Chế tạo cảm biến sinh học chẩn đoán bệnh sớm

sinh học vẫn gặp rất nhiều khó khăn như độ ổn định trong chế tạo sản phẩm, phương pháp đo tín hiệu, thời gian phản ứng, khả năng tái sử dụng, … Do vậy, những nghiên cứu mới trong tương l

LỜI CẢM ƠN

Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi xin được gửi tới Tiến sĩ Trương Thị Ngọc Liên, người Thầy đã luôn tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong công việc cũng như trong cuộc sống

Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy cô, các anh chị em trong Viện Vật

Lý Kỹ Thuật, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nói chung và nhóm Biosensor nói riêng đã có những ý kiến đóng góp và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt luận văn

Đặc biệt tôi muốn gửi lời cảm ơn tới đề tài “Fabrication and characterization

of gold nanoparticles based electrochemical impedance (EIS) and Quartz Crysral

Microbalance (QCM) biosensor for medical application” - The Academic of

Science for the Developing World (TWAS) No:09-005 RG/PHYS/AS_I-UNESCO FR: 3240230341

Cuối cùng xin dành lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè tôi, những người luôn đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, 26 tháng 12 năm 2010

Học viên

Đặng Thị Thùy Nga

MỞ ĐẦU

Cảm biến sinh học có thể hiểu là một thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học như enzyme, các kháng thể, DNA… để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hóa chất Vì vậy một cảm biến sinh học thông thường gồm có 3 thành phần cơ bản, đó là: thành phần hóa học, thành phần sinh học và thành phần vật lý

Với sự phát triển mạnh mẽ của xã hội như hiện nay, nhu cầu về đo đạc, phân tích hóa chất là rất lớn, chính vì thế sự ra đời của cảm biến sinh học là khá quan trọng

Nó là một công cụ quan trọng trong kiểm tra an toàn thực phẩm, chuẩn đoán y học

và kiểm tra nội khoa, các hệ phát hiện các tác nhân ô nhiễm môi trường Cảm biến sinh học là một thiết bị có nhiều ưu điểm: sử dụng đơn giản, có khả năng phát hiện nhanh, độ nhạy cao cũng như có tính chọn lọc mạnh mẽ trong các hệ hóa học và sinh học

Giáo sư LelDNA C Clark Jnr được biết đến như cha đẻ của cảm biến sinh học Năm

1956 ông công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá Những năm tiếp theo ông tiếp tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả năng hoạt động của cảm biến như phát hiện được thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến Vào năm 1962, tại hội nghị New York Academy of Science, ông đã thuyết trình một

bài về cảm biến sinh học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sDNAwiches” Ông đưa ra mô hình đầu tiên về cảm biến sinh học

(xem hình 1) Cảm biến sinh học theo mô hình của C Clark [1] bao gồm điện cực oxy hóa, trên đó có màng giữ enzyme glucose (glucose oxidase) Khi mật độ glucose trong môi trường phản ứng giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một

cách tương ứng Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ glucose trong môi trường cần kiểm tra.

Hình 1 Mô hình cảm biến sinh học đầu tiên của C Clark [1]

Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo [2] lần đầu tiên công bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê dựa trên điện cực cố định enzyme urê (urease) bằng màng chất lỏng chọn lọc amonium

Năm 1975 Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fibre-optic sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2 Cũng vào năm 1975, một số vi khuẩn cũng đã được sử dụng như những thành phần sinh học trên các điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn Năm 1975 công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý tưởng của Clark thành hiện thực thông qua việc thương mại hóa các cảm biến sinh học Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời sống Vào năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến glucose in vivo, là loại cảm biến kim đầu tiên cho các xét nghiệm dưới da

Hiện nay, cảm biến sinh học đã và đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các trung tâm nghiên cứu Tuy nhiên việc chế tạo cảm biến

sinh học vẫn gặp rất nhiều khó khăn như độ ổn định trong chế tạo sản phẩm, phương pháp đo tín hiệu, thời gian phản ứng, khả năng tái sử dụng, … Do vậy, những nghiên cứu mới trong tương lai chủ yếu sẽ tập trung vào hai hướng chính:

(1) Khắc phục những khó khăn sẵn có của thế hệ cảm biến cũ: Nâng cao độ

ổn định để có thể chế tạo hàng loạt, cải thiện khả năng tái sử dụng của các cảm biến sinh học, tìm giải pháp hạ giá thành sản phẩm

(2 ) Xây dựng mô hình lý thuyết: Giải thích, tìm kiếm vật liệu cũng như khả

năng ứng dụng mới của cảm biến, giảm kích thước cảm biến để tích hợp được nhiều cảm biến trên một thiết bị, cải tiến thiết bị đo đơn giản và dễ sử dụng, rút ngắn thời gian đáp ứng v.v

Do dó, nội dung của bản luận văn chỉ tập trung vào những vấn đề sau: Sử dụng linh

kiện QCM (Quartz Crystal Microbalance) trong nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học

chẩn đoán sớm hai loại bệnh ung thư: Tiền liệt tuyến và u lá nuôi thời kì thai nghén Luận văn gồm có 4 chương:

Chương 1: Trình bày cấu tạo cũng như khả năng ứng dụng của cảm biến sinh

học

Chương 2: Trình bày tổng quan về tương tác sinh học kháng nguyên-kháng thể

và một số phương pháp phát hiện bệnh ung thư hiện nay

Chương 3: Trình bày về các phương pháp nghiên cứu chế tạo hai loại cảm biến

PSA-QCM và hCGα - QCM

Chương 4: Kết quả đo nồng độ PSA và hCG bằng phương pháp sử dụng vi cân

tinh tinh thể thạch anh QCM

CHƯƠNG I CẢM BIẾN SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ LINH KIỆN QCM

I.1 Cảm biến sinh học

Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng về sự hiện diện của các tác nhân

khác nhau trong môi trường thông qua các tương tác sinh học (theo IUPAC - International Union of Pure and Applied Chemistry)

Cảm biến sinh học đã và đang thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học cũng như các trung tâm nghiên cứu bởi những ứng dụng rộng rãi trong thực tế

cuộc sống cũng như khoa học kỹ thuật

I.1.1 Ứng dụng

Sau đây là một số ứng dụng cụ thể của cảm biến sinh học và những ưu điểm của việc sử dụng cảm biến trong nghiên cứu và trong thực tế đời sống

(1) Trong lĩnh vực y tế và chăm sóc sức khoẻ: Đây là một trong những lĩnh vực

ứng dụng quan trọng nhất công nghệ cảm biến sinh học và thu hút được sự quan tâm rất lớn của các nhà khoa học Chúng ta có thể kể ra rất nhiều loại cảm biến như: cảm biến đo nồng độ oxy và lượng glucose trong máu [3],phát hiện nồng độ urê trong nước tiểu [4], cảm biến đo huyết áp, … Những cảm biến này giúp người bệnh có thể thường xuyên theo dõi tình hình bệnh tật của mình mà không nhất thiết phải đến các trung tâm y tế Thiết bị này không những không ngừng nâng cao độ tin cậy, giảm thời gian hồi đáp mà còn được chế tạo theo hướng càng ngày càng nhỏ gọn, rẻ tiền và dễ sử dụng

