Nghiên cứu tạo chủng vắc xin salmonella choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạ

Salmonella hiện đang được sử dụng làm chủng vi khuẩn biến nạp mang các loại gen kháng nguyên của virus cúm, HBV, virus sốt xuất huyết, vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn tả, liên cầ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

LÂM THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN

Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC

LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-*** -

LÂM THỊ HUẾ

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VẮCXIN

Salmonella choleraesuis NHƯỢC ĐỘC

LÀM CHỦNG VI KHUẨN BIẾN NẠP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS VŨ KHẮC HÙNG

2 PGS TS NGUYỄN THỊ XUÂN SÂM

Hà Nội – 2012

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình làm luận án, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội, Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung, các thầy cô giáo trong Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm của trường, các cán bộ - Bộ môn công nghệ sinh học

và tập thể cán bộ công nhân viên ở Phân viện

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện đào tạo sau đại học, Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm – Đại học Bách Khoa Hà Nội và Ban lãnh đạo Phân viện Thú y miền Trung

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Khắc Hùng, người đã trực tiếp hướng dẫn

tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tại Bộ môn công nghệ sinh học – Phân viện Thú y miền Trung Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành đến tập thể cô chú, anh chị trong bộ môn công nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo trong thời gian tôi thực hiện luận án ở đây

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, người đã

hướng dẫn tôi cùng các thầy cô giáo trong Viện công nghệ sinh học – công nghệ thực phẩm

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến những người thân trong gia đình đã động viên, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận án

Hà Nội, ngày 20 tháng 03 năm 2012

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN 5

1.1.1 Bệnh phó thương hàn 5

1.1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh 5

1.1.1.2 Triệu chứng – Bệnh tích 5

1.1.1.3 Chẩn đoán 7

1.1.1.4 Phòng và trị bệnh 7

1.1.2 Bệnh phù đầu (Edema Disease) 8

1.1.2.1 Nguyên nhân gây bệnh 8

1.1.2.2 Triệu chứng – Bệnh tích 8

1.1.2.3 Chẩn đoán 9

1.1.2.4 Phòng và trị bệnh 9

1.2 VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN TỪ VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC 9

1.2.1 Vắcxin thú y 9

1.2.2 Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc 11

1.2.3 Vắcxin phòng bệnh phó thương hàn và phù đầu ở lợn 13

1.3 VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S choleraesuis) 14

1.3.1 Đặc điểm hình thái 14

1.3.2 Đặc tính về nuôi cấy 15

1.3.3 Đặc tính sinh hóa 15

1.3.4 Sức đề kháng 15

1.3.5 Cấu trúc kháng nguyên 16

1.3.6 Tính gây bệnh 16

1.4 GEN CRP (cAMP RECEPTOR) VÀ ASD (β-ASPARTIC SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE) 17

1.4.1 Gen crp (cAMP receptor) 17

1.4.2 Gen asd (β-aspartic semialdehyde dehydrogenase) 19

1.5 PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG 19

1.5.1 Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+) 20

1.5.2 Plasmis pRE112 21

1.6 TẾ BÀO CHỦ ĐỂ KHUẾCH ĐẠI GEN 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 23

2.2 VẬT LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU 23

2.2.1 Chủng vi sinh vật 23

2.2.2 Hóa chất và môi trường 23

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 25

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25

2.3.2 Phương pháp tách chiết ADN plasmid 26

2.3.3 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR sau điện di 27

2.3.4 Phương pháp PCR 27

2.3.5 Phản ứng phân cắt sản phẩm PCR, plasmid và lai của Vu-Khac H và Kurt Miller 30

2.3.6 Phương pháp biến nạp của Kang và cs 31

2.3.7 Phương pháp tạo tế bào E coli khả biến 32

2.3.8 Phương pháp tiếp hợp của Kang và cộng sự 33

2.3.9 Phương pháp lên men các loại đường 33

2.3.10 Phương pháp ngưng kết kháng huyết thanh O và H 33

2.3.11 Kiểm tra tính ổn định của gen đột biến 33

2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆crp 34

3.1.1 Khuếch đại đoạn gen Pr12, Pr34 với enzyme Pwo - polymerase 34

3.1.2 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 35

3.1.3 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆crp 36

3.1.3 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆crp 36

3.2 TẠO CHỦNG S choleraesuis Smith MANG GEN CRP ĐỘT BIẾN 38

3.3 KIỂM TRA ĐẶC TÍNH CỦA S choleraesuis 539 40

3.3.1 Đặc điểm hình thái 40

3.3.2 Tốc độ sinh trưởng 40

3.3.3 Khả năng lên men đường 41

3.3.4 Giám định kháng nguyên H, O 42

3.3.5 Kết quả giải trình tự 42

3.3.6 Kiểm tra tính ổn định của gen ∆crp trong chủng S choleraesuis 539 43

3.4 TẠO DÒNG PLASMID TÁI TỔ HỢP pRE112/∆asd 45

3.4.1 Khuếch đại đoạn gen Pa12, Pa34 với enzyme Pwo - polymerase 45

3.4.2 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆asd 46

3.4.3 Tạo dòng plasmid tái tổ hợp pRE112/∆asd 47

3.5 TẠO CHỦNG S choleraesuis 539 MANG GEN ASD ĐỘT BIẾN 48

3.6 KIỂM TRA CÁC ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG S choleraesuis 179 50

3.6.1 Tốc độ sinh trưởng của S choleraesuis 179 50

3.6.2 Khả năng lên men đường của S choleraesuis 179 50

3.6.3 Xác định dạng kháng nguyên O và H 51

3.6.4 Tính ổn định của gen ∆asd trong hệ gen S choleraesuis 179 51

3.6.5 Kết quả giải trình tự gen asd của S choleraesuis 179 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

KẾT LUẬN 55

KIẾN NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56

LỜI CAM ĐOAN

số liệu, hình ảnh trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực, khách quan

Tác giả luận văn

Lâm Thị Huế

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CIRAD Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement (French Agricultural

Research Centre for International Development)

Cm Chloramphenicol

R Reverse

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Trang Bảng 2.1: Các cặp mồi dùng cho phản ứng PCR 24

Bảng 2.2 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 27

Bảng 2.3 Bảng chu trình nhiệt 28

Bảng 2.4 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 28

Bảng 2.5 Bảng chu trình nhiệt 28

Bảng 2.6 Thành phần cho một mẫu phản ứng PCR 29

Bảng 2.7 Bảng chu trình nhiệt 29

Bảng 2.8 Thành phần cho một mẫu phản ứng colony PCR 30

Bảng 2.9 Bảng chu trình nhiệt 30

Bảng 3.1 So sánh khả năng lên men đường của S choleraesuis 539 và S choleraesuis Smith 42

Bảng 3.2 So sánh khả năng lên men đường của S choleraesuis 179 và S choleraesuis Smith 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già

lợn mắc bệnh 6

Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn S choleraesuis 14

Hình 1.3 Plasmid pBSIIK+ 20

Hình 1.4 Plasmid pRE112 21

Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là ADN tổng số của chủng S choleraesuis Smith với cặp mồi Pr1F-Pr2R, Pr3F-Pr4R và enzyme Pwo-polymerase 34

Hình 3.2: Điện di kiểm tra tách chiết plasmid pBSIIK+ (A), sản phẩm cắt ADN plasmid của 4 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pr12 với enzyme cắt giới hạn BamHI/XbaI (B) 35

Hình 3.3 Sản phẩm cắt ADN plasmid của 3 dòng pBSIIK(+)/∆crp với enzyme cắt giới hạn XhoI/KpnI 36

Hình 3.4: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại ∆crp (2,7kb) từ plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/∆crp (A) và sản phẩm cắt của 4 dòng pRE112/∆crp bằng XbaI-KpnI (B) 37

