Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của một số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae ở Việt Nam

Các hợp chất đã được phân lập từ một số loài Ardisia có cấu trúc phong phú, bao gồm các tritecpen saponin, benzoquinon,bisbenzoquinon, flavonoid, isoflavonoid, steroid, alkylphenolic, cá

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR Proton Magnetic Resonance

spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhânproton

13C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic

Resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhâncacbon 13

DEPT Distortionless Enhancement

COSY Corrrlated Spectroscopy Phổ COSY

NOESY Nuclear Overhauser Effect

DMSO Dimethyl sulfoxide

Nồng độ gây tác động sinhhọc cho 50% đối tượng thửnghiệm

IC50 Inhibitory Concentration at

50%

Nồng độ ức chế 50% đốitượng thử nghiệm

KB Human epidemic carcinoma Ung thư biểu mô

LU-1 Human lung carcinoma Ung thư phổi

MCF7 Human breast carcinoma Ung thư vú

Hep- G2 Hepatocellular carcinoma Ung thư gan

LNCaP Hormone dependent human

prostate carcinoma

Ung thư tuyến tiền liệt

δH Proton chemical shift Độ dịch chuyển hóa học của

δC Carbon chemical shift Độ dịch chuyển hóa học của

carbon

s: Singlet d: Doublet t: Triplet q: Quartet

m: Multiplet dd: double doublet DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh cây A balansana 13

Hình 1.2: Hình ảnh cây A splendens 14

Hình 1.3: Hình ảnh cây A insularis 15

Hình 1.4: Hình ảnh cây A Incarnata 16

Hình 2.3: Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết n-hexan và etyl axetat của cây cơm nguội rạng 49

Hình 2.4: Sơ đồ phân lập chất từ cặn nước của cây cơm nguội rạng 50

Hình 2.5:Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết etyl axetat của cây cơm nguội đảo 56

Hình 2.6: Sơ đồ phân lập chất từ cặn nước của cây cơm nguội đảo 57

Hình 2.7: Sơ đồ phân lập chất từ cặn nước của cây cơm nguội thắm 63

Hình 2.8: Sơ đồ phân lập chất từ cặn chiết etyl axetat của cây cơm nguội thắm 64

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất AB-1 69

Hình 3.2: Cấu trúc hóa học của hợp chất AB-2 71

Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất AB-3 72

Hình 3.4: Cấu trúc hóa học của hợp chất AB-4 73

Hình 3.5: Cấu trúc hóa học của hợp chất AB-5 75

Hình 3.6: Cấu trúc hóa học của hợp chất AB-6 78

Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của hợp chất AS-1 79

Hình 3.9: Phổ HMBC của hợp chất AS-1 80

Hình 3.11: Phổ COSY của hợp chất AS-1 81

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất AS-1 83

Hình 3.13: Cấu trúc hóa học của các hợp chất 2, 3, 4, 5, 6, AS-7 84

Hình 3.14: Cấu trúc hóa học của các hợp chất AS-8, AS-9, AS-10, AS-11, AS-12 .88

Hình 3.15: Phổ 1H-NMR của hợp chất AI-1 92

Hình 3.16: Phổ 13C-NMR của hợp chất AI-1 93

Hình 3.18: Phổ HMBC của hợp chất AI-1 94

Hình 3.20: Phổ ROESY của hợp chất AI-1 96

Hình 3.22: Cấu trúc hóa học của hợp chất AI-1 99

Hình 3.23: Các tương tác HMBC và COSY của hợp chất AI-1 99

Hình 3.24: Cấu trúc hóa học của các hợp chất AI-2, AI-3, AI-4, AI-5 101

Hình 3.25: Cấu trúc hóa học của các hợp chất 6, 7, 8, 9, 10, AI-11 106

Hình 3.26: Cấu trúc hóa học của các hợp chất AI-12, AI-13, AI-14 108

Hình 3.27: Cấu trúc hóa học của các hợp chất AInc-1, AInc-2, AInc-3, AInc-4, AInc-5, AInc-6, AInc-7, AInc-8 110

MỞ ĐẦU

Tài nguyên sinh vật trên thế giới rất phong phú và đa dạng Đến nay conngười đã nhận biết và gọi tên được hơn một triệu loài sinh vật khác nhau ViệtNam là một nước nhiệt đới gió mùa, đa dạng về địa hình, thổ nhưỡng và đặc trưngkhí hậu khác nhau giữa các vùng miền nên là điều kiện thuận lợi để các loài sinhvật phát triển đa dạng về số lượng các loài, phong phú về chủng loại Trong đó cónhiều thực vật có công dụng được sử dụng làm thuốc trong dân gian Tổng kết cáccông bố về hệ thực vật Việt Nam, đã ghi nhận có 15.986 loài thực vật khác nhau.Trong đó có 4.528 loài thực vật bậc thấp và 11.458 loài thực vật bậc cao, có 10%

số loài thực vật là đặc hữu, hơn 3.200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc

Họ Đơn nem (Myrsinaceae) là một họ thực vật khá lớn, bao gồm 35 chi vàkhoảng 1400 loài, được phân bố rộng rãi khắp nơi, nhất là ở các nước có khí hậu

ôn đới và nhiệt đới, trong đó chi Cơm nguội (Ardisia) là chi lớn nhất, có khoảng

500 loài [1] Kết quả nghiên cứu tài liệu cho thấy các loài Ardisia có nhiều hoạt

tính sinh học rất đáng quý, như: hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, kháng virut,hoạt tính chống oxi hóa, chống lao, antileishmania, chống đái tháo đường, bảo vệthần kinh, bảo vệ tim mạch, chống loãng xương và đặc biệt là hoạt tính gây độc tế

bào, chống ung thư rất tốt Các hợp chất đã được phân lập từ một số loài Ardisia

có cấu trúc phong phú, bao gồm các tritecpen saponin, benzoquinon,bisbenzoquinon, flavonoid, isoflavonoid, steroid, alkylphenolic, các dẫn xuất củabergenin, các dẫn xuất của resorcinol…, trong đó có nhiều chất có cấu trúc mới

Ở Việt Nam, họ Đơn nem có khoảng 140 loài và được phân thành 6 chi, gồm

có: Ardisia, Embelia, Maesa, Aegyceras, Rapanea và Myrsine, phân bố rộng rãi ở

khắp nơi trên toàn quốc, nhất là ở các vùng đồng bằng trung du Chi lớn nhất trong

họ này là Ardisia có khoảng 98 loài [2] Nghiên cứu về các loài thực vật này hầu

như chưa có ở Việt Nam, chúng chỉ mới được sử dụng trong phạm vi dân gian để

chữa bệnh Các loài trong chi Ardisia thường có tác dụng thanh nhiệt giải độc, tiêu

thũng và được sử dụng trong dân gian để chữa các bệnh viêm khớp, đòn ngã tổnthương, sưng đau hầu họng, trị ỉa chảy, lậu, sốt rét, viêm ruột, loét dạ dày, mụnnhọt ghẻ lở và trị các bệnh về gan [3, 4] Do đó, với mong muốn tìm kiếm các hoạtchất ứng dụng trong Y-Dược từ nguồn dược liệu Việt Nam, chúng tôi đã chọn các

thực vật chi Cơm nguội (Ardisia) họ Đơn nem (Myrsinaceae) làm đối tượng

nghiên cứu cho đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học

của một số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae ở Việt Nam”.

