc, Sac trong mẫu thạch 84

Bảng 3.16 Kết quả phân tích hàm lượng bốn chất tạo ngọt trong thực phẩm

bằng phương pháp CE – C4D và phương pháp tiêu chuẩn HPLC (n= ?) 87

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của pH đến diện tích píc (Spíc) và thời gian di chuyển (tdc) của Sal, Met và Rac 89

Bảng 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến diện tích píc (Spíc) và thời gian di chuyển (tdc) của Sal, Met và Rac 93

Bảng 3.19 Ảnh hưởng của thế tách đến thời gian di chuyển Sal, Met và Rac 94

Bảng 3.20 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến thời gian di chuyển (tdc)

Sal, Met, Rac 95

Bảng 3.21 Điều kiện thích hợp xác định đồng thời Sal, Met, Rac

Bảng 3.22 Phương trình đường chuẩn của Sal, Met và Rac 98

Bảng 3.23 Giới hạn phát hiện Sal, Met và Rac bằng phương pháp CE – C4D 98

Bảng 3.24 Độ lặp lại phương pháp CE – C4D xác định Sal, Met, Rac

trong dung dịch chuẩn 99

Bảng 3.25 Độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định Sal, Met, Rac

trong dung dịch chuẩn 100

Bảng 3.26 Kết quả phân tích Sal và Rac trong mẫu thức ăn chăn nuôi (TACN) 103

Bảng 3.27 Độ lặp lại của phương pháp CE – C4D xác định salbutamol kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu nước tiểu lợn 112

Bảng 3.28 Độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định salbutamol kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu nước tiểu lợn 113

Bảng 3.29 Kết quả phân tích hàm lượng Sal trong mẫu nước tiểu 114

Bảng 3.30 Độ lặp lại của phương pháp CE – C4D xác định salbutamol kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu thịt lợn 121

Bảng 3.31 Độ thu hồi của phương pháp CE – C4D xác định salbutamol kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu thịt lợn 121

Bảng 3.32 Kết quả phân tích salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn

bằng phương pháp CE – C4D và phương pháp LC/MS/MS 123

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Kết quả kiểm tra việc sử dụng salbutamol trong chăn nuôi đợt 01.2015

của chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh 15

Hình 1.2 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị CE 33

Hình 1.3 Dòng EOF và sự di chuyển của các cation và anion trong mao quản 36

Hình 1.4 Sơ đồ nguyên lý hoạt động của detector độ dẫn không tiếp xúc 40

Hình 1.5 A) Sơ đồ biểu diễn cấu trúc của detector độ dẫn không tiếp xúc,

với hai điện cực ngăn cách với dung dịch cần đo bởi thành mao quản 41

B) Mạch điện tương đương 41

Hình 1.6 Biểu diễn mối liên hệ giữa tín hiệu đầu ra và độ lớn (điện thế và tần số) của nguồn kích thích xoay chiều 41

Hình 1.7 Quá trình chuyển đổi tín hiệu của C4D 42

Hình 2.1 Ảnh chụp hệ thiết bị CE – C4D triển khai tại Việt Nam 44

Hình 2.2 Các bước chiết pha rắn 53

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ đệm điện di His/Mes đến sự phân tích acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric 62

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thế tách đến sự phân tích acid formic, acid acetic,

acid propionic và acid butyric 64

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến sự phân tích acid formic,

acid acetic, acid propionic, acid butyric 66

Hình 3.4 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu tới sự phân tích acid formic,

acid acetic, acid propionic, acid butyric 66

Hình 3.5 Đường chuẩn xác định acid formic theo diện tích píc 69

Hình 3.6 Đường chuẩn xác định acid acetic theo diện tích píc 69

Hình 3.7 Đường chuẩn xác định acid propionic theo diện tích píc 69

Hình 3.8 Đường chuẩn xác định acid butyric theo diện tích píc 69

Hình 3.9 Điện di đồ xác định acid formic, acid acetic, acid propionic,

Hình 3.10 Sự tương quan giữa phương pháp CE – C4D và HPLC khi phân tích

acid formic, acid acetic, acid propionic và acid butyric trong thực phẩm 74

Hình 3.11 Ảnh hưởng của pH với các thành phần đệm điện di khác nhau

đến sự phân tích Ace – K, Asp, Cyc, Sac 76

Hình 3.12 So sánh khả năng phân tích Ace – K, Asp, Cyc, Sac của các đệm

điện di Tris/Ches, Tris/His, Arg/Mes, Arg/CAPS ở pH = 9,2 77

Hình 3.13 Ảnh hưởng của thế tách đến sự phân tích chất tạo ngọt Ace – K,

Asp, Cyc, Sac 78

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến sự phân tích các chất tạo ngọt Ace – K, Asp, Cyc, Sac 80

Hình 3.15 Đường chuẩn xác định Ace – K theo diện tích píc 82

Hình 3.16 Đường chuẩn xác định Asp theo diện tích píc 82

Hình 3.17 Đường chuẩn xác định Cyc theo diện tích píc 82

Hình 3.18 Đường chuẩn xác định Sac theo diện tích píc 82

Hình 3.19 Kết quả phân tích chất tạo ngọt trong mẫu nước giải khát

bằng phương pháp CE – C4D 85

Hình 3.20 Điện di đồ phân tích chất tạo ngọt trong một số mẫu thực tế 86

Hình 3.21 Điện di đồ xác định Sac trong mẫu nước chè đỗ đen

bằng phương pháp thêm chuẩn 86

Hình 3.22 Ảnh hưởng của pH đến sự phân tích Sal, Met, Rac 89

Hình 3.23 Ảnh hưởng của pH đến diện tích píc của Sal, Met, Rac 90

Hình 3.24 Ảnh hưởng của thành phần đệm đến sự phân tích Sal, Met, Rac 91

Hình 3.25 Ảnh hưởng của thành phần đệm điện di đến diện tích píc của

Sal, Met, Rac 91

Hình 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm điện di đến sự phân tích