Hình 3.5: Các khuẩn lạc S choleraesuis Smith sau khi tiếp hợp với E coli χ7213/pRE112/∆crp mọc trên môi trường chọn lọc LB chứa Cm 38

Hình 3.6: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của S choleraesuis 539(1), S choleraesuis Smith(2), plasmid của χ7213/pRE112/∆crp(3) với cặp mồi Pr5F-Pr6R(A) và Pr6R-Pr7F(B) 39

Hình 3.7: Hình ảnh khuẩn lạc của chủng S choleraesuis Smith (A) và chủng S choleraesuis 539 (B) sau 24 giờ nuôi cấy 41

Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng của chủng S choleraesuis 539 và chủng S

choleraesuis Smith 41

Hình 3.9 Trình tự đoạn gen khuếch đại gen crp của S choleraesuis 539 từ cặp mồi

Pr5F- Pr6R mất đoạn gen 322bp (545-867) so với gen crp của S

choleraesuis 43

Hình 3.10 Sản phẩm PCR từ genome của S choleraesuis 539 các đời 1, 5, 10, 15,

20 với cặp mồi Pr5F-Pr6R (trắng) và Pr7F-Pr6R (trắng) 44 Hình 3.11: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR chạy từ khuôn là ADN tổng số của

chủng S choleraesuis Smith với cặp mồi Pa1F-Pa2R, Pa3F-Pa4R và

enzyme Pwo-polymerase 45 Hình 3.12: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt 6 dòng plasmid tái tổ hợp pBSIIK+/Pa12

với BamHI/XbaI (A) và 6 dòng pBSIIK(+)/∆asd với BamHI/KpnI (B) 46 Hình 3.13: Điện di sản phẩm cắt pBSIIK+/∆asd bằng cặp enzyme XbaI-KpnI 47

Hình 3.14: Điện di kiểm tra sản phẩm cắt của 3 dòng plasmid tái tổ hợp

pRE112/∆asd bằng cặp enzyme XbaI/KpnI 48 Hình 3.15 Hình khuẩn lạc chủng S choleraesuis 539 sau khi tiếp hợp với chủng

E coli χ7213/pRE112/∆asd-1 trên môi trường chọn lọc 48

Hình 3.16: Điện di kiểm tra sản phẩm PCR từ genome của các chủng S

choleraesuis với cặp mồi Pa5F-Pa6R (A) và Pa6R-Pa7F (B) 49

Hình 3.17: Đường cong sinh trưởng của S choleraesuis 179 và S choleraesuis Smith 50 Hình 3.18: Sản phẩm PCR từ genome của S choleraesuis 179 các đời 1, 5, 10, 15,

20 với cặp mồi Pa5F-Pa6R (trắng) và Pa7F-Pa6R (trắng) 51

Hình 3.19: Trình tự đoạn gen khuếch đại gen asd của chủng S choleraesuis 179 từ

cặp mồi Pa5F- Pa6R mất đoạn gen 1485 bp (434-1902) so với gen asd

của S choleraesuis 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nền kinh tế phát triển, cùng với hội nhập kinh tế toàn cầu, mức sống của người dân được nâng cao, vai trò của ngành chăn nuôi trở lên quan trọng, đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn Ngành chăn nuôi lợn đã góp phần đáp ứng nhu cầu thực phẩm trong nước và một phần dành cho xuất khẩu thu ngoại tệ Theo CIRAD - Trung tâm hợp tác quốc tế về nghiên cứu nông nghiệp vì phát triển , thịt lợn chiếm 77% tổng lượng các loại thịt tiêu dùng hàng ngày trên thị trường Việt Nam [25]

Mục tiêu của kế hoạch phát triển chăn nuôi lợn của Việt Nam theo chiến lược phát triển chăn nuôi đến 2020: đàn lợn từ 29,9 triệu con năm 2010, lên 32,9 triệu con năm 2015 và lên 34,7 triệu con năm 2020 Sản lượng thịt hơi từ 3,1 triệu tấn năm 2010, lên 3,9 triệu tấn năm 2015 và 4,8 triệu tấn năm 2020; sản lượng thịt xẻ từ 2191,3 ngàn tấn năm 2010; 2794,7 ngàn tấn năm 2015 và 3493,1 ngàn tấn năm 2020 Trong đó đàn lợn nuôi công nghiệp 5,8 triệu con (chiếm 19,3%) năm 2010, lên 8,9 triệu con (chiếm 27,0%) năm 2015 và lên 12,9 triệu con (chiếm 37,0%) năm 2020 Sản phẩm thịt hơi nuôi công nghiệp từ 1135,2 ngàn tấn (chiếm 36,5%) năm 2010; 1851,5 ngàn tấn (chiếm 47,2%) năm 2015 và 2866 ngàn tấn (chiếm 59,%) năm 2020 [7]

Để đạt được những mục tiêu có tính chiến lược đó, việc đầu tư cho công tác giống, quan tâm đến vấn đề thức ăn, các chương trình quản lý; đặc biệt nhiệm vụ của công tác chăn nuôi – thú y càng nặng nề hơn, tăng cường áp dụng các biện pháp khoa học kỹ thuật cho công tác phòng, chống dịch bệnh ở vật nuôi có hiệu quả là điều hết sức quan trọng

Một thách thức không nhỏ đối với việc phát triển chăn nuôi lợn là dịch bệnh vẫn thường xuyên xảy ra trên các đàn lợn ở mọi lứa tuổi, làm giảm năng suất, giảm chất lượng con giống Sản phẩm thịt lợn nhiễm bệnh làm tăng nguy cơ mất an toàn

vệ sinh thực phẩm Một trong những bệnh thường gặp phải kể đến là bệnh phó

thương hàn và phù đầu do vi khuẩn Salmonella và Escherichia coli (E coli) gây ra

Bệnh do vi khuẩn Salmonella và E coli xảy ra ở hầu hết các loại hình chăn nuôi và gây ra thiệt hại rất lớn về kinh tế cho các nhà chăn nuôi Việc sử dụng

kháng sinh tràn lan đã dẫn đến tỷ lệ rất lớn các chủng vi khuẩn kháng lại kháng

sinh, do vậy việc điều trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn Các loại vắcxin thú y ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, bởi vì việc sử dụng vắcxin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người [47, 61] Sử dụng vắcxin phòng bệnh vẫn là một lựa chọn số 1 đối với các nhà chăn nuôi

Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vắcxin vi trùng, trong đó hai loại vắcxin chết và vắcxin nhược độc được sử dụng nhiều nhất Vắcxin chết ít hiệu quả hơn so với các loại vắcxin sống nhược độc [30] Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắcxin sống nhược độc Tuy nhiên các loại vắcxin sống nhược độc tạo ra qua tác dụng lý hóa hoặc bằng phương pháp tiếp truyền truyền thống chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắcxin nhược độc quay trở lại độc lực cao là rất lớn [43, 56] Để khắc phục những mặt hạn chế trên, loại vắcxin thế hệ mới ra đời, một trong số đó là vắcxin tái tổ hợp Quá trình tạo vắcxin tái tổ hợp bắt đầu bằng

việc tạo chủng vi khuẩn nhược độc Sử dụng kỹ thuật gen để loại bỏ những gen gây

bệnh của vi khuẩn nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và phát triển như vi khuẩn ban đầu [23, 37, 51] Sau đó tổ hợp gen biểu hiện kháng nguyên

ngoại lai cùng với hệ thống khởi động được thiết kế và ghép vào chủng vi khuẩn

nhược độc Chủng này mang plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên ngoại lai Vì vậy trên chủng vắcxin mang đồng thời 2 loại kháng nguyên, kháng nguyên của vi khuẩn và kháng nguyên ngoại lai