Mục đích của đề tài:

1 Phân lập các hợp chất từ các bộ phân khác nhau của một số loài Ardisia thu hái

ở Việt Nam

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chât phân lập được dựa vào các phương pháp phổ hiện đại.

3 Thăm dò hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại họ Đơn nem (Myrsinaceae) và chi

Ardisia ở Việt Nam

1.1.1 Họ Đơn nem (Myrsinaceae)

Họ Đơn nem là một họ lớn, trên thế giới có khoảng 35 chi và hơn 1400 loài,phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của hai bán cầu như Ấn Độ,Mianma, Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Lào, Campuchia, Thái Lan,Malaysia, Philippin, New Zealand, Australia, Nam Phi, Nam Mỹ Hệ thực vật trong

họ này chủ yếu là cây và những khóm cây bụi, đôi khi là những dạng leo bám Tuy là

1 họ rộng song trong họ này chủ yếu là các chi: Ardisia, Embelia, Maesa,

Aegyceras, Rapanea và Myrsine Một số chi được sử dụng như cây trồng, đôi khi

lại là cây trang trí, một số trong số đó còn được xếp vào hàng cây thuốc quý sửdụng trong dân gian đã được báo cáo trong dược điển cây thuốc ở một số nướctrong việc diệt giun sán, tiêu diệt vi khuẩn… [64].

Họ Đơn nem là một trong những họ rất dễ nhận biết ngoài thiên nhiên, bởichúng mọc phổ biến dưới tán rừng, ven đường đi, một số loài gặp ở vùng đồi núi.Chúng có dạng cây gỗ nhỏ hoặc bụi phân nhánh, thường cao khoảng 1-2 m, có khicao 6-12 m, một số loài cao 7-50 cm hoặc bụi không phân nhánh, rất ít khi cây

thảo, riêng chi Chua ngót (Embelia) có dạng bụi leo Lá đơn mọc cách, không có

lá kèm, mép nguyên hoặc khía răng Hoa tập trung ở đầu cành hoặc ở nách lá tạothành cụm hoa hình chùm, tán hoặc ngù Tất cả các bộ phận của cây từ các bộphận dinh dưỡng như lá đến các bộ phận sinh sản như các thành phần của hoa hầuhết đều có điểm tuyến hoặc dưới dạng đường gân rõ nhất là ở chi Đơn nem

(Mease) hoặc ở quả như chi Cơm nguội (Ardisia) Hoa phần lớn mẫu 4-5, ít khi

mẫu 6 Bầu thượng hoặc trung gặp ở chi Đơn nem Quả hạch, hình cầu, một hạt

hoặc quả hạch nhiều hạt và hạt có cạnh (Mease) Tuy nhiên họ Đơn nem rất dễ

nhận biết các chi, nhưng khó khăn về phân biệt thành phân loài nhất là chi Cơmnguội là chi lớn nhất (khoảng 101 loài ở Việt Nam) có những loài nhìn bằng mắtthường rất giống nhau, cho nên sự có mặt của điểm tuyến, hình dạng và vị trí cụmhoa, cách sắp xếp lá đài là đặc điểm rất quan trọng để phân biệt các loài trong chiCơm nguội [4]

1.1.2 Chi Ardisia (Cơm nguội)

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chung của chi Ardisia

Ardisia là một chi lớn thuộc họ Myrsinaceae, chi lớn trên thế giới có

khoảng 500 loài, phân bố phần lớn ở vùng nhiệt đới châu Mỹ, châu Á, số ít ở châu

Úc, các đảo Thái Bình Dương Số lượng tuyệt đối của loài trong chi này, thêm sựthiếu chính xác trong việc cập nhật số lượng loài đã phần nào gây ra những khókhăn nhất định trong việc xác định mức độ loài trong chi này Chi này được biết

đến như các vị thuốc dùng trong dân gian từ xa xưa, sử dụng lá, thân rễ, cành, đôikhi là quả [25].

Ở Việt Nam chi Ardisia có khoảng 101 loài Đặc điểm thực vật chung, cây

nhỏ, bụi hoặc nửa bụi gần với dạng cây thảo Lá đơn, mọc cách, ít khi mọc đốihoặc gần mọc vòng, phiến lá thường có điểm tuyến, mép nguyên hoặc khía răngcưa tròn, giữa các răng có điểm tuyến, hoặc khía răng cưa nhỏ và nhiều Cụm hoahình chùm, xim, tán, ngù ở đầu cành, nách lá hoặc ngoài nách lá Hoa lưỡng tính,thường mẫu 5, ít khi mẫu 4 Lá bắc nhỏ và sớm rụng Lá đài thường hợp ở gốc, ítkhi rời, xếp van hay xếp lợp, thường có điểm tuyến Cánh hoa hơi hợp ở gốc, ít khihợp đến 1/2 chiều dài, xếp vặn về phía phải, thường có điểm tuyến Nhị đính ởgốc ống tràng (hoặc đính ở giữa); chỉ nhị ngắn hơn cánh hoa, ít khi dài bằng hoặcdài hơn; bao phấn hai ô, mở dọc, ít khi mở lỗ, trung đới thường có điểm tuyến.Bầu thường hình cầu hoặc hình trứng; vòi nhị, chỉ nhị thường ngắn hơn cánh hoa;núm hình chấm; noãn 3-12 hoặc nhiều hơn, xếp thành một vòng đến nhiều vòng.Quả mọng dạng quả hạch, hình cầu hoặc hình cầu dẹt, thường có màu hồng, cóđiểm tuyến, có lúc có gân tuyến Hạt hình cầu, lõm ở gốc, hạt bao phủ bởi một cáimàng còn lại của giá noãn; nội nhủ sừng, phôi hình trụ mọc ngang hoặc thẳng [2,4]

1.1.2.2. Đặc điểm thực vật một số loài Ardisia nghiên cứu

1.1.2.2.1 Ardisia balansana – Cơm nguội balansa

Loài A.balansana được Yang miêu tả khoa học lần đầu năm 1989 Là loại cây

bụi nhỏ, có thân dễ bò, thân đứng thẳng cao 25-50(100) cm, có vảy hình khiêntròn Lá mọc cách hoặc gần như vòng, phiến hình mác ngược hoặc trứng ngượchẹp, 8-20(26)x3-5,5(8) cm, dai, chóp lá tù, gốc hẹp từ từ và thành hình nêm, mặttrên màu đen, nhẵn, trừ gân chính có lông, mép lá khía răng cưa nhỏ mịn, khôngđều; gân bên khoảng 8-12 đôi; cuống lá có cánh Cụm hoa chùy ở nách lá, dài 6-7(11) cm; cuống hoa dài 3-7 mm, đạt đến 1cm khi mang quả Lá đài 5, hình tamgiác hoặc trứng, có lông nhỏ và điểm tuyến Cánh hoa 5, màu trắng sau trở thành

hồng nhạt; dài 3-4 mm, có điểm tuyến Nhị 5, dài gần bằng cánh hoa, bao phấn cóđiểm tuyến ở lưng Bầu có lông; vòi ngắn hơn cánh hoa; noãn 4-5, 1 vòng Quảhình cầu, khi chín màu đỏ, đường kính 6-8 mm, có tuyến dọc, có lông, sau nhẵn[2, 4].