Sal, Met, Rac 92

Hình 3.27 Ảnh hưởng của thế tách đến thời gian di chuyển và sự phân tích

Sal, Met, Rac 94

Hình 3.28 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến thời gian di chuyển (tdc)

Sal, Met, Rac 95

Hình 3.29 Đường chuẩn xác định Sal theo diện tích píc 97

Hình 3.30 Đường chuẩn xác định Met theo diện tích píc 97

Hình 3.31 Đường chuẩn xác định Rac theo diện tích píc 97

Hình 3.32 Điện di đồ khảo sát sự ảnh hưởng của các cation đến sự phân tích

của Sal, Met, Rac 102

Hình 3.33 Điện di đồ xác định Sal, Met, Rac trong một số mẫu thức ăn

chăn nuôi 103

Hình 3.34 Khảo sát lựa chọn cột chiết pha rắn mẫu nước tiểu lợn 105

Hình 3.35 Độ thu hồi của các loại cột chiết mẫu nước tiểu lợn 105

Hình 3.36 Khảo sát đệm chiết pha rắn mẫu nước tiểu lợn 107

Hình 3.37 Khảo sát dung môi rửa tạp chất chiết pha rắn mẫu nước tiểu lợn 108

Hình 3.38 Hiệu suất thu hồi của các dung môi rửa tạp chiết mẫu nước tiểu lợn 109

Hình 3.39 Khảo sát hệ dung môi rửa giải chiết mẫu nước tiểu lợn 110

Hình 3.40 Điện di đồ xác định MDL của phương pháp CE – C4D xác định salbutamol kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu nước tiểu lợn 112

Hình 3.41 Khảo sát lựa chọn cột chiết pha rắn mẫu thịt lợn 115

Hình 3.42 Hiệu suất thu hồi của các loại cột chiết mẫu thịt lợn 116

Hình 3.43 Khảo sát dung môi rửa tạp 1, 2, 3 chiết mẫu thịt lợn 117

Hình 3.44 Khảo sát dung môi rửa tạp 4, 5, 6 chiết mẫu thịt lợn 118

Hình 3.45 Hiệu suất thu hồi của dung môi rửa tạp mẫu thịt lợn 118

Hình 3.46 Điện di đồ xác định MDL của phương pháp CE – C4D xác định salbutamol kết hợp chiết pha rắn xử lý mẫu thịt lợn 120

Hình 3.47 Điện di đồ phân tích mẫu thịt thực tế 122

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết và mục tiêu của luận án

Vấn đề an toàn thực phẩm ở nước ta đã trở nên đáng báo động hơn bao giờ hết khi một loạt các vụ việc về thực phẩm bẩn bị phanh phui trong thời gian vừa qua Các vụ vi phạm liên quan đến an toàn thực phẩm diễn ra khắp mọi nơi, ở các công ty chế biến thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, từ chợ cóc đến siêu thị uy tín, từ nhà hàng sang trọng đến bếp ăn tập thể trong khu công nghiệp, trường học, quán cơm bình dân… Ngộ độc thực phẩm và các bệnh do thực phẩm gây ra không chỉ gây ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ, cuộc sống của mỗi người, mà còn gây thiệt hại lớn về kinh tế, là gánh nặng chi phí cho chăm sóc sức khoẻ

Một trong số các vấn đề liên quan đến an toàn thực phẩm đang được quan tâm hiện nay là sử dụng trái phép và tồn dư các chất cấm (như chất tạo nạc), kháng sinh… trong chăn nuôi, sử dụng không đúng liều lượng và quy cách các chất phụ gia thực phẩm (chất tạo ngọt, chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm…) Do

đó, việc nghiên cứu phát triển các quy trình và phương pháp phân tích cho các nhóm chất này là rất cần thiết

Việc phân tích các chỉ tiêu thực phẩm ở Việt Nam hiện nay vẫn là vấn đề mới, chưa có đầy đủ các qui trình phân tích tiêu chuẩn theo TCVN Thông thường, việc kiểm nghiệm thực phẩm được thực hiện chủ yếu bằng các phương pháp sắc ký (như: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký khí khối phổ (GC – MS), sắc ký ion (IC)…) Tuy nhiên, các thiết bị phân tích này có chi phí đầu tư lớn và thường chỉ được trang bị tại Viện kiểm nghiệm tuyến Trung ương (Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia) và một số trung tâm kiểm nghiệm tuyến tỉnh Trong khi đó, nhu cầu phân tích, kiểm nghiệm các chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm là rất lớn và nhiều khi cần thực hiện ngay tại các địa phương để đáp ứng nhiệm vụ kiểm tra, ngăn ngừa và xử lý kịp thời các vụ việc Phương pháp điện di

gần đây được biết đến là một công cụ hữu hiệu trong phân tích thực phẩm với các

ưu điểm nổi trội như thiết bị nhỏ gọn, hoạt động đơn giản, lượng mẫu và các dung môi hóa chất ít, chi phí đầu tư và vận hành thấp, có thể chế tạo với linh kiện thay

thế sẵn có tại Việt Nam, từ đó cho chi phí phân tích mẫu thấp hơn so với các

cho thấy triển vọng trở thành một công cụ đắc lực trong sàng lọc, kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, nhất là tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ ở tuyến địa phương, các chợ và siêu thị, các địa điểm kinh doanh, bếp ăn tập thể hay nhóm hộ tiêu dùng

Với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp điện di mao quản sử dụng detector