Hiện nay, tại Việt Nam có hai loại vắcxin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó

là vắcxin chết và vắcxin nhược độc Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E coli gây ra,

hiện nay có một số cơ sở sản xuất vắcxin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin Đến nay, vẫn chưa có vắcxin kép phòng hai bệnh trên Vì vậy, để phòng cả hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắcxin khác nhau, ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lợn Việc

áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của Mỹ để nghiên cứu chế tạo vắcxin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, giá thành hạ với một lần tiêm có thể phòng được nhiều bệnh là

việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do bệnh gây ra

Từ yêu cầu thực tế và những tìm hiểu về tình hình nghiên cứu chế tạo vắcxin thế hệ mới đang được thực hiện tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới, việc

nghiên cứu tạo chủng vắc xin Salmonella choleraesuis (S choleraesuis) nhược độc

mang gen crp (cAMP receptor protein), gen asd (aspartic semialdehyde dehydrogenase) đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp mang plasmid ngoại lai của

E coli để phòng hai bệnh phù đầu và phó thương hàn lợn được đặt ra có ý nghĩa về

khoa học và thực tiễn cao

Để góp phần đi tới đích chung nêu ra ở trên trong luận văn này tôi thực hiện

các nghiên cứu ở công đoạn đầu với nội dung: ”Nghiên cứu tạo chủng vắcxin S

choleraesuis nhược độc làm chủng vi khuẩn biến nạp”

Mục tiêu:

+ Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen crp đột biến (pRE112/∆crp)

+ Tạo chủng Salmonella cholerasuis nhược độc mang gen crp đột biến

+ Tạo dòng plasmid pRE112 mang gen asd đột biến (pRE112/∆asd)

+ Tạo chủng Salmonella cholerasuis nhược độc mang hai gen crp và asd đột

biến

+ Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S choleraesuis mang hai

gen crp và asd đột biến

Mục đích:

Tạo được chủng vắcxin S choleraesuis nhược độc mang hai gen crp, asd đột

biến làm chủng vi khuẩn biến nạp

Để đạt được những mục tiêu và mục đích trên, các nội dung nghiên cứu bao

gồm:

- Tạo dòng plasmid pRE112/∆crp Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/∆crp

- Chuyển nạp plasmid pRE112/∆crp vào chủng S choleraesuis nhược độc

gây đột biến gen crp Kiểm tra kết quả gây đột biến gen crp

- Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S choleraesuis mang gen crp đã bị đột biến (S choleraesuis ∆crp)

- Tạo dòng plasmid pRE112/∆asd Kiểm tra kết quả tạo dòng plasmid pRE112/∆asd

- Chuyển nạp plasmid pRE112/∆asd vào chủng S choleraesuis ∆crp Kiểm

tra kết quả gây đột biến gen asd

- Kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học của chủng S choleraesuis mang hai

gen crp, asd đột biến

Đối tượng nghiên cứu: chủng S choleraesuis nhược độc (S choleraesuis

Smith) do Phân viện Thú y miền Trung cung cấp

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 BỆNH PHÓ THƯƠNG HÀN VÀ PHÙ ĐẦU LỢN

1.1.1 Bệnh phó thương hàn [67]

Bệnh phó thương hàn lợn (Salmonellosis of Swine typhoid - Swine Entoritis Swine paratyphoid) là một bệnh truyền nhiễm xảy ra trên lợn ở mọi lứa tuổi, thường gặp ở lợn con đặc biệt là lợn sau cai sữa từ 2 - 4 tháng tuổi, ở lợn trưởng thành thì ít thấy Hầu như không thấy trường hợp lợn đang bú sữa mắc bệnh (do lợn con có kháng thể truyền từ sữa mẹ) Bệnh có đặc điểm gây bại huyết, viêm dạ dày, ruột, tiêu chảy, mụn loét ở ruột già, viêm phổi, viêm gan, viêm màng não Các đàn lợn bị nhiễm bệnh không những gây thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi mà còn là nguồn

tàng trữ mầm bệnh gây hại đối với con người [53, 62]

1.1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh phó thương hàn lợn gây ra chủ yếu do 2 loài vi khuẩn là S choleraesuis chủng Kunzendorf gây thể cấp tính, S typhisuis chủng Voldagsen gây thể mãn tính Ngoài ra có các chủng khác như S enteritidis, S typhimurium, S dublin

Vi khuẩn có thể tồn tại nhiều ngày, hàng tuần, thậm chí cả năm trong những điều kiện thích hợp, nhưng dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ cao và các loại hoá chất sát trùng như Glutaraldehyde, Benzalkonium chloride, Formaldehyde Ở lợn bệnh, vi khuẩn có ở trong máu, phủ tạng, các chất tiết (nhiều nhất ở trong phân); ở lợn nái có nhiều trong dịch tiết đường sinh dục, thai bị sẩy Những lợn khoẻ mang trùng có ý nghĩa rất quan trọng đối với lưu hành dịch bệnh và nguy cơ đối với sức khoẻ cộng đồng.Một vài yếu

tố như: cai sữa, vận chuyển, thay đổi thời tiết đột ngột làm giảm sức đề kháng của heo,

có thể là những nguyên nhân làm dịch bệnh bộc phát

1.1.1.2 Triệu chứng – Bệnh tích

Thời kỳ nung bệnh từ 3 - 6 ngày có khi kéo dài đến 1 tuần lễ hay 1 tháng tùy thuộc số lượng vi khuẩn xâm nhập, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể con vật

Thể cấp tính: con vật sốt cao 41,50C - 420C, kém ăn hoặc không ăn, không

bú Con vật táo bón, phân có màu đen có màng giả, bí đại tiện, nôn mửa, tiêu chảy, phân thối có màu vàng, da tụ máu thành từng nốt, đỏ ửng rồi chuyển thành màu tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi, ngực Bệnh thường kéo dài 2 - 4 ngày, con vật gầy còm, còi cọc, tiêu chảy nhiều rồi chết Tỷ lệ chết có thể từ 25 - 95%, có khi bệnh chuyển sang thể mãn tính

Một số bệnh tích có thể thấy như: lá lách sưng to do dai như cao su, màu xanh thẫm; hạch lâm ba sưng, mềm, đỏ; thận có những nốt hoại tử ở vỏ thận; gan tụ máu,

có nốt hoại tử; niêm mạc dạ dày và ruột viêm đỏ, có điểm xuất huyết, có khi có vết loét nhỏ như hạt đậu, hoại tử ở dạ dày (trên đỉnh các nếp nhăn), ở ruột non và từng đoạn dài biến thành khối vàng bột như cám; phổi tụ máu và có các ổ viêm

Thể mãn tính: bệnh phát ra lúc đầu không rõ triệu chứng Con vật sốt nhẹ,

gầy yếu dần, ăn uống giảm sút, chậm lớn, da xanh, trên da có những mảng đỏ hoặc xám tím bầm Con vật tiêu chảy, phân lỏng, có màu vàng rất thối Bệnh tiến triển trong vài tuần Tỉ lệ chết từ 25 - 75% Một số có thể khỏi bệnh nhưng tiêu hoá thức

ăn kém, chậm lớn

Bệnh tích chủ yếu ở dạ dày và ruột Thành ruột dày và có nhiều chỗ bị hoại tử,

có bã đậu (casein hoá), xuất huyết, vết loét liền nhau thành mảng, hạch ruột xuất huyết, có khi có mủ, gan, lách sưng, mềm, có những đốm hoại tử, xoang bụng tích nước viêm

Hình 1.1: Lợn mắc bệnh gầy còm và những vết loét ở ruột già

lợn mắc bệnh

1.1.1.3 Chẩn đoán

Chẩn đoán lâm sàng

Ở thể cấp tính: lợn sốt cao, chết nhanh, viêm cata dạ dày, ruột, lách sưng to,

đàn hồi, dai như cao su, có màu xanh sẫm, gan sưng, có ổ hoại tử, xuất huyết ở thận, tương mạc

