Nghiên cứu phẩm chất, môi trường bảo tồn và sử dụng tinh đông lạnh trâu murrah phối giống cho trâu cái việt nam

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Ý nghĩa của chữ viết tắt A Activity Hoạt lực ADN Acid Deoxyribo Nucleic ATP Adenosin triphosphat C Concentration Nồng độ tinh trùng ĐTC Đạt tiêu c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LÊ THỊ LIÊN

NGHIÊN CỨU PHẨM CHẤT, MÔI TRƯỜNG BẢO TỒN VÀ SỬ DỤNG TINH ĐÔNG LẠNH TRÂU MURRAH PHỐI GIỐNG CHO TRÂU CÁI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành: Chăn nuôi

Thái Nguyên - 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đức Hùng

Thái Nguyên - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa hề sử dụng cho một học vị nào Mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đều đã được cảm ơn Các thông tin, tài liệu trình bày trong luận văn này được ghi từ nguồn gốc trong phần phụ lục

Tác giả

Lê Thị Liên

đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nói chung, khoa Chăn nuôi nói riêng những người đã giúp

đỡ, giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Chăn nuôi Miền núi và toàn thể cán bộ công nhân viên của Trung tâm, những người luôn hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp luôn giúp

đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và nghiên cứu tại Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Chăn nuôi Miền núi!

Thái Nguyên, ngày 15 tháng 08 năm 2016

Học viên

Lê Thị Liên

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm ngoại hình, sức sản xuất của trâu Murrah 3

1.1.2 Sinh lý sinh dục trâu đực 5

1.1.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch trâu 8

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch 10

1.1.5 Kỹ thuật đông lạnh tinh dịch trâu 12

1.1.6 Kỹ thuật đông lạnh và giải đông tinh dịch trâu 18

1.1.7 Giới thiệu môi trường pha loãng, đông lạnh tinh dịch trâu dùng trong nghiên cứu 20

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 21

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 21

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.1.2 Nguyên, vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị 26

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 27

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của cá thể và mùa vụ đến một số chỉ tiêu đánh giá phẩm chất tinh dịch 28

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu lựa chọn môi trường pha loãng 31

2.4.3 Phương pháp dẫn tinh và xác định tỷ lệ thụ thai ở trâu cái nội 33

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Ảnh hưởng của cá thể và mùa vụ đến một số chỉ tiêu phẩm chất tinh dịch trâu Murrah 35

3.1.1 Ảnh hưởng của cá thể đến một số chỉ tiêu phẩm chất tinh trâu 35

3.1.2 Ảnh hưởng của mùa vụ đến một số chỉ tiêu phẩm chất tinh trâu Murrah 49

3.2 Nghiên cứu lựa chọn tinh dịch trâu và môi trường đông lạnh 64

3.3 Nghiên cứu sử dụng tinh trâu Murrah đông lạnh 67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Ý nghĩa của chữ viết tắt

A Activity (Hoạt lực)

ADN Acid Deoxyribo Nucleic

ATP Adenosin triphosphat

C Concentration (Nồng độ tinh trùng)

ĐTC Đạt tiêu chuẩn

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations:

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc FSH Follicle-stimulating hormone

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TTNT Thụ tinh nhân tạo

V Volume (Thể tích tinh dịch)

VAC Tổng số tinh trùng sống tiến thẳng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thiết bị dùng trong nghiên cứu 26

Bảng 2.2 Hóa chất, dụng cụ 27

Bảng 2.3 Môi trường pha loãng, đông lạnh tinh dịch 32

Bảng 3.1 Thể tích của từng cá thể trâu Murrah 36

Bảng 3.2 pH tinh dịch của từng cá thể trâu Murrah 37

Bảng 3.3 Hoạt lực tinh trùng của từng cá thể trâu Murrah 39

Bảng 3.4 Nồng độ tinh trùng của từng cá thể trâu Murrah 41

Bảng 3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của từng cá thể trâu Murrah 43

Bảng 3.6 Tỷ lệ tinh trùng sống của từng cá thể trâu Murrah 45

Bảng 3.7 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần xuất tinh của từng cá thể 47

Bảng 3.8 Thể tích tinh dịch của trâu Murrah ở các mùa trong năm 50

Bảng 3.9 pH tinh dịch của trâu Murrah ở các mùa trong năm 52

Bảng 3.10 Hoạt lực tinh trùng của trâu Murrah ở các mùa trong năm 54

Bảng 3.11 Nồng độ tinh trùng của trâu Murrah ở các mùa trong năm 56

Bảng 3.12 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của trâu Murrah ở các mùa trong năm 58

Bảng 3.13 Tỷ lệ tinh trùng sống của trâu Murrah ở các mùa trong năm 60

Bảng 3.14 Tổng số tinh trùng tiến thẳng của trâu Murrah ở các mùa trong năm 62

Bảng 3.15 Chất lượng tinh dịch của trâu Murrah sau giải đông 65

Bảng 3.16 Tỷ lệ thụ thai của trâu cái nội ở lần phối đầu 68

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Thể tích tinh dịch của từng cá thể trâu Murrah 36

Biểu đồ 3.2 pH tinh dịch của từng cá thể trâu Murrah 38

Biểu đồ 3.3 Hoạt lực tinh trùng của từng cá thể trâu Murrah 40

Biểu đồ 3.4 Nồng độ tinh trùng của từng cá thể trâu Murrah 42

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của từng cá thể trâu Murrah 44

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ tinh trùng sống của từng cá thể trâu Murrah 46

Biểu đồ 3.7 Tổng số tinh trùng tiến thẳng của từng cá thể trâu Murrah 48

Biểu đồ 3.8 Thể tích tinh dịch của trâu Murrah ở các mùa trong năm 50

Biểu đồ 3.9 pH tinh dịch của trâu Murrah ở các mùa trong năm 53

Biểu đồ 3.10 Hoạt lực tinh trùng của trâu Murrah ở các mùa trong năm 54

Biểu đồ 3.11 Nồng độ tinh trùng của trâu Murrah ở các mùa trong năm 57

Biểu đồ 3.12 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của trâu Murrah ở các mùa trong năm 59

Biểu đồ 3.13 Tỷ lệ tinh trùng sống của trâu Murrah ở các mùa trong năm 60

Biểu đồ 3.14 Tổng số tinh trùng tiến thẳng của trâu Murrah ở các mùa trong năm 62

Biểu đồ 3.15 Chất lượng tinh dịch sau giải đông ở 3 môi trường khác nhau 65

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trâu là động vật nuôi rất quan trọng của nông dân Việt Nam, là loài cung cấp chủ yếu sức kéo, thịt chất lượng cao; đồng thời còn cung cấp phân bón cho cây trồng và là một nguồn vốn tiết kiệm góp phần cải thiện cuộc sống của người nông dân Việt Nam là một trong những nước có đàn trâu lớn trên thế giới Theo Tổng cục Thống kê, năm 2015 nước ta có hơn 2,5 triệu con trâu Trâu được phân bố ở tất cả các tỉnh, nhưng tập trung chủ yếu ở các tỉnh vùng núi phía Bắc

Mặc dù, chăn nuôi trâu là một nghề đã có từ lâu trong đời sống nông nghiệp, nông thôn của nước ta, nhưng nhìn chung vẫn còn mang tính quảng canh, phân tán, nhỏ lẻ Việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào chăn nuôi trâu còn hạn chế Chính vì vậy, trong chăn nuôi đại gia súc thì đàn trâu nước

ta không chỉ chiếm một tỷ trọng khá khiêm tốn mà còn kém cả về chất lượng, thể hiện ở tầm vóc nhỏ, sinh sản kém Do tập quán chăn nuôi trâu theo hình thức quảng canh nên trâu sinh sản tự nhiên là chủ yếu; công tác giống chưa được chú ý đúng mức, đặc biệt là con đực chưa được chọn lọc, hiện tượng cận huyết khá phổ biến, đàn trâu có chiều hướng thoái hóa về tầm vóc

Từ thực tế đó, ngay từ thập kỷ 70 của thế kỷ trước, nước ta đã tiến hành nhập giống trâu Murrah từ Ấn Độ với số lượng lớn nhằm lai, cải tạo giống trâu nội Trâu Murrah là một giống trâu tốt của Ấn độ, có thể chất vững chắc, khối lượng lớn và sức sản xuất sữa cao Tuy nhiên, do đặc điểm sinh lý sinh dục của trâu đực Murrah có nhiều điểm không phù hợp với trâu cái nội, phần lớn trâu đực Murrah không có ham muốn tính dục với trâu cái Việt Nam (Mai Văn Sánh, 1996) [12], nên việc lai tạo bằng giao phối trực tiếp gặp nhiều khó khăn Vì vậy việc ứng dụng thụ tinh nhân tạo là giải pháp quan trọng để lai tạo nhằm cải tạo đàn trâu nội

Hiệu quả thụ tinh nhân tạo phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó có chất lượng tinh dịch, đặc biệt là tinh dịch được bảo tồn Tinh dịch được bảo tồn dưới dạng đông lạnh có ưu điểm là kéo dài thời gian sống của tinh trùng, cho

phép bảo tồn nguồn vật liệu di truyền của con đực dưới dạng ngân hàng gen trong thời gian dài, do vậy có thể mở rộng bán kính thụ tinh, thuận tiện trong vận chuyển và đáp ứng yêu cầu thương mại hóa sản phẩm tinh dịch Tuy nhiên, kỹ thuật và môi trường đông lạnh tinh dịch có ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng tinh dịch trong quá trình bảo tồn, sau giải đông và dẫn tinh