độ dẫn không tiếp xúc xác định một số phụ gia thực phẩm và beta-agonist”,

mục tiêu của luận án là nghiên cứu phát triển ứng dụng của phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE – C4D) nhằm xác định một số phụ gia thực phẩm và beta-agonist bao gồm: phân tích đồng thời bốn chất điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm; phân tích đồng thời bốn chất tạo ngọt và xác định đồng thời ba chất thuộc nhóm beta-agonist, trong đó có salbutamol thường được thêm trái phép vào thức ăn chăn nuôi để tăng tỷ lệ thịt nạc của vật nuôi (còn hay được gọi là chất tạo nạc)

2 Nội dung nghiên cứu

gia thực phẩm: tìm các điều kiện thích hợp để xác định đồng thời bốn acid hữu cơ (acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric), bốn chất tạo ngọt (acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin) và ba chất tạo nạc lựa chọn thuộc nhóm các beta-agonist (salbutamol, ractopamin, metoprolol)

2 Nghiên cứu khảo sát phương pháp chiết pha rắn làm sạch và làm giàu salbutamol trong mẫu nước tiểu và mẫu thịt lợn nhằm xác định bằng phương pháp

CE – C4D

3 Nghiên cứu áp dụng các điều kiện thích hợp đã khảo sát được để phân tích một số phụ gia thực phẩm trong các mẫu thực tế, đặc biệt là chất tạo nạc salbutamol trong qui trình khép kín từ thức ăn chăn nuôi đến nước tiểu lợn và thịt lợn

phân tích một số chỉ tiêu liên quan đến an toàn thực phẩm, so sánh, đối chứng kết quả phân tích mẫu thực tế với kết quả phân tích bằng các phương pháp phân tích

3 Điểm mới, những đóng góp mới về mặt khoa học và thực tiễn của luận án

 Về mặt khoa học

Phương pháp điện di mao quản với detector UV đã được ứng dụng nhiều trong phân tích thực phẩm nhưng lần đầu tiên ở Việt Nam, luận án đã nghiên cứu ứng dụng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc

chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt) và beta-agonist (chất tạo nạc)

trong thực phẩm Tổng quan nghiên cứu cho thấy, trên thế giới cũng chưa có nhiều

(hai nghiên cứu xác định các anion hữu cơ và vô cơ trong đó có format và acetat,

hai nghiên cứu xác định nhóm chất tạo ngọt, một nghiên cứu xác định salbutamol trong dược phẩm và một nghiên cứu xác định beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi)

trong lĩnh vực phân tích thực phẩm, đóng góp thêm một phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm mới, góp phần vào việc quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt Nam

 Về mặt thực tiễn

Phương pháp CE – C4D với các ưu điểm về hệ thiết bị mở ra khả năng áp dụng phân tích nhiều đối tượng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là với lĩnh vực an toàn thực phẩm, có ý nghĩa thực tế lớn, thích ứng với hoàn cảnh, điều kiện kinh tế, xã hội ở nước ta

Các quy trình phân tích xây dựng trong luận án đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, có độ chính xác cao, rất phù hợp để áp dụng phân tích các chất điều chỉnh

độ acid, bảo quản thực phẩm và chất tạo ngọt trong các mẫu thực phẩm, giúp kiểm soát sử dụng đúng hàm lượng và quy cách các phụ gia này trong thực phẩm

Đặc biệt là với salbutamol, một chất tạo nạc được sử dụng trái phép nhiều trong chăn nuôi ở nước ta, quy trình phân tích trong luận án đã được áp dụng để phân tích salbutamol trong mẫu thức ăn chăn nuôi, mẫu nước tiểu lợn và mẫu thịt lợn, có thể giúp các nhà quản lý kiểm tra, giám sát và kịp thời ngăn chặn xử lý việc

sử dụng chất cấm này trong chăn nuôi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Một số chất phụ gia và beta-agonist trong sản xuất thực phẩm

Thực phẩm hay còn được gọi là thức ăn [37] là bất kỳ vật phẩm nào, bao

gồm chủ yếu các chất: chất bột (cacbohydrat), chất béo (lipit), chất đạm (protein)

hoặc nước mà con người hay động vật có thể ăn hay uống được, với mục đích cơ

bản là thu nạp các chất dinh dưỡng nhằm nuôi dưỡng cơ thể hay vì sở thích Từ xa

xưa, để bảo quản hay cải thiện hương vị và hình thức của thực phẩm, các chất phụ

gia đã được thêm vào thực phẩm Ngày nay, vì nhiều mục đích khác nhau, ngoài

phụ gia được cho phép dùng, rất nhiều các chất cấm (như các loại beta-agonist,

hoóc môn…) đã được thêm trái phép vào thực phẩm bằng nhiều hình thức khác

nhau Một chất phụ gia thực phẩm (PGTP) đã được cho phép sử dụng đồng nghĩa

với việc nó an toàn cho người sử dụng trong giới hạn cho phép Tuy nhiên nếu thực

phẩm có hàm lượng phụ gia vượt quá giới hạn cho phép hoặc đặc biệt có chứa các

chất cấm, sẽ gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Bảng 1.1 giới thiệu một số

nhóm phụ gia và beta-agonist trong sản xuất thực phẩm [6, 11]

Bảng 1.1 Danh mục một số nhóm chất phụ gia và beta-agonist

Acid acetic, acid citric, natri acetat, kali adipat…

vị của thực phẩm

Canxi glutamate, acid glutamic (L(+)– ), etyl maltol…

phân tán, đồng nhất

Canxi cacbonat, natri hydro cacbonat, kali clorua…

4 Các chất bảo quản Cản trở, trì hoãn các

hoạt động của vi sinh vật, các biến đổi sinh hóa của thực phẩm

Acid formic, canxi format, acid benzoic, kali sulfit, natri propionat, acid propionic, …

oxi hóa

Đề phòng, cản trở sự oxi hóa trong thực phẩm

Acid ascorbic (L– ), butylat hydroxy anisol (BHA)…

Salbutamol, ractopamin, clenbuterol…

Nếu sử dụng chất phụ gia và beta-agonist không đúng liều lượng, chủng loại,

nhất là những chất không được phép dùng trong thực phẩm, sẽ gây những tác hại

cho sức khỏe con người như:

– Gây ngộ độc cấp tính: nếu dùng quá liều cho phép

– Gây ngộ độc mãn tính: dù dùng liều lượng nhỏ nhưng sử dụng thường xuyên, liên tục, một số chất phụ gia thực phẩm có khả năng tích lũy trong cơ thể,

gây tổn thương lâu dài

Trong các nhóm chất ở bảng 1.1, nhóm phụ gia thực phẩm như các chất điều

chỉnh độ acid, chất bảo quản, chất tạo ngọt… ít gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Nhóm beta-agonist có thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng nên nhóm này đa phần bị cấm sử dụng trong sản xuất thực phẩm

1.1.1 Khái quát chung về một số nhóm phụ gia thực phẩm

1.1.1.1 Acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric điều chỉnh độ acid, bảo quản thực phẩm

Acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric được sử dụng khá phổ biến trong thực phẩm Mỗi acid có một tác dụng riêng với từng loại thực phẩm và ảnh hưởng khác nhau tới sức khỏe con người Thông tin chi tiết của 4 acid này được trình bày ở bảng 1.2 [4, 7]

Bảng 1.2 Thông tin chung về acid formic, acid acetic, acid propionic, acid butyric

Acid formic và các muối của nó được sử dụng để chống vi khuẩn và nấm mốc phát triển trong thức ăn, nước uống như cà phê, rượu vang… Ngoài ra, acid này còn được trộn vào thức ăn chăn nuôi để ngăn chặn sự phát triển của E.Coli, ngăn ngừa bệnh tiêu chảy cho gia súc dưới dạng muối format Tuy nhiên, nồng độ acid formic trong máu cao sẽ ức chế các cytocrom oxidat của ty nạp thể trong tế bào gây thiếu oxy tế bào, tổn thương thần kinh thị giác và võng mạc mắt

Acid acetic ở hàm lượng phổ biến từ 5,0 – 7,0 % được gọi là dung dịch giấm ăn Công nghệ thực phẩm sử dụng giấm ăn rộng rãi để chế biến đồ hộp,

rau, quả và gia vị Acid acetic có vai trò như là một thành phần chính trong

nhóm chất điều chỉnh độ acid (độ chua) trong ngành phụ gia thực phẩm Ngoài

ra, acid acetic cũng được dùng như là một chất bảo quản thực phẩm thường có trong công nghiệp đồ uống như cà phê, rượu nho, rượu vang… Acid acetic là

một loại phụ gia thông dụng nhưng nếu lạm dụng quá có thể gây hại tới chính

loại thực phẩm cần bảo quản vì độ chua quá cao sẽ dẫn tới sự lên men các vi sinh

vật, làm hỏng thực phẩm [7]

Phần lớn acid propionic được sử dụng làm chất bảo quản thực phẩm dành

cho cả người và gia súc để ức chế hiệu quả sự sinh trưởng của vi sinh vật ở môi trường pH = 5,0 – 6,0 hàm lượng sử dụng có thể lên đến 0,1 % (theo khối lượng sản phẩm) Ngoài ra acid propionic và các muối natri, canxi của nó là những chất chống

mốc hiệu quả, các propionat có thể làm chậm hoạt động của nấm men, kéo dài thời

gian lên men trong bánh mỳ và các sản phẩm nướng khác Tuy nhiên, nếu hàm lượng propionat trong bánh mì cao (0,5 – 0,7 %) bánh sẽ có vị đắng [4]

Acid butyric được sử dụng trong điều chế các loại este butanoat khác

nhau Các este khối lượng phân tử thấp như methyl butanoat chủ yếu có mùi vị thơm dễ chịu nên thường được sử dụng tạo hương cho thực phẩm Acid butyric

là phụ gia ít được dùng hơn so với các loại phụ gia khác do hầu hết các acid này đều được chuyển thành các dạng este trong bảo quản cũng như tạo mùi hương trong thực phẩm

Cả bốn acid trên ngoài các công dụng riêng như bảo quản thực phẩm, chống oxi hóa… đều có khả năng điều chỉnh độ acid, có tác dụng duy trì hay trung hòa độ acid của thực phẩm, tạo vị chua đối với thực phẩm Tuy nhiên, nếu lạm dụng chúng thì có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người, nhất là đối với dạ dày Vì

vậy, để loại trừ các ảnh hưởng đó, TCVN 7045:2002 đã có quy định về hàm lượng các acid hữu cơ dễ bay hơi (quy về tính theo acid acetic) với hàm lượng tối đa là 1,5 g/l đối với các loại rượu vang cũng như các loại đồ uống khác [14] Bộ Y Tế cũng

đã ban hành thông tư số 27/2012/TT–BYT ngày 30.11.2012 về hướng dẫn việc quản lý PGTP, trong đó có quy định về hàm lượng tối đa được phép sử dụng của acid formic trong hai nhóm thực phẩm là nước chấm cùng các sản phẩm tương tự và

đồ uống hương liệu lần lượt là 200 và 100 mg/kg; acid acetic trong nhóm sản phẩm dinh dưỡng cho trẻ đến 36 tháng tuổi là 500 mg/kg và acid propionic trong fomat tươi là 3000 mg/kg [7]

1.1.1.2 Chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin

Chất tạo ngọt là phụ gia thực phẩm được sử dụng khá phổ biến trong công nghệ chế biến thực phẩm Chất tạo ngọt có nhiều loại tương ứng với các cấu trúc và tính chất hóa học khác nhau Đến nay, các nhà khoa học đã tìm thấy hàng trăm chất

hóa học có khả năng tạo vị ngọt, được chiết tách từ thực vật hoặc sản xuất bằng phương pháp tổng hợp Tuy nhiên, chỉ có một số được phép sử dụng trong công nghệ thực phẩm, danh mục chất tạo ngọt cho phép sử dụng có thể khác nhau tùy vào quy định của mỗi quốc gia

