Nghiên cứu xác lập điều kiện và giải pháp công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân protein bã nấm men bia nhằm ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Bởi vậy, xuất phát từ mục Ďích sử dụng hiệu quả bã nấm men bia Ďể tạo sản phẩm ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, chúng tôi tiến hành thực hiện Ďề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu xác lập đi

Tôi xin cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, Trường Ďại học Bách Khoa Hà Nội Ďã giúp Ďỡ và góp ý cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu

Nhân dịp này cho tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh Ďạo Công ty TNHH cơ nhiệt Ďiện lạnh Bách Khoa – Tập Ďoàn Polyco và các bạn bè Ďồng nghiệp Ďã hết sức giúp Ďỡ

và tạo mọi Ďiều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn các giáo sư, phó giáo sư, tiến sĩ là chủ tịch hội Ďồng, phản biện, thư ký và ủy viên hội Ďồng Ďã dành thời gian quý báu Ďể Ďọc tham gia hội Ďồng chấm luận án với những góp ý cụ thể, những gợi ý bổ ích, giúp tôi hoàn thiện tốt hơn các nội dung nghiên cứu của luận án

Tôi cũng vô cùng cảm ơn sự khích lệ, Ďộng viên và giúp Ďỡ hết sức nhiệt tình của gia Ďình và bè bạn, những người luôn Ďộng viên và tạo Ďiều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Thanh Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa từng Ďƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Một số số liệu Ďã Ďƣợc Ďăng trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong: “ Danh mục các công trình khoa học Ďã công bố có liên quan Ďến luận án”, Ďã Ďƣợc sự Ďồng ý cho phép sử dụng các số liệu của các Ďồng tác giả Việc tham khảo các nguồn tài liệu Ďã Ďƣợc thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo theo Ďúng yêu cầu

PGS TS Quản Lê Hà

Tác giả

Nguyễn Thị Thanh Ngọc

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ NẤM MEN BIA 4

1.1.1 Nấm men sử dụng trong sản xuất bia 4

1.1.2 Thành phần hóa học của bã nấm men bia 4

1.1.3 Thành phần bất lợi của bã nấm men bia 6

1.1.4 Tình hình tận thu bã nấm men bia 7

1.2 TỔNG QUAN VỀ SẢN PHẢM THỦY PHÂN PROTEIN 8

1.2.1 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân protein 8

1.2.2 Hàm lượng acid amin trong sản phẩm thủy phân protein 10

1.2.3 Nguyên nhân gây Ďắng của sản phẩm thủy phân protein 11

1.3 TÁC NHÂN VÀ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 14

1.3.1 Tác nhân thủy phân protein 14

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng Ďến hiệu quả thủy phân và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân 18

1.4 MỘT SỐ GIẢI PHÁP KỸ THUẬT NÂNG CAO MỨC ĐỘ THỦY PHÂN VÀ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THỦY PHÂN TỪ BÃ NẤM MEN BIA 23

1.4.1 Xử lý bã nấm men bia 23

1.4.2 Kỹ thuật thủy phân protein bã nấm men bia bằng chế phẩm proteas26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 35

2.1.1 Vật liệu 35

2.1.2 Chế phẩm protease 35

2.1.3 Hóa chất 35

2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 35

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.2.1 Điều kiện thích hợp xử lý và thủy phân protein bã nấm men bia 40

2.2.2 Cô Ďặc sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia 43

2.2.3 Thử nghiệm sản xuất bánh cracker có bổ sung sản phẩm thủy phân ở quy mô công nghiệp 44

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 44

2.3.1 Xác Ďịnh tỷ lệ tế bào sống sót của bã nấm men bia 44

2.3.2 Xác Ďịnh Ďộ ẩm bã nấm men bia và sản phẩm thủy phân sau cô

Ďặc…… 44

2.3.3 Xác Ďịnh nồng Ďộ chất khô của sản phẩm thủy phân sau cô Ďặc ……… ……… 44

2.3.4 Xác Ďịnh Ďộ tro của bã nấm men bia và sản phẩm thủy phân sau cô Ďặc… 44

2.3.5 Xác Ďịnh chỉ tiêu vi sinh của sản phẩm thủy phân sau cô Ďặc 45

2.3.6 Xác Ďịnh Ďộ Ďắng của bã nấm men bia sau quá trình rửa 45

2.3.7 Xác Ďịnh hàm lượng protein tổng bằng phương pháp Kjelhdal 45

2.3.8 Xác Ďịnh hàm lượng acid amin theo phương pháp quang phổ 45

2.3.9 Xác Ďịnh thành phần acid amin theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ………45

2.3.10 Đánh giá hiệu quả phá vỡ tế bào bã nấm men bia 46

2.3.11 Xác Ďịnh hàm lượng acid nucleic trong các mẫu sản phẩm thủy

phân…… 47

2.4 PHƯƠNG PHÁP CẢM QUAN 47

2.4.1 Đánh giá Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân theo phương pháp cảm quan cho Ďiểm 47