Việc nghiên cứu bảo tồn tinh dịch ở dạng đông lạnh đã được nhiều nước trên thế giới thực hiện Các nước Đức, Nhật, Mỹ, Pháp… đã rất thành công trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch gia súc phục vụ cho thụ tinh nhân tạo hoặc lưu trữ bảo tồn quỹ gen quý Ở Việt Nam, nghiên cứu tinh đông lạnh trâu Murrah mới được thực hiện trong thời gian gần đây và còn nhiều vấn đề cần giải quyết để nâng cao chất lượng tinh dịch sau bảo tồn Để góp phần làm phong phú thêm kỹ thuật và công nghệ trong sản xuất tinh đông lạnh và sử dụng tinh trâu Murrah để thụ tinh nhân tạo cho trâu cái nội, chúng tôi tiến

hành đề tài “Nghiên cứu phẩm chất, môi trường bảo tồn và sử dụng tinh

đông lạnh trâu Murrah phối giống cho trâu cái Việt Nam”

2 Mục tiêu của đề tài

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Cơ sở khoa học của đề tài

1.1.1 Nguồn gốc, đặc điểm ngoại hình, sức sản xuất của trâu Murrah

1.1.1.1 Nguồn gốc, quá trình nhập và phát triển trâu Murrah ở Việt Nam

Trâu Murrah có nguồn gốc từ Ấn Độ, được nhập vào nước ta từ năm

1958, nhưng đến thập niên 70 của thể kỷ trước trâu Murrah mới được nhập vào nước ta với số lượng lớn Năm 1970, nước ta đã nhập 30 trâu Murrah từ Quảng Tây (Trung Quốc) và được nuôi ở Trại thí nghiệm trâu Ngọc Thanh (Vĩnh Phú) Năm 1976 nước ta tiếp tục nhập 1000 con trâu Murrah của Ấn

Độ về nuôi tại Trung tâm Trâu sữa Phùng Thượng và một số địa phương trong cả nước (Nguyễn Văn Bình,Trần Văn Tường, 2007)[3] Đến năm 1978, Trung tâm Nghiên cứu Trâu và Đồng cỏ Sông Bé đã nhận 502 trâu Murrah từ

Ấn Độ với sự tham gia của các chuyên gia Ấn Độ và công tác nghiên cứu trâu Murrah được tiến hành có hệ thống (Mai Văn Sánh, 1996) [12], nhằm phát triển nhân rộng đàn trâu này và các con lai giữa trâu Murrah và trâu nội với mục đích phát triển đàn trâu Murrah ở Việt Nam cung cấp thịt và sữa

1.1.1.2 Đặc điểm ngoại hình

Trâu Murrah thường có da và lông màu đen tuyền, da mỏng, mềm mại, nhẵn bóng, có lông thưa, ở cuối đuôi có chòm lông màu trắng sát với chân; có một tỷ lệ thấp màu xám nâu hoặc xám nâu vàng, rất ít khi có trâu trắng.Trâu Murrah có sừng xoắn khác với trâu thường có sừng vòng cung

Phần đầu: Đặc điểm nổi bật và rõ nét nhất của trâu Murrah là sừng ngắn, quay ra sau và lên trên sau đó vòng vào trong thành hình xoắn ốc, mặt sừng phẳng Đầu trâu đực thô kệch và nặng nề, đầu con cái thì tương đối nhỏ, cân đối Trán rộng và hơi gồ, mặt cân đối, lỗ mũi rộng, mắt trâu đực không lồi lắm, nhưng mắt con cái thì lồi, nhanh nhẹn và sáng Tai trâu bé, mỏng và rủ xuống Cổ trâu đực thô và mập, cổ trâu cái dài, mảnh

Phần thân: Ngực trâu to, rộng, không có yếm Trâu đực có phần thân trước nặng, phần sau nhẹ, trâu cái thì phần thân trước nhẹ và hẹp, phần thân sau nặng và rộng tạo thành hình cái nêm Lưng rộng, dài và thon về phía đầu Xương sườn rất tròn, núm rốn nhỏ, không có u bướu

Phần sau: Đuôi dài, mảnh, dễ vận động Con cái có bầu vú phát triển, các tĩnh mạch vú nổi rõ, núm vú dài và cách xa nhau, cân đối, dễ nắm để vắt sữa và sữa xuống dễ dàng

1.1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Theo Nguyễn Văn Bình, Trần Văn Tường (2007) [3], trâu đực trưởng thành có khối lượng từ 650–730 kg/con, có thể nặng tới 1.000 kg, chiều cao trung bình của trâu là 142 cm; trâu cái trưởng thành có khối lượng từ 350–

400 kg/con, có thể tới 900 kg, chiều cao trung bình 133 cm; nghé sơ sinh nặng 30 kg/con, khi trưởng thành chúng có khối lượng thịt cao hơn so với giống trâu bản địa ở Việt Nam từ 50 đến 70 kg/con

1.1.1.4 Sức sản xuất

Khả năng sản xuất sữa trung bình khoảng 1400-2000 kg/chu kỳ, tỷ lệ

mỡ sữa cao 7% Tỷ lệ thịt xẻ khoảng 48-52% (Nguyễn Văn Bình, Trần Văn Tường, 2007) [3]

1.1.1.5 Khả năng sinh sản

Theo Nguyễn Văn Bình, Trần Văn Tường (2007) [3] cho biết, trâu cái Murrah có biểu hiện động dục lần đầu ở 34 tháng tuổi; Tuổi đẻ lứa đầu trung bình là 39,8 tháng; Khoảng cách giũa 2 lứa đẻ là 15-16 tháng; Khối lượng trâu cái khi đẻ lứa đầu trung bình là 367,8 kg Động dục lại sau đẻ 117 ngày Trâu đực thành thục tính dục trung bình lúc 36,3 tháng tuổi; Khối lượng khi thành thục tính dục trung bình là 355,8kg; Thời gian sử dụng trâu đực tốt nhất

từ 4 đến 5 năm tuổi

1.1.2 Sinh lý sinh dục trâu đực

1.1.2.1 Đặc điểm cấu tạo cơ quan sinh dục

Cơ quan sinh dục của trâu Murrah có nhều nét tương đồng như của bò, kích thước tinh hoàn của trâu chỉ bằng 1/2 so với bò đực cùng thể trọng, tinh hoàn ở trong bìu đái từ lúc mới đẻ Dương vật của trâu đực hình ống và nhỏ dần về phía đầu, nó có ít tổ chức làm cương nở, độ dài dương vật trung bình khoảng 83,5 cm Cơ quan sinh dục phụ của trâu phát triển kém hơn so với bò, nhưng tuyến cowper lại dài tuy bề rộng không lớn Trâu cái, âm đạo có nhiều

cơ, thẳng và sừng tử cung thì uốn nhiều hơn so với bò, buồng trứng của trâu khác hẳn so vói bò về hình thù, kích thước và trọng lượng (Đinh Văn Cải, Nguyễn Ngọc Tấn, 2007) [4]

Các bộ phận chính của cơ quan sinh dục trâu đực bao gồm bao dịch hoàn, dịch hoàn, phụ dịch hoàn, ống dẫn tinh, các tuyến sinh dục phụ và dương vật… (Nguyễn Văn Bình, Trần Văn Tường, 2007) [3], cụ thể:

Dịch hoàn: Trâu đực có hai dịch hoàn được treo phía ngoài cơ thể

trong bao dịch hoàn, kích thước dài khoảng 11-12 cm, đường kính 5-7 cm và khối lượng khoảng 250-350 gam Dịch hoàn có 2 chức năng cơ bản là sản xuất tinh trùng và tiết hóc môn

Dịch hoàn phụ: Dịch hoàn phụ là ống dẫn tinh từ dịch hoàn ra ngoài,

nằm trên bề mặt dịch hoàn Đỉnh dịch hoàn phụ bao gồm nhiều ống nhỏ gom tinh vào một ống lớn phía đáy dịch hoàn phụ Dịch hoàn phụ là nơi thành thục

và lưu giữ tinh trùng trong thời gian đợi phóng tinh

Ống dẫn tinh: Ống dẫn tinh bắt đầu từ đuôi dịch hoàn phụ, đi vào

xoang bụng và đổ vào ống dẫn niệu; phía cuối phình ra tạo thành một túi chứa lớn có dạng như một cái ampule, có nhiệm vụ hứng tinh trùng và dẫn tinh trùng đổ vào ống niệu

Các tuyến sinh dục phụ: Tuyến sinh dục phụ bao gồm tuyến tinh nang

(tuyến túi), tuyến tiền liệt (prostate), tuyến cầu niệu đạo (tuyến Cowper) Các tuyến này nằm dọc theo niệu quản, chúng tiết ra dịch lỏng đổ vào niệu đạo,

hỗn hợp với tinh trùng thành tinh dịch trước khi xuất tinh Dịch tiết của chúng làm tăng thể tích tinh dịch, cung cấp chất dinh dưỡng cho tinh trùng hoạt động, cung cấp chất đệm phosphate và carbonate để duy trì pH của tinh dịch, đảm bảo cho sự sống, sự vận động và khả năng thụ tinh của tinh trùng

Dương vật: Dương vật là cơ quan giao cấu ở con đực Dương vật trâu

có dạng cong hình chứ S Bình thường dương vật nằm trong bao dương vật, khi được kích thích thì dương vật cương lên và phần cong hình chữ S được làm thẳng ra Quy đầu là đầu mút tự do của dương vật Quy đầu nằm trong túi gọi là bao dương vật