Có thể phân loại các chất tạo ngọt thành hai nhóm chính: Nhóm có giá trị dinh dưỡng và không có giá trị dinh dưỡng

Acesulfam kali (Ace – K), aspartam (Asp), cyclamat natri (Cyc), saccharin

(Sac) là bốn chất tạo ngọt tổng hợp, không có giá trị dinh dưỡng Các chất tạo ngọt này thường được sử dụng để tạo vị ngọt trong thực phẩm hoặc thay thế đường trong các sản phẩm ăn kiêng

Thông tin chung về bốn chất tạo ngọt acesulfam kali, aspartam, cyclamat

Bảng 1.3 Thông tin chung về acesulfam kali, aspartam, cyclamat natri, saccharin

như không bị biến đổi tính chất vật lí và hóa học trong thời gian dài nên Ace – K thường được sử dụng trong các sản phẩm nướng, các sản phẩm gia công ở nhiệt độ cao hoặc các sản phẩm có thời hạn sử dụng lâu Khoảng 90 quốc gia cho phép sử dụng Ace – K trong thực phẩm và đồ uống [117]

Aspartam (Asp) ngọt hơn vị ngọt chuẩn khoảng 133 lần [117], vị ngọt của nó kéo dài hơn và cảm nhận chậm hơn so với đường, không để lại dư vị khó chịu Hơn

90 quốc gia cho phép sử dụng Asp trong hơn 6000 sản phẩm như: bánh, nước giải khát, kẹo và cả trong dược phẩm, đặc biệt Asp được sử dụng thay thế đường trong thực phẩm ăn kiêng [117] Theo Hiệp hội An toàn lương thực Châu Âu (EFSA), Asp không có nguy cơ gây thiệt hại cho các gen và không gây ung thư [36]

Cyclamat natri (Cyc) có độ ngọt lớn hơn gấp 35 lần vị ngọt chuẩn [117], bền

ổn định trong khoảng pH rộng (2,0 – 8,0) Cyc được phối hợp với gelatin, tinh bột, anginit natri hoặc đường saccharin, saccharose để tạo vị ngọt, che đi các vị khó chịu của thực phẩm Cyc cũng được dùng cho người bị đái đường và để sản xuất các sản phẩm thực phẩm có độ calo thấp Hiện nay có khoảng 55 nước trên thế giới sử

dụng Cyc trong thực phẩm nhưng Mỹ đã cấm sử dụng Cyc khi có báo cáo nghi ngờ một số khuẩn đường ruột dưới tác động của Cyc sẽ sản sinh chất độc cyclohexylamine gây ung thư gan, thận, phổi… dị dạng bào thai trên nghiên cứu thực nghiệm ở chuột [117]

Saccharin (Sac) có vị ngọt gấp 450 lần dung dịch saccharose 10 %, có vị chát, ổn định trong môi trường acid nhưng không bền khi bị đun nóng [117] Sac bị thủy phân bởi nhiệt độ và acid sẽ giải phóng phenol làm thức ăn có mùi khó chịu Sac thường được sử dụng ở nồng độ 0,02 – 0,5 % (về khối lượng) để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, kem đánh răng, nước súc miệng Cùng với Asp, Sac thường

có trong nước giải khát dành cho những người ăn kiêng và được xem như một phát hiện quan trọng, nhất là với những bệnh nhân tiểu đường Hơn 90 quốc gia cho phép sử dụng Sac trong thực phẩm và đồ uống, tuy nhiên Cục quản lí Thực phẩm và

năng lượng thấp này do nó có thể thấm qua nhau thai và những ảnh hưởng của nó trên thai nhi thì chưa được khẳng định [82, 117]

Theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất ngọt tổng hợp, lượng ăn vào hàng ngày chấp nhận được (chỉ số ADI) với Ace – K, Sac lần lượt là: 0 – 15 mg/kg thể trọng, 0 – 5 mg/kg thể trọng [5], Asp được Ủy ban chuyên gia quốc tế về phụ gia thực phẩm khuyến cáo ở mức 0 – 40 mg/kg thể trọng, của Cyc là 0 – 11 mg/kg thể

trọng [117]

Bộ Y tế cũng đã ban hành quy định mức giới hạn tối đa đối với các PGTP trong từng sản phẩm cụ thể [7] Theo đó, hàm lượng tối đa Ace – K trong 69 nhóm thực phẩm từ 110 – 5000 mg/kg sản phẩm, của Asp trong 73 nhóm thực phẩm từ

200 – 6000 mg/kg sản phẩm, của Cyc trong 36 nhóm thực phẩm từ 250 – 3000 mg/kg sản phẩm, của Sac trong 67 nhóm thực phẩm từ 80 – 2500 mg/kg sản phẩm

1.1.2 Các chất beta-agonist

1.1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm beta-agonist

tương tự với các dẫn xuất amin của catechol như dopamin, norepinephrin (noradrenalin) và epinephrin (adrenalin) [53] Các beta-agonist còn gọi là chất tạo nạc có nhiều ứng dụng trong y dược nhưng cũng được sử dụng trái phép trong thức

ăn chăn nuôi Trong y học, các beta-agonist làm tác nhân điều trị các bệnh về hô hấp, trong thức ăn chăn nuôi chúng có tác dụng làm tăng hàm lượng protein, kích thích tăng trưởng nhờ quá trình chuyển hóa hàm lượng mỡ tích tụ thành các mô cơ