(2) Ứng dụng trong công nghệ môi trường: Đó là các cảm biến dạng “mũi điện

tử” sử dụng xác định hoá chất độc hại nào đó hoặc xác định độ ô nhiễm của môi trường sống như các cảm biến xác định nồng độ CO2, H2S, xác định dư lượng thuốc trừ sâu [5] và xác định nồng độ của các kim loại nặng [6]

(3) Ứng dụng trong các tương tác Người – Máy: Đây cũng là một lĩnh vực mới

mẻ có nhiều nghiên cứu ứng dụng Chúng ta có thể kể ra một số cảm biến dạng này như cảm biến nhận dạng tiếng nói, hình ảnh, hoặc nhận dạng các đặc trưng sinh học của con người

(4) Ứng dụng trong việc điều khiển và quản lý các quá trình trong công nghệ sinh học: Ngày nay, khi công nghệ sinh học phát triển đồng thời với việc các

chế phẩm sinh học ngày càng được sản xuất rộng rãi trên qui mô công nghiệp, cũng như tham gia ngày càng nhiều vào các quá trình sản xuất khác thì nhu cầu tất yếu nảy sinh, đó là việc theo dõi, quản lý, điều khiển các quá trình sinh học Cảm biến sinh học đã được chế tạo để phát hiện sự biến đổi gen của một số loại thực phẩm có nguồn gốc từ cây trồng chuyển gen [7] Đặc biệt, hiện nay, loại cảm biến sinh học được ứng dụng rất nhiều trong việc phát hiện các loại virus, vi khuẩn gây bệnh [8] Các cảm biến sinh học

đã tỏ ra có nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp truyền thống như có tính chọn lọc cao, thời gian đáp ứng nhanh hơn, đơn giản và chính xác cao

a b c

Hình 1.1: Cảm biến xác định vi rút gây bệnh của Motorola (a, b),

Toshiba (c) [9, 10]

I.1.2 Cấu tạo

Cấu tạo chung của một cảm biến sinh học (xem hình 1.2) bao gồm bốn bộ phận chính [11,12]

- Đầu thu sinh học: Có tác dụng phát hiện sự có mặt của các tác nhân sinh học

hoặc các chất cần phân tích

- Tác nhân cố định: Giúp gắn các đầu thu lên trên điện cực

- Bộ phận chuyển đổi tín hiệu: Giúp chuyển đổi các tương tác sinh học thành

các tín hiệu có thể đo đạc được

- Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu: Bộ phận này có tác dụng chuyển thành các tín

hiệu điện để máy tính và các thiết bị khác có thể xử lý

I.1.2.1 Tác nhân cần phát hiện

Tác nhân cần phát hiện được phân loại theo cấu tạo như sau:

- Vi khuẩn: E.coli, vi khuẩn HIV, vi khuẩn bệnh than, vi khuẩn cúm gà, …

- Các phân tử nhỏ: Các phân tử nhỏ mà cảm biến sinh học có thể phát hiện

được là CO, CO2, phân tử gluco, phân tử rượu, ure, thuốc trừ sâu, amino axit, paracetamol, aspirin, penicilin, TNT, các tác nhân thần kinh khác, …

- Các phân tử sinh học có kích thước lớn: Những phân tử này có thể là các

phân tử DNA, RNA, protein, enzyme, các hocmon, …

Hình 1.2 : Sơ đồ cấu tạo của một cảm biến sinh học thông thường

Đầu thu sinh học (Biological Receptor) là bộ phận phản ứng trực tiếp với các tác

nhân cần phát hiện và có nguồn gốc từ các thành phần sinh học Dựa vào các tác

nhân sinh học sử dụng người ta chia ra thành một số loại đầu thu như sau:

- Đầu thu làm từ enzyme: Đầu thu sinh học làm từ enzyme là dạng đầu thu phổ

biến nhất Đó là các đầu thu làm từ các enzyme urease, glucose,

- Đầu thu làm từ các kháng thể / kháng nguyên: Các đầu thu dạng này có đặc

điểm là tính chọn lọc rất cao đồng thời các liên kết được tạo thành khá mạnh

- Đầu thu làm từ protein: Rất nhiều cảm biến có đầu thu sinh học làm từ các protein

như cảm biến phát hiện hocmôn, xác định các chất kích thích thần kinh, Các đầu

thu này có đặc điểm là có tính chọn lọc rất cao Tuy nhiên, chúng có nhược điểm là rất khó cách ly

- Đầu thu làm từ các axit nucleic: Các axit nucleic như DNA, ARN có thể sử

dụng làm đầu thu sinh học Các cảm biến có đầu thu dạng này thường được

sử dụng để phát hiện đột biến và các sai lệch trong cấu trúc di truyền

- Đầu thu kết hợp: Với các đầu thu dạng này, người ta sử dụng đồng thời hai

hay nhiều các phân tử dạng trên (enzyme, kháng thể, protein, ) trên một đế Việc kết hợp này mở rộng khả năng làm việc của các cảm biến sinh học Một

số cảm biến dạng này là cảm biến xác định thuốc nổ TNT, cảm biến xác định

vi khuẩn bệnh than và cảm biến thử thai

- Đầu thu làm từ tế bào: Các đầu thu sinh học không chỉ được làm từ các phân

tử, nguyên tử mà nó còn có thể được làm từ các tế bào Một số tế bào biến đổi gien của vi khuẩn đã được sử dụng làm đầu thu sinh học Khi có mặt các phân tử chất độc, các tế bào này sẽ phát sáng, thông qua đó chúng ta xác định được sự xuất hiện của các phân tử chất độc

Hình 1.3: Một số phần tử được sử dụng làm đầu thu sinh học

I.1.2.3 Tác nhân cố định

Các tác nhân cố định là một phần rất quan trọng trong cảm biến sinh học Các tác nhân này có nhiệm vụ gắn kết các đầu thu sinh học lên trên đế Nói một cách khác đây là bộ phận trung gian có tác dụng liên kết các thành phần sinh học (có nguồn gốc từ cơ thể sống) với thành phần vô cơ Như vậy việc lựa chọn những tác nhân cố định thích hợp cũng là một công việc quan trọng Những tác nhân này vừa phải đảm bảo gắn kết, cố định về mặt cơ học, vừa phải đảm bảo liên kết về mặt tín hiệu giữa bộ phận sinh học và bộ phận chuyển đổi Trên hình 1.4 trình bày cách bắt giữ thành phần sinh học theo phương pháp vật lý và hóa học

Hình 1.4: Các dạng bắt giữ đầu thu sinh học bằng phương pháp vật lý và hoá học I.1.2.4 Bộ phận chuyển đổi

Đây là bộ phận quan trọng trong cảm biến sinh học Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ

- Chuyển đổi điện hoá [13]: Điện thế (potentiometric), dòng điện

(amperometric) và độ dẫn (conductometric)

- Chuyển đổi quang: Hấp thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV, phát xạ huỳnh

quang [15] và lân quang, bio – luminiscence, chemi – luminiscence

- Chuyển đổi nhiệt: Hoạt động dựa trên hiện tượng thay đổi entapi khi hình

thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme Bộ chuyển đổi này có ưu điểm hoạt động tốt với tất cả các loại phản ứng hóa học Tuy nhiên, dạng chuyển đổi này có tính chọn lọc thấp

Hình 1.5: Cảm biến nhận biết lai hóa sử dụng bộ chuyển đổi điện hóa [14]

- Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện piezoelectric [16]: Tinh thể thạch anh sẽ

thay đổi tần số dao động khi có lực tác dụng lên nó Sự thay đổi này tuân

theo phương trình Sauerbrey:

Trong đó, F là tần số dao động ban đầu của tinh thể áp điện, ∆mlà khối lượng

đặt lên tinh thể áp điện, A diện tích hiệu dụng của tinh thể áp điện

Chuyển đổi dạng này có ưu điểm là có độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, quá trình xác định không cần đánh dấu[16, 17]

Có thể sử dụng đo đạc trong môi trường lỏng và khí Trên hình 1.6 trình bày sơ đồ

bộ chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện để phát hiện kháng nguyên

Hình 1.6: Bộ chuyển đổi sử dụng tinh thể áp điện

Chuyển đổi bằng các hệ vi cơ: Cảm biến sinh học sử dụng biến đổi này được gọi

là cảm biến sinh học cantilever (cantilever biosensor) Nguyên lý hoạt động của cảm biến sử dụng chuyển đổi này như sau : chiếu một chùm laser đến bộ phản xạ trên bề mặt một thanh dầm rất mỏng, ánh sáng phản xạ được thu nhận bởi photodetector Thanh mỏng này được chế tạo sao cho chỉ với một lực tác động rất nhỏ cũng làm cho thanh bị uốn cong đi Như vậy tín hiệu phản xạ thu nhận được trên photodetector sẽ bị thay đổi so với trường hợp không có lực tác dụng lên thanh Căn cứ vào sự thay đổi tín hiệu phản xạ này, người ta có thể xác định được lực tác

dụng lên thanh [18, 19]

Hình 1.7: Cảm biến sinh học cantilever

I.1.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học

Dưới đây là một số tiêu chí đánh giá, cũng như các yêu cầu đối với một cảm

biến sinh học:

- Độ chính xác: Độ chính xác thể hiện ở khả năng xác định đúng chất quan

tâm, không bị lẫn lộn với các chất khác Độ chính xác còn được thể hiện ở khả năng định lượng chính xác chất cần phát hiện

- Độ nhạy: Độ nhạy cũng là một tiêu chí khá quan trọng, nó thể hiện lượng

chất nhỏ nhất mà cảm biến có thể phát hiện

- Giới hạn đo: Giới hạn đo là giá trị lớn nhất, nhỏ nhất mà cảm biến có thể đo

được

- Tốc độ hồi đáp: Tốc độ hồi đáp là khả năng phát hiện, định lượng chất cần

phân tích nhanh hay chậm Đây là một trong những tính chất của cảm biến

mà người ta đang tập trung cải tiến

- Khả năng tái sử dụng: Cho đến bây giờ, hầu hết các cảm biến sinh học chỉ

dùng được một lần do khi các tác nhân bắt cặp với đầu thu sinh học, rất khó

để tách các tác nhân này ra và tạo thành đầu thu ‘sạch’ như lúc ban đầu Để khắc phục nhược điểm này người ta đang cố gắng giảm giá thành các sản phẩm dùng một lần và nghiên cứu chế tạo sản phẩm dùng nhiều lần

- Dễ sử dụng và an toàn: Các cảm biến sinh học sẽ được sử dụng phổ biến

ngoài phòng thí nghiệm do đó tiêu chí dễ dàng sử dụng và an toàn cũng rất quan trọng

- Giá thành: Cho đến thời điểm hiện nay, giá thành chế tạo của một cảm biến

sinh học vẫn còn khá cao do chúng thường chỉ sử dụng được một lần Do vậy, tăng cường khả năng tái sử dụng cảm biến biến sinh học là một nhiệm

vụ cấp thiết hàng đầu trong việc giảm giá thành của sản phẩm

I.2 Cảm biến sinh học sử dụng linh kiện QCM

I.2.1 Linh kiện QCM

Năm 1980, Pierre và Jacques Curie đã phát hiện ra hiện tượng: Khi đặt một áp lực lên tinh thể muối Rochell (NaKC4H4O6 4H2O) sẽ phát sinh ra điện áp và ngược lại khi đặt điện áp lên tinh thể thì sẽ gây biến dạng cơ học Phát hiện này là tiền đề của hiệu ứng áp điện Tuy nhiên nó không được quan tâm nhiều cho đến tận 1917 khi người ta phát hiện ra rằng tinh thể Quartz có thể dùng để truyền và nhận sóng siêu âm trong nước

Năm 1921, lần đầu tiên các nhà nghiên cứu chế tạo thành công bộ dao động điều khiển tần số dựa trên tinh thể Quartz loại X - cut Tuy nhiên loại tinh thể này có nhược điểm là khá nhạy cảm với nhiệt độ vì thế hiện nay không còn được sử dụng

nhiều Đến năm 1934 người ta phát hiện ra rằng tinh thể Quartz loại AT - cut ổn định với nhiệt độ Nhờ đặc điểm này mà nó hầu như là lựa chọn hàng đầu để làm QCM Khi đặt điện áp xoay chiều vào tinh thể AT - cut, hai bên điện cực sẽ sinh ra dao động trượt dọc theo bề mặt tinh thể Dao động này sẽ cộng hưởng khi tần số dòng điện bằng tần số dao động riêng của tinh thể Quartz Tất cả các ứng dụng của cảm biến sử dụng linh kiện QCM đều xoay quanh tần số dao động cộng hưởng của nó Linh kiện QCM được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực như: Chế tạo các cảm biến khí, cảm biến mùi và bộ chỉ thị cho quá trình điện hóa, đo chiều dày của màng mỏng tạo thành trong quá trình chế tạo màng Đặc biệt, linh kiện QCM được ứng dụng mạnh mẽ trong việc chế tạo cảm biến sinh học như: Sử dụng để phát hiện virus gây bệnh, phát hiện chuyển gen DNA…vv

I.2.2 Tinh thể Quartz

I.2.2.1 Cấu trúc

Tinh thể Quartz được cấu thành từ hai nguyên tố : Silic và Oxy Trong điều kiện

nhiệt độ phòng, tinh thể Quartz có cấu trúc trigonal (α - Quartz) và có hiệu ứng áp