2.4.2 Đánh giá cảm quan mẫu bánh cracker 49

2.5 PHƯƠNG PHÁP TOÁN HỌC 49

2.5.1 Tính toán mức Ďộ thủy phân 49

2.5.2 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bã nấm men bia 49

2.6 PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 52

2.6.1 Xử lý số liệu Ďiểm Ďắng trong cảm quan Ďộ Ďắng sản phẩm thủy

phân… ………52

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ XỬ LÝ VÀ THỦY PHÂN PROTEIN BÃ NẤM MEN BIA 53

3.1.1 Xử lý bã nấm men bằng NaOH 53

3.1.2 Điều kiện thích hợp Ďể thủy phân protein bã nấm men bia 55

3.1.3 Đánh giá hiệu quả áp dụng của các giải pháp nâng cao mức Ďộ thủy phân và giảm Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân 68

3.2 TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN BÃ NẤM MEN BIA BẰNG HỖN HỢP HAI CHẾ PHẨM FLAVOURZYME VÀ ALCALASE 72

3.2.1 Tối ưu hóa quá trình thủy phân gián Ďoạn 72

3.2.2 Tối ưu hóa quá trình thủy phân chảy tràn liên tục 77

3.2.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục 82

3.3 TỔNG HỢP VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THỦY PHÂN PROTEIN BÃ NẤM MEN BIA 89

3.3.1 Kết quả xác Ďịnh thành phần acid amin trong các mẫu sản phẩm thủy phân bằng phương pháp HPLC 89

3.3.2 So sánh chất lượng sản phẩm thủy phân với một số sản phẩm nghiên cứu khác và sản phẩm thương mại 95

3.3.3 Kết quả phân tích hàm lượng acid nucleic trong các mẫu sản phẩm thủy phân nghiên cứu 99

3.4 ỨNG DỤNG SẢN PHẨM THỦY PHÂN TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 102

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 106

TÀI LIỆU THAM KHẢO 107

BU Đơn vị Ďo Ďộ Ďắng của nước rửa bã men bia

CFU/g Số Ďơn vị khuẩn lạc/gam mẫu

CTLT Chảy tràn liên tục

DHA Mức Ďộ thủy phân bằng Alcalase

DHF Mức Ďộ thủy phân bằng Flavourzyme

DYH Sản phẩm thủy phân dạng khô

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

KNPU-S/g Đơn vị hoạt Ďộ protease

SEM Kính hiển vi Ďiện tử quét

TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

TEM Kính hiển vi Ďiện tử truyền qua

THLT Tuần hoàn liên tục

v/v Thể tích/ thể tích

w/v trọng lượng/ thể tích

w/w trọng lƣợng/ trọng lƣợng WYE Chiết xuất nấm men dạng ƣớt WYH Sản phẩm thủy phân dạng ƣớt

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ Ďồ nguyên lý quá trình thủy phân liên tục protein Ďậu nành 28

Hình 1.2 Sơ Ďồ khối quá trình sản xuất sản phẩm chiết xuất nấm men quy mô công nghiệp 29

Hình 2.1 Sơ Ďồ nguyên lý và thiết bị thực nghiệm thủy phân gián Ďoạn 36

Hình 2.2 Sơ Ďồ nguyên lý Ďiều khiển thủy phân chảy tràn liên tục 37

Hình 2.3 Hệ thống thực nghiệm thủy phân chảy tràn liên tục 38

Hình 2.4 Sơ Ďồ nguyên lý Ďiều khiển thủy phân tuần hoàn liên tục 39

Hình 2.5 Hệ thống thực nghiệm thủy phân tuần hoàn liên tục 40

Hình 2.6 Đồ thị Ďường chuẩn của quinine 48

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng Ďộ NaOH và thời gian rửa Ďến Ďộ Ďắng của nước rửa (a) và tỷ lệ sống sót của tế bào (b) 53

Hình 3.2 Độ Ďắng của nước rửa bã nấm men bia 54

Hình 3.3 Ảnh hưởng của pH Ďến DH (a) và BT (b) trong quá trình thủy phân protein bã nấm men bia bằng 3 chế phẩm protease 56