ở vật nuôi Tuy nhiên, thịt động vật chứa dư lượng beta-agonist gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người tiêu dùng như làm tăng huyết áp, tim đập nhanh, nhức đầu, tay chân run, buồn nôn, rối loạn tiêu hóa Salbutamol (Sal), metoprolol (Met), và

ractopamin (Rac) là ba chất thuộc họ beta-agonist, trong đó Met đến nay chỉ được

sử dụng trong dược phẩm, Rac được dùng trái phép trong chăn nuôi, đặc biệt là Sal vừa có ứng dụng trong dược phẩm và thêm trái phép vào thức ăn chăn nuôi, dẫn đến tồn dư ở thịt động vật, cần được kiểm soát chặt chẽ Thông tin chung về ba hợp chất beta-agonist được thể hiện trong bảng 1.4 [28, 31, 53, 85, 95, 105]

Bảng 1.4 Thông tin chung về salbutamol, metoprolol và ractopamin

Tan hoàn toàn trong methanol, độ tan trong nước là 4100mg/l KLPT

1.1.2.2 Vai trò và tác dụng phụ của các beta-agonist

Salbutamol (Sal) là một thụ thể beta-agonist được sử dụng để làm giảm co thắt phế quản trong các bệnh như hen suyễn, bệnh tắc nghẽn phổi mãn tính [38,74]

tiếp đến cơ trơn phế quản Sal cũng được sử dụng trong sản khoa, ở dạng dịch truyền, Sal như là thuốc đỡ đẻ, làm giãn cơ mềm tử cung, có tác dụng làm chậm sự

đẻ non Tác dụng phụ khi sử dụng Sal thường thấy nhất là run, lo lắng, đau đầu, rút

cơ, khô họng và hồi hộp Các triệu chứng phụ khác có thể bao gồm mạch đập nhanh, rối loạn nhịp tim, thiếu máu cục bộ cơ tim, rối loạn giấc ngủ và hành vi Sử dụng Sal với lượng lớn gây hiện tượng tim đập nhanh, hệ thống thần kinh hưng phấn quá mức

Metoprolol (Met) là thuốc beta-adrenergic có tác dụng làm giảm nhịp tim, điều trị loạn nhịp nhanh Met cũng làm giảm áp lực co cơ tim và làm giảm nhu cầu oxy của cơ tim nên có tác dụng điều trị đau thắt ngực [25, 95] Tuy nhiên sử dụng

Met có thể gây mệt mỏi, chóng mặt, trầm cảm, nhịp tim chậm, thở nông, giảm huyết

áp, giảm tuần hoàn ngoại biên (lạnh các chi), ngứa, ban Ngoài ra, Met còn gây ợ nóng, ỉa chảy, khô miệng, đau bụng, thở khò khè, khó thở

Ractopamin (Rac) là chất chủ vận beta-adrenergic được sử dụng làm phụ gia thức ăn trong chăn nuôi để thúc đẩy sự tạo nạc trong động vật nuôi lấy thịt Đây là

thành phần hoạt chất trong sản phẩm Paylean cho lợn và Optaflexx cho gia súc Các

tác dụng phụ khi sử dụng Rac đã xuất hiện trên một số bệnh nhân như mất ngủ, lo

lắng và rùng mình

Trong chăn nuôi, beta-agonist được chứng minh là chất chuyển đổi khá hiệu quả, làm giảm tỷ lệ mỡ, tăng tỷ lệ nạc ở gia súc, gia cầm Lợi dụng đặc tính này nên một số người đã sử dụng beta-agonist như chất bổ sung trong thức ăn để kích thích cho heo bung đùi, nở vai, tạo nạc trong thời gian rất ngắn để bán [16] Beta-agonist tác động trực tiếp thông qua các thụ thể beta-adrenergic trên cơ xương, màng tế bào

mỡ [32, 33] Khi các beta-agonist gắn vào các thụ thể adrenergic trên tế bào mỡ sẽ hoạt hóa một số enzym trong đường dẫn làm giảm tỷ lệ tổng hợp và dự trữ mỡ trong

tế bào, làm cho động vật nuôi nạc hơn [31, 32] Mức độ của những thay đổi này phụ

thuộc vào liều lượng và thời gian cho ăn các beta-agonist, loại beta-agonist và loài

vật được cho ăn [71]

1.1.2.3 Vấn đề sử dụng beta-agonist trên thế giới và ở Việt Nam

Trong vòng 15 năm gần đây, việc sử dụng beta-agonist bất hợp pháp để kích thích tăng trưởng đã được báo cáo ở châu Âu và Mỹ [58, 64, 65, 89] Các beta-agonist bị cấm sử dụng ở Châu Âu cho mục đích tăng trưởng theo chỉ thị 96/22/EC

(EC, 1996) Tuy nhiên, một số nước trên thế giới như Mỹ, Úc, Canada, Hàn Quốc, Brazil, Thái Lan… vẫn cho phép sử dụng Rac là chất kích thích tăng trưởng cho heo thịt với một số điều kiện nhất định Tại Úc và Mỹ, nhiều bò thịt đã bị phát hiện có

dư lượng Rac vì vậy nhiều quốc gia như Nga, Đài Loan, Indonesia… đã cấm nhập khẩu thịt bò Úc [70]

Tháng 4.2002, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc đã ban hành một danh mục các

loại thuốc thú y và một số hợp chất tổng hợp bị cấm sử dụng trong chăn nuôi [24] Danh mục này áp dụng cho cả các loại thuốc sản xuất trong nước và nhập khẩu Đứng đầu danh sách này là salbutamol, ractopamin, clenbuterol … và các muối của chúng, bị cấm sử dụng trong mọi loại thức ăn chăn nuôi