Ở thể mãn tính: lợn bị tiêu chảy dai dẳng, gầy còm, suy nhược, chết do kiệt sức, viêm ruột, gan, phổi

Chẩn đoán phân biệt

Cần chẩn đoán phân biệt với các bệnh dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu…vv Để xác định chắc chăn nguyên nhân bệnh cần thiết phải lấy mẫu để làm

các xét nghiệm tại phòng thí nghiệm

1.1.2 Bệnh phù đầu (Edema Disease) [68]

Bệnh phù đầu ở lợn được Shanks mô tả lần đầu tiên vào năm 1938 và đặc biệt phổ biến ở Châu Âu vào sau Thế chiến thứ II Tại Việt Nam, bệnh phù đầu và tiêu chảy ở lợn con gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi; từ rất sớm các tác giả Nguyễn Thị Nội và cộng sự đã nghiên cứu về bệnh này; bệnh xảy ra ở tất cả

ba miền Nam, Trung và Bắc [5] Tại miền Nam, bệnh xảy ra ở các tình đồng bằng sông Cửu Long [4], các tỉnh phía Bắc [1, 3, 6] và các tỉnh miền Trung [6] với tỷ lệ nhiễm dao động 15,72 – 58,78% Bệnh thường xảy ra đột ngột ở lợn con cai sữa với các dấu hiệu điển hình của bệnh sưng mí mắt, mặt phù thũng, đi lảo đảo

1.1.2.1 Nguyên nhân gây bệnh

Bệnh phù đầu lợn do vi khuẩn E coli mang kháng nguyên bám dính F18ab

và sản xuất độc tố shiga biến thể 2e (Stx2e) gây ra cho lợn con trước và sau cai sữa Các chủng vi khuẩn E coli này có đặc điểm gây dung huyết khi cấy trên thạch máu

Vi khuẩn E coli dung huyết gây bệnh phù đầu thường xuyên có mặt trong đường

ruột lợn với số lượng rất ít Khi xuất hiện các yếu tố bất lợi làm giảm sức đề kháng

cơ thể lợn như cai sữa, thay đổi thời tiết hoặc thức ăn, quần thể E coli gây bệnh sẽ

phát triển nhanh, lây lan gây thành dịch

Nguyễn Viết Không và cộng sự khi nghiên cứu về kháng thể kháng E coli

phù đầu ở lợn chăn nuôi công nghiệp cho thấy chỉ có 6,25% lợn con theo mẹ có kháng thể này [2] Gần đây, khi phân tích kháng nguyên bám dính F4 và F18 trên

184 chủng E coli phân lập từ lợn con bị phù đầu ở các tỉnh Nam Trung bộ và Tây

Nguyên Võ Thành Thìn và cộng sự tìm thấy 27/184 chủng mang kháng nguyên

bám dính F18ab [9] Cù Hữu Phú và cộng sự đã chọn một số chủng E coli phân lập

từ lợn bị bệnh phù đầu tại Hà Tây và Bình Định để sản xuất vắcxin dưới dạng chết

có bổ trợ keo phèn để phòng bệnh phù đầu [6] Gần đây, bộ môn Vi Trùng Phân viện Thú y miền Trung cũng đã nghiên cứu chế tạo vắcxin phòng bệnh phù đầu dưới dạng bacterin có bổ trợ keo phèn

1.1.2.2 Triệu chứng – Bệnh tích

Thường xảy ra một cách đột ngột với các triệu chứng ban đầu là bỏ ăn và rất

khát nước, sau đó xuất hiện các triệu chứng thần kinh như run rẩy, nằm đạp chân kiểu bơi chèo hoặc chạy quanh, liệt hoặc nằm úp trên 4 chân Đa số lợn con sẽ chết trong vòng 24 giờ sau khi xuất hiện các triệu chứng thần kinh Kiểm tra kỹ, thấy phù ở mí mắt, xung huyết kết mạc mắt, phù đầu

Ngoài ra còn thấy khó thở, táo bón hoặc tiêu chảy trước khi xuất hiện triệu chứng thần kinh Đa số không thấy thân nhiệt tăng cao

- Chuồng trại khô ráo, thoáng mát, định kỳ sát trùng tẩy uế chuồng trại

- Khi cai sữa nên giữ heo con ở lại chuồng và chuyển heo mẹ sang chuồng khác Trong những ngày đầu cai sữa không cho ăn quá nhiều, giảm chất bột, đạm và tăng chất xơ trong khẩu phần

- Tiêm vaccin E coli phòng bệnh, tiêm bắp hoặc dưới da, liều 2ml/con

Điều trị

- Khi độc tố của E coli đã nhiễm vào máu và heo đã sưng phù đầu thì việc

điều trị sẽ không hiệu quả

- Thường điều trị dự phòng bằng cánh sử dụng 1 trong các loại kháng sinh sau: Sodibio, Mycofloxacine 10%, Bio và B12, Clamoxyl L.A, Multibio : 1ml/10kg thể trọng, tiêm bắp 1lần/ngày liên tục trong 3 - 5 ngày

1.2 VẮCXIN THÚ Y VÀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮCXIN TỪ

VI KHUẨN Salmonella NHƯỢC ĐỘC

1.2.1 Vắcxin thú y

Việc phát triển vắcxin thú y có nhiều mục đích như ngăn ngừa và kiểm soát bệnh truyền nhiễm trên động vật, bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi, giảm giá thành thức ăn cho vật nuôi [48, 61] Mặt khác, khi tiêm phòng vắcxin cho vật nuôi cũng ngăn chặn được khả năng lây lan bệnh truyền nhiễm từ động vật sang người Ngoài ra các chương trình tiêm chủng vắcxin đại trà cho vật nuôi, sẽ làm giảm đáng

kể sử dụng thuốc thú y, dẫn đến hạn chế tác dụng phụ của thuốc thú y đối với môi

trường cũng như hạn chế được sự tồn đọng thuốc thú y trong động vật nuôi [60] Tóm lại, các loại vắcxin sử dụng trong thú y, ngoài việc cải thiện sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng nâng cao sức khỏe cộng đồng

Mặc dù các loại vắcxin dùng trong thú y chỉ chiếm khoảng 23% trên tổng số các loại sinh phẩm bảo vệ động vật nuôi trên thị trường toàn cầu, nhưng những nghiên cứu về các loại vắcxin ngày một tăng do việc áp dụng những tiến bộ khoa học để nghiên cứu và phát triển vắcxin, do số lượng rất lớn các loại vi khuẩn kháng lại kháng sinh, và do sự xuất hiện các loại dịch bệnh mới Các loại vắcxin thú y ngoài việc bảo vệ sức khỏe cho động vật nuôi còn có tác dụng bảo vệ sức khỏe cộng đồng, bởi vì việc sử dụng vắcxin làm giảm đi đáng kể sử dụng các loại kháng sinh

và các loại kích thích tố trong chăn nuôi, dẫn đến giảm đi sự tồn đọng của chúng trong quá trình sản xuất và chế biến thực phẩm cho người Điều này sẽ thúc đẩy làm tăng các hoạt động của cơ quan soạn thảo luật nhằm bảo vệ quyền lợi của người tiêu dùng thực phẩm tại thị trường lớn như Mỹ và liên minh Châu Âu [55]