điện rất mạnh Các ô đơn vị lặp lại tuần hoàn trong không gian Tinh thể Quartz có nhiệt độ chuyển pha là 5730C Khi nhiệt độ lớn hơn 5730C, tinh thể chuyển sang cấu

trúc hexagonal (β-Quartz) và mất đi tính áp điện Mạng tinh thể có các ion Si+ và

O- , chúng được sắp xếp như trình bày trên hình 1.8

Hình 1.8: Cấu trúc của tinh thể α - Quartz trong không gian (a)

và trong mặt phẳng (b)

I.2.2.2 Tính chất áp điện

Nguồn gốc của hiện tượng áp điện xảy ra trong tinh thể α-Quartz là do sự dịch

chuyển của các ion Si+ và O- trong mạng tinh thể khi có biến dạng Khi chưa có ứng suất bên ngoài thì trọng tâm điện tích âm và điện tích dương trùng nhau nên tinh thể có tính trung hòa về điện Khi có ứng suất bên ngoài, ứng suất này sẽ làm cho trọng tâm các điện tích dương và điện tích âm lệch nhau dẫn đến hình thành một momen phân cực điện Sự xuất hiện của moment phân cực điện này sẽ tạo ra điện tích trái dấu giữa 2 mặt tinh thể

Hình 1.9: Cơ chế gây hiện tượng áp điện trong tinh thể α - Quartz

Khi đặt điện áp xoay chiều có tần số thích hợp lên hai mặt tinh thể, tinh thể sẽ dao động với tần số của điện áp và sinh ra một tín hiệu điều hòa, gọi là mode dao động của tinh thể Quartz Mode dao động này phụ thuộc vào cách cắt tinh thể Đối với tinh thể loại AT - cut, dao động tinh thể theo mode trượt (xem hình 1.10) Còn đối với tinh thể X - cut có mode dao động co dãn tinh thể dọc theo hướng đặt điện

áp (xem hình 1.11)

Hình 1.10: Mô tả mode dao động trượt theo bề dày của linh kiện QCM

Hình 1.11: Mô tả một số mode dao động trượt bề dày, mode trượt bề mặt

và mode co giãn

Ngoài ra, tinh thể Quartz còn có mode dao động tổng hợp Loại mode này bao gồm cả các dao động tuần hoàn (cơ bản), các dao động không tuần hoàn và các họa

âm Các mode dao động không tuần hoàn là các mode không mong muốn vì chúng gây

ra hiện tượng dịch tần số khỏi điểm cộng hưởng một khoảng gọi là bước nhảy tần số

I.2.3 Linh kiện vi cân tinh thể thạch anh

Năm 1959, Sauerbrey đã phát hiện ra mối liên hệ giữa sự dịch chuyển tần số cộng hưởng của tinh thể Quartz với sự thay đổi khối lượng trên một đơn vị diện tích

bề mặt của nó Công trình này đã đặt nền móng cho việc chế tạo và sử dụng tinh thể Quartz như linh kiện một vi cân (Quartz Crystal Microbalance - QCM) Để biểu diễn mối liên hệ giữa độ dịch tần số cộng hưởng và biến thiên khối lượng trên bề mặt, Sauerbrey đã đưa ra phương trình [20]:

∆ = − ∆ (1-2) F0 c m F Trong đó, c F là hệ số tỉ lệ ∆m biểu diễn sự biến thiên khối lượng trên một đơn vị

bề mặt diện tích của tinh thể ∆F 0 là độ dịch tần số tương ứng với biến thiên khối lượng Như vậy, dựa vào phương trình này chúng ta có thể xác định được độ tăng khối lượng hấp phụ trên bề mặt của linh kiện QCM

Ngoài ra, trong chất lỏng, độ dịch tần số tỉ lệ với căn bậc 2 của tích mật độ và độ nhớt dung dịch theo phương trình:

Trong đó, η L , ρ L lần lượt là độ nhớt và mật độ chất lỏng; η q , µ qlần lượt là độ nhớt

và modun trượt của tinh thể Quartz Đây chính là cơ sở cho các ứng dụng của QCM trong việc xác định mật độ cũng như độ nhớt của môi trường

Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu tập trung vào ứng dụng QCM đo nồng

độ khí trong môi trường, làm các cảm biến sinh học hoặc sử dụng nghiên cứu tương tác giữa các phân tử bề mặt Ngoài ra, tinh thể Quartz còn nhạy đối với một số thay

đổi khác trên bề mặt tinh thể như áp suất, nhiệt độ và độ nhám bề mặt Lấy gần đúng bậc nhất coi độ dịch tần số bằng tổng độ dịch thành phần do các tác nhân khác nhau, ta có:

0 mass density/viscosity compres onsi roughness temprature

Ảnh hưởng của các thành phần khối lượng, độ nhớt của dung môi, nhiệt độ cũng như độ nhám bề mặt của tinh thể Quartz lên độ dịch tần số cộng hưởng được đánh giá như sau:

(1) Ảnh hưởng của khối lượng chất hấp phụ

Khi một lượng chất hấp phụ lên bề mặt tinh thể Quartz thì lượng chất đó có thể coi như khối lượng cộng thêm vào tinh thể Quartz đồng thời làm tăng chiều dày tinh

thể lên ∆d, dẫn tới làm thay đổi tần số cộng hưởng của QCM một khoảng ∆F 0 theo phương trình (1-2)

(2) Ảnh hưởng của độ nhớt dung môi

Khi tiếp xúc với chất lỏng, tần số của hộp cộng hưởng giảm do độ nhớt và mật

độ chất lỏng gây ra sự tiêu tán năng lượng Tần số cộng hưởng của QCM tỷ lệ nghịch với tích độ nhớt và mật độ chất lỏng tiếp xúc với điện cực:

(1-5) Trong đó:

(3) Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tần số dao động của tinh thể Quartz cũng phụ thuộc nhiệt độ như trình bày trên hình 1.12 Tuy nhiên, sự phụ thuộc này đối với tinh thể Quart loại AT - cut là tương đối nhỏ Trong thực tế, tinh thể loại AT - cut thường có hệ số nhiệt gần như bằng không ở nhiệt độ phòng Trong khoảng nhiệt độ từ 0 ÷ 60oC, sự phụ thuộc F(T) là

rất nhỏ, cỡ 1 - 3Hz/ oC và có thể coi như tuyến tính:

tần số cộng hưởng và khối lượng hấp thụ trên bề mặt tinh thể Quartz vẫn tuân theo

phương trình Sauerbrey (phương trình 1-2) Độ dịch tần số được tính theo công

thức:

(1-7)

Trong đó : h là độ cao trung bình, L là khoảng cách trung bình giữa 2 mô nhám

là một hàm của các tỉ số giữa các thông số a, L, h, δ

(5) Ảnh hưởng của ứng suất

Từ biểu thức c F =2F02/ ρ µq q có thể suy ra tần số của QCM tăng tuyến tính

với áp suất do ảnh hưởng của áp suất tới modun đàn hồi của tinh thể Độ dịch tần do

áp suất P được xác định bằng công thức :

