Nghiên cứu phương pháp cố định kháng thể lên vật liệu nano có cấu trúc một chiều nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học

Với định hướng phát triển được loại cảm biến sinh học để có thể ứng dụng trong phát hiện vi rút/vi khuẩn gây bệnh tại Việt Nam, chúng tôi đã đề xuất đề tài „„Nghiên cứu phương pháp cố đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN LƯƠNG HOÀNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ LÊN VẬT LIỆU NANO CÓ CẤU TRÚC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN LƯƠNG HOÀNG

NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH

KHÁNG THỂ LÊN VẬT LIỆU NANO CÓ CẤU TRÚC

MỘT CHIỀU NHẰM ỨNG DỤNG CHO

CẢM BIẾN SINH HỌC Chuyên ngành : VẬT LÝ KỸ THUẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

VẬT LÝ KỸ THUẬT

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

PGS.TS PHƯƠNG ĐÌNH TÂM

Hà Nội – 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng các kết quả khoa học được trình bày trong luận văn này là thành quả nghiên cứu của bản thân tôi và chưa từng xuất hiện trong công bố của các tác giả khác Các kết quả đạt được là chính xác và trung thực

Hà Nội, ngày 30 tháng 9 năm 2016 Người cam đoan

Nguyễn Lương Hoàng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN 2

MỤC LỤC 3

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT 5

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU 6

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 7

MỞ ĐẦU 9

CHƯƠNG I 11

TỔNG QUAN 11

1 Cảm biến sinh học 11

2 Giới thiệu về cảm biến miễn dịch 14

3 Giới thiệu về kháng thể và kháng nguyên 15

4 Tổng quan các phương pháp cố định kháng thể lên cảm biến sinh học 17 CHƯƠNG 2 24

THỰC NGHIỆM 24

1 Hoá chất sử dụng 24

2 Chế tạo điện cực 24

3 Tổng hợp dây nano CeO2 25

4 Thực nghiệm cố định kháng thể sử dụng các phương pháp khác nhau 26 5 Thiết bị nghiên cứu 29

CHƯƠNG 3 37

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

1 Nghiên cứu chế tạo vật liệu dây nano CeO2 37

2 Kết quả nghiên cứu cố định kháng thể 39

3 Đặc trƣng của cảm biến 42

KẾT LUẬN 52

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 57

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

1 APTS 3-aminopropyl triethoxy-silane

2 EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

hydrochloride

3 NHS Sulfo-N-HydroxySuccinimide

4 BSA Bovine Serum Albumin

5 EIS Electrochemical Impedance Spectroscopy

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1 Bảng 2.1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu 24

2 Bảng 3.1 So sánh các thông số của cảm biến miễn dịch

phát hiện V cholera O1 được cố định kháng thể bằng các phương pháp khác nhau

47

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

2 Hình 1.2 Nguyên lý làm việc cảm biến sinh học 12

3 Hình 1.3 Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể 16

4 Hình 1.4 Sơ đồ minh họa qui trình chế tạo cảm biến miễn

dịch, cố định kháng thể dùng protein A bằng phương pháp màng Langmuir Blodgett

19

5 Hình 1.5 So sánh mật độ bề mặt thu được từ màng LB trên

(A)lớp ưa nước, (B) lớp kỵ nước và (C)lớp silane hóa bằng APTS Số trong ngoặc đơn là số lớp màng được phủ lên