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ Ďến DH (a) và BT (b) trong quá trình thủy phân protein bã nấm men bia bằng 3 chế phẩm protease 57

Hình 3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ bã nấm men bia/nước Ďến DH và BT của sản phẩm thủy phân 58

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S Ďến DH và BT của Flavourzyme (a) và Alcalase (b)… 59

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S của hỗn hợp Alcalase + Flavourzyme Ďến DH và BT… 61

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH và nhiệt Ďộ thủy phân Ďến DH và BT 61

Hình 3.9 Khảo sát diễn biến của DH (a) và BT (b) theo thời gian thủy phân bằng Alcalase (A), Flavourzyme (F) và hỗn hợp Alcalase + Flavourzyme (A + F) 62 Hình 3.10 Hình ảnh chụp TEM tế bào bã nấm men bia ban Ďầu (a), sốc nhiệt (b) và siêu âm (2 phút) (c) sau Ďó thủy phân 65

Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian tự phân Ďến mức Ďộ thủy phân và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân 65

Hình 3.12 Hình ảnh chụp TEM tế bào của (a) mẫu A24, (b) mẫu H12 và (c) mẫu A24H12… 66

Hình 3.13 Sự biến thiên của DH (a) và BT (b) theo thời gian thủy phân bằng kỹ thuật gián Ďoạn, tuần hoàn liên tục và chảy tràn liên tục 69

Hình 3.14 Ảnh hưởng của giải pháp sốc nhiệt + tự phân (bằng kỹ thuật CTLT và THLT) trước quá trình thủy phân Ďến DH (a) và BT(b) 71

Hình 3.15 Ảnh hưởng của các yếu tố Ďến mức Ďộ thủy phân (a) và Ďộ Ďắng của

sản phẩm thủy phân (b) bằng kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn 74

Hình 3.16 Bề mặt Ďáp ứng của nhiệt Ďộ và pH Ďến mức Ďộ thủy phân gián Ďoạn (a) và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân (b) 75

Hình 3.17 Mức Ďộ Ďáp ứng sự mong Ďợi của quá trình thủy phân gián Ďoạn 76

Hình 3.18 Ảnh hưởng của các yếu tố Ďến mức Ďộ thủy phân (a) và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân (b) bằng kỹ thuật thủy phân chảy tràn liên tục 79

Hình 3.19 Bề mặt Ďáp ứng của nhiệt Ďộ và pH Ďến mức Ďộ thủy phân (a) và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân (b) bằng kỹ thuật thủy phân chảy tràn liên tục 80

Hình 3.20 Mức Ďộ Ďáp ứng sự mong Ďợi của quá trình thủy phân chảy tràn liên tục………… 81

Hình 3.21 Ảnh hưởng của các yếu tố Ďến DH (a) và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân (b) thủy phân bằng kỹ thuật thủy phân tuần hoàn liên tục 85

Hình 3.22 Bề mặt Ďáp ứng của nhiệt Ďộ và pH Ďến DH thủy phân (a) và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân (b) bằng kỹ thuật thủy phân tuần hoàn liên tục 86

Hình 3.23 Mức Ďộ Ďáp ứng sự mong Ďợi của quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục……… 87

Hình 3.24 Kết quả DH, BT và tỷ lệ acid amin kỵ nước trong các mẫu sản phẩm thủy phân…… 94

Hình 3.25 Mối liên hệ giữa Ďộ Ďắng và tỷ lệ acid amin kỵ nước trong các mẫu sản phẩm thủy phân 95

Hình 3.26 Tổng hàm lượng acid amin trong các mẫu ở bảng 3.26 (nồng Ďộ chất khô 55% w/w) 97

Hình 3.27 Hình ảnh sản phẩm thủy phân Ďã Ďược cô Ďặc chân không Ďến nồng

Ďộ 55% (trên hệ thống thủy phân tuần hoàn liên tục) 98

Hình 3.28 Hàm lượng acid nucleic trong sản phẩm thủy phân 101

Hình 3.29 Sản phẩm các mẫu bánh cracker A, B, C 104

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của bã nấm men bia 4

Bảng 1.2 Thành phần vitamin của bã nấm men bia 5

Bảng 1.3 Thành phần nguyên tố vi lượng của bã nấm men bia 5

Bảng 1.4 Một số loại enzyme trong nấm men bia 6

Bảng 1.5 Hàm lượng acid amin trong sản phẩm chiết xuất nấm men và so sánh với protein… 11

Bảng 1.6 Đánh giá vị cảm quan của các acid amin theo các mức thị hiếu khác Nhau……… 12