Tại Hồng Công, Trung Tâm Y tế công cộng đã đưa ra quy định về các chất cấm trong thú y bao gồm salbutamol, clenbuterol và các hóa chất nông nghiệp khác, đồng thời nghiêm cấm mua bán các loại thịt và nội tạng động vật bị nhiễm độc từ ngày 31.12.2001 [30] Việc thử nghiệm trước khi giết mổ lợn được thực hiện ngay tại các lò mổ nhằm bảo đảm an toàn đối với thực phẩm trước khi đưa ra thị trường Trung bình, mỗi năm có hơn 60000 mẫu nước tiểu lợn được kiểm tra, tất cả các lô

hàng có kết quả dương tính đều bị tiêu hủy

Trung tâm kiểm soát chất kích thích của trường đại học Sains – Malaysia đã đưa ra báo cáo vào tháng 01.2007 về việc xác định tồn dư salbutamol trong mẫu thịt

bò, lợn, cừu và thịt vịt cho thấy, có khoảng 2 % của hơn 100 mẫu xét nghiệm tìm

thấy dư lượng Sal [70] Năm 1996, Malaysia đã cấm sử dụng toàn bộ các chất thuộc nhóm beta-agonist

Tại Việt Nam, thông tư 57 ngày 7.11.2012 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã đưa ra quy định về việc kiểm tra, giám sát và xử lý vi phạm các chất

kháng sinh, hóa chất cấm sử dụng trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi ban hành ngày 20.6.2002 của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn, salbutamol, ractopamin, clenbuterol là những chất bị cấm sử dụng hoàn toàn [1, 2] Tuy nhiên, Sal lại được sử dụng nhiều trong dược phẩm và chưa được kiểm soát chặt chẽ, dẫn tới một lượng lớn Sal đã được sử dụng trái phép trong chăn nuôi Nguy hiểm là vật nuôi thường được thúc tăng cân bằng Sal ở giai đoạn cuối rồi đem bán ngay nên trong gan, thận, thịt vẫn còn tồn tại dư lượng Sal Người tiêu dùng tiêu thụ các sản phẩm này sẽ dễ dàng đưa Sal vào cơ thể, gây ngộ độc

Hình 1.1 Kết quả kiểm tra việc sử dụng salbutamol trong chăn nuôi đợt 01.2015

của chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh

Việc sử dụng Sal trong chăn nuôi có chiều hướng gia tăng đáng báo động ở các địa phương phía Nam như chi cục thú y thành phố Hồ Chí Minh công bố trong hình 1.1, không chỉ tác động xấu đến sức khỏe cộng đồng mà còn làm phương hại đến sản xuất ngành chăn nuôi trong nước, nhất là trong lúc sức ép của các loại thực phẩm ngoại nhập đang ngày một gia tăng Từ thực trạng này cho thấy, cần thiết phải kiểm tra các đối tượng mẫu liên quan như: thức ăn chăn nuôi, nước tiểu vật nuôi ở giai đoạn vỗ béo trước khi xuất bán tại các trang trại chăn nuôi nhằm phát hiện,

ngăn chặn vật nuôi có sử dụng chất cấm đưa ra thị trường; cũng như kiểm tra các mẫu thịt, gan, thận của vật nuôi tại các lò mổ, chợ để kiểm soát hàm lượng Sal nói riêng và một số chất thuộc nhóm beta-agonist trước khi đến tay người tiêu dùng, đảm bảo sức khỏe của người dân

1.2 Các phương pháp xác định chất phụ gia và beta-agonist trong thực phẩm

So với phương pháp GC, phương pháp HPLC phân tích chất phụ gia và agonist trong thực phẩm được sử dụng phổ biến hơn Trong phương pháp HPLC, tùy thuộc vào cấu trúc phân tử, tính chất hóa lý, nồng độ, giới hạn cho phép của phụ gia và beta-agonist trong thực phẩm, … mà lựa chọn các detector phù hợp để phát hiện như detector UV, SPD, DAD, MS, ELSD, Q/TOF… [56, 83, 93, 99, 101, 104,

beta-105, 111, 113, 114]

Giới hạn cho phép của những phụ gia thực phẩm (chất ổn định độ acid, bảo quản thực phẩm, chất tạo ngọt) thường cao (hàm lượng cỡ ppm) nên chúng thường được phát hiện bằng các detector có độ nhạy thấp (cỡ ppm) như UV, ELSD, DAD, SPD Các nghiên cứu [56, 99, 101] sử dụng phương pháp HPLC với các detector

UV và SPD để xác định các acid hữu cơ trong rượu, sữa và các sản phẩm từ sữa cho

độ nhạy trong khoảng từ 1 – 175 ppm Các chất tạo ngọt trong đồ uống, sữa chua, sản phẩm dinh dưỡng được xác định bằng HPLC sử dụng detector ELSD và DAD

[46, 116] Nhóm chất beta-agonist là chất cấm, được lén lút sử dụng trái phép trong chăn nuôi, thường có hàm lượng thấp (ng/ml – ppb) nên cần sử dụng các detector có

độ đặc hiệu và độ nhạy cao như detector khối phổ (MS), đặc biệt là kỹ thuật MS/MS Trong số các phương pháp LC– MS, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ kiểu tứ cực chập ba (HPLC– MS/MS) với nguồn ion hóa phun sương điện tử (ESI) có độ chọn lọc tốt và độ nhạy cao thường được sử dụng để phân tích các chất beta-agonist trong mẫu thực phẩm và mẫu sinh học Các beta-agonist trong thức ăn chăn nuôi, nước tiểu, thịt lợn, xúc xích xác định bằng các phương pháp này cho giá trị LOD trong khoảng 0,01 – 5 ppb [88, 105, 106, 111,

113, 114] Phương pháp GC sử dụng detector MS [87, 97] xác định beta-agonist

trong thức ăn chăn nuôi và nước tiểu gia súc có LOD < 2,5 ppb Bảng 1.5 tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc ký xác định một số acid hữu cơ ổn định độ acid, bảo quản thực phẩm, các chất tạo ngọt và beta-agonist trong mẫu thực phẩm và sinh học

Bảng 1.5 Tóm tắt một số nghiên cứu xác định các acid hữu cơ, chất tạo ngọt và beta-agonist trong thực phẩm