14 Hình 2.6 Cấu tạo của kính hiển vi huỳnh quang (Nikon) 33

15 Hình 2.7 Sơ dồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh

quang

34

16 Hình 3.1 Ảnh FE-SEM của dây nano CeO2 được tổng hợp

bằng phương pháp thuỷ nhiệt

37

17 Hình 3.2 Phổ EDS của dây nano CeO2 được tổng hợp bằng

phương pháp thuỷ nhiệt

38

18 Hình 3.3 Phổ nhiễu xạ X-ray của dây nano CeO2 được tổng

hợp bằng phương pháp thuỷ nhiệt

39

19 Hình 3.4 Ảnh huỳnh quang của kháng thể trên điện cực 40

20 Hình 3.5 Phổ hồng ngoại FTIR 41

21 Hình 3.6 Phổ Nyquist của cảm biến miễn dịch 44

22 Hình 3.7 Thế vòng C-V của cảm biến miễn dịch 49

23 Hình 3.8 Tính ổn định của cảm biến miễn dịch 50

MỞ ĐẦU

Những năm gần đây, rất nhiều các nhà khoa học trong nước và Quốc tế đã tập trung nghiên cứu chế tạo ra loại cảm biến sinh học có độ nhạy, độ chọn lọc cao, thiết bị nhỏ gọn, sử dụng tiện ích và cho kết quả tin cậy Thiết bị này được đánh giá với nhiều tính năng vượt trội và có khả năng khắc phục được một số nhược điểm của các thiết bị phân tích truyền thống khác như ELISA, PCR Trong tương lai không xa, các nhà khoa học dự đoán rằng các thiết bị truyền thống sẽ dần bị thay thế bởi các thế hệ cảm biến sinh học do chính những tiện ích của nó mang lại Trong việc phát hiện vi-rút gây bệnh, cảm biến sinh học miễn dịch đang là một trong những cảm biến sinh học được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu hơn cả

Do chúng có nhiều đặc tính nổi trội như độ nhạy cao, thời gian phân tích nhanh, quy trình chế tạo đơn giản, dễ dàng sử dụng, và đặc biệt nhờ kích thước nhỏ gọn người

ta có thể sử dụng những loại cảm biến này tại những vùng xa xôi, hẻo lánh, phục vụ cho việc ngăn ngừa dịch bệnh bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Để chế tạo cảm biến sinh học nói chung và cảm biến miễn dịch nói riêng, việc cố định các thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt bộ chuyển đổi có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất của chúng Nếu quá trình cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến không tốt, nó sẽ làm cho độ nhạy cảm biến giảm, thời gian đáp ứng tăng lên và thời gian sống của cảm biến cũng giảm Do vậy, việc tìm ra được phương pháp cố định cho cảm biến là rất quan trọng Với định hướng phát triển được loại cảm biến sinh học để có thể ứng dụng trong phát hiện vi

rút/vi khuẩn gây bệnh tại Việt Nam, chúng tôi đã đề xuất đề tài „„Nghiên cứu

phương pháp cố định kháng thể lên vật liệu nano có cấu trúc một chiều nhằm ứng dụng cho cảm biến sinh học’’ với mục tiêu là phải cố định thành công được

thành phần cảm nhận sinh học lên trên bề mặt bộ chuyển đổi sử dụng các phương pháp khác nhau từ đó tìm ra được phương pháp tối ưu nhất để ứng dụng phát triển cảm biến sinh học miễn dịch nhằm xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy trong điều kiện nghiên cứu hiện có tại cơ sở đào tạo

Từ mục tiêu này chúng tôi đặt ra một số nhiệm vụ sau:

- Tổng hợp được dây nano CeO2 bằng phương pháp thuỷ nhiệt để sử dụng như vật liệu trung gian cho cố định thành phần cảm nhận sinh học

- Nghiên cứu các phương pháp cố định khác nhau để cố định kháng thể lên

trên điện cực cảm biến, từ đó lựa chọn ra được phương pháp cố định tối ưu trong điều kiện nghiên cứu

- Ứng dụng cảm biến để xác định vi khuẩn gây bệnh tiêu chẩy

Bố cục của luận văn được trình bày như sau:

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Trong chương này, toàn bộ kết quả của quá trình thực nghiệm được trình bày

và những bàn luận của chúng tôi đối với những kết quả đạt được, từ đó đưa ra kết luận và những ý kiến đề xuất

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1 Cảm biến sinh học

1.1 Giới thiệu

Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì: “Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng”

1.2 Cấu tạo

Cảm biến sinh học được cấu tạo gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một bộ chuyển đổi tín hiệu Ngoài ra, nó còn có

bộ phận xử lý và hiển thị tín hiệu

- Đầu thu sinh học (phần tử nhận biết sinh học): Là thành phần sinh học như

ADN, enzyme, protein hay các kháng thể Nó có tác dụng bắt cặp, phát hiện sự có mặt của các tác nhân sinh học cần phân tích

Hình1.1 Cấu tạo cảm biến sinh học

- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu: bộ phận này giúp chuyển các biến đổi sinh

học thành các tín hiệu có thể đo đạc được

Có các dạng chuyển đổi:

+ Chuyển đổi điện hóa

+ Chuyển đổi quang

+ Chuyển đổi nhiệt

+ Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện piezoelectric

+ Chuyển đổi bằng các hệ vi cơ

- Bộ phận xử lý giúp đọc tín hiệu ra: Bộ phận này có tác dụng chuyển các tín

hiệu không điện thành các tín hiệu điện có thể xử lý

1.3 Nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học

a) Nguyên lý chung:

Các vật liệu sinh học như : vi khuẩn, tế bào, enzym, kháng thể, DNA, … được cố định lên trên bề mặt cảm biến bằng các phương pháp khác nhau (hấp phụ, cộng hóa trị) Khi các chất cần phân tích tiếp xúc với đầu dò của cảm biến sinh học tương ứng, một liên kết đặc trưng sẽ được hình thành, điều này làm thay đổi tính chất của đầu dò

Những sự thay đổi này được nhận biết bằng các bộ chuyển đổi như: quang,

cơ, nhiệt, điện Các thay đổi này được chuyển thành tín hiệu điện từ đó cho ta thông tin về các vật liệu sinh học

Hình1.2 Sơ đồ mô tả nguyên lý làm việc của cảm biến sinh học

1.4 Phân loại cảm biến sinh học

a Phân loại theo cơ chế chuyển đổi

- Chuyển đổi điện hoá: Bao gồm chuyển đổi dựa trên điện thế (potentiometric), dòng điện (amperometric) và độ dẫn (conductometric)

- Chuyển đổi quang: Là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng như: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio-luminiscence;chemi–luminiscence…

- Chuyển đổi nhiệt: Hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entanpi khi hình thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng Bộ chuyển đổi này có

ưu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng Tuy nhiên, dạng chuyển đổi này có tính chọn lọc thấp

- Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric): tinh thể sẽ thay đổi tần số dao động khi lực tác dụng lên nó thay đổi Chuyển đổi dạng này có ưu điểm là độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao

- Chuyển đổi bằng các hệ vi cơ : Nguyên lý hoạt động của cảm biến sử dụng chuyển đổi này như sau: chiếu một chùm laser đến bộ phản xạ trên bề mặt một thanh dầm rất mỏng, ánh sáng phản xạ được thu nhận bởi photodetector Thanh mỏng này được chế tạo sao cho chỉ với một lực tác động rất nhỏ cũng làm cho thanh

bị uốn cong đi Như vậy tín hiệu phản xạ thu nhận được trên photodetector sẽ bị thay đổi so với trường hợp không có lực tác dụng lên thanh Căn cứ vào sự thay đổi tín hiệu phản xạ này, người ta có thể xác định được lực tác dụng lên thanh

b.Phân loại theo đầu thu sinh học

- Đầu thu làm từ enzyme: Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng đầu thu phổ biến nhất Đó là các đầu thu làm từ các enzyme urease, glucose,…

- Đầu thu làm từ các kháng thể/kháng nguyên: Các đầu thu dạng này có đặc điểm là tính chọn lọc rất cao đồng thời các liên kết được tạo thành khá mạnh

- Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm từ các protein như cảm biến phát hiện hocmôn, xác định các chất kích thích thần kinh, Các đầu thu này có đặc điểm là có tính chọn lọc rất cao Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là rất khó bảo quản

- Đầu thu làm từ các axit nucleic: Các axit nucleic như ADN, ARN có thể sử dụng làm đầu thu sinh học Các cảm biến có đầu thu dạng này thường được sử dụng

để phát hiện đột biến và các sai lệch trong cấu trúc di truyền

- Đầu thu kết hợp: Với các đầu thu dạng này, người ta sử dụng đồng thời hai hay nhiều các phân tử dạng (enzyme, kháng thể, protein, ) trên một đế Việc kết hợp này mở rộng khả năng làm việc của các cảm biến sinh học Một số cảm biến dạng này là cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến xác định vi khuẩn bệnh than

và cảm biến thử thai

- Đầu thu làm từ tế bào: Các đầu thu sinh học không chỉ được làm từ các phân tử, nguyên tử mà nó còn có thể được làm từ các tế bào Một số tế bào biến đổi gen của vi khuẩn đã được sử dụng làm đầu thu sinh học Khi có mặt các phân tử chất độc, các tế bào này sẽ phát sáng, thông qua đó chúng ta xác định được sự xuất hiện của các phân tử chất độc

1.5 Ứng dụng của cảm biến sinh học

Ứng dụng trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ: Đây là lĩnh vực có nhiều cải tiến cũng như nhiều ứng dụng nhất Chúng ta có thể kể ra rất nhiều loại cảm biến như cảm biến phát hiện các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn, cảm biến đo lượng glucose trong máu, cảm biến huyết áp Ngày nay, các cảm biến dạng này không những tăng độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà còn được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ và dễ sử dụng