Các loại vắcxin thú y được cấp phép sử dụng bao gồm các loại vắcxin chết

và vắcxin sống nhược độc Mặc dù các loại vắcxin này đã và đang được sử dụng rộng rãi và góp phần đáng kể bảo vệ sức khỏe cho vật nuôi cũng như cộng đồng trên toàn cầu, nhưng vẫn còn một số hạn chế nhất định Các loại vắcxin truyền thống thường giá thành sản xuất cao, đòi hỏi phải có chất bổ trợ và phải tiêm chủng nhiều lần mới tạo được miễn dịch tốt, hơn nữa các loại vắcxin này có thể ảnh hưởng đến việc tạo kháng thể trên gia súc mẹ dẫn tới khả năng bảo hộ thấp hoặc không có khả năng bảo hộ đối với gia súc non [19, 48] Các loại vắcxin độc tố có thể tạo miễn dịch dịch thể tốt, tuy nhiên không có tác dụng hoặc tác dụng ít trong việc tạo miễn dịch trung gian tế bào Các loại vắcxin chết toàn khuẩn thường chứa cơ chất kháng nguyên và không kháng nguyên, các đáp ứng miễn dịch chống lại cơ chất không kháng nguyên hoàn toàn trái ngược với sự ngăn chặn nhiễm trùng và có thể làm ảnh hưởng hoặc làm giảm đáp ứng miễn dịch đối với cơ chất kháng nguyên Chúng có thể tạo ra phản ứng phụ có hại do các cơ chất ngoài mong muốn như các loại nội độc tố [62] Các loại vắcxin sống nhược độc có khả năng tạo ra hai loại miễn dịch,

miễn dịch dịch thể và miễn dịch trung gian tế bào Những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và số liệu liên quan đến quy trình sản xuất các loại vắcxin sống nhược độc Tuy nhiên các loại vắcxin sống nhược độc chỉ giới hạn ở một số loại mầm bệnh nhất định và nguy cơ các chủng vi khuẩn vắcxin nhược độc quay trở lại độc lực cao

là rất lớn [57] Để khắc phục những nhược điểm của các loại vắcxin trên, vắcxin thế

hệ mới ra đời dựa trên kỹ thuật gen, một trong số đó là vắcxin tái tổ hợp. Có nhiều đối tượng vi sinh vật có thể sử dụng làm chủng vi khuẩn biến nạp trong vắcxin tái tổ

hợp như vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Lao, E coli, hoặc một số loại virus như

virus đậu, virus adeno,

Ưu thế của vắcxin tái tổ hợp sử dụng vi khuẩn Salmonella là dễ dàng thao

tác, dễ sử dụng, dễ nhân lên và dễ phân phối kháng nguyên cho cơ thể Việc nuôi cấy chủng vi khuẩn tái tổ hợp không phức tạp do đó đảm bảo việc tiếp giống, nhân

giống và sản xuất vắcxin để ứng dụng Salmonella hiện đang được sử dụng làm

chủng vi khuẩn biến nạp mang các loại gen kháng nguyên của virus cúm, HBV, virus sốt xuất huyết, vi khuẩn gây bệnh đường ruột, vi khuẩn tả, liên cầu khuẩn, ký sinh trùng sốt rét,

1.2.2 Một số nghiên cứu sản xuất vắcxin từ vi khuẩn Salmonella nhược độc

Các chủng vi khuẩn Salmonella nhược độc đầu tiên được sử dụng làm vắcxin phòng các bệnh do vi khuẩn Salmonella gây trên người và động vật Hiện nay, việc sử dụng các chủng Salmonella nhược độc mang một số gen đột biến

làm chủng vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên ngoại lai để tạo thành các chủng sản xuất vắcxin phòng nhiều bệnh đang

là hướng nghiên cứu thu hút nhiều sự tham gia của các nhà khoa học [23, 37] Những vắcxin tái tổ hợp này tạo miễn dịch do các kháng nguyên ngoại lai đồng

thời tạo miễn dịch do các kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella Các chủng vắcxin Salmonella đã được loại bỏ gen asd nhưng mang plasmid asd+ tái tổ hợp

đã chủng hóa các gen kháng nguyên ngoại lai nên mang trên mình đồng thời hai

hoại kháng nguyên đó là kháng nguyên của Salmonella và kháng nguyên ngoại

lai [28]

Gần đây, có rất nhiều nghiên cứu sử dụng các chủng vắcxin Salmonella

nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang các plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các

kháng nguyên ngoại lai phòng các bệnh do Salmonella cũng như các bệnh do các

kháng nguyên ngoại lai gây ra cho người và động vật Bucley và cộng sự sử dụng

chủng Salmonella typhimurium DeltaaroA nhược độc làm tế bào chủ mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của Campylobacter làm vắcxin phòng bệnh do Campylobacter jejuni gây ra trên gia cầm [13] Zekarias và cộng sự đã dùng chủng Salmonella typhimurium nhược độc làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen Alpha tốc xin của Clostridium perfingens làm

vắcxin phòng bệnh viêm ruột hoại tử trên gà Gà tiêm vắcxin được bảo hộ tốt khi

công cường độc với chủng Clostridium perfringens cường độc [63] Tương tự, Xin

và cộng sự cũng sử dụng Salmonella typhimurium làm vi khuẩn biến nạp mang

plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa gen của kháng nguyên protein bề mặt A của

Streptococcus pneumoniae gây bệnh viêm phổi, viêm màng não trên người; khi thử

nghiệm trên chuột, vắcxin có tác dụng tạo miễn dịch tốt [67] Branger và cộng sự

khi nghiên cứu vắcxin tái tổ hợp phòng bệnh do Yersinia gây ra trên người, chủng

vi khuẩn vắcxin nhược độc Salmonella typhimurium được sử dụng làm tế bào chủ

mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các gen kháng nguyên Lcrv và Lcrv196 [16] Zhao và cộng sự khi nghiên cứu thử nghiệm vắcxin phòng bệnh sảy thai truyền nhiễm, các tác giả này đã dòng hóa các gen kháng nguyên protein L7/L12 của vi

khuẩn Brucella trên plasmid plasmid và biến nạp vào chủng vắcxin nhược độc

Salmonella typhirmurium; vắcxin có hiệu lực cao khi thử nghiệm trên chuột [65]

Các chủng vắcxin Salmonella nhược độc không những là tế bào chủ mang các

plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên vi khuẩn mà còn là vật mang cho các plasmid tái tổ hợp dòng hóa các kháng nguyên vi rút và ký sinh trùng Benitez

và cộng sự đã sử dụng chủng vắcxin Salmonella typhimurium nhược độc SL3261

làm vi khuẩn biến nạp mang plasmid tái tổ hợp đã dòng hóa các kháng nguyên của

Cryptosporidium parvum [11] Ning và cộng sự nghiên cứu vắcxin tái tổ hợp phòng

bệnh đốm trắng trên tôm trong đó kháng nguyên protein vỏ V28 được dòng hóa trên

plasmid pcADN3,1-VP28 và biến nạp vào chủng Salmonella nhược độc SV4089;

vắcxin có tác dụng bảo hộ cao trên tôm [44]

Plasmid tái tổ hợp mang gen ngoại lai đã được chứng minh là ổn định trong tế bào chủ trong điều kiện invitro Garmory và cộng sự khi nghiên cứu về các chủng

vắcxin Salmonella typhimurium mang plasmid tái tổ hợp đã được dòng hóa kháng nguyên F1 của vi khuẩn Yersinia pestis, đã kiểm tra sự ổn định của plasmid tái tổ

hợp bằng phương pháp cấy truyền [29] Các tác giả này nhận thấy sau khi cấy truyền 60 lần plasmid tái tổ hợp vẩn ổn định trong tế bào chủ Zekarias và cộng sự sau khi cấy truyền 50 lần thì plasmid tái tổ hợp mang kháng nguyên độc tố Alpha

toxin (PLcC) trong chủng vắcxin Salmonella typhimurium vẫn ổn định [63] Tương

tự hai nghiên cứu trên, Branger và cộng sự đã chứng minh được sự ổn định của

plasmid tái tổ hợp trong tế bào chủ sau 70 lần cấy truyền [16]