Phân bố: cây mọc ở rừng dày thường xanh lá rộng, khe đá, nơi ẩm ướt, bờ suối, ở

độ cao 1000-1500 m Phân bố chủ yếu ở miền bắc Việt Nam, Vân Nam (TrungQuốc) [2]

Mẫu nghiên cứu được thu tại Mẫu Sơn – Lạng Sơn – Việt Nam:

Hình 1.1: Hình ảnh cây A balansana

1.1.2.2.2 Ardisia splendens – Cơm nguội rạng

Ardisia splendens được Pitard miêu tả khoa học lần đầu năm 1930 Là loại cây

bụi, cao khoảng 1-1,2 m Thân non tròn, mảnh, vỏ màu xám, có đường khía dọc

Lá hình mác ngược hẹp, 8-15x1,5-4 cm, chóp lá nhọn hoặc tù, giảm dần dài vàmen xuống cuống, mép cuộn xuống phía dưới; gân bên 8-12 đôi, hướng lên, gâncấp III không rõ; cuống dài 5-8 mm, dẹp và có rãnh ở mặt trên Cụm hoa hìnhchùm dạng gần ngù tán ở đầu cành, dài 8-18 cm, trục thứ cấp dài 1-2 cm, mang ởđầu nhiều hoa, xếp thành tán hoặc ngù; cuống hoa dài 5-8 mm, khi ra quả đạt đến

10 mm Lá đài 5, hình tam giác, dài 1,5 mm, mép nguyên, xếp lợp không rõ; ống

dài 0,75 mm Cánh hoa 5, dài 5-6 mm, hình thuôn, nhọn, mỏng, màu hồng; ống rấtngắn Nhị 5, dài 3 mm, chỉ nhị ngắn; bao phấn hình thuôn, nhọn ở đầu, lưng cóđiểm tuyến to Bầu hình cầu, cao 1 mm, vòi nhụy dài 6 mm, núm hình chấm Quảhình cầu, đường kính 5-7 mm [2, 4].

Phân bố: A splendens mới thấy ở Đồng Nai

Mẫu nghiên cứu được thu hái tại Cát Tiên – Tân Phú – Đồng Nai:

Hình 1.2: Hình ảnh cây A splendens

1.1.2.2.3 Ardisia insularis – Cơm nguội đảo

Loài Ardisia insularis được Mez miêu tả khoa học lần đầu vào năm 1902 Là

loại cây bụi, cao 2-2,5 m; cành mảnh, cành non và trục cụm hoa có lông vảy màunâu, cành non hơi dẹt, vỏ màu xám, có đường khía dọc Lá hình mác thuôn hoặcbầu dục hẹp, 12-24x2,5-5 cm, chóp lá hẹp dần và nhọn, gốc hình nêm, mép hơigợn sóng, mặt dưới có nhiều điểm tuyến rõ; gân chính lõm ở mặt trên, gân bênnhiều hướng lên, mảnh, nỗi rõ ở mặt dưới, gân cấp III hình mạng; cuống dài 0,5-1,5(1,8) cm Cụm hoa hình chùy ở đầu cành, dài 12-15 cm, trục thứ cấp 8-10, dài1-1,5 cm, trục tam cấp dài 0,8-2 cm; lá bắc dài khoảng 1 mm, hẹp, nhọn; cuốnghoa dài 0,3 cm Hoa họp thành 8-12 chiếc, thành chùm ở đầu các trục chính, thứ

cấp và tam cấp Hoa màu hồng, thơm Lá đài 5, hình trái xoan, đầu tù hoặc nhọn,dài 0,75 mm, có lông quanh mép, có điểm tuyến Cánh hoa 5, hình trái xoan, dài3-4 mm, hơi nhọn, có gân và có điểm tuyến ít rõ Nhị 5, hình mác nhọn, bao phấnlưng có ít điểm tuyến, chỉ nhị dài 1 mm Bầu hình trứng, cao 0,75 mm, vòi nhụydài 5 mm; noãn nhiều, 3 vòng Quả hình cầu, đường kính 4-5 mm, dẹp ở đầu.Phân bố: Đồng Nai (Trảng Bom, núi Đỉnh) Còn có ở Ấn Độ, Thái Lan, Malaysia.Mẫu thực vật nghiên cứu thu tại Quảng Khê, Đăk Glong, Đắk Nông, TâyNguyên:

Hình 1.3: Hình ảnh cây A insularis

1.1.2.2.4 Ardisia incarnata – Cơm nguội thắm

Ardisia incarnata được miêu tả khoa học lần đầu tiên bởi Pitard năm 1930 Là

loại cây bụi, cao khoảng 2-3m, đường kính gốc khoảng 10 cm Cành mang hoa dài

50 cm, mảnh, vỏ màu xanh, có đường kính khía dọc nhỏ, về sau tròn, vỏ màu xám,

có nhiều bì khổng Lá hình mác, mác ngược hoặc thuôn, 7-11x2-3 cm, thường đầu

lá cong dạng lưỡi liềm, chóp lá nhọn, gốc hình nêm, phiến mỏng, mép cuộn xuốngphía dưới và hơi nhăn nheo, tuyến mép ít rõ; gân bên 10-14 đôi, mảnh, ít rõ; gâncấp III hình mạng; cuống dài 0,7-2 cm, có rãnh ở mặt trên Cụm hoa hình tán kép

ở đầu cành, có lông nhỏ; cuống cụm hoa dài 1cm, cuống hoa dài 1,5 cm Lá bắchình thuôn, dài 6 mm Lá đài 5, hình thuôn hoặc trứng, dài 2,5 mm, đầu tù hoặcnhọn, có vài điểm tuyến Cánh hoa 5, màu hồng, dài 8 mm, hình trái xoan hẹp, đầunhọn, mỏng, có điểm tuyến ở đầu Nhị 5, bao phấn dài 5 mm, hình thuôn, đầunhọn Bầu gần hình cầu cao 1 mm, có nhiều điểm tuyến; vòi nhụy dài 6 mm; númhình chấm, noãn 5, 1 vòng

Phân bố: Mới thấy ở Lào Cai, Khánh Hòa ( núi Vọng Phu – Nha Trang), NinhThuận (Phan Rang)

Mẫu thực vật được thu ở Cát Cát - Sa Pa - Lào Cai:

Hình 1.4: Hình ảnh cây A Incarnata

1.2 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học về chi

Ardisia trên thế giới

1.2.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

Các loài thực vật thuộc chi Ardisia họ Myrsinaceae đã được nghiên cứu từ rất

sớm trên thế giới Ngay từ năm 1968, Ogawa Hideko và các cộng sự đã tìm thấy

các hợp chất ardisiaquinon A, B, C từ loài Ardisia sieboldi của Nhật Bản [70] Tuy

nhiên, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các thực

vật thuộc chi này chỉ thực sự phát triển vào khoảng chục năm trở lại đây Các kết

quả nghiên cứu gần đây cho thấy các loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae chứa

nhiều lớp chất thú vị, trong đó có nhiều hợp chất có cấu trúc mới, như cáctritecpen saponin, benzoquinon, flavonoid, isoflavonoid, steroid, polyphenolic, cácdẫn xuất của bergenin, các dẫn xuất của resorcinol… và có nhiều hoạt tính sinhhọc đáng quý trong đó nổi trội nhất là hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư

1.2.1.1 Các hợp chất có khung tritecpen saponin

Tritecpen saponin được biết đến như một lớp chất phổ biến phân bố rộngrãi ở rất nhiều cây lớn, sinh vật biển, sự đa dạng về cấu trúc của lớp chất này đãđem lại những hoạt tính thú vị như kháng nấm, kháng khuẩn và đặc biệt hơn là cótác dụng ức chế tế bào ung thư rất tốt [60] Ghi nhận trên các báo cáo từ trước chođến nay cho thấy lớp chất này rất phổ biến trong họ Myrsinaceae và đặc biệt rất

nhiều trong chi Ardisia.

Ban đầu việc xác định thành phần hóa học của chi này được báo cáo bởiChaweewan và cộng sự năm 1986 với 2 hợp chất tritecpen saponin là

ardisiacrispin A (1) và ardisiacrispin B (2) phân lập được từ rễ của cây Ardisia

crispa [36] Hỗn hợp 2 chất này được báo cáo có thể ức chế sự tăng sinh tế bảo

Bel-7402 bằng cách gây ra sự chết tế bào theo chương trình [51]

H 3 C

R 4

CH 3 H

O O

HO OR 3

O

HO OR 2

HO HO

Ardisiacrispin A (1) CHO β-D-Glucopyranosyl

β-D-Glucopyranosyl

OH

α-Ardisiacrispin B (2)

Rhamnopyranosyl

L-OH

α-OHArdisicrenoside

CH2OH

OHArdisicrenoside

β-D-xylopyranosyl

OHArdisicrenoside I (12)

α-CH(OCH3)2

OH

α-Ardisicrenoside J (13)

Rhamnopyranosyl

L-OHArdisicrenoside

α-Năm 1992, khi nghiên cứu thành phần hóa học trên cây Ardisia crenata, từ rễ

cây này đã phân lập được 20 hợp chất tritecpen saponin [23, 36, 37, 38, 47, 55,57]

trong đó 2 hợp chất ardisiacrispin A & B còn được tìm thấy từ loài A crispa, A.

HO HO

OH O

OCH 3 O

OCH 3 O

OH

OH O

OH

Từ rễ loài A japonica, các tác giả đã phân lập được 24 hợp chất tritecpen

saponin và đã khảo sát hoạt tính của chúng, trong đó có hợp chất ardisicrenoside A

đã được phân lập từ A.crenata trước đó [17, 25, 51]

CH 3 H CH 2 OH

O O

O HO

HO

O HO HO O O

O O

HO

O O

HO

O HO HO

Ara Glc

Glc Glc

O O

HO O O

HO

O HO HO

Ara Glc

Glc

O HO HO

O

HO O

O HO HO

O HO HO O O

O O

HO O O

HO

O HO HO

Ara Glc

Glc Glc

S1 S2

O

O O

HO O O

HO

O HO HO

Ara Glc

Glc

O HO HO HO O

O O

HO

O O HO HO

Ara Glc

Glc

O HO

HO

OH

Ara Glc

O

O O

HO

OH

Ara Glc

O HO

S5 S6

O HO

HO HO

HO

O O

HO

O O HO

HO

Ara Glc

Nghiên cứu trên loài A mamillata, Jing Hang đã phân lập được 8 hợp chất

triterpenoid saponin từ rễ được đặt tên là ardisimamillosides (A-H) [32, 33,34],

cùng với đó 17 hợp chất triterpenoid saponin đã thu được từ loài A gigantifolia,

trong đó 13 hợp chất được phân lập từ phần rễ thân của loài này [29, 61, 62, 63,90]

13 16 17 18 H3C

R2

CH 3 H

CH3

R1 O

CH3

O H3C H

O O

HO OR 3

O

R 5 O O

HO HO O

R 4 O OH HO

OH

α-Glucopyranosyl

Glucopyranosy

(33) CH2OAc

Glucopyranosy

β-D-l

6-OAc-β-D-Glucopyranosyl H

(39)

α-OH

H

Điều đặc biệt ở đây sau khi phân lập các hợp chất saponin từ loài này, tác giả

đã có sự đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc, sự ảnh hưởng và hiệuquả giữa bộ khung aglycon (tritecpen) và phần đường tới hoạt tính của lớp chất.Kết quả chỉ ra rằng sự kết hợp của nhóm C=O tại vị trí C16, phần đường L-rhamnose của R5, nhóm acetyl của 6-OH ở phần đường glucose, làm gia tăngđáng kể hoạt tính ức chế trên 2 dòng tế bào A549, HCT-8 song cùng với đó là sựsuy giảm hoạt tính trên dòng tế bào Bel-7402 [69]

Nghiên cứu thành phần hóa học loài A pusilla đã phân lập được một số

tritepen saponin mới và ardipusillosides (I-V) Tất cả các hợp chất được thửnghiệm, đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, trong đó ardipusillosides (I, II) thể hiệnhoạt tính đáng kể trong việc chống lại ung thư biểu mô ở phổi và gan [85] Ba hợpchất ardipusillosides (III-V) thể hiện tiềm năng gây độc tế bào U251MG ở người[81,82]

Gần đây, 2 loài A kivuensis, A elliptica cũng đã được nghiên cứu, trong việc

nỗ lực nghiên cứu thành phần hóa học của loài, một lần nữa các tritecpen saponinmới lại được tìm thấy trong 2 loài này [65,75]

1.2.1.2 Các hợp chất có khung quinone và alkyl phenol

Quinone là lớp chất hữu cơ bắt nguồn từ các hợp chất thơm ví như benzenhoặc naphthalen, hợp chất này được xác định bởi sự hiện diện của 2 liên kết đôicủa một vòng thơm Cũng giống như lớp chất tritecpen saponin, ở một số loài

thuộc chi Ardisia, người ta cũng tìm thấy sự đa dạng về cấu trúc của bộ khung

quinone

Năm 1987, từ rễ thân loài A cornudentata, lần đầu tiên đã phân lập được 2

hợp chất 1, 4-benzoquinon [86] Tiếp sau đó, một loạt các hợp chất có bộ khung

quinone, alkyl phenol được phân lập từ rễ thân loài A japonica, các hợp chất này

sau đó đều được thử nghiệm hoạt tính sinh học trên enzym PTB1B, trong đó hợp

chất 40, 41, 42 thể hiện hoạt tính in vitro đáng kể trong việc ức chế enzym này

[28, 52, 53]