I.2.4 Một số cấu trúc QCM

Tùy theo mục đích sử dụng hiện nay người ta đã chế tạo ra nhiều kiểu cấu trúc

QCM như planar, bi - mesa, plano - convex Cấu trúc QCM thường gặp là cấu trúc

phẳng – planar Hình 1.13 thể hiện các kiểu cấu trúc linh kiện QCM

0

L LF

δ = η πρ

lx Lx

d t

lx Lx

d

Lx

t

lx k

d Lx

t

lx k

d Lx

t

lx k

d t

lx k

d

Hình 1.13: Các kiểu cấu trúc QCM: a) Planar , b) Bi - mesa , c) Plano – convex

I.2.5 Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM

Cảm biến sinh học trên cở sở linh kiện QCM là loại cảm biến có bộ phận chuyển đổi tín hiệu là linh kiện QCM Nguyên tắc hoạt động của cảm biến này dựa trên nguyên lý suy giảm là tần số dao động của linh kiện QCM khi có sự thay đổi khối lượng chất bám trên bề mặt điện cực của linh kiện QCM Mối quan hệ giữa sự thay đổi khối lượng và độ dịch tần số được thể hiện qua phương trình nổi tiếng của Sauerbrey:

F = -2.3×10 6 F 2 ∆m/A (1-9)

Trong đó, F là tần số dao động của linh kiện QCM, ∆mkhối lượng thay đổi trên

linh kiện QCM A là diện tích làm việc của linh kiện QCM

Cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM có một số ưu điểm như: có thể phát hiện được sự thay đổi rất nhỏ về khối lượng (cỡ picogam), khả năng hồi đáp nhanh

và có thể hoạt động trong cả môi trường lỏng và khí Trên hình 1.14 trình bày

a)

b)

c)

nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học sử dụng linh kiện QCM Bằng phương pháp hóa học hoặc vật lý, các thành phần sinh học có thể gắn kết được lên bề mặt điện cực của linh kiện QCM, các thành phần sinh học này sẽ tương tác với các tác nhân cần phát hiện dẫn đến khối lượng chất hấp phụ lên bề mặt của linh kiện QCM thay đổi.Sự thay đổi về khối lượng này sẽ dẫn đến sự suy giảm tần số cộng hưởng của linh kiện QCM [21,22]

Hình 1.14: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học trên cơ sở linh kiện QCM

CHƯƠNG II

CẢM BIẾN SINH HỌC KHÁNG NGUYÊN - KHÁNG THỂ

II.1 Cấu trúc kháng nguyên và kháng thể [23]

II.1.1 Kháng nguyên

II.1.1.1 Khái niệm

Kháng nguyên (antigen) là những vật chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo cơ thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức là một quá trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp những phân tử đặc biệt gọi là kháng thể (dịch thể hay kháng thể tế bào) Tóm lại, kháng nguyên là chất gây ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và phản ứng với các sản phẩm của đáp ứng đó

II.1.1.2 Phân loại kháng nguyên

Căn cứ vào đặc tính và điều kiện kháng nguyên

* Kháng nguyên hoàn toàn (antigen)

Là loại kháng nguyên có đầy đủ hai khả năng là tính kích thích cơ thể sinh kháng thể và sự kết hợp đặc hiệu với kháng thể đó đo chính kháng nguyên ấy kích thích sinh ra Hầu hết các kháng nguyên hoàn toàn có bản chất là protein như các cấu phần của cơ thể động vật, thực vật, vi sinh vật, các chất độc thực vật, các nọc độc động vật

* Kháng nguyên không hoàn toàn (haptoll)

Còn gọi là bán kháng nguyên, là những chất tự bản thân nó không có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể, nhưng có khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng thể

tương ứng.Ví dụ: kháng nguyên thân (O) của vi khuẩn Pneumococcus là chất đa đường polysaccarit, một mình nó không làm sản sinh ra kháng thể, để trở thành một kháng nguyên hoàn toàn trong thân vi khuẩn, bán kháng nguyên polysaccarit kết

hợp với protein (hoặc nucleoproteit), trong đó thành phần đa đường sinh ra phản ứng đặc hiệu, còn thành phần protein làm sinh ra kháng thể đặc hiệu

Căn cứ vào bản chất, cấu trúc

* Kháng nguyên là protein

+ Kháng nguyên là protein động vật : Kháng nguyên là protein động vật là loại có tính kháng nguyên mạnh nhất như huyết thanh của loài này là kháng nguyên mạnh đối với loài khác

+ Kháng nguyên là protein thực vật : Kháng nguyên là protein thực vật là các loại protein chiết xuất từ thực vật cũng có biểu hiện tính kháng nguyên, đặc biệt là protein có trong phấn hoa của một số loài thực vật

+ Kháng nguyên là protein vi khuẩn : Kháng nguyên là protein vi khuẩn: các độc tố

vi khuẩn là protein, vì vậy nó có tính kháng nguyên cao

+ Kháng nguyên là protein capxit của virus : Đây là loại kháng nguyên mạnh, có thể chiết xuất thành kháng nguyên hoà tan Có virus nguyên vẹn cũng là kháng nguyên hoà tan và có thể kích thích cơ thể sinh miễn dịch cao

* Kháng nguyên là gluxit, polysaccrit : Đại đa số gluxit, polysaccarit có tính kháng

nguyên yếu, riêng của vi khuẩn thì có tính kháng nguyên mạnh Các nhóm máu được biểu thị theo các kháng nguyên có trên bề mặt của hồng cầu, chúng là polysaccarit có nhóm A, B, AB và O

* Kháng nguyên lipit : Kháng nguyên lipit tự bản thân không có tính kháng nguyên, chúng chỉ biểu thị tính kháng nguyên khi nằm trong phức hợp lipoproteit

* Kháng nguyên là axit nucleic : Các axit nucleic (ADN, ARN) tự bản thân có tính

kháng nguyên rất yếu và cũng chỉ sau khi liên kết với protein trong phức hợp

nucleoproteit mới biểu thị tính kháng nguyên

II.1.1.3 Tính đặc hiệu của kháng nguyên

Người ta gọi khả năng kết hợp của kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu tương ứng là tính đặc hiệu của kháng nguyên Trong trường hợp đáp ứng miễn dịch dịch thể thì kháng nguyên kết hợp với globulin (kháng thể), còn trong trường hợp đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào thì kháng nguyên liên kết với những receptor xuất hiện ngay trên bề mặt những tế bào lympho T hay gọi là kháng thể tế bào

Kháng nguyên nào thì kháng thể ấy, kháng nguyên gắn với kháng thể như chìa khoá ấn vào ổ khoá, như âm bản với dương bản