1.2.3 Vắcxin phòng bệnh phó thương hàn và phù đầu ở lợn

Hiện nay, tại Việt nam có hai loại vắcxin phòng bệnh phó thương hàn lợn đó

là vắcxin chết và vắcxin nhược độc Vắcxin Phó thương hàn chết được sản xuất dưới dạng nước có bổ sung các chất bổ trợ làm tăng cường và kéo dài khả năng

miễn dịch Vắcxin nhược độc được sản xuất dạng đông khô kết hợp với Pasteurella

Mutocida nhược độc phòng 2 bệnh Phó thương hàn và Tụ huyết trùng lợn Ưu điểm

của vắcxin kép nhược độc dạng đông khô là an toàn, hiệu lực cao, giá thành hạ

Đối với bệnh phù đầu trên lợn do E coli gây ra, hiện nay có một số cơ sở sản

xuất vắcxin phòng bệnh phù đầu ở dạng bacterin Đến nay, vẫn chưa có vắcxin tái

tổ hợp phòng hai bệnh trên, để phòng hai bệnh trên thì phải tiêm hai mũi vắcxin khác nhau, gây stress lớn cho lợn ảnh hưởng tốc độ tăng trưởng của lơn

Việc áp dụng những kỹ thuật tiên tiến của khoa học để nghiên cứu chế tạo vắcxin tái tổ hợp đa giá chất lượng cao, an toàn, giá thành hạ với một lần tiêm có phòng được nhiều bệnh là việc làm cần thiết góp phần hạn chế những thiệt hại do bệnh gây ra

1.3 VI KHUẨN Salmonella choleraesuis (S choleraesuis)

S choleraesuis là một trong những vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn lợn

Lợn bị nhiễm S choleraesuis không chỉ bị viêm dạ dày, ruột mà gây chết biểu hiện

bao gồm viêm phổi, viêm gan, viêm màng não [53]

Vi khuẩn S choleraesuis được phân lập lần đầu tiên ở lợn con vào năm 1885

do Salmon và Smith [8]

Phân loại khoa học của S choleraesuis :

Giới (regnum) : Bacteria

Ngành (phynum) : Proteobacteria

Lớp (class) : Gamaproteobacteria

Bộ (ordo) : Enterobacteriales

Họ (familia) : Enterobacteriaceae

Chi (genus) : Salmonella

Loài (species) : S choleraesuis

1.3.1 Đặc điểm hình thái

S choleraesuis là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4

– 0,6 × 1 – 3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào, gram âm

S choleraesuis có khả năng di động mạnh do có từ 7 – 12 lông quanh thân

[8]

Hình 1.2: Đặc điểm hình thái của vi khuẩn S choleraesuis [71]

1.3.2 Đặc tính về nuôi cấy

Trên thạch: khi nuôi cấy ở nhiệt độ 370C sau 24 – 48 giờ, vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, trắng hoặc xám, hơi lồi lên ở giữa, hình thành một bờ chất dính lầy nhầy ở xung quanh Trên mặt thạch thỉnh thoảng xuất hiện khuẩn lạc R nhám, mặt không bóng, không đều, mờ [8]

1.3.3 Đặc tính sinh hóa

Khả năng chuyển hóa đường: S choleraesuis lên men có sinh hơi glucose,

levulose, galactose, mannitol, xyclose, rhamnose, maltose, dextrin; không lên men sucrose, lactose, arabinose [8]

Khả năng chịu nhiệt: vi khuẩn có khả năng chịu nhiệt kém, bị diệt ở 500C sau

1 giờ, 700C trong 20 phút, đun sôi trong 5 phút, thanh trùng theo phương pháp Pasteur Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn sau 5 giờ ở nước trong và 9 giờ ở nước đục

Salmonella có thể sống trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) được 4 – 8

tháng ở nhiệt độ từ 6 – 120C Xử lý miếng thịt nhiễm trùng bằng hơ lửa hay nướng

ít có tác dụng diệt Salmonella ở bên trong

Các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn: phenol 5%, HgCl2 1/500, formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15 – 20 phút Nhưng đối với một số hóa chất như cristal violet, lục malachite, natri hyposunfit, dixitrat, muối mật với những

nồng độ vừa đủ gây độc cho E coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của

Salmonella Dựa vào tính chất này, người ta chế tạo ra những môi trường chọn lọc để

kìm hãm sự phát triển của E coli và giúp cho Salmonella phát triển dễ dàng [8]

1.3.5 Cấu trúc kháng nguyên

Hiện nay có hơn 2500 kiểu huyết thanh của Salmonella được phát hiện, các kiểu huyết thanh của Salmonella được phân biệt dựa trên phản ứng miễn dịch của

hai kháng nguyên bề mặt chính: kháng nguyên O và kháng nguyên H

Kháng nguyên O có bản chất cacbohydrate (hay polysaccharide) và là thành phần nằm ngoài cùng của màng lipopolysaccharide Kháng nguyên O là polymer của các tiểu phần O, mỗi tiểu phần O sẽ gồm 4 – 6 nhóm đường tùy từng nhóm nguyên O Các kháng nguyên O khác nhau do chứa các nhóm đường khác nhau, hay khác nhau do bản chất liên kết cộng hóa trị giữa các nhóm đường trong cùng một tiểu phần hoặc khác nhau về liên kết cộng hóa trị giữa các tiểu phần Kháng nguyên

O được kí hiệu bằng số và được chia thành từng nhóm khác nhau, một số nhóm còn được kí hiệu bằng chữ cái latin

Kháng nguyên H là protein tiểu phần cấu tạo nên phần sợi của lông roi, đây là phần cấu trúc chính của lông roi, do đó kháng nguyên H còn được gọi là kháng nguyên lông roi (hay protein kháng nguyên flagellin) Flagellin chia làm 8 vùng:

vùng I, II và VIII là các vùng bảo tồn cho chỉ Salmonella và họ vi khuẩn đường

ruột, có vai trò g liên kết các flagellin tiểu phần Vùng IV, V, VI là vùng biến đổi, nằm trên bề mặt sợi roi có tính miễn dịch kháng nguyên cao, kích thích tạo kháng

thể chuyên biệt với các kiêu huyết thanh của Salmonella

Theo bảng phân loại Salmonella của Kauffman S choleraesuis có công thức

kháng nguyên O6,7 và H1,5 [8]

1.3.6 Tính gây bệnh

Trong tự nhiên: vi khuẩn có thể theo thức ăn, nước uống vào đường tiêu hóa Bình thường chúng có thể sống trong ống tiêu hóa mà không gây bệnh Khi sức đề kháng của con vật giảm sút, vi khuẩn xâm nhập vào máu, nội tạng và gây bệnh Sự giảm sút sức đề kháng có thể do thời tiết, do chăm sóc nuôi dưỡng, lợn con sau cai

sữa, tách đàn vận chuyển xa hoặc do con vật mắc các bệnh truyền nhiễm khác, thường là các bệnh: tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và đặc biệt là phó thương hàn

Vi khuẩn gây ra bệnh phó thương hàn cho lợn con từ 2 – 4 tháng tuổi với tỷ

lệ tử vong trên 50% có khi lên đến 95%, bệnh có thể ở lợn lớn với thể mãn tính và ít gây chết

Trong phòng thí nghiệm: chuột bạch dễ cảm nhiễm nhất Sau khi tiêm canh

khuẩn Salmonella nuôi 24 giờ vào dưới da thì 8 – 12 ngày con vật bị bại huyết và

chết Chuột lang, thỏ cũng cảm nhiễm, tiêm tĩnh mạch giết chết con vật từ 5 – 9 ngày với các bệnh tích viêm ruột, gan sưng hoại tử