Ứng dụng trong công nghệ môi trường: Đó là các cảm biến dạng “mũi điện tử” xác định một hoá chất độc hại nào đó hoặc xác định độ ô nhiễm của môi trường như cảm biến xác định nồng độ khí độc (CO2, H2S), xác định dư lượng thuốc trừ sâu, xác định nồng độ của các kim loại nặng,

Ứng dụng trong việc điều khiển, quản lý các quá trình trong công nghệ sinh học: Ngày nay, khi công nghệ sinh học phát triển, đồng thời với việc các chế phẩm sinh học được sản xuất rộng rãi trên qui mô công nghiệp, cũng như tham gia ngày càng nhiều vào các quá trình sản xuất khác thì một nhu cầu tất yếu nảy sinh, đó là việc theo dõi, quản lý, điều khiển các quá trình sinh học như điều chỉnh lượng glucose trong quá trình nuôi vi khuẩn v.v Các cảm biến sinh học đã tỏ ra có nhiều ưu điểm so với các phương pháp truyền thống như tính chọn lọc cao, đáp ứng nhanh, đơn giản và chính xác

2 Giới thiệu về cảm biến miễn dịch

Cảm biến miễn dịch là một loại cảm biến sinh học trong đó phần tử cảm nhận sinh học là kháng thể được cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi

Hoạt động của cảm biến miễn dịch dựa trên cơ sở phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể được cố định trên bề mặt cảm biến, khi đó sẽ làm thay đổi tín hiệu sinh hoá trên bề mặt cảm biến Sự thay đổi tín hiệu này sẽ được phát hiện bằng

bộ chuyển đổi và được hiển thị ở đầu ra của cảm biến

Hiện nay, cảm biến miễn dịch đang thu hút được nhiều sự chú ý do nó có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau như trong chẩn đoán lâm sàng [4, 11,

16, 24, 27], các ngành công nghiệp thực phẩm [9, 18, 26], và giám sát môi trường [6, 8, 12, 17] Cũng như các loại cảm biến sinh học khác, cảm biến miễn dịch có thể được phân loại thành các cảm biến như cảm biến miễn dịch quang, cơ, hoặc điện

3 Giới thiệu về kháng thể và kháng nguyên

a) Kháng thể: Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất

glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất

- Cấu trúc điển hình của kháng thể: Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi

polypeptide, gồm hai chuỗi nặng (H, heavy, tiếng Anh) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light, tiếng Anh) cũng giống hệt nhau Có hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ Các chuỗi của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độ đàn hồi nhất định Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố định nhưng phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng đặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, điều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó

Có thể tạm so sánh sự đặc hiệu của phản ứng kháng thể-kháng nguyên với ổ khóa

và chìa khóa

+ Các domain hằng định: Các domain hằng định (C, constant) đặc trưng bởi

các chuỗi amino acide khá giống nhau giữa các kháng thể Domain hằng định của chuỗi nhẹ ký hiệu là CL Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng định, tùy theo lớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và CH4

Các domain hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể Do đó, phần "chân"

của chữ Y còn được gọi là Fc (tức là phần hoạt động sinh học của kháng thể F: fragment, c: cristallisable)

Hình1.3 Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể

+ Các domain biến thiên: Mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V,

variable) ở đầu tận hai "cánh tay" của chữ Y Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope) Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với 2 kháng nguyên giống nhau Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần nhận biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding) Domain kháng nguyên nơi gắn vào kháng thể gọi là epitope

Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều giữa các kháng thể Chính sự biến thiên đa dạng này giúp cho hệ thống các kháng thể nhận biết được nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau

b) Kháng nguyên: là phân tử kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể, đặc

biệt là sản xuất kháng thể Thông thường kháng nguyên là một protein hay một polysaccharide, nhưng nó cũng có thể là bất cứ loại phân tử nào, mang các phân tử hapten nhỏ và gắn với một protein chuyên chở

c) Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể: Liên kết giữa kháng

thể và kháng nguyên, tương tự như giữa enzyme và cơ chất, có tính thuận nghịch

Liên kết mạnh hay yếu tùy vào số lượng liên kết và độ đặc hiệu giữa vùng nhận diện kháng nguyên trên kháng thể và cấu trúc epitope tương ứng

Ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên là hợp lực của các lực liên kết yếu không đồng hóa trị (liên kết hydro, lực van der Waals và các liên kết ion ) Các lực liên kết yếu này chỉ có tác dụng trong một bán kính nhỏ, do đó sự đặc hiệu (hay tính chất bổ sung) trong cấu trúc không gian 3 chiều của 2 vùng phân tử có vai trò quyết định đối với ái lực của kháng thể với kháng nguyên

Như vậy, một kháng nguyên có thể được nhận diện bởi nhiều kháng thể với

độ đặc hiệu khác nhau, dòng kháng thể nào phù hợp nhất về cấu trúc 3 chiều với epitope sẽ được khuếch trương mạnh nhất

4 Tổng quan các phương pháp cố định kháng thể lên cảm biến sinh học

Hiện nay, một số phương pháp cố định kháng thể đã được báo cáo như hấp phụ vật lý [13], liên kết cộng hóa trị [3, 28] phương pháp Langmuir Blodgett [1], và các phương pháp khác Dưới đây sẽ trình bày một số phương pháp cố định kháng thể thường được sử dụng cho cảm biến miễn dịch

4.1 Cố định kháng thể bằng phương pháp hấp phụ

Phương pháp cố định kháng thể dựa trên sự hấp phụ vật lý của các kháng thể lên bề mặt cảm biến được thực hiện dựa vào các lực liên kết yếu như Van der Waals, kỵ nước, hoặc tương tác tĩnh điện Ví dụ, Năm 1995, Buijs và công sự ở đại học Wageningen, Hà Lan đã so sánh việc cố định kháng thể IgG và Fab bằng phương pháp hấp phụ [13] Trong nghiên cứu này, Buijs đã so sánh khả năng cố định của IgG và Fab lên trên bề mặt silica và bề mặt silica được methyl hóa tại các mức pH khác nhau Bề mặt silica được methyl hóa bằng cách ngâm bề mặt silica trong 0,3% (v/v) dichlorodimethylsilane trong 1,1,1-trichloroethane với thời gian là

30 phút, và được sấy khô Quá trình cố định kháng thể được tiến hành bằng cách: nhỏ dung dịch IgG hoặc Fab lên trên bề cảm biến Tiếp theo bề mặt cảm biến được phủ một lớp BSA để tránh sự hấp phụ của các kháng nguyên trong quá trình đo Năm 2003, Chen và cộng sự tại khoa kỹ thuật hóa học và công nghệ sinh học của đại học Washington Mỹ cũng đã báo cáo một nghiên cứu về sự hấp phụ kháng thể

lên bề mặt silic và cho kết quả tương tự [22].Năm 2010, Sungkanak cùng cộng sự ở Khoa Hóa học lâm sang, Đại học Mahidol Thái Lan đã nghiên cứu thành công một cảm biến miễn dịch siêu nhạy sử dụng cấu trúc vi dầm côngxon (microcantilever) [25] Trong đó, kháng thế được cố định lên bề mặt của cấu trúc này bằng phương pháp hấp phụ Bề mặt vi dầm côngxon được phủ một lớp vàng dày 1 µm, rộng 35

µm và dài 250 µm Trước khi sử dụng, bề mặt vi dầm côngxon được làm sạch bằng dung dịch piranha (H2SO4 trong H2O2 30%; 1:1, v/v) sau đó rửa sạch bằng nước cất Tiếp theo nó được ngâm trong dung dịch ethanol có chứa 3-mercaptopropionic 10

mM, và rửa sạch với ethanol, nước khử ion Sau đó, vi dầm tiếp tục được ngâm trong 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) 200

mM và sulfo-N- hydroxysuccinimide (NHS) 50 mM Sau khi được rửa với nước cất, bề mặt vi dầm được phủ với dung dịch anti-V cholerae O1 0,5 mg/ml trong dung dịch PBS (pH 7,4) Cuối cùng, bề mặt vi dầm được phủ bovine serum albumin (BSA) 3 mg/ml trong PBS (pH 7,4)