Tính đặc hiệu của kháng nguyên không phải do toàn bộ cấu trúc của cả phân tử

kháng nguyên quyết định mà do “nhóm quyết định” của kháng nguyên, đó là những

đoạn nhỏ hoặc một bộ phận nhỏ nằm trên bề mặt phân tử kháng nguyên quyết định Nhóm quyết định kháng nguyên không những quyết định tính đặc hiệu sinh kháng thể tương ứng mà còn là vị trí để kháng thể đó hoặc lympho bào mẫn cảm có thể gắn với kháng nguyên một cách đặc hiệu Nếu kháng nguyên chỉ có một nhóm quyết định thì sẽ kích thích cơ thể sinh ra một loại kháng thể tương ứng và kháng nguyên đó chỉ kết hợp đặc hiệu và duy nhất với kháng thể đó mà thôi Nếu kháng nguyên có nhiều nhóm quyết định thì có nhiều kháng thể tương ứng được sinh ra, nhưng nhóm quyết định nào thì kết hợp đặc hiệu với kháng thể tương ứng với nhóm

đó mà thôi Có bao nhiêu nhóm quyết định kháng nguyên thì có bấy nhiêu loại kháng thể và kết hợp đặc hiệu độc lập với nhau

II.1.1.4 Quyết định kháng nguyên

Bất kỳ một polypeptide hay protein phức hợp nào có hoạt tính sinh học cao đều

có cấu trúc phức tạp, thông thường chúng có cấu trúc gấp khúc, mà người ta thường

gọi là cấu trúc không gian ba chiều (threedimensional protein = 3-D protein)

Những vùng lồi lõm nằm trên protein chịu trách nhiệm về tính kháng nguyên, được gọi là điểm quyết định kháng nguyên (antigendeterminant) hay còn gọi là

epitope Mỗi một protein kháng nguyên có thể có 1 epitope hoặc nhiều epitope

khác nhau

Thông thường các protein được coi là kháng nguyên đều có khả năng kích thích sinh kháng thể Chúng ta cần phân biệt 2 khái niệm về loại kháng thể: kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng

- Kháng thể đa dòng: là kháng thể do nhiều epitope kháng nguyên kích thích

sinh ra, do vậy chúng có khả năng kết hợp với nhiều epitope trong phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể

- Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody = Mab) : là do duy nhất một epitope

kích thích sinh ra và chỉ kết hợp duy nhất với epitope đó

II.1.2 Kháng thể

II.1.2.1 Khái niệm

Globulin hay kháng thể là các protein có trong huyết thanh hoặc dịch sinh học của cơ thể (nước tiểu, sữa ) có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh

ra nó Kháng thể theo đinh nghĩa trên đây được gọi kháng thể đặc hiệu

Bản chất của kháng thể là protein, nên các tác nhân hóa, lý như axít, kiềm nhiệt

độ đều có thể phá huỷ kháng thể Hoạt tính của kháng thể phụ thuộc vào pH của môi trường và nhiều yếu tố khác Amone sulfat, natri sulfat, cồn ở 4°C có thể làm kết tủa kháng thể nhưng không làm mất hoạt tính của chúng, do đó người ta lợi dụng tính chất này để tinh chế kháng thể

Hai đặc tính sinh học quan trọng của kháng thể là khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên và khả năng biểu hiện như một kháng nguyên, tức là kích thích sinh kháng thể chống lại chính nó Kháng thể chống lại kháng thể gọi là kháng kháng thể Có thể tạo kháng thể chống từng loại Ig hoặc chống từng phần cấu trúc của phân tử Ig (mảnh Fab hoặc Fc)

II.1.2.2 Đặc tính của kháng thể

Có tính đặc hiệu với kháng nguyên rất cao, mỗi loại kháng thể chỉ kết hợp đặc hiệu duy nhất với loại kháng nguyên đã sinh ra chúng, ví dụ: Kháng thể chống độc

tố uốn ván chỉ kết hợp với độc tố uốn ván, không kết hợp với độc tố bạch hầu

Phần đặc hiệu có khả năng liên kết với kháng nguyên được gọi là “trung tâm hoạt động” của kháng thể Kháng thể có bao nhiêu “trung tâm hoạt động” thì có bấy

nhiêu hoá trị, thông thường có hai hoá trị như phân tử lớn, nhưng cũng có thể kháng thể có đa hoá trị

Kháng thể có bản chất là protein, nên kháng thể dễ bị cồn, nhiệt độ hoá chất,

axit, kiềm, các loại men phá huỷ

II.1.2.3 Các loại kháng thể đặc hiệu

Chiếm khoảng 75 - 80% tổng số globulin của cơ thể, phần lớn kháng thể lưu động thuộc lớp IgG Hoạt tính của IgG rất cao so với các lớp khác, có phân tử lượng 160.000, là kháng thể có hai hoá trị: tức là có khả năng kết hợp với hai phân tử kháng nguyên tương ứng - IgG có cấu trúc gồm hai chuỗi nhẹ lamda (γ hoặc kappa (K) và hai chuỗi nặng gamma (γ) IgG có 4 lớp phụ là: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, các lớp phụ này có hoạt tính sinh học khác nhau chút ít

Hình 2.2: Vị trí của các điểm chức năng trên phân tử IgG

II.1.2.3.2 Lớp IgM

Chiếm khoảng 5-10% globulin miễn dịch của cơ thể, IgM là globulin miễn dịch lớn nhất, có phân tử lượng từ 800.000 - 1.000.000 Da (Dalton), IgM có cấu trúc gần giống ngôi sao năm cánh, gồm 10 chuỗi nhẹ lamda hoặc kappa và 10 chuỗi nặng (µ) Hoạt tính của IgM mãnh liệt hơn IgG hàng chục đến hàng trăm lần nhưng thời gian tồn tại của IgM rất ngắn chỉ vài ba ngày

II.1.2.3.3 Lớp IgA

Có hai lớp: IgA trong huyết thanh và IgA tiết tại chỗ

- IgA trong huyết thanh: Có phân tử lượng 150.000 Da, cấu trúc gồm 5 chuỗi lamda (γ) hoặc kappa (K) và hai chuỗi nặng alpha (α)

- IgA tiết tại chỗ: Có trong nước bọt, nước mắt, trong các dịch tiết ở mũi, phế quản, ở ruột, ngoài ra có trong nước tiểu và sữa IgA tiết là sản phẩm của các

tế bào plasma có trong niêm mạc của các cơ quan nói trên tiết ra, do vậy gọi

là IgA tiết tại chỗ

II.1.2.3.4 Lớp IgD

Chiếm hàm lượng rất thấp trong huyết thanh miễn dịch (dưới 0.3%), là loại dễ bị biến chất, chịu được nhiệt, bị phân huỷ bởi enzym và các môi trường axit, kiềm Có phân tử lượng 170.000 - 200.000 Da, gồm hai chuỗi nhẹ lamda hoặc kappa và hai chuỗi nặng delta (δ) Chức năng sinh học của IgD còn biết rất ít, có lẽ IgD có vai trò

cụ thể cho kháng nguyên vì nó gắn trên bề mặt lympho B để tạo điểm thụ thể giữa lympho B và kháng nguyên tương ứng