1.1.2.2 Sinh lý sinh dục của trâu đực

Quá trình sinh tinh và thành thục của tinh trùng diễn ra liên tục kể từ khi con đực thành thục về tính dục Tuy nhiên, cường độ có thay đổi chút ít theo mùa Quá trình tạo tinh bắt đầu từ khi phân chia nguyên bào tinh cho đến khi bài tiết tinh trùng vào xoang ống dẫn tinh, thường kéo dài từ 48-50 ngày Các nguyên bào tinh phân chia và biệt hóa qua một giai đoạn loạt phân bào, cuối cùng hình thành nên tinh trùng Khi tinh trùng được hình thành đầy đủ chúng sẽ được đẩy ra hầu như tự do trong xoang ống sinh tinh (Hà Văn Chiêu,1999) [6]

Trâu đực có khả năng giao phối lúc 3 năm tuổi, thời gian sử dụng tốt nhất là 4-5 năm, tuy nhiên có thể khai thác tinh dịch tới hai chục năm nhưng tính hăng và kết quả phối giống sẽ giảm dần khi đực giống về già Một trâu đực có thể sử dụng phối giống trực tiếp cho 30-50 trâu cái, nhưng tỷ lệ ghép thích hợp là 1 đực 20 cái, tối đa không quá 30 cái Mỗi lần phóng tinh trâu đực xuất 2,5-3 ml tinh dịch, hoạt lực 70-80%, nồng độ 0,8-1 tỷ/ml Tần số phối giống tốt là 2-3 lần trong một tuần, nếu nhiều hơn thì phẩm chất tinh sẽ kém và tỷ lệ thụ thai thấp hơn Trâu đực không có chu kỳ tính dục nhưng phẩm chất tinh dịch cũng phần nào bị ảnh hưởng bởi mùa vụ, phẩm chất tinh trâu tốt nhất vào mùa thu so với các mùa khác trong năm do ảnh hưởng của thức ăn tốt trong mùa mưa (Nguyễn Văn Bình, Trần Văn Tường, 2007) [3]

Một khó khăn lớn trong công tác lai tạo với đàn trâu với trâu nội Việt Nam, đó là phần lớn trâu Murrah không có phản xạ sinh dục với trâu nội Tuy nhiên, nếu được trâu đực Murrah được nuôi ghép với trâu cái nội ngay từ bé, trong điều kiện chăn thả, thì trâu đực Murrah vẫn có phản xạ nhảy với trâu cái nội (Mai Văn Sánh, 1996) [12] Để khắc phục hiện tượng này, việc lai tạo giữa trâu đực Murah và trâu cái Việt Nam được thực hiện chủ yếu bằng kỹ thuật thụ tinh nhân tạo

1.1.2.3 Hình thái và hoạt động của tinh trùng trâu

a Hình thái và kích thước của tinh trùng

Tinh trùng trâu hình dạng giống con “nòng nọc” có chiều dài từ 68-80

µm, có thể chia làm 4 phần chính gồm đầu, cổ, đoạn giữa và đuôi (Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [7], cụ thể:

Đầu tinh trùng: Có hình Ovan dài từ 8,0 đến 9,5 µm, rộng từ 3,3 đến

5,5 µm, dày 2 µm, chứa nhân tế bào nơi có ADN - là vật chất di truyền các đặc điểm của con đực Bao lấy phần chỏm là thể đỉnh chứa enzyme hyaluronidaza có chức năng phá vỡ màng ngoài (Mucopolysaccarit) của tế bào trứng để mở đuờng cho nhân tinh trùng vào dung hợp với nhân của trứng

Sự nguyên vẹn của thể đỉnh giữ vai trò quan trọng như là chỉ số đánh giá về khả năng thụ tinh của tinh trùng

Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn cắm vào hõm của đáy ở đầu, dễ dàng bị

gãy Cổ chứa hai trung tử, trung tử gần nhân và trung tử xa nhân, là nơi bắt nguồn của bó trục của đuôi tinh trùng

Đoạn giữa: đoạn này ñuợc nối vào cổ và dày hơn đuôi, có chiều dài

14,8µm, đuờng kính trong khoảng từ 0,7 đến 1,0µm Đoạn giữa có một tập hợp sợi trục (2 sợi trục chính và 9 sợi vòng), bọc quanh là một bao ty thể xoắn

và màng tế bào chất Phía cuối của đoạn giữa là một vòng nhẫn, giàu phospholipids, chứa nhiều oxydase và cung cấp năng luợng cho tinh trùng

Đuôi tinh trùng: Là đoạn còn lại cho đến hết chót đuôi, có chiều dài từ

45 đến 60µm, đuờng kính từ 0,3 đến 0,7µm, gồm hai phần là đoạn chính và chót đuôi Đoạn chính có 9 sợi trục nối vào vòng nhẫn, bao quanh là một bó

sợi trục coi như nguyên sinh chất Chót đuôi là phần tận cùng của đuôi, chỉ gồm hai sợi trung tâm, đuợc bao bọc bằng màng tế bào

Nếu phân đoạn theo chức năng của từng bộ phận thì tinh trùng có thể chia thành hai phần chính: Phần đầu lưu giữ yếu tố di truyền và các men liên quan đến năng lực thụ tinh của tinh trùng; Phần đuôi là cơ quan có chức năng vận động bằng nguồn năng luợng của ty thể và cấu trúc của đuôi

b Hoạt động của tinh trùng

Trạng thái hoạt động của tinh trùng thể hiện chất lượng tinh dịch Nếu tinh trùng hoạt động càng mạnh thì chất lượng càng tốt Tinh trùng có 3 hình thức vận động cơ bản:

Vận động tiến thẳng: là vận động của những tinh trùng có khả năng thụ thai Vận động xoay tròn: là tinh trùng này thường không có khả năng thụ thai Vận động tại chỗ: là hình thức vận động của tinh trùng non, dị tật, chỉ

lắc lư tại chỗ Những tinh trùng này không có khả năng thụ thai

1.1.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch trâu

Việc khai thác tinh dịch trâu chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp dùng âm đạo giả và vào buổi sáng, trước khi cho ăn

Một số chỉ tiêu thường dùng đánh giá phẩm chất tinh dịch là thể tích tinh dịch (ml), nồng độ tinh trùng (tỷ/ml), hoạt lực tinh trùng (%), pH tinh dịch, tỷ

lệ tinh trùng kỳ hình (%), tỷ lệ tinh trùng sống (%) và tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần xuất tinh (tỷ/lần xuất tinh)

1.1.3.1 Thể tích tinh dịch V (ml)

Thể tích tinh dịch là số ml tinh dịch trong một lần khai thác Người ta xác định thể tích tinh dịch bằng ống đo có vạch đến 1/10 ml

1.1.3.2 Hoạt lực tinh trùng (A)

Hoạt lực tinh trùng là chỉ số phản ánh số lượng tinh trùng hoạt động tiến thẳng trong tinh dịch và được đánh giá bằng ước tính trực quan theo tỷ lệ phần trăm Hoạt lực tinh trùng là một trong những chỉ tiêu quan trọng và là

chỉ tiêu chủ yếu trong đánh giá chất lượng của tinh dịch Nếu chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng không đạt tiêu chuẩn sẽ không thể sản xuất được tinh đông lạnh có chất lượng tốt, cho dù các chỉ tiêu khác của tinh dịch vẫn đảm bảo tiêu chuẩn

1.1.3.3 Nồng độ tinh trùng (C – tỷ/ml)

Nồng độ tinh trùng là số lượng tinh trùng có trong một ml tinh dịch Nồng độ tinh trùng thường được tính bằng đơn vị tỷ/ml Tinh dịch có nồng độ tinh trùng càng cao phản ánh chất lượng tinh dịch càng tốt Nồng độ tinh dịch cùng với lượng xuất tinh được dùng để xác định lượng môi trường pha loãng

và số lượng tinh đông lạnh sản xuất được

1.1.3.4 Độ pH tinh dịch

Độ pH tinh dịch phản ánh nồng độ [H+] có trong tinh dịch pH của tinh dịch liên quan đến năng lực đệm, sức sống và năng lực thụ tinh của tinh trùng, đồng thời phản ánh chế độ dinh dưỡng cũng như trạng thái bệnh lý của cơ quan sinh dục đực

1.1.3.6 Tỷ lệ tinh trùng sống (Sg-%)

Tỷ lệ tinh trùng sống là chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng tinh dịch, vì nó liên quan khá chặt chẽ với khả năng sinh sản của gia súc Tỷ lệ tinh trùng sống phản ánh số tinh trùng sống trong liều tinh

1.1.3.7 Tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần xuất tinh (V.A.C - tỷ)

Tổng số tinh trùng tiến thẳng là tích của của 3 chỉ tiêu V.A.C, là chỉ tiêu tổng hợp đánh giá phẩm chất tinh dịch trong một lần xuất tinh hoặc trong một liều tinh VAC càng lớn phản ánh sức sản xuất của con đực càng cao hoặc chất lượng liều tinh càng tốt

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch

Các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch có mối tương quan với nhau

và chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như giống, cá thể, lứa tuổi, mùa vụ, dinh dưỡng, chăm sóc, quản lý

1.1.4.1 Giống, cá thể và độ tuổi

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, giống, cá thể và độ tuổi có ảnh hướng lớn đến số lượng và chất lượng tinh dịch Các giống khác nhau cho số lượng xuất tinh khác nhau Nordin và cs (1990) [48] cho biết lượng xuất tinh trung bình của trâu đầm lầy trưởng thành đạt 3,7ml, trong khi trâu Murrah có lượng xuất tinh trung bình đạt 2,58ml (Bhakat và cs 2011) [25] đến 2,93ml (Trịnh Thị Kim Thoa và cs, 2006) [15], trâu Nili-Ravi đạt tới 4,96ml (Javed và cs., 2000) [39] Hà Minh Tuân (2014) [18] cho biết, lượng xuất tinh trung bình của trâu Việt Nam đạt 3,89ml