4.2 Cố định kháng thể bằng phương pháp Langmuir-Blodgett

Màng Langmuir-Blodgett là một màng bao gồm các lớp kế tiếp hoàn toàn có

tổ chức mà sự trật tự của nó là do các tính chất ưa nước hoặc kỵ nước của các phân

tử cấu tạo nên màng Để minh hoạ các phân tử đặc biệt này, chúng ta hãy mô hình hoá phân tử này dưới dạng một quả bóng nhỏ được thổi phồng bằng một chất hơi nhẹ hơn không khí và được buộc vào một quả cầu nặng bằng một sợi chỉ Giả sử khá nhiều phân tử loại này được phun trên một mặt phẳng, chúng sẽ tạo nên một lớp rất đồng đều hoàn toàn trật tự, phần “kỵ nước” là quả bóng hướng ra ngoài, còn phần “hút nước” là quả cầu nặng nằm trên mặt phẳng

Nhờ vào đặc điểm này mà một số nhóm nghiên cứu đã áp dụng để cố định kháng thể lên bề mặt cảm biến Đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của Ahluwalia ở trung tâm E.Piaggio, Đại học Pisa Ý đã nghiên cứu cố định thành công kháng thể lên bề mặt cảm biến bằng phương pháp Langmuir Blodgett [1] Trong nghiên cứu này, họ đã chế tạo đế ưa nước bằng cách nung ở 400 ºC trong 10 h, tiếp theo đế được đun sôi trong axit cromic trong thời gian khoảng 30 phút Sau quá

trình này, đế được rửa sạch bằng nước khử ion Tiếp theo, đế được silan hoá amin bằng cách ngâm trong dung dịch 90% 2-propanol, 5% Nước và 5% aminopropyltriethoxysilane (APTS) trong thời gian khoảng 1 giờ Sau đó, đế tiếp tục được rửa sạch và sấy khô

Hình 1.4 Sơ đồ minh họa qui trình chế tạo cảm biến miễn dịch, cố định

kháng thể dùng protein A bằng phương pháp màng Langmuir Blodgett [15]

Hình 1.5 So sánh mật độ bề mặt thu được từ màng LB trên (A)lớp ưa

nước, (B) lớp kỵ nước và (C)lớp silane hóa bằng APTS Số trong ngoặc đơn là số

lớp màng được phủ lên.[1]

Năm 1995, Koji Owaku và Masahiro Goto (phòng thí nghiệm nghiên cứu

dược phẩm, 560 Kashio-cho, Totsuka-Ku, Yokohama 244, Nhật Bản) cùng cộng sự

đã công bố nghiên cứu về phương pháp cố định kháng thể bằng phương pháp

Langmuir Blodgett [15] Protein A được được sử dụng để tạo màng Langmuir

Blodgett, trong nghiên cứu tác giả đã khảo sát các điều kiện áp lực bề mặt để tạo ra

màng Langmuir Blodgett tốt nhất, sau đó cố định kháng thể lên trên bằng cách

ngâm trong dung dịch đệm PBS có chứa kháng thể IgG Phép đo huỳnh quang được

tác giả sự dụng để nghiên cứu liên kết kháng thể lên trên màng Langmuir Blodgett

4.3 Cố định kháng thể bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị

Phương pháp cố định kháng thể bằng liên kết cộng hóa trị được thực hiện

bằng cách hình thành liên kết cộng hoá trị giữa kháng thể và bề mặt cảm biến

Hình 1.6 Cố định phân tử sinh học lên trên đế bằng liên kết cộng hóa trị

Hiện nay, có nhiều nhóm đã sử dụng phương pháp liên kết cộng hoá trị để cố định kháng thể lên bề mặt cảm biến Năm 2008, Corso (phòng kỹ thuật y sinh, viện công nghệ Georgia, Atlanta Mỹ) và cộng sự đã công bố những nghiên cứu về cố định kháng thể bằng liên kết cộng hóa trị [3]

Trong nghiên cứu này, Corso và cộng sự đã cố định kháng thể lên trên bề mặt đế ZnO bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng các hóa chất khác nhau Đầu tiên, đế ZnO được silane hóa bằng GPS hoặc MTS nhờ phản ứng với các gốc hydroxyl trên bề mặt Với quy trình silane hóa bằng GPS, kháng thể sẽ được cố định trên bề mặt đế nhờ phản ứng tạo liên kết với nhóm amin có trong kháng thể (Hình 1.7 a) Còn đế ZnO được silane hóa bằng MTS, tiếp tục tạo liên kết trung gian với GMBS và cuối cùng kháng thể mới được cố định lên trên bề mặt đế thông qua liên kết với gốc amin (Hình 1.7 b) Bằng cách sử dụng phép đo góc tiếp xúc nước, kính hiển vi lực nguyên tử và kính hiển vi huỳnh quang, Corso nhận thấy hai phương pháp sử dụng hóa chất MTS hoặc GPS đều có hiệu quả trong việc cố định kháng thể lên trên bề mặt đế ZnO Tuy nhiên phương pháp sử dụng hóa chất MTS cho thấy hiệu quả tốt hơn