II.1.2.3.5 Lớp IgE

Chiếm tỷ lệ rất thấp, gồm hai chuỗi nhẹ lamda hoặc kappa và hai chuỗi nặng epsilon (ε), trọng lượng phân tử là 180.000 Da, IgE bị diệt ở nhiệt độ 560C trong khoảng 30 phút Nói chung IgE là nguyên nhân của miễn dịch bệnh lý, là kháng thể đặc hiệu không có lợi cho cơ thể

II.1.2.4 Cấu trúc kháng thể

Ở đây chúng ta tìm hiểu cấu trúc của IgG là loại kháng thể thường thấy trong huyết thanh Cấu trúc của IgG gồm 4 chuỗi polypeptit liên kết chặt chẽ với nhau, trong đó có hai chuỗi nhẹ L (Light) và hai chuỗi nặng H (Heavy) Giữa các chuỗi được nối với nhau bằng cầu nối disunfua (-S-S-)

Hình 2.3: Sơ đồ cấu trúc phân tử kháng thể

II.1.2.4.1 Chuỗi nhẹ L(Light)

Mỗi chuỗi nhẹ có 214 axit amin tính từ đoạn tận cùng là nhóm -NH2, việc xác định trình tự các axit quan này làm thay đổi trong cấu trúc của globulin và được chia thành hai vùng bằng nhau:

* Vùng thay đối V L (variable region)

Vùng thay đổi VL có đầu tận cùng bằng nhóm -NH2 : từ axit amin đầu tiên tiến đến axit amin thứ 107 có thể sắp xếp trình tự khác nhau, vì vậy vùng này gọi là vùng thay đổi, ký hiệu là VL (variable region) Trong vùng thay đổi chỉ có một số

đoạn có trình tự sắp xếp các axit amin bị biến đổi, trong đó có một số đoạn có sự

biến đổi mạnh hơn được gọi là “vùng siêu biến” hay “vùng cực kỳ thay đổi” (Hypervariable region)

* Vùng hằng định C L (Constant region)

Vùng hằng định CL có tận cùng là nhóm–COOH: từ axit amin thứ 108 đến axit amin thứ 214, trình tự sắp xếp các axit amin ở vùng này ít thay đổi vì vậy gọi đó là vùng hằng định CL (constant region)

II.1.2.4.2 Chuỗi nặng H (Heavy)

Mỗi chuối nặng H có khoảng 440-446 axit amin và cũng chia ra làm hai vùng:

* Vùng thay đối V H (variable region)

Vùng thay đổi VH cũng giống như vùng thay đổi của chuỗi nhẹ, ký hiệu là VH(Variable region) có khoảng 16 axit amin, cũng có những khu vực cực kỳ thay đổi ở đầu tận cùng là nhóm -NH2

* Vùng hằng định C H (constant region)

Vùng hằng định CH có khoảng 330 axit amin đầu tận cùng là nhóm - COOH, ký hiệu là CH (Constant region) Vùng CH được chia thành ba vùng có khoảng xấp xỉ

110 axit amin lần lượt được ký hiệu là CH1, CH2, CH3 (hình 2.4)

Hình 2.4: Sơ đồ cấu tạo của phân tử IgG

II.1.2.5 Chức năng của kháng thể

Sự kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên là một trong những chức năng chính của kháng thể Chức năng của kháng thể liên quan chặt chẽ với cấu trúc, do cấu trúc quy định

Đoạn Fab: Có chức năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên, làm bất hoạt nó,

mà các kết quả lý hóa đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều kỹ thuật miễn dịch

Đoạn Fc: Nối 2 đoạn Fab với nhau, có chức năng kết hợp với các thụ thể trên bề mặt tế bào (hoặc phân tử), khởi động các cơ chế hoạt hóa: Bạch cầu, bổ thể Như vậy kháng thể có chức năng hoạt hóa hệ miễn dịch không đặc hiệu

Fab và Fc không hoạt động riêng rẽ, mà có sự quan hệ phối hợp rất chặt chẽ

Ví dụ: Khi Fab tách khỏi Fc bằng enzyme thì nó vẫn kết hợp được với kháng nguyên, nhưng sẽ không gây được kết tủa, ngưng kết

Tóm lại, các kháng thể có chức năng bất hoạt một cách đặc hiệu kháng nguyên, đồng thời hoạt hóa các cơ chế miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể, kết hợp chặt chẽ miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu

II.1.2.6 Kháng thể đơn dòng (Monoclonal Antibody)

Kháng thể đơn “clon” hay kháng thể đơn dòng mới được nói đến trong những năm gần đây, nhưng thực sự nó có ý nghĩa quan trọng trong các nghiên cứu và ứng dụng Khi đưa một hỗn hợp gồm n loại kháng nguyên vào cơ thể thì sẽ có n loại kháng thể được sinh ra Để có được kháng thể đơn đặc hiệu (tức là kháng thể chỉ chống lại một loại kháng nguyên) người ta phải dùng phương pháp hấp thu, tách chiết kháng thể không cần thiết hoặc làm tinh khiết kháng nguyên Kháng thể này tuy nói là đơn đặc hiệu nhưng thực chất đó vẫn là một hợp chất gồm nhiều kháng thể hợp lại, mà

mỗi một kháng thể chống lại một loại quyết định kháng nguyên có trong phân tử kháng nguyên Phương pháp sản xuất này tốn kém, phức tạp và thường dùng động vật để điều chế huyết thanh

Theo thuyết chọn lọc “clon” thì mỗi lympho bào trong cơ thể có khả năng nhận

diện một loại “quyết định kháng nguyên” và mỗi một loại “quyết định kháng nguyên” sau khi nhận diện đều có thẩm quyền kích thích lympho bào này tăng sinh

và biệt hoá thành một đơn lympho bào có khả năng sinh ra kháng thể chống lại quyết định kháng nguyên tương ứng (hay kháng thể đơn đặc hiệu tương ứng) Như vậy kháng thể đơn dòng là một loại kháng thể do một “clon” lympho bào sản xuất

và tiết ra để chống lại một loại quyết định kháng nguyên nhất định Kỹ thuật này được Milstein và Kohler đưa ra 1975 và được ứng dụng để sản xuất các kháng thể đơn dòng ở ngoài cơ thể bằng kỹ thuật liên hợp tế bào myeloma với tế bào lympho

B hoạt hoá của chuột

II.2 Phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể

II.2.1 Khái niệm

Khi cho tiếp xúc giữa kháng thể đặc hiệu (kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào) với kháng nguyên đã kích thích sinh ra chúng thì phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra một cách đặc hiệu Phản ứng kết hợp này có thể xảy ra

“invivo”(trong cơ thể sống) hoặc “invitro”(trong ống nghiệm)

II.2.2 Cơ chế kết hợp kháng nguyên-kháng thể

Sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể dịch thể đặc hiệu nhờ vào các lực liên kết

lý hóa sau:

- Lực liên kết các phân tử với nhau hay còn gọi là lực liên kết Wander – Wals:

do sự chuyển động của các điện tử làm cho phân tử trở thành có cực, và hút phân tử bên cạnh nếu tiếp cận với lực khác dấu của phân tử này