1.4 GEN CRP (cAMP RECEPTOR) VÀ ASD (β-ASPARTIC SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE)

Quá trình tạo vắcxin tái tổ hợp bắt đầu bằng việc tạo chủng Salmonella

nhược độc Bằng kỹ thuật gen đã cắt bỏ hoặc xoá hoạt tính những gen gây bệnh của

vi khuẩn Salmonella nhưng vẫn giữ nguyên các đặc tính sinh học, sinh trưởng và

phát triển như vi khuẩn ban đầu Sau đó tổ hợp gen kháng nguyên cùng với hệ

thống khởi động được thiết kế kèm theo được ghép vào chủng Salmonella nhược

độc Chủng này tiếp nhận gen kháng nguyên tạo thành chủng vi khuẩn tái tổ hợp Chủng vi khuẩn tái tổ hợp được nuôi cấy và tạo vắcxin

Trong những thập kỷ qua, một loạt chủng S choleraesuis sống giảm độc lực

đột biến đã được phát triển để sản xuất vắcxin Chúng bao gồm các chủng có đột biến trong các gen tham gia vào tổng hợp purine (pur), tổng hợp thymidine (thy), the cAMP-reception (crp), adenylate cyclase (cya), type III secretion system (T3SS), Gifsy-1 prophage protein (gifsy-1), và D-galactonate transport protein

(dgoT)…[23, 35, 58] Trong số này, các chủng S choleraesuis với đột biến gen crp

một mình hoặc kết hợp với các gen khác cho thấy có rất nhiều suy yếu trong tính độc hại và phục vụ làm chủng sản xuất vắcxin có hiệu quả chống lại bệnh truyền nhiễm ở lợn [23, 36]

1.4.1 Gen crp (cAMP receptor)

Gen crp quy định khả năng lên men cacbohydrate và peptid nhỏ của vi sinh

vật Ngoài ra gen này còn mã hoá sinh tổng hợp cAMP receptor protein, protein hoạt hóa dị hóa CAP (catabolite activatorprotein), kiểm soát sự biểu hiện của các

gen liên quan đến quá trình trao đổi năng lượng Trong Escherichia coli, các protein

thụ thể cAMP (crp) kích hoạt phiên mã của hơn 100 gen [38] Sau khi ghép đôi với AMP allosteric tác động theo chu kỳ, gen crp khởi tạo sao chép bằng cách liên kết đến các đoạn ADN cụ thể và tăng cường sự gắn kết của ARN polymerase holoenzyme để kích hoạt phiên mã [15] Theo cách này, các gen liên quan đến sự hấp thu và sử dụng nguồn cacbon, tổng hợp roi, sự hấp thu sắt, tổng hợp glycogen,

protein màng tế bào bên ngoài được quy định trong E coli và Salmonella

Typhimurium [12] Hơn nữa, đột biến gen crp và cya đã được báo cáo ảnh hưởng

đến sản xuất của các protein tạo bởi Ysc (Yersinia secretion), Ysa (Yersinia

secretion apparatus), và T3SS (type III secretion system) trong Yersinia

enterocolitica [49] Tuy nhiên, ít được biết đến về vai trò của gen crp trong độc lực

vi khuẩn Salmonella cho đến khi một nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng gen crp / cya là cần thiết cho biểu hiện của gen sirA quyết định khả năng gây bệnh của một cụm gen ở Salmonella là SPI-1 T3SS (Salmonella pathogenicity island 1 encoded

type III secretion system) [20, 55]

SPI-1 T3SS là một trong những yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn

Salmonella, bằng cách cung cấp hơn 10 loại protein khác nhau tác dụng lên các

thành phần hoặc cấu trúc của thành tế bào niêm mạc ruột làm giảm tính thấm của

muối mật giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô khởi đầu cho quá trình gây

nhiễm trùng và gây ra viêm ruột trong các vật chủ [20, 52] Hơn nữa, các SPI-1 T3SS SipB protein cũng tương tác làm hoạt hóa quá trình tự hủy (caspase-1 apoptosis) các đại thực bào, đóng một vai trò thiết yếu trong sinh bệnh của

Salmonella Nhiều nghiên cứu cho thấy, chủng S choleraesuis mang gen crp đột

biến không thể tiết ra SPI-1 T3SS - yếu tố quyết định độc lực của Salmonella và sự gây độc tế bào đại thực bào cũng giảm đáng kể khi tiến hành gây nhiễm với S

choleraesuis Ucrp [32, 41]

1.4.2 Gen asd (β-aspartic semialdehyde dehydrogenase)

Gen asd mã hóa cho enzyme aspartic β-semialdehyde deshydrogenase (ASD,

EC 1.2.1.11) ASD là một loại enzyme rất quan trọng trong sinh tổng hợp các axit amin trong prokaryote, nấm và một số thực vật [33] Nó tham gia vào con đường chuyển hóa aspartate tạo thành lysine, methionine, leucine, isoleucine Con đường này cũng sản xuất axit diaminopimelic (DAP), một thành phần cần thiết cho sự tổng hợp peptidoglycan của vi khuẩn Gram âm và thành tế bào vi khuẩn Gram dương [46, 48, 59] Ở động vật có vú không tổng hợp cũng không sử dụng DAP như là một chất nền trong bất kỳ con đường chuyển hóa và lysine không được tổng hợp vì

nó là một acid amin thiết yếu được lấy từ nguồn thực phẩm [14], [17], [31] Ngoài

ra lysine, threonine, methionine, isoleucine là axit amin thiết yếu trong chế độ ăn uống của cá [39]

Kể từ khi enzyme aspartic β-semialdehyde deshydrogenase được biết không

có mặt trong các mô động vật có vú, xóa gen asd đã được khai thác làm vô hiệu hóa enzyme này để gây tử vong cho các sinh vật Bên cạnh đó, một số nghiên cứu cho thấy gen asd đột biến có một yêu cầu bắt buộc phải có DAP Điều này đã được

chứng minh bởi các nghiên cứu gen asd trên Legionella pneumophila [31],

Salmonella Typhimurium [28] và Streptococcus mutans Do đó, sử dụng đột biến

gen asd như một điểm lựa chọn vị trí đánh dấu kháng kháng sinh [28]

Như vậy, có thể nói S choleraesuis đột biến ở gen crp và asd có nhiều suy giảm trong tính độc hại Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu tạo ra chủng vắcxin S choleraesuis

nhược độc mang hai gen crp, asd đột biến làm chủng vi khuẩn biến nạp

1.5 PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG

Các plasmid sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng hay gọi là các thể mang gen cần phải có các đặc điểm tiêu chuẩn sau:

• Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc tế bào chủ

• Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng

• Mang những vị trí nhận biết duy nhất của các enzyme cắt giới hạn

• Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép nhanh hiệu quả

• Số lượng bản sao trong tế bào cao

Các plasmid đã được cải tiến rất nhiều trở thành các plasmid đa năng và chuyên dụng Hiện nay, plasmid được sử dụng với ba nhóm chính là: nhóm PUC, nhóm pGEM, nhóm pBluescrip Nhóm PUC có kích thước 2,6 kb mang gen kháng kháng sinh ampicillin, chứa một phần gen lacZ’, có chứa polylinker cho phép chèn vào gần như bất kỳ ADN lạ nào Nhóm pGME có kích thước 3 kb, mang đầy đủ các trình tự của PUC và mang promotor đặc trưng cho ARN polymerase (SP6.T7) Nhóm pBluescrip có kích thước 3kb và có ưu thế nhất, kết hợp được tất cả các ưu điểm của hai nhóm trên Chính vì thế, chúng tôi chọn plasmid pBuescrip II SK+ làm plasmid mang gen trong nghiên cứu này

1.5.1 Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+)

Plasmid pBSIIK+ có kích thước khoảng 3 kb, plasmid này mang gen kháng kháng sinh ampicillin và vùng tạo dòng MSC chứa các điểm cắt của các enzyme

giới hạn XhoI, BamHI, KpnI, XbaI

Hình 1.3 Plasmid pBSIIK+ [70]