Hình 1.7 Quy trình cố định kháng thể trên bề mặt ZnO bằng liên kết cộng

hóa trị: a) sử dụng GPS b) sử dụng MTS và GMBS [3]

Năm 2004, Wang (cao đẳng kỹ thuật và khoa học thực phẩm, đại học Zhejiang, Hàng Châu, Trung Quốc) và cộng sự đã báo cáo một phương pháp cố định dựa trên protein A cho cảm biến miễn dịch [10] Nghiên cứu của họ cho thấy khả năng liên kết tốt của protein A với các hạt nano vàng Bề mặt sau khi đã cố định protein A được khảo sát qua phép đo kính hiển vi lực nguyên tử Việc sử dụng PPF trong quá trình cố định kháng thể đã nâng cao khả năng liên kết của kháng thể do đó nâng cao hiệu suất của cảm biến

Hình 1.8 Quy trình cố định kháng thể lên trên bề mặt tinh thể thạch anh sử

dụng PA và PPF [10]

Trong một nghiên cứu khác, năm 2013, Franco (trung tâm nghiên cứu khoa học nano và công nghệ nano (CSIC) & CIBER-BBN, Tây Ban Nha) và cộng sự thực hiện cố định kháng thể trên bề mặt vàng bằng cách sử dụng protein A để chế tạo một cảm biến miễn dịch [5] Các liên kết protein A-vàng bao gồm một peptide

là vàng gắn kết với miễn dịch globulin - protein A sau đó nó sẽ được sử dụng để cố định kháng thể Các cảm biến miễn dịch chế tạo theo phương pháp này đạt được giới hạn phát hiện 90 ng/mL, với thay đổi thấp hơn 7%

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

1 Hoá chất sử dụng

Bảng 2.1 Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu

biến miễn dịch Do đó, chúng tôi kế thừa các điện cực đã được nhóm nghiên cứu chế tạo từ trước đó Quy trình chế tạo có thể được tóm tắt như sau:

Đầu tiên, phiến silíc được làm sạch bề mặt bằng các phương pháp khác nhau Sau đó, được ôxi hóa tạo lớp ôxít có chiều dầy thích hợp để làm lớp cách điện Sau khi ôxi hóa bề mặt, phiến silic được sử dụng để tạo hình linh kiện bằng quá trình quang khắc Trước khi quang khắc, trên bề mặt phiến được phủ một lớp có cấu tạo nhạy sáng đặc biệt gọi là chất cảm quang Đây là chất bền vững trong dung môi axít

và kiềm, nó có tác dụng như một khuôn tạo hình dạng cho cảm biến, bảo vệ cho các chi tiết khỏi bị tác động của dung môi hóa học Sau quang khắc là quá trình phún xạ

Cr / Pt để tạo điện cực kim loại trên bề mặt phiến Si Cuối cùng là tẩy lớp cảm quang để thu được các cảm biến Hình ảnh cảm biến sau khi hàn dây và đóng gói được mô tả trên hình 2.1

Hình 2.1 Hình ảnh cảm biến sau khi được hàn và đóng gói

3 Tổng hợp dây nano CeO 2

Dây nano CeO2 được tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là bột Ce(NO3)2.6H2O Sản phẩm này đã được thương mại hoá và không qua bất kỳ một khâu xử lý nào Quá trình tổng hợp bằng phương pháp thuỷ nhiệt được tiến hành như sau: Bột Ce(NO3)2.6H2O được phân tán trong dung dịch có chứa HCl và

K2HPO4:KH2PO4 bằng máy khuấy từ trong vòng 3 giờ Sau đó hỗn hợp này được

chuyển sang autoclave với lớp lót bằng Teflon Quá trình tổng hợp thuỷ nhiệt được tiến hành trong khoảng nhiệt độ 160 0C, thời gian tổng hợp 10 giờ Kết thúc quá trình thuỷ nhiệt dây nano được hình thành thu lại bằng quay ly tâm 5000 vòng/phút