- Lực hút tĩnh điện giữa các nhóm chức khác nhau Ví dụ giữa nhóm amin và nhóm carboxyl

- Lực liên kết nhẹ giữa các cầu nối hydro với nhau: Tạo ra giữa nguyên tử H+ (trên phân tử kháng nguyên hoặc kháng thể) với O2-, hoặc N3-, thực chất đây cũng là lực hút tĩnh điện

- Lực kỵ nước: Khi 2 nhóm kỵ nước nằm đủ gần, thì chúng sẽ liên kết với nhau sau khi loại trừ các phân tử nước giữa chúng Lực này chi phối 50% lực liên kết kháng nguyên - kháng thể nói chung

Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể không phải là một phản ứng hóa học hoàn toàn, nên người ta có thể tách trở lại các thành phần kháng nguyên và kháng thể

Hình 2.5: Liên kết kháng nguyên- kháng thể

II.2.2.1 Các phản ứng kháng nguyên - kháng thể

II.2.2.1.1 Phản ứng ngưng kết (Agglutination test)

Đây là phản ứng với các kháng nguyên hữu hình (ví dụ như xác vi khuẩn) Khi gặp kháng thể đặc hiệu, các kháng nguyên sẽ kết lại với nhau thành đám lớn mà mắt thường có thể quan sát được Đó là hiện tượng ngưng kết trực tiếp

Khi cho kháng nguyên hữu hình trộn với kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì các

vi khuẩn sẽ kết lại với nhau qua cầu nối kháng thể đặc hiệu Do mỗi cầu nối với các kháng nguyên dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên những đám ngưng kết biểu hiện bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn những hạt cát hoặc những cụm bông lơ lửng

Hình 2.6: Phản ứng ngưng kết

A - Không xẩy ra khi cả 2 vị trí của IgG đều gắn vào một xác vi khuẩn

B - Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các xác vi khuẩn

C - Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM

II.2.2.1.2 Phản ứng kết tủa (Precipitation test)

Nguyên lý: Giống phản ứng ngưng kết, chỉ khác là kháng nguyên trong phản ứng này là kháng nguyên hòa tan được trộn với kháng thể dịch thể tương ứng, cũng

là chất hòa tan trong huyết thanh

Nếu thiếu hoặc thừa một trong 2 thành phần này thì sự kết tủa khó xảy ra, sự kết tủa biểu hiện bằng chất cặn màu sáng trắng dễ quan sát được

Phản ứng kết tủa cũng cần có một số điều kiện như: nhiệt độ, pH, các ion môi trường điện giải

II.2.3 Ứng dụng cảm biến sinh học kháng nguyên - kháng thể

Các kỹ thuật dùng trong chẩn đoán vi sinh vật hiện nay hầu hết thuộc các phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể Trong chẩn đoán trực tiếp, sau khi vi sinh vật đã dược nuôi cấy phân lập, người ta dùng kháng huyết thanh mẫu (huyết thanh chứa loại kháng thể đã biết) để xác định loại vi sinh vật gây bệnh Trong chẩn đoán gián tiếp, người ta xác định kháng thể đặc hiệu có trong dịch thể của động vật nghi mắc bệnh, thường kháng thể có trong huyết thanh nhờ các kháng nguyên mẫu (là vi sinh vật đã biết được nuôi cấy thuần khiết)

Phản ứng ELISA

Trong rất nhiều phương pháp xét nghiệm dựa trên tương tác kháng nguyên – kháng thể đang được áp dụng thì phương pháp dựa trên phản ứng ELISA là phổ biến nhất

Nguyên lý: Dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzym, rồi cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên, sau đó cho cơ chất vào, cơ chất sẽ kết hợp

với enzym đã gắn tạo nên mầu và khi soi màu trong quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng

Phản ứng ELISA trực tiếp : Dùng để phát hiện kháng nguyên

Cố định kháng thể đặc hiệu lên phiến chất dẻo, rửa nước để loại bỏ kháng thể không gắn kết Cho dung dịch bệnh phẩm, chất chiết suất thành dung dịch hoà tan (kháng nguyên cần chẩn đoán) Nếu có kháng nguyên tương ứng chúng sẽ gắn với kháng thể đặc hiệu Rửa nước để loại bỏ các thành phần thừa Cho kháng kháng thể

đã gắn enzym vào Nếu trong bước hai đã có xảy ra kháng nguyên với kháng thể đặc hiệu thì trong bước này sẽ xảy ra kết hợp lần thứ hai của kháng nguyên với kháng thể đánh dấu bằng enzym, bởi vì kháng nguyên này là loại phân tử có nhiều quyết định kháng nguyên (ít nhất là hai quyết định kháng nguyên) một quyết định

đã gắn với kháng thể đặc hiệu trong bước hai, quyết định còn lại sẽ gắn với kháng kháng thể đã được đánh dấu enzym, rửa nước để loại bỏ kháng kháng thể đánh dấu thừa Tiếp tục cho thêm vào đó cơ chất tương ứng với enzym

Phản ứng ELISA gián tiếp: Dùng để phát hiện kháng thể

Gắn kháng nguyên đã biết lên tiêu bản phiến chất dẻo, rửa nước để loại bỏ kháng nguyên thừa Cho huyết thanh cần chẩn đoán lên (có thể có hay không có kháng thể cần tìm)

Nếu có kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì sẽ có kết hợp kháng nguyên với kháng thể, rửa nước để loại bỏ các chất thừa Cho kháng kháng thể tương ứng

đã gắn enzym vào Nếu đã có kết hợp kháng nguyên kháng thể rồi thì sẽ tiếp tục có kết hợp kháng nguyên với kháng thể và kháng kháng thể (có gắn enzym) và khi rửa nước sẽ không bị trôi đi Cho cơ chất tương ứng với enzym vào, enzym sẽ phân huỷ

cơ chất thành sản phẩm có màu và sau đó dùng quang phổ kế để định lượng phản ứng Trong trường hợp huyết thanh không có kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì sẽ không xảy ra kết hợp kháng nguyên - kháng thể ở bước hai, do đó mà khi cho kháng kháng thể vào cũng không có kết hợp nên khi rửa nước bị trôi đi và khi cho cơ chất vào thì không có enzym để phân huỷ nên không có màu sắc, phản ứng âm tính

II.3 Một số phương pháp phát hiện bệnh ung thư hiện nay

II.3.1 Ung thư tiền liệt tuyến

II.3.1.1 Ung thư tiền liệt tuyến với sức khỏe con người [39]

Ung thư tuyến tiền liệt (UTTTL) là loại ung thư (UT) phổ biến nhất tại Mỹ Mặc

dù tỷ lệ tử vong của bệnh từng bước được cải thiện nhờ các tiến bộ trong chẩn đoán sớm và điều trị nhưng UTTTL vẫn là nguyên nhân gây chết thứ 2 trong số các bệnh ung thư ở nam giới Bệnh có xu hướng ngày càng gia tăng Ước tính tại Mỹ vào