O

O OH

Từ rễ và gốc loài A viren đã phân lập được 31 hợp chất trong đó có 4 hợp

chất thuộc khung quinone và 27 hợp chất thuộc lớp chất alkyl phenol, các hợp chấtđều được thử hoạt tính gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào MCF-7, NCI-H460 vàSF-268 và các giá trị IC50 đã được Hsun-Shuo Chang và cộng sự công bố năm

2009 Từ loài A punctata, 3 hợp chất mới là dẫn xuất của 1, 4-benzoquinone cũng

đã được phân lập [48]

Trong những năm gần đây, loài A kivuensis được nghiên cứu bởi nhiều nhà

khoa học Từ năm 2011, những nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã

được công bố, từ lá và rễ đã phân lập được các hợp chất ardisiaquinone J-P

(43-50), trước đó các hợp chất ardisiaquinone (A-H) lần lượt được phân lập từ loài A.

sieboldii và A teysmanniana [64, 65, 91]

ra bởi vi khuẩn gram dương [64, 65, 70].

1.2.1.3 Các hợp chất có khung isocoumarin

Ngoại trừ các lớp chất đã nhắc đến trong chi này thì lớp chất isocoumarin

cũng rất đáng được quan tâm, điển hình như bergenin (50) Lớp chất này có nhiều

tác dụng đã được báo cáo như hoạt tính chống lại tế bào ung thư gan, kháng nấm,chống loạn nhịp tim, chống HIV [54, 72,74] Hợp chất này được tìm thấy trong

nhiều loài thực vật khác nhau và trong một số loài trong chi Ardisia như A.

colorata, A elliptica, A japonica, A crenata… Đặc biệt, nghiên cứu cho thấy

hàm lượng bergenin ở loài A elliptica khá cao [46] Ngoài ra, các nhà nghiên cứu

phân lập được 11-Ogalloylbergenin (51) và 11-O-syringylbergenin (52) cùng với 2

dẫn xuất mới của bergenin là 11-O-vanilloyl-bergenin và

11-O-(3-dimethylgalloyl)-bergenin (53-54) từ rễ A crenata [39] Một dẫn xuất khác của bergernin là demethoxybergenin (55) cũng được phân lập từ loài A colorata [79].

Từ loài A gigantifolia, 6 hợp chất là dẫn xuất của bergenin, trong đó có một hợp

chất mới là 11-O-veratroylbergenin (56) đã được phân lập từ phần rễ của loài này

[62]

O

O OH

HO MeO

O

OH H

H OH HO

Bergenin (50)

O

O OH

HO HO

O

OH H

H OH HO

Demethoxy-bergenin (55)

O

O OH

HO MeO

O

O

OH H

11-O-(3-dimethylgalloyl)- bergenin (54) Ome Ome OH

1.2.1.4 Các hợp chất có khung resorcinol

Từ rễ của một số loài như A brevicaulis, A cornudentata, A gigantifolia, A.

maculosa và lá của loài A silvestris, một loạt các hợp chất resorcinol được phân

lập, cấu trúc và hoạt tính của chúng đã được báo cáo [15, 18, 56,66]

Năm 2010, khi nghiên cứu thành phần từ dễ cây của loài A brevicaulis đã phân

lập được 6 hợp chất resorcinol (57-62), trong đó có hai hợp chất mới là 57 và 58

OH

OAc MeO

(57) 4-hydroxy-2-methoxy-6-[(8Z)-pentadec-8-en-1-yl] phenyl acetat

(60) 5-tridecylresorcinol (61) 5-pentadecylresorcinol

HO

OH

(62) 5-[(8Z)-pentadecyl-8-en-1-yl] resorcinol

1.2.1.5 Các hợp chất có khung flavonoid

Cho đến nay, lớp chất flavonoid trong chi này được báo cáo rất ít Năm 2005,

trong việc nghiên cứu hoạt tính ức chế PTP1B trên loài A japonica, lần lượt các

lớp chất flavonoid phổ biến như quercitin, myricitin, kaempferol rhamnopyranoside và rutin được tìm thấy trong loài này [52] Đến năm 2009, từ

3-O-α-L-loài A colorata trong một nghiên cứu của Kikuchi H và cộng sự đã phân lập được

11 hợp chất isoflavon (63-73), trong đó có một hợp chất mới coloratanin A(63)

OH O

O

HO

Derrisoflavone D

68

O

OMe HO

OH O

OHDerrisoflavone A

OMe HO

OH O

Isolupalbigennin

71

O

OH HO

OH O

OR2

R 1

R1=OH,R2=Me;

1.2.2 Nghiên cứu hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy các loài thực vật họ Myrsinaceae, đặc

biệt là các loài thuộc chi Ardisia, có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý, như: hoạt

tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virut, kháng viêm giảm đau, chống oxi hóa,chống đái tháo đường, chống loãng xương, bảo vệ thần kinh, bảo vệ gan và nhất làhoạt tính chống ung thư rất tốt Trong một bài review đăng trên tạp chí Journal of

Ethnopharmacology, Kobayashi H de Mejía E (Mỹ) đã nhận định: Chi Ardisia –

một nguồn mới cung cấp các hợp chất tăng cường sức khỏe và dược phẩm cónguồn gốc thiên nhiên quý giá [46].

Điểm nổi trội nhất về hoạt tính sinh học của các thực vật thuộc chi Ardisia họ

Myrsinaceae là hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư Một nghiêncứu sàng lọc về hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư máu HL-60của 155 dịch chiết từ 93 loài cây thuốc ở Malaysia cho thấy, dịch chiết metanol

của loài A crenata đã tiêu diệt hơn 50% tế bào khi thử ở nồng độ 20 µg/ml [49].