Các giống trâu khác nhau cho chất lượng tinh dịch khác nhau Trịnh Thị Kim Thoa và cs (2006) [15] cho biết chất lượng tinh dịch của trâu Murrah nuôi tại Việt Nam và trâu đầm lầy có sự khác nhau rõ rệt Nồng độ, hoạt lực, tỷ lệ sống, tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng và độ pH của tinh trùng của trâu Murrah nuôi tại Việt Nam lần lượt là 1,03 tỷ/ml; 68,0%; 96,36%; 7,93%

và 6,63, trong khi đó các chỉ tiêu này ở trâu đầm lầy là 0,91 tỷ/ml; 64,36%; 95,78%; 7,30% và 6,87 Hà Minh Tuân (2014) [18] cho biết, trâu Việt Nam

có lượng xuất tinh, nồng độ và hoạt lực tinh trùng lần lượt là 3,89 ml, 1,14 tỷ/ml và 75,08%

Các nghiên cứu cũng cho biết, giữa các cá thể trâu có sự khác biệt về số lượng, chất lượng tinh dịch (Kumar và cs., 1993a) [41] McCool và Entwistle (1989) [47] thấy có sự khác biệt giữa các cá thể trâu đầm lầy về chu vi dịch hoàn, tuổi dậy thì, thành thục tính dục từ đó ảnh hưởng tới số lượng, chất lượng tinh Các nghiên cứu trên trâu Murrah và trâu Surti cũng có kết quả tương tự Mahmoud và cs (2013) [43] cũng nhận thấy các cá thể trâu Murrah khác nhau đáng kể về lượng xuất tinh và nồng độ tinh trùng (P <0,05)

1.1.4.2 Yếu tố ngoại cảnh

a) Mùa vụ:

Yếu tố mùa vụ ảnh hưởng trực tiếp tới gia súc thông qua nhiệt độ, độ

ẩm, lượng mưa … Nhiệt độ cao sẽ gây ra stress đối với giá súc, gián tiếp ảnh hưởng tới số lượng và chất lượng tinh dịch Trong mùa hạ, nồng độ thyroxin tiết giảm dẫn đến giảm lượng thức ăn ăn vào của động vật, giảm sự trao đổi chất và từ đó làm giảm quá trình sinh tinh Do gia súc bị stress nhiệt nên có thể kiệt sức và giảm hưng phấn sinh dục, giảm khả năng khải thác tinh (Mandal và cs, 2000) [44]

TrịnhThị Kim Thoa và cs (2006) [16] cho biết, chất lượng tinh dịch trâu Murrah và trâu đầm lầy trong mùa xuân và thu tốt hơn mùa hè và đông, trong khi đó Hà Minh Tuân (2014) [18] lại cho biết chất lượng của trâu Việt nam trong mùa thu và đông tốt hơn so với mùa xuân và hè Sự giảm chất lượng tinh dịch trong mùa hè có liên quan tới sự gia tăng của nhiệt độ môi trường xung quanh trong những tháng nóng dẫn đến xáo trộn trong hoạt động sinh sản của trâu

b) Thức ăn

Thức ăn có vai trò đặc biệt quan trọng trong sinh trưởng phát triển và sinh sản của gia súc, là một trong những yếu tố quyết định đến số lượng, chất lượng tinh dịch của con đực

Việc thiếu hụt dinh dưỡng vitamin, khoáng chất đa lượng và vi lượng

đã làm giảm chất lượng tinh dịch Vitamin A và E có liên quan trực tiếp đến chất lượng của tinh dịch trong tất cả các loài vật nuôi Thiếu hụt selen làm tăng kỳ hình đuôi tinh trùng Các axit amin cũng có tác dụng cải thiện chất lượng tinh dịch, việc bổ sung lysine và methionine vào thức ăn cho trâu giúp tăng số lượng, chất lượng tinh dịch và chất lượng tinh đông lạnh (Singh và cs, 2000a) [52]

c) Quản lý, chăm sóc

Các yếu tố quản lý, chăm sóc, khai thác và sản xuất tinh đông lạnh cũng ảnh hưởng tới chất lượng tinh trâu Việc phun nước làm mát cho trâu trong những tháng mùa hạ nóng làm giữ ổn định chất lượng tinh dịch trong

năm (Jainudeen và cs, 1982) [38] Kỹ thuật kích thích hưng phấn nhảy giá khai thác tinh ở trâu đực làm tăng nồng độ tinh trùng

Koonjaenak và cs (2007) [40] thấy rằng, tần suất khai thác tinh ảnh hưởng đến các dạng kỳ hình về kích thước đầu tinh trùng, kỳ hình đuôi có mảng bám và đuôi cong Ngoài ra, việc tiêm phòng bệnh truyền nhiễm, một mặt giúp gia súc tránh được bệnh dịch nhưng mặt khác cũng làm ảnh hưởng đến số lượng, chất lượng tinh dịch vì tiêm phòng vắc xin gây phản ứng sốt sau tiêm chủng Khai thác tinh một lần trong một tuần là hợp lý nhất cho gia súc có độ tuổi từ 2 đến 3 năm Việc thực hiện tốt kỹ năng kích thích hưng phấn nhảy giá và

kỹ thuật lấy tinh bằng âm đạo giả của người khai thác tinh gia súc sẽ giúp thu được số lượng tinh dịch nhiều hơn

1.1.5 Các nguyên lý cơ bản, yếu tố ảnh hưởng và vai trò của môi trường pha loãng trong đông lạnh tinh dịch trâu

1.1.5.1 Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch

a) Hiện tượng đóng băng chất lỏng

Khi chất lỏng bị làm lạnh xuống nhiệt độ quá thấp sẽ xảy ra hiện tượng đóng băng Quá trình này xảy ra qua các giai đoạn sau:

Tiền đóng băng: là quá trình làm lạnh một chất lỏng Nếu tốc độ làm

lạnh chậm, nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đóng băng mà chất lỏng vẫn giữ nguyên trạng thái và chưa có tinh thể đóng băng Trạng thái của chất lỏng lúc này là không ổn định, chỉ cần một tác động nhẹ là xảy ra hiện tượng tạo nhân hoặc phá vỡ hiện tượng tạo nhân tinh thể thay vào đó là hiện tượng kết

hạt (Ditto, 1992) [33]; (Weize, 1991) [60]

Tạo nhân tinh thể: một chất lỏng đóng băng phải có một hạt nhỏ làm

nhân cho các phân tử nước lần lượt bám vào để hình thành tinh thể Hiện

tượng tạo nhân tinh thể có hai hình thái Đối với nước nguyên chất, việc tạo nhân từ hạt tinh thể nước; đối với dung dịch, các hạt chất tan làm nhân cho các phân tử nước bao quanh tạo tinh thể

Giãn nở của tinh thể băng: khi đóng băng các tinh thể hình thành, thể

tích của chúng sẽ tăng lên, sự giãn nở thể tích này giải phóng năng lượng tiềm

ẩn trong các phân tử nước làm cho nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đóng băng mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục (Iritani, 1989) [37] Tại thời điểm đóng băng, nhiệt độ của dung dịch không đổi trong một giai đoạn nhất định

và giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc độ đóng băng Nếu tốc độ đóng băng nhanh thì giai đoạn trên sẽ ngắn và sự giãn nở của tinh thể sẽ bị loại trừ và thay vào đó là hiện tượng tinh thể hóa

Kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (EP/Entectic point): khi

hiện tượng làm lạnh tiếp tục, lượng tinh thể nước tăng lên và pha lỏng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng và dung dịch sẽ tách ra làm 2 phần: pha tinh thể

và pha lỏng Nếu hiện tượng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ biến mất ở nhiệt

độ nhất định Điểm đó gọi là điểm đóng băng hoàn chỉnh của một dung dịch

(Weize, 1991) [60]

b) Ảnh hưởng của đóng băng lên tế bào tinh trùng

Tinh trùng là một tế bào đặc biệt rất mẫn cảm với các yếu tố ngoại cảnh Khi đông lạnh, tinh trùng bị ảnh hưởng bởi các hiện tượng sau:

Hiện tượng đóng băng nội bào: tinh trùng bị chết hoặc bị mất năng lực

hoạt động khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nuớc nội bào Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch nuớc muối sinh lý có thể loại trừ đuợc hiện tuợng này, vì được các phân tử nuớc dạng lỏng bao quanh, mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đóng băng ở nhiệt độ -2oC hoặc -5oC Như vậy, quá trình đóng băng sẽ không làm hại tới tế bào tinh trùng cho đến khi nuớc nội bào đông lạnh mặc dù dung môi môi truờng bao quanh đã đông lạnh

(Mazur, 1989) [46]

Sự mất nước của tế bào tinh trùng: nếu nước nội bào thoát ra ngoài,

tinh trùng sẽ bị teo lại nhưng vẫn có tinh trùng sống được ở nhiệt độ thấp hoặc cực thấp -196oC Trong quá trình làm lạnh, nước ngoại bào đóng băng làm áp suất thẩm thấu chênh lệch, nước nội bào thoát ra khỏi tinh trùng và tiếp tục đông băng phần ngoại bào Có 80% nước nội bào bị đông lạnh ở -

150C và được thoát ra ngoài, do đó ngăn ngừa được hiện tượng đóng băng nội bào (Hà Văn Chiêu, 1999) [6]

Hiện tượng đóng băng ngoại bào: trong quá trình đông lạnh, hiện

tượng đóng băng nước ngoại bào sẽ xảy ra làm nồng độ dung dịch tăng lên và ASTT ngoại bào cao hơn ASTT nội bào dẫn đến sự thoát nước nội bào ra môi trường, pH cũng thay đổi (Iritani, 1989) [37]