và được rửa sạch sau đó sấy khô trong môi trường không khí

4 Thực nghiệm cố định kháng thể sử dụng các phương pháp khác nhau

Do kháng thể không thể liên kết trực tiếp với bề mặt cảm biến, do đó cần vật liệu trung gian để cố giữa kháng thể và bề mặt cảm biến Hiện nay, có rất nhiều vật liệu trung gian để cố định kháng thể như ống nano các bon [7], vật liệu polymer dẫn [20], các vật liệu ô xít kim loại bán dẫn [2] Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi đã sử dụng dây nano CeO2 làm chất trung gian để cố định giữa kháng thể

và bề mặt điện cực Để cố định kháng thể thì vật liệu CeO2 phải được phủ lên bề mặt điện cực Bề mặt điện cực trước khi phủ dây nano cần được làm sạch với Kcr2O7 trong 98%H2SO4 Tiếp theo là quét thế vòng với điện áp quét từ -1V đến 2,1V với tốc độ quét là 25mV/s trong 0.5M H2SO4 để hoạt hoá bề mặt cảm biến

Hình 2.2 (a) cấu trúc của 1 điện cực, (b) hình ảnh điện cực được phóng to,

(c) hình ảnh FE-SEM của các dây nano CeO 2 được phun lên trên điện cực, (d) hình ảnh phóng to của của dây nano CeO 2

Dây nano CeO2 được ngâm với APTS 1% (v/v) trong ethanol 36 giờ ở nhiệt

độ phòng Sau đó, một hỗn hợp của APTS/CeO2 NWS được ly tâm trong 60 phút tại

3500 rpm và rửa ba lần với ethanol Tiếp theo, APTS/CeO2 NWS được phun lên bề mặt điện cực đã được kích hoạt (Hình 2.2)

4.2 Cố định kháng thể sử dụng các phương pháp khác nhau

Để nghiên cứu sự cố định kháng thể lên bề mặt cảm biến chúng tôi đã sử dụng 3 phương pháp là phương pháp hấp phụ, phương pháp hoạt hoá kháng thể bằng EDC/NHS và phương pháp cố định liên kết cộng hoá trị sử dụng protein A Chi tiết của các phương pháp sẽ được đề cập trong phần tiếp theo

30 phút, rửa sạch với nước khử ion, và sấy khô dưới dòng nitơ Hình 2.3 (a) cho thấy sơ đồ cố định kháng thể lên trên bề mặt của điện cực được phủ APTS/CeO2

NWS bằng phương pháp hấp phụ

b) Cố định bằng phương pháp hoạt hoá kháng thể bằng EDC/NHS

Đối với phương pháp hoạt hóa kháng thể bằng EDC/NHS, đầu tiên 12 µg/ml kháng thể anti-V.cholerae O1 được ủ trong 50 µl dung dịch đệm PBS 0,01 M chứa

5 mg/ml EDC và 10 mg/ml NHS 20 phút ở pH 7,4 và nhiệt độ phòng EDC sẽ gắn các nhóm cacboxyl với amin chính tạo thành một O-acylisourea trung gian Liên kết này không ổn định trong môi trường nước vì vậy để ổn định chúng tôi dùng NHS tạo ra liên kết trung gian nhờ phản ứng của amin và NHS este

Sau đó điện cực đã được kích hoạt và phủ phủ APTS/CeO2 NWS được ngâm với dung dịch có chứa kháng thể đã hoạt hóa bằng EDC/NHS trong 24 giờ ở nhiệt

độ phòng Tại bước này các kháng thể đã được hoạt hóa sẽ liên kết với các nhóm amin tự do trên bề mặt điện cực được kích hoạt và phủ APTS/CeO2 NWS

Tiếp theo, bề mặt của điện cực đã được rửa sạch bằng nước cất 2 lần và sấy khô dưới dòng nitơ

Cuối cùng, điện cực được ngâm trong dung dịch PBS có chứa 1% BSA trong

30 phút, rửa sạch với nước khử ion, và sấy khô dưới dòng nitơ Khi không sử dụng

các cảm biếm miễn dịch được bảo quản ở 4 ◦C trong tủ lạnh Hình 2.3 (b) cho thấy

sơ đồ cố định kháng thể trên bề mặt của điện cực được kích hoạt và phủ APTS/CeO2 NWS bằng phương pháp hoạt hóa kháng thể bởi EDC/NHS

Hình 2.3 Sơ đồ minh họa các phương pháp cố định kháng thể: (a) phương

pháp hấp phụ, (b) phương pháp hoạt hóa kháng thể bằng EDC/NHS, (c) phương pháp sử dụng protein A