Từ loài A colorata, ba hợp chất tritecpen saponin khác là ardisiphenols A – C có

hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú ở chuột FM3A [17]

Các hợp chất tritecpen saponin và các hợp chất là dẫn xuất của benzoquinon

tìm thấy ở các loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae cũng thể hiện hoạt tính gây độc đối với các dòng tế bào ung thư rất tốt Từ loài A crispa, một hợp chất

benzoquinonoid là 2-metoxy-6-tridecyl-1,4-benzoquinon (ký hiệu AC7-1) có tác

dụng ngăn chặn rất tốt sự bám dính và sự xâm lấn của tế bào u ác tính B16-F10 in

vitro, đồng thời hợp chất này cũng ức chế đáng kể sự lớn lên và sự di căn vào phổi

của khối u in vivo Hai hợp chất alkyl benzoquinon từ loài A cornudentata là

ardisianone và cornudentanone có hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bàoNCI-H460 với các giá trị IC(50) là 2,3 và 2,5 µg/mL tương ứng [16]

Một số hợp chất 2, 17, 18, 19 được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên 6

dòng tế bào ung thư là HCT-8, Bel7402, BGC-823, A549, A2780 và KETR3 vớichất đối chứng dương là taxol song đều cho kết quả âm tính, chỉ riêngardisiacrispin B được coi là chất ức chế yếu đối với 6 dòng tế bào trên [93] Gần

đây, thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào U251MG của hai hợp chất 1 và 2 đã cho

thấy tiềm năng của hợp chất 2 khi cho giá trị IC50 là 3,33 µmol/L so với chất đốichứng dương Nimustine hydrochloride (giá trị IC50 0,98 µmol/L); trong khi đó hợp

chất 1 cũng thể hiện hoạt tính song ở một mức độ thấp hơn, cụ thể giá trị IC50

12,20 ± 1,14 µmol/L [85] Các hợp chất 2, 4, 5, 6, 7, 18 còn được thử nghiệm trên

enzym cAMP phosphodiesterase (một loại enzym có tác dụng phân hủy các chất

truyền tín hiệu nội bào gây ra việc rối loại ở nam giới), kết quả cho thấy các hợp

chất có khả năng ức chế mạnh ngoại trừ hợp chất 7 [37].

Trong nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài A.

Mamillata và A Gigantifolia, đã ghi nhận 10 hợp chất có khả năng ức chế những

dòng tế bào khác nhau trên 3 dòng tế bào thử nghiệm là A549, Bel-7402 và tế bào

HCT-8, các hợp chất 29, 31-33, 36-39 cho tác dụng tốt trên cả 3 dòng tế bào trên, các hợp chất 30, 34 chỉ có tác dùng trên tế bào Bel-7402, còn riêng hợp chất 35 chỉ

cho kết quả tốt đối với dòng tế bào HCT-8 [59]

Bên cạnh hai lớp chất tritecpen saponin và benzoquinon, các dẫn xuất của

resorcinol được tìm thấy ở các loài Ardisia cũng có hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u tốt Một dẫn xuất của resorcinol phân lập từ loài A maculosa có hoạt

tính gây độc tế bào đối với tế bào ung thư người với giá trị GI (50) là 0,214 µM/ml

.Từ loài A gigantifolia, hai dẫn xuất khác của resorcinol đã được tìm thấy và có

hoạt tính gây độc tế bào mạnh đối với các dòng tế bào PC-3, EMT6, A549, Hela,RM-1 và SGC7901 với các giá trị IC(50) nhỏ hơn 30 µM [56] Mới đây, năm

2010, từ loài A brevicaulis, bốn dẫn xuất của resorcinol là

4-hydroxy-2-methoxy-6-[(8Z)-pentadec-8-en-1-yl]phenyl acetate, pentadecylphenyl acetate, 5-tridecylresorcinol và ardisiphenol D có tác dụng ứcchế các dòng tế bào A549, MCF-7 và PANC-1, đặc biệt cả bốn hợp chất này đềuthể hiện hoạt tính ức chế rất mạnh đối với dòng tế bào A549 (với các giá trị IC(50)tương ứng là 3,0; 3,2; 12,5 và 3,4 µM), mạnh hơn cả chất đối chứng cisplatin (cógiá trị IC(50) là 18,7 µM) [11] Một hợp chất isoflavonoid là coloratanin A được

4-hydroxy-2-methoxy-6-phân lập từ vỏ cây A colorata có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi người AGS

thông qua con đường tăng cường hoạt tính của DR5 (một thụ thể gây chết gắn kếtvới protein gây ra cái chết theo chương trình của tế bào TRAIL) [Kikuchi-2009]

Lá của loài A compressa được uống thay trà ở Mỹ để chữa các bệnh mãn tính,

trong đó bao gồm cả bệnh ung thư Kết quả nghiên cứu cho thấy các thành phầntanin và polyphenolic là các thành phần chính quyết định đến hoạt tính này

[15,76] Một nghiên cứu khác cho thấy, các hợp chất phenolic tìm thấy ở loài nàynhư axit gallic, epicatechin gallate, proanthocyanidin dime, kaempferol,naringenin và một số dẫn xuất của ardisin có tác dụng ức chế đối với dòng tế bàoung thư ruột kết ở người [25].

Ngoài hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư và hoạt tính kháng nấm kháng

khuẩn, các thực vật thuộc chi Ardisia họ Myrsinaceae còn có nhiều hoạt tính sinh

học quý giá khác như hoạt tính kháng virut (virut viêm gan B, virut viêm gan C,virut HIV-1 và 2), hoạt tính trừ giun và các loài nhuyễn thể, ức chế enzym(PTP1B, acetylcholinesterase), hoạt tính chống ôxi hóa, bảo vệ thần kinh, bảo vệgan, chống đái tháo đường, chống nhồi máu cơ tim, chống co giật…

Gần đây nhất (năm 2011), hợp chất beta-amyrin phân lập từ loài A elliptica có

tác dụng ức chế sự đông kết tiểu cầu gây ra bởi collagen mạnh hơn cả chất đốichứng aspirin: giá trị IC(50) của beta-amyrin là 4,5 µg/ml (10,5 µM) trong khi đógiá trị này của aspirin là 11 µg/ml (62,7 µM), tức là hợp chất beta-amyrin có hoạttính ức chế sự đông kết tiểu cầu mạnh hơn aspirin 6 lần [19]

1.3 Tình hình nghiên cứu về chi Ardisia ở Việt Nam

Ở Việt Nam chưa có nhiều các nghiên cứu về hóa học cũng như hoạt tính sinhhọc của các thực vật họ Myrsinaceae nói chung và các loài thực vật trong chi

Ardisia nói riêng, chúng chỉ mới được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa

bệnh Duy nhất chỉ có một công trình công bố trên tạp chí Planta medica năm

1996 của tác giả Nguyễn Hoàng Anh và cộng sự nghiên cứu về thành phần hóa

học của hai loài A silvestri và A gigantifolia, trong đó công bố đã tìm thấy

2-methyl-5-(Z-nonadec-14-enyl)resorcinol và 5-(Z-nonadec-14-enyl)resorcinol cùngmột số các hợp chất tritecpen khác [66]

Trong dân gian, nhìn chung các thực vật thuộc họ này có tính mát, có tác dụngkháng sinh, hoạt huyết tán ứ, tiêu thũng tiêu viêm và thường được sử dụng để chữaphong thấp đau xương, đòn ngã tổn thương, chữa các bệnh về gan, chữa sưng đau

yết hầu, chữa ho ra máu, chữa bệnh đái đượng, bệnh lỵ, chữa mụn nhọt, eczema vàcác bệnh ngoài da, đau dạ dày, chữa rắn cắn và trị giun sán Lá của một số loàiđược dùng uống thay trà hoặc ăn gỏi để chữa các bệnh về ngộ độc thực phẩm Quảcủa một số loài cũng ăn được [3, 4]