Chuyển động của nước và sự giãn nở của tinh thể nước gây ra hủy hoại

cơ học đối với tinh trùng: Hiện tuợng giải đông giống như đông lạnh, có ảnh

huởng đến tinh trùng do chênh lệch áp suất thẩm thấu, sự di chuyển của nước qua màng tế bào tinh trùng và sự giãn nở của các tinh thể nước đá trong quá trình đông lạnh hoặc tan băng có thể gây tổn thương tinh trùng Bọt khí tồn tại trong tinh thể băng cũng có thể gây tổn hại tinh trùng trong quá trình này (Hà Văn Chiêu, 1999) [6])

1.1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng sau đông lạnh

Khả năng chịu lạnh của tinh trùng là tỷ lệ sống sót của tinh trùng sau khi giải đông Khả năng chịu lạnh của tinh trùng còn gọi là sức kháng lạnh Sức kháng lạnh của tinh trùng phụ thuộc vào giống, độ tuổi lấy tinh, mùa vụ lấy tinh…

Thành phần môi trường pha loãng cũng ảnh hưởng đến sức kháng của tinh trùng Môi trường pha loãng bao gồm chất có năng lượng, chất đệm, chất chống đông, chất điện giải… Tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh và giải đông phụ thuộc vào các thành phần trên Nếu thành phẩn tỷ lệ các chất liệu cấu tạo môi trường không hợp lý sẽ làm giảm hoạt lực, tăng tỷ lệ chết của tinh trùng

Thời gian cân bằng khi đông lạnh tinh dịch: Tinh trùng sau khi ra ngoài

cơ thể rất dễ bị sốc nhiệt do sự chênh lệch giữa nhiệt độ trong cơ thể và nhiệt

độ môi trường ngoài cơ thể Chính vì vậy, cần thiết phải hạ nhiệt độ từ từ để tinh trùng làm quen với nhiệt độ thấp Theo Ditto (1992) [33], thời gian cân bằng khoảng 3-5h ở nhiệt độ 50C có tác dụng làm tinh trùng quen với nhiệt

độ thấp và nâng cao tỷ lệ tinh trùng sống sau đông lạnh Trịnh Thị Kim Thoa

và cs (2006) [15] cho biết, thời gian làm lạnh tinh dịch tinh trâu đầm lầy từ

370C đến 40C trong 2 giờ cho kết quả bảo tồn tốt hơn so với thời gian làm lạnh trong 1 giờ hoặc trên 1 giờ đến dưới 2 giờ

Tốc độ đông lạnh cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của tinh trùng Khi đông lạnh sâu để tinh trùng đóng băng, tốc độ đông lạnh nhanh hay chậm quyết định đến hoạt lực tinh trùng sau giải đông Trịnh Thị Kim Thoa và cs (2006) [15] nhận thấy, đông lạnh tinh trâu đầm lầy với tốc độ 130C/phút trong giai đoạn hạ nhiệt từ + 40C đến – 350C, 650C/phút trong giai đoạn từ -

300C đến -1350C và 40C/phút trong giai đoạn từ -1350C đến -1500C cho kết quả tốt nhất

Tốc độ giải đông có ảnh hưởng lớn đến hoạt lực tinh trùng: Tinh cọng

rạ (0,5ml/cọng) giải đông bằng nước ấm ở 370C trong 5 giây và 30 giây thì hoạt lực tương ứng 34% và 29% (Davies Morel, 1999) [31]

Chế độ bảo quản có ảnh hưởng lớn đến sức sống của tinh trùng sau giải đông Tinh trùng sau đông lạnh luôn phải được bảo quản trong nitơ lỏng (-1960C) Nếu bảo quản tốt sau vài chục năm, tỷ lệ sống và sức hoạt động của tinh trùng vẫn không thay đổi, khả năng thụ thai vẫn không bị giảm (Hà Văn Chiêu, 1996) [6]

1.1.5.3 Vai trò của môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch trâu

Môi trường pha loãng tinh dịch là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tồn tại của tinh trùng trong quá trình đông lạnh Theo Ivanop (1890) được Nguyễn Đức Hùng và cs, (2003) [9] trích dẫn, môi trường pha loãng và bảo tồn tinh dịch là một môi trường lý, hóa học, đáp ứng đầy đủ các điều kiện sống và trao đổi chất của tinh trùng và sau khi bảo tồn có khả năng hồi phục chức năng hoạt động và thụ tinh Vì vậy, môi trường phải đảm bảo các nguyên tắc cơ bản sau: áp lực thẩm thấu phải tương đương với áp lực thẩm thấu của tinh dịch; có độ pH tương đương với pH của tinh dịch hoặc toan yếu (6,4-6,7); có năng lực đệm để ổn định pH trong quá trình bảo tồn; có các chất điện giải và không điện giải hợp lý; có các đặc điểm vật lý (độ nhớt, tỷ trọng ) phù hợp để tinh trùng sống, hoạt động (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [9] Đặc biệt, đối với môi trường pha loãng, đông lạnh tinh dịch phải bổ sung vào môi trường chất chống choáng lạnh

Để đáp ứng các nguyên tắc trên, các môi trường pha loãng, bảo tồn tinh thường có các thành phần chất yếu sau:

- Chất cung cấp năng lượng

Chất cung cấp năng lượng thường dùng trong môi trường là các loại đường, như glucoza, fructoza, lactoza và Raffinose hydrate Ngoài vai trò cung cấp năng lượng, đường còn có tác dụng bảo vệ màng tinh trùng, giúp tinh trùng tránh được hiện tượng mất điện tích và không gây tụ dính cho tinh trùng; giải độc cho tinh trùng, ổn định tỷ lệ chất điện giải và chất không điện giải (Nguyễn Mạnh Hà và cs, 2012) [8] Khi pha loãng tinh dịch bằng những dung dịch trên thì các vi khuẩn gây mủ bị kìm hãm, ít phát triển và có lợi cho đời sống tinh trùng (Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1]

- Chất đệm

Trong quá trình bảo tồn, tinh trùng vẫn sống và trao đổi chất bằng quá trình đường phấn yếm khí, mà sản phẩm cuối cùng là axit lactic, có xu hướng làm giảm độ pH của môi trường, có nguy cơ đầu độc tinh trùng Vì vậy, người

ta cần phải cho vào môi trường để ổn định độ pH Có nhiều chất hóa học được dùng làm chất đệm, Tris là một trong các chất đó Tris (hydroxymethyl -amino-methane) là một hóa chất quan trọng trong quá trình đông lạnh tinh dịch gia súc Theo Andrabi (2009) [23], Tris-citric axit có thể cung cấp các hệ thống đệm tốt nhất để cải thiện chất lượng tinh trùng sau giải đông và do đó cũng có thể cải thiện khả năng sinh sản của tinh trùng trâu Tris-citric và Tris-citrate làm tăng hoạt lực và khả năng sống của tinh trùng sau giải đông (Dhamivà cs., 1994) [32]

- Chất chống choáng lạnh

Glycerol là chất bảo vệ lạnh được sử dụng nhiều nhất trong các môi trường pha loãng tinh dịch Tác dụng bảo vệ tinh trùng trong quá trình đông lạnh của glycerol do nó tăng áp suất thẩm thấu của dịch ngoại bào để kéo nước trong tế bào ra ngoài, qua đó làm giảm nguy cơ hình thành tinh thể băng trong tế bào, hạ thấp điểm đóng băng của nước trong tế bào Nghiên cứu của Andrabi (2006) [22] về ảnh hưởng của các nồng độ glycerol khác nhau trong

môi trường pha loãng tinh trâu (2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 10% hoặc 12%) cho biết, ở nồng độ 7% glycerol tinh trùng trâu sau giải đông có hoạt lực, tỷ lệ sống và tính toàn vẹn màng tế bào tốt hơn so với các nồng độ glycerol khác

Lòng đỏ trứng cũng có tác dụng ''bảo vệ'' cho tinh trùng chống được hiện tượng choáng lạnh, chức năng này được thực hiện nhờ một dạng lipit của lòng đỏ trứng Lipit có trong lòng đỏ trứng gà chiếm 32,6% Thành phần của lipit lòng đỏ trứng gồm: 62,3% Glyxeryl, 32,8% photpholipit, 4,9% steron (Nguyễn Tấn Anh, 1996) [1]

- Chất kháng khuẩn

Môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch cần phải bổ sung chất kháng khuẩn để bảo vệ tinh trùng Chất kháng khuẩn thường được dùng trong môi trường đó là Penicillin, Streptomycin, Tetracyline

Nhóm Pencilline có tác dụng ức chế sự tổng hợp các mucoproteit của

vỏ tế báo vi khuẩn Vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng sẽ lớn lên về kích thước, vỏ tế bào mỏng ra ở một số điểm để chuẩn bị cho sự phân chia Tại các điểm mỏng yếu nhất của vỏ, penicilline được gắn vào và phong bế enzym chuyển hóa protit thành mucoproteit, làm cho vỏ tế bào vi khuẩn không được

bổ sung, dẫn đến cấu trúc bị thiếu sót Trong khi đó, thể tích nguyên sinh ở bên trong vẫn tăng lên gây ra áp lực ngày càng cao ở bên trong màng tế bào,

do đó tế bào vi khuẩn bị vỡ tung ra do áp lực từ bên trong, người ta gọi là hiện tượng dung giải vi khuẩn Kết quả cuối cùng là tế bào vi khuẩn bị chết (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [9]

Nhóm Streptomycine có tác động lên các ARN thông tin, làm cho nó chọn nhầm axit amin trong quá trình tổng hợp protit Quá trình này làm cho vi khuẩn tổng hợp ra một đa protein không đặc hiệu, vô nghĩa Kết quả cuối cùng là vi khuẩn không thể sinh sản được và chết trong một thời gian ngắn (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [9]