Plasmid pBSIIK+ được sử dụng để tạo dòng pBSIIK+ mang đoạn gen crp, asd

của chủng S choleraesuis Smith nhằm tạo ra và nhân gen crp, asd đột biến

1.5.2 Plasmid pRE112

Để ∆crp, ∆asd sau khi đưa vào S choleraesuis có thể thực hiện quá trình thay

thế gen crp của hệ gen trong tế bào thì nó cần phải được đưa vào một plasmid tự

hủy (sucide plasmid) Đây là plasmid chỉ có thể nhân lên trong các tế bào E coli

mang gen pir sinh tổng hợp protein π có vai trò khởi động cho quá trình sao chép

plasmid, do đó không thể tồn tại trong các tế bào vi khuẩn S.cholerasuis [50] Vì

vậy trước khi bị loại bỏ, plasmid này sẽ gắn đoạn gen của chúng mang vào hệ gen của vật chủ thông qua cơ chế trao đổi chéo, nhờ đó mà việc trao đổi gen được thực

hiện thành công Plasmid pRE112 là một trong các sucide plasmid có kích thước

khoảng 5 kb, mang gen kháng chloramphenicol (Cmr) và sacBI cho phép có thể nhận biết được sự tiếp nhận và loại bỏ của tế bào đối với plasmid này, nên đã được chúng tôi lựa chọn

Hình 1.4 Plasmid pRE112 1.6 TẾ BÀO CHỦ ĐỂ KHUẾCH ĐẠI GEN

Có rất nhiều tế bào chủ dùng trong tạo dòng như E coli, Bacillus subtilis,

Saccharomyces cerevisia, virut động vật,… E coli là tế bào chủ phổ biến nhât, dễ

nuôi, sinh sản nhanh, không tiết enzyme E coli dùng để tạo dòng đã được cải tiến

rất nhiều như loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế bằng cách gây đột biến hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh, hệ thống tái tổ hợp ADN được sửa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp, thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm tăng lượng plasmid tích lũy trong tế bào

Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn chủng E coli JM109 khả biến (endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk-, mk+), relA1, supE44, ∆ (lac-proAB), [F’,

traD36, proAB, laqIqZ∆M15], Amps) trong việc tạo dòng pBSIIK+/∆crp, pBSIIK+/∆asd

Chủng E coli χ7213 (thi-1, thr-1, leuB6, fhuA21, lacY1, glnV44, ∆asdA4,

recA1, RP4 2-Tc:Mu[ λpir], Kmr, Amps, DAP) sử dụng trong việc tạo dòng plasmid pRE112/∆crp, pRE112/∆asd Plasmid pRE112 - plasmid chỉ nhân lên trong tế bào

E coli có gen pir sinh tổng hợp protein π có vai trò khởi động cho quá trình sao

chép plasmid và E coli χ7213 đáp ứng được yêu cầu

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đối tượng: chủng S choleraesuis nhược độc (S choleraesuis Smith) đang

được dùng để sản xuất vắcxin phòng bệnh phó thương hàn ở lợn tại Phân viện Thú

y miền Trung

Địa điểm: Phân viện Thú y miền Trung – Nha Trang – Khánh Hòa

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 01/2011 – tháng 01/2012

2.2 VẬT LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU

2.2.1 Chủng vi sinh vật

+ Chủng S choleraesuis Smith là chủng nhược độc đang được sử dụng để

sản xuất vắcxin phòng bệnh phó thương hàn ở lợn tại Phân viện Thú y miền Trung

+ Tế bào khả biến E coli JM109, E coli χ7213 được cung cấp bởi công ty Promega

+ Plasmid pRE112 được lấy từ đại học Bang Arizona – Mỹ

+ Plasmid pBluescript II SK+ (pBSIIK+) của viện công nghệ sinh học

2.2.2 Hóa chất và môi trường

+ Bộ kít chiết tách ADN tổng số, bộ kít QIA Quick Gel Extraction kit, bộ kít chiết tách plasmid QIAprep Spin Miniprep Kit and a microcentrifuge của hãng Promega và Qiagen

+ Môi trường:

LB (Luria – Bertani) broth, LB agar

NA: casein (10g/l), yeast extract (5g/l), agar (18g/l)

NB: casein (10g/l), yeast extract (5g/l)

Một số môi trường có bổ sung thêm sucrose 5%, chloramphenicol (Cm) 30µg/ml, DL-α,ε-Diaminopimelic acid (DAP) 50µg/ml, ampicillin 100 µg/mL, kanamycin (Km) 50 µg/mL, ethidium bromide

+ Dung dịch đệm:

Phosphate buffer saline (PBS): NaCl (8g), KCl (0,2g), Na2HPO4 (1,44g), KH2PO4 (0,24g) Nước cất hai lần vừa đủ đến 1000ml, chuẩn pH 7,4

Tris-Borate-EDTA (TBE) trong điện di (10X): Tris base (108g), Boric acid (55g), EDTA (8,3g), nước cất vừa đủ 1000ml, pH 8,3

Môi trường SOC: Tryption (20g), Yeast extract (5g), NaCl 5M (2ml), KCl 1M (2,5ml), MgCl2 1M (10ml), MgSO4 1M (10ml), glucose 1M (20ml), nước vừa đủ 1000ml

+ Các loại đường: glucose, sucrose, maltose, mannitol, lactose, arabinose, rhamnose, xylose,

+ Các enzyme: enzyme cắt giới hạn XbaI, BamHI, KpnI, XhoI, enzyme Taq, PFU – Pwo Polymerase, enzyme T4 ADN ligase

+ Cặp mồi: Pi1 – Pi2, Pr1F – Pr2R, Pr3F – Pr4R, Pr5F – Pr6R, Pr7F – Pr6R, Pa1F – Pa2R, Pa3F – Pa4R, Pa5F – Pa6R, Pa7F – Pa6R [20, 23, 24, 58, 66]

Crp/Ucrp

Pr7F TCGCGTACCCATACAACTT

1731/1412 Pr6R GCCATTCTGACGGAATTAACGGG

Đoạn đầu asd

(Pa12)

Pa1F TTTCTAGACGCTTTGAGCACGACTAA

2112

XbaI

Pa2R TTGGATCCTCCGTTAGGAACGGAATC BamHI

Đoạn cuối asd

Asd/Uasd

Pa7F TTGGACAATGTTACCGATAA

3717/2229 Pa6R TCCTATCTGCGTCGTCCTAC

2.2.3 Dụng cụ, thiết bị

Dụng cụ: micropipet, đầu típ các loại, pipet thủy tinh các loại, dao, cục

khuấy từ, đũa thủy tinh, paraffin, panh, kéo, cốc thủy tinh, đĩa petri, bình tam giác, chai schott, ống eppendorf, đầu lọc, màng lai 0,45µm…

Thiết bị:

− Máy ly tâm – Hettich – Đức

− Máy ly tâm lạnh Z36HK – Đức

− Máy voltex – VWR – Singapore

− Máy luân nhiệt – Techne TC52 – Đức

− Hệ thống điện di ngang – Minigel XL – Đức

− Bộ đọc điện di – Vilber Lourmart – Pháp

− Cân phân tích - Switzerland

− Máy đo pH – Hàn Quốc

− Máy quang phổ đo OD UV mini – 1240 – Nhật

− Tủ sấy – Đức

− Nồi hấp tiệt trùng – Nhật

− Máy khuấy từ…

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

Tách chiết ADN tổng số theo protocol tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn gram (-) của nhà cung cấp

Cấy 1 khuẩn lạc vào môi trường dịch, nuôi lắc qua đêm ở 370C Dịch nuôi cấy được ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ phần dịch nổi và thu cặn tế bào

vi khuẩn Sau đó tế bào vi khuẩn được hoàn nguyên trong 180 µl ATL