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Đã tiến hành thu hái và xác định tên khoa học của 09 loài Ardisia Danh sách

các loài bao gồm tên khoa học, tên gọi thông thường, nơi thu hái mẫu và hình ảnhmẫu được đưa ra trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Mẫu các loài Cơm nguội đã được thu thập để sử dụng trong nghiên cứu

Địa điểmthu hái

Bộphậnthuhái

Ảnh, số hiệu mẫu

balansana Yang

Cơmnguộibalansa

BảnKhoang,

Sa Pa, LàoCai

Toàncây

VMN-B0001635

2 Ardisia caudata

Hemsl

Cơmnguộiđuôi

BảnKhoang,

Sa Pa, LàoCai; độ cao

Cát Cát, Sa

Pa, LàoCai; độ cao1.500 m

VMN-B0001452

4 Ardisia insularis

Mez

Cơmnguộiđảo

QuảngKhê, ĐăkGlong,Đắk Nông,TâyNguyên

Sín Chải,

Sa Pa, LàoCai; độ cao1.700 m

Lá

VMN-B0001476

Ardisia primulifolia

Gardn

Cơmnguội anhthảo

Mẫu Sơn,Lạng Sơn;

ở độ cao1.100 m

Mẫu Sơn,Lạng Sơn;

độ cao 800m

VQG CátTiên, TânPhú, ĐồngNai

Trạm Tôn,

Sa Pa, LàoCai; độ cao1.700 m

Lá

VMN-B0001428

Mẫu cây của 9 loài Ardisia trên đều được TS Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng

Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học Tiêu bản mẫu được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Các mẫu thực vật sau khi thu hái được rửa sạch đất cát, thái nhỏ, phơi trongbóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 50-60 oC và nghiền thành bột Bột được chiết kết hợpsiêu âm và gia nhiệt trong dung môi metanol ở 50 oC (3 lần x 2 giờ mỗi lần) Dịchchiết metanol sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm Cặn metanol tổng

được bổ sung thêm nước và chiết phân bố lại với các dung môi n-hexan, cloroform, etyl axetat và n-butanol Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được

các cặn chiết tương ứng

2.1.3 Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây

Phương pháp chiết tách, phân lập các hợp chất: sử dụng các phương phápnghiên cứu thông thường trong hoá học: phương pháp chiết, tách, phân lập cácchất bằng sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel pha thường, silica gel pha đảo vàdianion

 Sắc kí lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần,

được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Aluofolien 60 F254 (Merck), RP18F254s (Merck) Dung môi triển khai sắc ký là hỗn hợp của một số trong số các dung

môi thông thường như n-hexan, chloroform, etyl axetat, axeton, metanol và nước.

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùngthuốc thử là dung dịch vanillin H2SO4 10 % được phun đều lên bản mỏng, sấy khôrồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu

 Sắc ký cột (CC): Được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường,

silica gel pha đảo Silica gel pha thường Merck có cỡ hạt là 0,040 – 0,063 mm(240-430 mesh) Silica gel pha đảo YMC (30-50 m, Fujisilisa Chemical Ltd.)

2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học cuả các hợp chất để cậpđến là sự kết hợp giữa việc xác định các thông số vật lý và các phương pháp phổhiện đại bao gồm:

 Phổ hồng ngoại (FT-IR): Phổ IR của các chất được đo trên máySHIMADZU FTIR 8107M của Nhật tại viện Hoá học - viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam Chế độ đo: đo độ truyền qua, dải số sóng 4000-500 cm-1, độ phân

giải 0,25 cm-1, số lần quét 32 lần/phổ; mẫu được chuẩn bị bằng cách nghiền mịnvới bột KBr theo tỷ lệ 5  10 mg chất /1gam KBr và ép thành viên trong suốt ở

600 psi trong 5 phút

 Phổ khối: Phổ khối ion hóa bụi electron (ESI-MS) được đo trên máyAGILENT 1100 LC-MSD ion Trap spectrometer-Viện Hóa học các Hợp chấtthiên nhiên

 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR được đo trên máyBRUKER ADVANCE – 500M của Đức tại Phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoáhọc - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các điều kiện đo: tần số 500 MHz

và 125 MHz, dung môi DMSO-d 6, chất chuẩn nội TMS

 Điểm nóng chảy (Mp): Điểm nóng chảy được đô trên máy hotstage của Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học vàCông nghệ Việt Nam

Kofer-micro-2.1.5 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học

2.1.5.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn

Các thí nghiệm thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn được tiến hành tạiphòng Sinh học thực nghiệm, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hànlâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành trên các phiến vi lượng

96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher & Vlietlinck (1991) và củaMCKane L & Kandel (1996)

Các chủng vi sinh vật kiểm định: vi khuẩn Gram (+) B subtillis, S aureus; vi khuẩn Gram (-) E coli, P aeruginosa; nấm men S cerevisiae, C albicans và nấm mốc Asp niger, F oxysporum.

Các chứng dương tính là: ampicilin cho vi khuẩn Gram (+), tetracylin cho vikhuẩn Gram (-), nystatin cho nấm sợi và nấm men

Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: ampicilin 50mM; tetracylin 10 mM; nystatin 0,04 mM.

Chứng âm tính: vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử.Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính: Các mẫu đã có hoạttính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần (từ 5 -

10 thang nồng độ) để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chếphát triển gần như hoàn toàn

2.1.5.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng virut

Các thí nghiệm thử hoạt tính kháng virut được tiến hành tại Khoa Dược,Viện Khoa học Dược Yonsei, Trường Đại học Yonsei, Incheon, Hàn Quốc

Virut Coxsackievirus A16 (CVA16) được cung cấp bởi Viện Nghiên cứumôi trường và Sức khỏe Chungcheongnam, Hàn Quốc và được nhân giống trong

tế bào Vero thận khỉ xanh Châu Phi (ATCC CCR-81) ở 37°C Các tế bào Verođược giữ trong môi trường MEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS)

và 0,01% dung dịch kháng sinh chống nấm Dung dịch kháng sinh chống nấm,axit trypsin-ethylene diamin (EDTA) và dung dịch MEM được cung cấp bởi hãngGibco BRL (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Đức) Các tấm nuôi cấy môđược cung cấp bởi hãng Falcon (BD Biosciences, San Jose, CA, Mỹ).Sulforhodamine B (SRB) được đặt mua của hang Sigma-Aldrich (St Louis, MO,Mỹ)

Phương pháp thử hoạt tính kháng virut: Hoạt tính kháng virut được đánh giátheo phương pháp SRB trong đó có đánh giá hiệu quả gây bệnh tế bào (CPE).Ribavirin được sử dụng làm chứng dương, DMSO được sử dụng làm chứng âm.Tác dụng gây bệnh tế bào (CPE) gây ra bởi virut đã được quan sát Cách tiến hànhnhư sau: Các tế bào MDCK được cấy vào khay 96 giếng với nồng độ 2 × 104 tếbào/giếng Sau một ngày, dịch môi trường được bỏ đi và sau đó rửa với PBS Sau