Tetracyline có tác dụng cản trở các ARN vận chuyển, không cho các ARN này vận chuyển axit amin đến ribosome Vì ở ribosome không có sẵn

các axit amin nên quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn không thể hiện được, do đó vi khuẩn mới không được hình thành và chết trong một thời gian ngắn (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [9]

- Chất “rửa sạch” môi trường

Trong tinh dịch có các ion kim loại nặng đa hóa trị như: Ca2+, Fe2+,

Al3+ gây độc cho tinh trùng trong quá trình bảo tồn Chính vì vậy, cần phải

bổ sung vào trong môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch chất làm sạch môi trường Chất làm sạch môi trường là những chất có khả năng liên kết các ion kim loại đa hóa trị có trong tinh dịch tạo thành phức vô hại với tinh trùng Trilon B là một trong những chất có khả năng đó (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2003) [9]

1.1.6 Kỹ thuật đông lạnh và giải đông tinh dịch trâu

1.1.6.1 Kỹ thuật đông lạnh tinh dịch trâu

Sau khi pha loãng với môi trường, tinh dịch được làm lạnh đến nhiệt độ 4-50C, đây là khoảng thời gian để tinh trùng thích nghi với quá trình giảm trao đổi chất, tránh sốc lạnh làm tổn thương màng tế bào Quá trình làm mát chậm, tốc độ mất nước trong tế bào tinh trùng đảm bảo điểm cân bằng thẩm thấu nội ngoại bào, quá trình làm mát nhanh khiến cho nước bên trong tế bào không thoát ra ngoài kịp thời dẫn đến hình thành tinh thể băng trong quá trình đông lạnh làm tổn hại tế bào tinh trùng Andrabi (2009) [23] cho biết, tốc độ làm mát từ 0,20C/phút đến 0,40C/phút được khuyến khích trong khi đông lạnh tinh dịch trâu

Trong giai đoạn cân bằng, glycerol thâm nhập vào tế bào tinh trùng và đảm bảo sự cân bằng nội ngoại bào Tuli và cs (1981) [56] thấy rằng, chất lượng tinh sau giải đông khi cân bằng glycerol trong 4 giờ tốt hơn so với 2 giờ hoặc 6 giờ Theo Dhami và Sahni (1994) [32] cho rằng thời gian cân bằng tinh dịch trong khoảng 2-4 giờ Tuy nhiên, các tác giả đều nhận định chung tinh dịch trâu nên

để ở 50

C trong khoảng thời gian từ 2 đến 6 giờ trước khi đông lạnh

Sau khi cân bằng lạnh, tinh dịch được đóng gói dưới dạng cọng rạ hoặc dạng viên Nhưng hiện nay, tinh trâu đông lạnh được đóng gói trong cọng rạ

0,25 ml hoặc 0,5 ml và được cân bằng glycerol trước khi đưa vào đông lạnh trong hơi nitơ lỏng Cọng rạ 0,25ml được sử dụng nhiều do chi phí sản xuất thấp hơn, tiết kiệm được môi trường pha loãng tinh dịch và không gian lưu trữ tinh đông lạnh Theo Ansari và cs (2011) [24], hoạt lực sau giải đông cũng bị tác động bởi thể tích cọng rạ, sử dụng loại cọng rạ 0,25ml để đông lạnh tinh trùng trâu cho kết quả hoạt lực tinh trùng cao hơn so với loại cọng rạ 0,5ml (P<0,05)

Đông lạnh trong hơi nitơ lỏng có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một hộp đẳng nhiệt đơn giản Các ống hút được treo ở vị trí ngang 1cm đến 4

cm trên nitơ lỏng trong 10-20 phút, sau đó cho ngập trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C (El-Sisy và cs., 2010 [34]; Ansari và cs., 2011 [24])

Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc đông lạnh tinh trâu bằng hệ thống máy móc chuyên dụng được lập trình sẵn góp phần nâng cao chất lượng và hiệu quả sản xuất tinh Vale (1997) [57] đã tiến hành giảm nhiệt

độ tinh dịch trâu với tốc độ 180

C/phút trong giai đoạn từ +40C xuống -400C, sau đó tiếp tục giảm nhiệt độ xuống -1400C với tốc độ 80C/phút cho kết quả tốt Sukhato và cs (2001) [53] cho biết, hoạt lực tinh trùng trâu tốt hơn khi đông lạnh tinh trâu bằng phương pháp giảm nhiệt độ từ 40C xuống -1200C với tốc độ

200C/phút hoặc 300C/phút

1.1.6.2 Kỹ thuật giải đông tinh trâu đông lạnh

Kỹ thuật giải đông tinh đông lạnh có vai trò quan trọng đến chất lượng tinh trùng sau giải đông Quá trình giải đông cần làm tan băng nhanh để ngăn chặn sự tái kết tinh bên trong tế bào, phục hồi trạng thái cân bằng nội ngoại bào tốt hơn Việc giải đông chậm dễ xảy ra những rối loạn pH, biến tính protein do nhiệt độ cao và gây chết tế bào

Nhiều tác giả đã công bố nhiệt độ và thời gian giải đông tinh trâu đông lạnh với các mức khác nhau Dhami và cs (1994) [32] thí nghiệm giải đông tinh trâu ở 40C trong 5 phút, 400C trong 1 phút hoặc 600C trong 15 giây Kết quả cho thấy, giải đông tinh trâu ở 600C trong 15 giây giúp chất lượng tinh trùng tốt hơn

Vale (1997) [57] tiến hành giải đông tinh trâu đông lạnh trong cốc ở

400C trong 30 giây Kumar và cs (1993b) [42] giải đông ở 370C trong 30 giây

Theo Sukhato và cs (2001) [53] cho biết giải đông tinh trâu đông lạnh với tốc độ 10000C/phút (giải đông nhanh) tốt hơn so với tốc độ 2000C/phút (giải đông chậm) về hoạt lực tinh trùng và tính toàn vẹn của acrosome

1.1.7 Giới thiệu môi trường pha loãng, đông lạnh tinh dịch trâu dùng trong nghiên cứu

Môi trường pha loãng, đông lạnh tinh dịch trâu là môi trường của Nhật Bản (Vũ Đình Ngoan và cs 2010) [11] với 03 mức glycerin là 6,5; 7,5 và 8,5%

a) Thành phần môi trường như sau:

b) Vai trò và cơ chế tác dụng của các thành phần có trong môi trường:

- Tris có tác dụng làm tăng thêm sức đệm cho môi trường, duy trì áp lực thẩm thấu

- Axit Citric là chất chống oxi hóa

- Fructose, Lactose, Raffinose là chất cung cấp năng lượng cho tinh trùng, bảo vệ màng tinh trùng và giải độc cho tinh trùng

- Penicillin G, Streptomycin là chất kháng khuẩn để hạn chế tác hại của

vi khuẩn với tinh trùng

- Lòng đỏ trứng gà có tác dụng bảo vệ tinh trùng chống hiện tượng choáng lạnh

- Glycerin có tác dụng chống lạnh, chống sự phá vỡ của tế bào và giữ được sự ổn định về nồng độ của các chất hoà tan, không làm thay đổi ASTT

và hạn chế việc phá hủy các protein của tinh trùng

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong nhiều năm qua, công tác phát triển đàn trâu ở Việt Nam chưa được quan tâm đúng mức, tình trạng thiếu trâu đực giống có ở nhiều nơi, hiện tượng giao phối cận huyết khá phổ biến dẫn đến đàn trâu có chiều hướng suy giảm cả về số lượng, tầm vóc và khối lượng (Nguyễn Quang Tuyên và cs, 2006) [19] Việc sử dụng trâu đực giống khối lượng lớn giúp đàn trâu địa phương nâng cao về tầm vóc và sinh trưởng, phát triển, khối lượng nghé từ sơ sinh đến 36 tháng tuổi tăng từ 8,5% đến 21,1% (Mai Văn Sánh và cs, 2008) [13] Do vậy, để phát triển và cải thiện nhanh chất lượng đàn trâu nội, tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi trâu, công tác TTNT đóng vai trò rất quan trọng

Hiện nay, ở nước ta những nghiên cứu về số lượng, chất lượng tinh dịch, kỹ thuật đông lạnh tinh và TTNT chủ yếu thực hiện trên bò sữa, bò thịt

và đã mang lại những kết quả to lớn trong công tác phát triển chăn nuôi bò Tuy nhiên, kỹ thuật TTNT cho trâu chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều, chỉ có một số ít công trình nghiên cứu về sinh sản của trâu, TTNT cho trâu, lai tạo trâu và đông lạnh tinh trâu

Lê Viết Ly và Võ Sinh Huy (1982) [10], Mai Văn Sánh (1996) [12] đã nghiên cứu bảo tồn tinh trâu trong môi trường lỏng gồm: Citrat natri H2O, glycagol, trilon B, tetracycline, lòng đỏ trứng gà và nước cất Kết quả bảo tồn tinh trâu được 2 ngày, hoạt lực tinh trùng đạt 55,2% đến 61%, tỷ lệ thụ thai khi phối TTNT đạt 53,65% khi tiến hành phối kép

Lê Việt Anh và cs (1984) [2], Nguyễn Hữu Trà và cs (2001) [17] nghiên cứu sản xuất tinh trâu đông lạnh Murrah dạng viên trong môi trường pha loãng đông lạnh của bò (Nagase) và môi trường Triladyl nhập của Đức Hoạt lực sau giải đông đạt khoảng 35%, tỷ lệ thụ thai khi phối TTNT đạt khoảng 50% khi phối kép