Sữa và các sản phẩm từ sữa

RP – HPLC

Nước giải khát, nước tăng lực, sữa chua

Thức ăn chăn nuôi

Thức ăn chăn nuôi

MS

1÷ 5 (ng/ml – ppb)

ng/ml; trong mẫu thức ăn gia súc: 2,5

(ng/ml – ppb) Sniegocki và

1.2.1.2 Phương pháp phổ hấp thụ phân tử UV – Vis xác định các chất tạo ngọt

Phương pháp UV – Vis không thường được sử dụng để phân tích các PGTP nói chung và các chất tạo ngọt nói riêng vì phổ hấp thụ của các chất này hay có sự chồng chéo lên nhau và ảnh hưởng lớn bởi các chất khác như chất bảo quản, phẩm

màu, các loại đường Tuy nhiên, UV – Vis kết hợp với các phương pháp hiệu chuẩn đa biến (PLS), có thể được sử dụng để xác định chất tạo ngọt với độ nhạy cỡ ppm Natalia E Llamas và đồng nghiệp [61], đã sử dụng phương pháp này để xác định Sac, Asp và Ace – K cho giá trị LOD là 2 – 15 mg/l đối với Sac, Ace – K là 2 – 20 mg/l và 2 – 25 mg/l đối với Asp Hiện nay Asp thường có mặt ở trong mẫu thực phẩm vì vậy phương pháp này được áp dụng thành công có thể xác định đồng

thời Sac và Ace – K trong các chất ngọt, nước trái cây mà không cần các bước loại

bỏ Asp Cũng dùng phương pháp chuẩn đa biến kết hợp với UV, trong tuyển tập

“Innovations in Chemical Biology” [77], Nasir và cộng sự đã giới thiệu nghiên cứu của Turak và cộng sự xác định đồng thời 3 chất tạo ngọt Asp, Ace – K và Sac trong

đồ uống Các chất tạo ngọt được chiết bằng dung dịch n – butanol và đo phổ hấp thụ

chuẩn được xây dựng của Asp nằm trong khoảng từ 7 – 9 µg/ml, Ace – K từ 1 – 3

µg/ml, Sac từ 2 – 4 µg/ml

Ngoài ra, Turak cùng với Ozgur [102] đã dùng phương pháp UV – Vis để xác định Ace – K và Asp đồng thời với các phẩm màu indigo carmine và brilliant blue Bước sóng tối ưu phát hiện Ace – K và Asp lần lượt là 242 nm và 227 nm Cả hai chất tạo màu và hai chất tạo ngọt đều cho đường chuẩn có độ tuyến tính cao, với các hệ số hồi qui từ 0,9992 – 0,9999 Các giá trị LOD và LOQ của Ace – K và Asp dao động trong khoảng 0,06 – 0,47 μg/ml, giá trị RSD tốt (< 0,81 %), hiệu suất thu hồi từ 99,78 % đến 100,67 %

1.2.1.3 Phương pháp điện hóa xác định các beta-agonist

Các cảm biến điện hóa được nghiên cứu và ứng dụng từ lâu và vẫn luôn thu hút được sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng như các hãng sản xuất Các cảm biến điện hóa có ưu điểm là phân tích nhanh, có độ chọn lọc, độ nhạy cao và

thường có kích thước nhỏ gọn, có thể phân tích tại hiện trường Lin và các cộng sự [59] đã nghiên cứu cảm biến điện hóa mới phân tích các beta-agonist Điện cực được chế tạo bằng cách tổng hợp điện hóa 4,5 – dihydroxy– 3– [(2– hydroxy– 5– sulfophenyl)azo]– 2,7– naphthalenedisulfonic acid trisodium salt (acid chrome blue K

(ACBK)) trên nền điện cực các bon thủy tinh (glassy carbon electrode – GCE) biến tính với oxit graphene (GO) – nafion Trên điện cực cacbon thuỷ tinh biến tính với poly– ACBK/GO – nafion, quét dòng tám beta-agonist gồm clenbuterol, salbutamol,

terbutaline, ractopamin, dopamin, dobutamin, adrenalin và isoprenalin, nồng độ tuyến tính thu được trong khoảng 1,0 – 36,0 ng/ml và LOD tương ứng từ 0,58 – 1,46 ng/ml Điện cực này đáp ứng yêu cầu về độ tái lặp và độ ổn định, đồng thời được ứng dụng thành công trong phân tính định lượng clenbuterol trong mẫu thịt lợn

Ractopamin, salbutamol trong các mẫu thịt lợn và mẫu nước tiểu người được Rajkumar và các cộng sự [85] nghiên cứu xác định bằng cách sử dụng quy trình chế tạo điện cực màng cacbon thuỷ tinh biến tính với poly taurine/hạt nano zirconi

0,65 V và Sal là 0,71 V Điện cực biến tính xác định được tín hiệu oxi hoá của Rac

trong khoảng tuyến tính từ 1 – 28 µM và Sal trong khoảng tuyến tính từ 5 – 220

µM Điện cực này cũng có thể dùng để xác định tín hiệu của Rac (1 – 26 µM) trong các mẫu thịt lợn và Sal (1 – 114 µM) trong các mẫu nước tiểu của người

1.2.1.4 Phương pháp sinh học xác định các beta-agonist

Phương pháp hấp thụ miễn dịch có gắn enzyme (ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay) đã được ứng dụng để xác định beta-agonist dựa trên nguyên

lý kháng nguyên – kháng thể Phương pháp ELISA có độ nhạy cao, thao tác tương đối đơn giản, thời gian phân tích nhanh nhưng có nhược điểm là kém chính xác trong các nền phức tạp, kém linh hoạt vì phải phụ thuộc vào hóa chất của nhà sản xuất Phương pháp ELISA xác định clenbuterol và salbutamol [10] có rất nhiều dạng, dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được