đó, 0,09 ml dung dịch chứa virut và 0,01 ml dung dịch môi trường có bổ sungtrypsin-EDTA có chứa mẫu thử nghiệm đã được thêm vào Hoạt tính kháng virutcủa mỗi mẫu thử nghiệm được xác định ở 6 nồng độ khác nhau từ 0,4 đến 50 µM,pha loãng 5 lần đối với mỗi mẫu thử Sau khi ủ hai ngày ở 37 0 C và 5% CO2, hìnhthái tế bào được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi AXIOVERT10 (ZEISS,Germany)

2.1.5.3 Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro

Các thí nghiệm thử hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành tại phòng Thửnghiệm sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam

Năm dòng tế bào ung thư được sử dụng là KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ungthư phổi), MCF7 (ung thư vú), Hep-G2 (ung thư gan) và LNCaP (ung thư tuyếntiền liệt)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằmsàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào

ung thư (TBUT) ở điều kiện in vitro

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật

độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bàođược nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuậnvới lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượngprotein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn

Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Chất thử (20 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay

96 giếng để có nồng độ cuối cùng là 100 g/ml; 50 g/ml; 25 g/ml; 12,5 g/ml;6,25 g/ml

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 180 l môitrường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180l)

sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được

cố định tế bào bằng TCA

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáygiếng, được nhuộm bằng SRB Cuối cùng, sử dụng unbuffered Tris base để hòatan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹtrong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả vềhàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông quacông thức sau:

% sống sót = [OD(chất thử )−OD (ngày 0)] x 100 OD (đối chứng âm)−OD(ngày 0)

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương DMSO 10% luôn được

sử dụng như đối chứng âm Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽđược xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve

Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóahọc) hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tínhgây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư

2.2 Phân lập các hợp chất từ cây cơm nguội balansana (Ardisia balansana)

2.2.1 Xử lý mẫu thực vật

Rễ cây cơm nguội balansa (Ardisia balansana) sau khi phơi khô, nghiền nhỏ

(3,5 kg), được chiết kết hợp siêu âm và gia nhiệt trong dung môi metanol ở 50oC

(3 lần x 2 giờ mỗi lần) Dịch chiết metanol được gộp chung lại và cất loại dungmôi dưới áp suất giảm thu được 500 g cặn chiết metanol tổng Cặn metanol tổng

được bổ sung thêm nước và chiết phân bố lại với các dung môi n-hexan, cloroform, etyl axetat và n-butanol Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn chiết n-hexan (AB/A, 60 g), chloroform (AB/B, 50 g), etyl axetat (AB/C,

30 g) và n-butanol (AB/D, 25 g) tương ứng Pha nước còn lại được lọc trên giấy

lọc thu được cặn rắn E (AB/E, 160 g) và dịch nước Phần dịch nước này được tiếnhành sắc ký trên cột dianion và rửa giải bằng dung môi MeOH (25%, 50%, 75%

và 100% MeOH), sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm từ phần dịch rửa100% MeOH thu được cặn AB/F (8 g)

Cặn AB/B (50 g) được tiến hành phân lập trên cột silica gel pha thường, hệ

dung môi rửa giải n-hexan:etyl axetat (từ 90:1 đến 1:1, 100% EtOAc) và 100%

MeOH, thu được 10 phân đoạn (ký hiệu từ B-1 đến B-10) Phân đoạn B-7 (500mg) được tiếp tục sắc ký trên cột silica gel pha thường và rửa giải bởi hệ dung môi

n-hexan:etyl axetat (4:1, v/v), thu được 4 phân đoạn (ký hiệu từ B-7/1 đến B-7/4).

Phân đoạn B-7/2 tiếp tục được sắc ký trên cột silica gel pha thường và rửa giải bởi

hệ dung môi n-hexan: etyl axetat (2:1, v/v), thu được hợp chất AB-1 (chất bột

không màu, 20 mg) Phân đoạn B/7-4 được tinh chế trên cột silica gel pha thường

với hệ dung môi rửa giải n-hexan:etyl axetat (1:1, v/v) thu được hợp chất AB-2

(tinh thể hình kim màu trắng, 20 mg) Phân đoạn B-10 (900 mg) tiếp tục được sắc

ký trên cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải cloroform:metanol:nước(5:1:0,1, v/v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ B/10-1 đến B/10-5) Hợp

chất AB-3 (chất bột màu trắng, 15 mg) thu được sau khi tiến hành sắc ký phân

đoạn B/10-3 trên cột silica gel pha đảo và rửa giải với hệ dung môi axeton:nước(8:1, v/v)

Cặn AB/C (30 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường, hệ

dung môi n-hexan:etyl axetat (từ 90:1 đến 1:1, 100% EtOAc) và 100% MeOH, thu

được 10 phân đoạn (ký hiệu từ C-1 đến C-10) Phân đoạn C-5 (600 mg) được tiếp

tục sắc ký trên cột silica gel pha thường và rửa giải bởi hệ dung môi n-hexan:etyl

axetat (4:1, v/v), thu được 5 phân đoạn nhỏ (ký hiệu từ C/5-1 đến C/5-5) Phânđoạn C/5-5 (75 mg) tiếp tục được sắc ký trên cột silica gel pha đảo với hệ dungmôi rửa giải MeOH:H2O (5:1, v/v) thu được hợp chất AB-4 (chất bột màu vàng,

30 mg)

Cặn AB/F (8 g) được tiến hành sắc ký trên cột silica gel pha thường, hệdung môi rửa giải clorofrom:metanol (10:1, 6:1, 3:1, 1:1, 100% MeOH, v/v) thuđược 5 phân đoạn (ký hiệu từ F-1 đến F-5) Phân đoạn F-2 tiếp tục được tiến hànhsắc ký trên cột silica gel pha thường và rửa giải bằng hệ dung môiclorofrom:metanol:nước (4:1:0,1, v/v/v), sau đó tinh chế trên cột silica gel pha đảovới hệ dung môi rửa giải MeOH:H2O (2:1, v/v) thu được hợp chất AB-5 (chất bộtmàu vàng nhạt, 20 mg) Phân đoạn F-3 được tiếp tục sắc ký trên cột silica gel phathường và rửa giải bằng hệ dung môi clorofom:metanol:nước (3:1:0,1, v/v/v) thu

được hợp chất AB-6 (chất bột màu vàng, 20 mg).

2.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây cơm nguội balansana

Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây cơm nguội balansana được trình bầytrong Hình 2.1 và Hình 2.2 dưới đây

Hình 2.1: Sơ đồ phân lập các chất từ cặn chiết chloroform của cây cơm nguội

balansana

CC, SiO2, CHCl3:MeOH:H2 O

(5:1:0,1)

CC, SiO2, n-hexan:etyl axetat (từ 90:1 – 100% EtOAc) và 100% MeOH

Cặn chloroform AB/B (50g)

CC, SiO2, n-hexan: etyl axetat (4:1)