Trong nghiên cứu sản xuất tinh trâu Murrah và trâu đầm lầy đông lạnh dạng cọng rạ, Trịnh Thị Kim Thoa (2006) [15] đã sử dụng 3 môi trường gồm Citrat-L (natri citrat, fructose, 25% lòng đỏ trứng gà, 7,5% glycerol, 1.000 UI Penicillin/ml, 1.000µg Streptomycin/ml), Citrat-G (natri citrat, glucose, 20% lòng đỏ trứng gà, 7,5% glycerol, 1.000 UI Penicillin/ml, 1.000µg Streptomycin/ml) và TCA (26,2g tris, 14,2g axit citric, 12g fructose, 1.000ml nước cất, 20% lòng đỏ trứng gà, 7,5% glycerol, 1.000 UI Penicillin/ml, 1.000µg Streptomycin/ml), kết quả cho thấy hoạt lực sau giải đông của tinh đông lạnh lần lượt đạt 22,5% (môi trường Citrat-L), 37,5% (môi trường Citrat-G) và 42,5% (môi trường TCA)

Tạ Văn Cần và cs (2006) [5] cho biết, trâu đực Murrah nuôi tại Thái Nguyên có thể tích tinh dịch dao động từ 2,35ml đến 3,51ml, hoạt lực tinh trùng dao động từ 72,21% đến 73,24%, nồng độ tinh trùng dao động từ 0,81 tỷ/ml đến 0,83 tỷ/ml, tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần xuất tinh dao động từ 1,38 tỷ đến 2,09 tỷ Tinh đông viên có hoạt lực tinh trùng sau giải đông trên 30% và tổng số tinh trùng tiến thẳng đạt từ 12,0 triệu đến 12,5 triệu/viên được coi là đủ tiêu chuẩn để TTNT Kết quả TTNT tinh đông viên cho đàn trâu cái địa phương đạt tỷ lệ thụ thai đạt 33,7%; Phối giống bằng tinh lỏng có tỷ lệ thụ thai đạt 39,1% Khi cho trâu đực Murrah nhảy trực tiếp trâu cái nội, tỷ lệ thụ thai đạt 72,5% (Tạ Văn Cần và cs, 2006) [5]

Vũ Đình Ngoan và cs (2010) [11] cho biết, tinh dịch trâu Murrah có màu trắng và trắng ngà, thể tích tinh dịch đạt 3,02ml, hoạt lực tinh trùng đạt 73,67%, nồng độ tinh trùng đạt 0,947 tỷ/ml, tổng số tinh trùng tiến thẳng đạt 2,36 tỷ/lần khai thác, tỷ lệ kỳ hình là 9,73%, pH là 6,57 Tác giả cũng cho biết hoạt lực tinh trùng sau giải đông thay đổi với các nhiệt độ và thời gian giải đông khác nhau

Như vậy, các nghiên cứu về sản xuất tinh trâu đông lạnh nói chung và tinh trâu dạng cọng rạ nói riêng ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở bước đầu xác định khả năng sản xuất tinh của một số ít trâu đực thí nghiệm, tinh đông lạnh sản xuất chỉ được sử dụng trong phạm vi hẹp hoặc trong khuôn khổ nội dung của các đề tài nghiên cứu và có xu hướng nghiên cứu nhiều trên đối tượng trâu Murrah Tuy nhiên, việc nghiên cứu về môi trường đông lạnh và ứng dụng tinh đông lạnh để TTNT cho trâu cái Việt Nam còn hạn chế

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Lần đầu tiên, Ivanop (1890) đã chỉ ra rằng có thể thay thế tinh thanh bằng môi trường nhân tạo và ý tưởng này đã đặt nền móng cho việc điều chế môi trường pha tinh mà ngày nay đang sử dụng rất phổ biến Một bước đột phá trong bảo quản tinh trùng là việc sử dụng thành công glycerol bảo quản lạnh tinh trùng động vật

Ấn Độ đã sản xuất tinh trâu đông lạnh phục vụ công tác TTNT trên đàn trâu từ năm 1955 Đến nay đã có 48 trạm sản xuất tinh đông lạnh với hơn 3 nghìn trâu, bò đực giống, hàng năm sản xuất trên 61 triệu liều tinh đông lạnh phục vụ công tác TTNT trâu, bò trong cả nước (DAHDF, 2013) [29]

Trâu Murrah đã được nhập vào Argentina từ Brazil từ những năm

1900, nhưng số lượng tổng đàn chỉ khoảng 15.000 con và tập trung chủ yếu ở tỉnh tỉnh Corrientes (chiếm 60%) Do vậy, mức độ giao phối cận huyết của đàn trâu là rất cao, làm giảm khả năng sinh sản của trâu Nhờ kỹ thuật TTNT với việc sử dụng tinh trâu đông lạnh sâu mà Argentina đã khắc phục được hạn chế này với đàn trâu trong nước Tỷ lệ phối giống lần 1 có chửa trong TTNT trâu đạt 56,8% Tỷ lệ đậu thai của toàn đàn đạt 71,8% (Crudeli, 1999) [28]

Nghiên cứu về ảnh hưởng của các giống trâu đến chất lượng tinh dịch, theo Nordin và cs (1990) [48] nhận thấy, trâu đầm lầy trưởng thành có tỷ lệ tinh trùng sống đạt 69,9%; trong khi đó trâu Murrah tỷ lệ tinh trùng sống đạt 77,77% (Capitan và cs., 1990) [27]

Rehman và cs (2012) [49] cho biết, trâu Kundi có pH tinh dịch đạt 5,81 và dao động từ 5,15 đến 6,53 thấp hơn nhiều so với trâu đầm lầy và các giống trâu sông khác như Murrah, Nili-Ravi, Surti thì pH dao động từ 6,26 đến 7,5 (Terezinha và cs., 1991 [54]; Javed và cs [39], 2000; Mandal và cs.,

2000 [44]; Sajjad và cs., 2007 [50]; Koonjaenak và cs., 2007 [40])

McCool và Entwistle (1989) [47] cho biết, tuổi dậy thì của trâu đầm lầy trung bình ở 24 tháng tuổi, thành thục tính dục ở giai đoạn từ 30 đến 33 tháng tuổi và lượng xuất tinh tăng theo tuổi (Jainudeen và cs, 1982) [38] Javed và cs (2000) [39] quan sát thấy ở trâu sông, có sự khác biệt đáng kể lượng xuất tinh giữa các trâu có độ tuổi khác nhau

Nordin và cs (1990) [48], Koonjaenak và cs (2007) [40] cho biết, hoạt lực tinh trùng của trâu đầm lầy có sự khác nhau giữa các độ tuổi Những trâu già có hoạt lực tinh trùng và nồng độ tinh trùng kém hơn so với trâu ở độ tuổi thành thục tính dục và trưởng thành (Javed và cs, 2000) [39] Theo Koonjaenak và cs (2007) [40], tuổi trâu ảnh hưởng đến dạng tinh trùng kỳ hình có giọt bào tương

Nghiên cứu về lựa chọn môi trường thích hợp pha loãng tinh dịch thì Koonjaenak (2007) [40] cho biết, tinh dịch trâu có hoạt lực tinh trùng không nhỏ hơn 70% được pha loãng với môi trường Tris - Lòng đỏ trứng gà, có bổ sung 8% glycerol và đưa vào đông lạnh sẽ cho chất lượng tinh trùng sau giải đông cao

Vale (1997) [57] cho rằng, thời gian chiếu sáng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh sản và hoạt động tình dục của trâu đực Mandal và cs (2000) [44] cho biết, hoạt lực tinh trùng trâu trong mùa xuân và mùa mưa là tốt hơn trong mùa hạ nóng ẩm Al-Sahaf và Ibrahim (2012) [26] cũng nhận thấy, hoạt động sinh sản của trâu, số lượng, chất lượng tinh dịch tăng lên trong những tháng có nhiệt độ vừa và thấp, giảm trong những tháng

có nhiệt độ cao Trái lại, Koonjaenak và cs, (2007) [40] lại quan sát thấy lượng xuất tinh, hoạt lực tinh trùng, nồng độ tinh trùng không bị ảnh hưởng bởi yếu tố mùa vụ, nhưng có ảnh hưởng dạng kỳ hình tinh trùng ở phần đầu

Kết quả nghiên cứu bổ sung thức ăn cho trâu đực trẻ từ 15 tháng tuổi cho thấy, trâu đực sử dụng thức ăn có khô dầu hạt bông có thời gian khai thác tinh sớm nhất và nồng độ tinh trùng đạt cao nhất Việc bổ sung thức ăn khác

nhau cho trâu đực trẻ đã ảnh hưởng đồng thời ảnh hưởng đến chất lượng tinh

do tác động tới nồng độ testosteron trong máu (Dahiya và Singh, 2013) [30] Ngoài ra, việc giảm thức ăn xơ thô, bổ sung các chất chống oxy hóa (kẽm, selen, vitamin E) trong mùa hạ cũng có tác dụng cải thiện sức khỏe và khả năng sinh sản của gia súc (Dahiya và Singh, 2013) [30]

Thái Lan đã phát triển công tác TTNT trâu từ năm 1956 với sự trợ giúp của FAO Các trung tâm TTNT được mở ra ở nhiều khu vực trong cả nước

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- 03 trâu đực giống Murrah từ 5 đến 7 năm tuổi, có khối lượng 600 kg đến 720 kg, có sức khỏe tốt

- Đàn trâu cái của các huyện thuộc tỉnh Thái Nguyên, khối lượng từ 300

kg đến 400 kg, độ tuổi từ 5 năm tuổi đến 7 năm tuổi, có khả năng sinh sản bình thường, đã đẻ 1 lứa, sức khỏe tốt

2.1.2 Nguyên, vật liệu nghiên cứu, hóa chất và thiết bị

2.1.2.1 Nguyên liệu: 120 liều tinh dịch trâu Murrah

2.1.2.2 Thiết bị

Bảng 2.1 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

2.1.2.3 Hóa chất, dụng cụ

Bảng 2.2 Hóa chất, dụng cụ

1 Citrat, fructoza, lactoza, glucoza, Na-citrat, axit

5 NaCl, Medium 199, DMEM, Phenol Red Sigam

6 CaCl2 .H2O, Albumin Bovine, Human

Chorionin Gonadotropin, Megnedium chloride

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Phẩm chất tinh dịch trâu Murrah: Nghiên cứu ảnh hưởng của cá thể, mùa vụ đến một số chỉ tiêu phẩm chất tinh dịch trâu Murrah

- Lựa chọn môi trường đông lạnh tinh dịch trâu Murrah: Nghiên cứu ảnh hưởng của 03 tỷ lệ glycerin khác nhau trong môi trường đông lạnh đến chất lượng của tinh dịch sau khi đông lạnh và giải đông

- Sử dụng tinh trâu Murrah đông lạnh để phối giống cho trâu cái nội: Xác định tỷ lệ thụ thai ở lần phối đầu bằng tinh đông lạnh cọng rạ của từng trâu đực Murrah với đàn trâu cái địa phương

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của cá thể và mùa vụ đến một số chỉ tiêu

đánh giá phẩm chất tinh dịch

- Nghiên cứu ảnh hưởng của cá thể đến một số chỉ tiêu phẩm chất tinh dịch của trâu Murrah, nhân tố thí nghiệm là các cá thể trâu

Trâu 05 được 5 năm tuổi có khối lượng 720kg, trâu 06 được 6 năm tuổi

có khối lượng 680kg, trâu 07 được 7 năm tuổi có khối lượng 600kg Cả 3 trâu thí nghiệm đều được nuôi nhốt và có khẩu phần ăn như nhau

- Nghiên cứu ảnh hưởng của mùa vụ đến một số chỉ tiêu phẩm chất tinh dịch của trâu Murrah, nhân tố thí nghiệm là mùa vụ

Mỗi vụ lấy 10 mẫu/trâu Lấy trong 4 vụ (xuân, hạ, thu, đông) nên tổng

có 40 mẫu/trâu

2.4.1.1 Phương pháp khai thác tinh dịch trâu Murrah

Thời gian khai thác tinh: từ 7 giờ đến 8 giờ

Tần suất khai thác tinh dịch: 2 lần/tuần

Chuẩn bị âm đạo giả: Các bộ phận của âm đạo giả được khử trùng rồi lắp ráp và bảo quản trong tủ ấm 420C trước khi lấy tinh

Chuẩn bị trâu đực: Những trâu đực đến ngày khai thác tinh được tắm sạch sẽ và thụt rửa bao dương vật trước khi khai thác tinh 30 phút bằng nước muối sinh lý 0,9%

Chuẩn bị trâu làm giá: Chọn trâu làm giá có tầm vóc thích hợp, vệ sinh

cơ thể trâu sạch sẽ và cho vào giá

Lấy tinh: Kích thích cho trâu đực hưng phấn, rồi cho nhảy trâu nhảy giá

và lấy tinh bằng âm đạo giả

Mẫu tinh dịch khai thác được đưa ngay vào phòng thí nghiệm và đặt trong bể nước ấm 350C để kiểm tra các chỉ tiêu số lượng, chất lượng tinh dịch

Mỗi cá thể trâu đực được lấy tinh trong 4 mùa (Xuân, Hạ, Thu, Đông)

và mỗi mùa lấy 10 mẫu tinh dịch/cá thể

2.4.1.2 Phương pháp xác định các chỉ tiêu đánh giá phẩm chất tinh dịch

* Thể tích tinh dịch trong một lần xuất tinh (V, ml): là lượng tinh dịch khai thác được trong 1 lần xuất tinh, được xác định bằng ống nhựa có chia vạch khắc ml, đặt thăng bằng ngang tầm mắt Đọc kết quả theo mặt cong của mặt thoáng tinh dịch

* Độ pH của tinh dịch: được xác định bằng giấy đo pH

Cách tiến hành cụ thể như sau: Dùng đũa thủy tinh lấy 1 giọt tinh dịch nhỏ lên giấy pH và sau 3 giây thì so sánh màu của giấy với bảng màu chuẩn

* Hoạt lực của tinh trùng (A):

Hoạt lực của tinh trùng là tổng số tinh trùng tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong tinh dịch trên vi trường quan sát

Dùng micropipét hút 0,01 ml tinh dịch + 0,09 ml dung dịch A (môi trường pha loãng tinh dịch không có glycerol) rồi nhỏ lên phiến kính chuyên dụng và được giữ ấm ở nhiệt độ 380C Dùng lamen khô, sạch đậy lên giọt tinh sao cho giọt tinh dịch quét đều bốn cạnh của lamen Đưa phiến kính lên soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 200 lần Tiến hành ước lượng tỷ lệ phần trăm số tinh trùng tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường mà ta

quan sát được Việc đánh giá cho điểm được tiến hành theo thang điểm 10 của Milovanov

* Nồng độ tinh trùng: Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp xác định nồng độ tinh trùng bằng buồng đếm Newbower

Lắp lamelle kính đã được làm sạch, khô lên mặt buồng đếm Dùng ống pha loãng hồng cầu để hút tinh dịch đến vạch 0,5 sau đó hút tiếp dung dịch NaCl 3% đến vạch 11 Chú ý: không được để có bọt khí trong ống pha loãng hồng cầu trong quá trình hút Nếu có bọt khí phải xúc rửa sạch ống pha loãng

và làm lại Bịt hai đầu ống pha loãng bằng ngón tay cái và ngón tay giữa, lắc nhẹ từ 5-6 lần cho tinh dịch trộn đều với dung dịch NaCl Mức độ pha loãng

200 lần Bỏ đi vài giọt dung dịch ở phần ống phía dưới, nhỏ hỗn hợp này vào trong buồng đếm sau đó đưa lên kính hiển vi có độ phóng đại 200-400 lần để đếm

* Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: được xác định bằng phương pháp của Chemineau (1991)

- Xác định tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng như sau:

+ Phết tiêu bản: Lấy một phiến kính A khô sạch, không có vết xước trên mặt Ghi số hiệu đực giống, ngày kiểm tra ở một đầu phiến kính, lấy một giọt tinh dịch kéo ngang trên phiến kính Đặt chiều rộng lam kính B trùng khít với cạnh ngang tinh dịch và nghiêng phiến kính A một góc 450, kéo xuôi nhẹ một lần sao cho tinh dịch dàn đều trên phiến kính A

+ Cố định: Để phiến kính có tinh dịch dàn đều tự khô trong không khí hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để tinh trùng dính chặt trên lam kính, cố định 2 - 3 phút sau đó cho vòi nước chảy nhẹ vào lam kính (tránh tinh trùng bị trôi mất), vẩy khô

+ Nhuộm: Dùng Methylen 5% hoặc đá Fucxin 5% hoặc Rosa bengad 5% nhỏ lên phiến kính để trong 5 phút, sau đó từng giọt nước trôi thật nhẹ nhàng trên lamen bằng nước sạch, vẩy khô

+ Quan sát trên kính hiển vi và đếm: Đặt phiến kính lên kính hiển vi với

độ phóng đại 400 lần, đếm số tinh trùng kỳ hình và tổng số tinh trùng có trong

vi trường

+ Đếm hết tinh trùng trong vi trường này xong mới chuyển sang vi trường khác cho đủ tổng số tinh trùng trong khoảng 300 - 500 Nếu vi trường

có tinh trùng quá dầy thì chọn vi trường khác để đếm

Công thức tính như sau:

K (%) = Số lượng tinh trùng kỳ hình x 100

500

* Tỷ lệ tinh trùng sống (Sg %): Xác định theo phương pháp của Blom (1950) [26], bằng cách nhỏ 1 giọt tinh dịch lên lam kính lõm và 2 giọt Eosin 5%, đảo nhẹ, sau đó nhỏ 4 giọt Nigrosin 10%, đảo nhẹ, để ấm 370C trong 30 giây Lấy 1 giọt tinh dịch đã nhuộm phết kính dàn mỏng đều đưa lên kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần Đếm tổng số 500 tinh trùng gồm cả tinh trùng sống và tinh trùng chết (tinh trùng chết là những tinh trùng bắt màu đỏ Eosin) Tính tỷ lệ tinh trùng sống bằng công thức sau:

Tỷ lệ tinh trùng sống (%) = Số lượng tinh trùng sống x 100

500

* Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong 1 lần phóng tinh (VAC - tỷ/lần lấy tinh): là tích số của thể tích tinh dịch khai thác được (V - ml) với hoạt lực (A)

và nồng độ (C – tỷ/ml)

2.4.2 Nghiên cứu lựa chọn môi trường pha loãng thích hợp

Nghiên cứu lựa chọn môi trường pha loãng, bảo tồn tinh dịch bằng cách so sánh chất lượng tinh dịch sau giải đông trong các môi trưởng có tỷ lệ glycerin khác nhau

2.4.2.1 Chuẩn bị mẫu tinh dịch

Các mẫu tinh dịch đem pha loãng bảo tồn đảm bảo đạt tiêu chuẩn lượng xuất tinh không nhỏ hơn 1ml, hoạt lực tinh trùng không nhỏ hơn 70%, nồng độ tinh trùng không nhỏ hơn 0,6 tỷ/ml, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình không lớn hơn 20%, tỷ lệ tinh trùng sống không nhỏ hơn 70%