Bảng 2.1 Thành phần hóa học của bã nấm men bia tại nhà máy bia Sài Gòn – Hà Nội…… 35

Bảng 2.2 Chế Ďộ chạy sắc ký 46

Bảng 2.3 Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố (sử dụng cho quá trình thủy phân gián Ďoạn và chảy tràn liên tục) 50

Bảng 2.4 Giá trị mã hóa và giá trị thực nghiệm của các yếu tố (sử dụng cho quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục) 50

Bảng 2.5 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu quá trình thủy phân gián Ďoạn và chảy tràn liên tục 51

Bảng 2.6 Các yếu tố tối ưu trong nghiên cứu quá trình thủy phân tuần hoàn liên ……… 52

Bảng 3.1 Độ Ďắng (BU) của nước rửa và tỷ lệ sống sót của tế bào (%) ở lần rửa 3 và 4……… 54

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của quá trình sốc nhiệt Ďến DH, BT và ST 64

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm Ďến DH, BT và ST 64

Bảng 3.4 Kết quả so sánh về mức Ďộ thủy phân, Ďộ Ďắng của H12 và A24 67

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của tốc Ďộ khuấy Ďến mức Ďộ thủy phân và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân 67

Bảng 3.6 Kết quả DH và BT của SPTP bằng kỹ thuật thủy phân chảy tràn liên tục và tuần hoàn liên tục (có và không có giải pháp sốc nhiệt + tự phân) 69

Bảng 3.7 Kết quả thí nghiệm quá trình thủy phân gián Ďoạn protein bã nấm men Bia………… 72

Bảng 3.8 Kết quả phân tích phương sai tối ưu tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng 73 Bảng 3.9 Kết quả phân tích sự tương thích của mô hình với thực nghiệm 74

Bảng 3.10 Kết quả DH và BT trước và sau khi tối ưu quá trình thủy phân gián Ďoạn 76

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm quá trình thủy phân chảy tràn liên tục protein bã nấm men bia… 77

Bảng 3.12 Kết quả phân tích phương sai tối ưu tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng cho quá trình thủy phân chảy tràn liên tục 78

Bảng 3.13 Kết quả phân tích sự tương thích của mô hình với thực nghiệm cho quá trình thủy phân chảy tràn liên tục 78

Bảng 3.14 Kết quả DH và BT trước và sau khi tối ưu quá trình thủy phân chảy tràn liên tục 81

Bảng 3.15 Kết quả Ďiều kiện tối ưu của kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn và chảy tràn liên tục 82

Bảng 3.16 Kết quả thí nghiệm quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục 83

Bảng 3.17 Kết quả phân tích phương sai tối ưu tổng hợp các yếu tố ảnh hưởng cho quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục 84

Bảng 3.18 Kết quả phân tích sự tương thích của mô hình với thực nghiệm cho quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục 84

Bảng 3.19 Kết quả DH và BT trước và sau khi tối ưu quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục 87

Bảng 3.20 Kết quả Ďiều kiện tối ưu của kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn, chảy tràn liên tục và tuần hoàn liên tục 88

Bảng 3.21 Thành phần acid amin trong sản phẩm thủy phân bằng Flavourzyme, Alcalase và hỗn hợp Alcalase + Flavourzyme 90

Bảng 3.22 Thành phần acid amin trong sản phẩm thủy phân bằng ba kỹ thuật thủy phân (có và không có giai Ďoạn sốc nhiệt + tự phân gián Ďoạn) 91

Bảng 3.23 Kết quả xác Ďịnh thành phần acid amin trong sản phẩm thủy phân bằng kỹ thuật thủy phân LTCT và THLT (giai Ďoạn tự phân gián Ďoạn và liên tục)

Bảng 3.29 Hàm lượng acid nucleic trong các mẫu sản phẩm thủy phân 100

Bảng 3.30 Hàm lượng acid nucleic trong sản phẩm thực phẩm (khi bổ sung ba loại sản phẩm thủy phân bằng các kỹ thuật khác nhau) 102

Bảng 3.31 Kết quả phân tích số liệu Ďánh giá các tính chất cảm quan bánh Cracker……… 103

Bảng 3.32 Phân tích phương sai kết quả Ďánh giá các tính chất cảm quan của các mẫu bánh cracker A, B, C 103

từ ngành công nghiệp rượu, bia [59] Đặc biệt, bã nấm men bia là một nguồn nguyên liệu dồi dào giàu protein còn chưa Ďược khai thác và sử dụng hợp lý ở nước ta Bã nấm men bia

có hàm lượng protein cao (chiếm 51-58% lượng chất khô) và tỷ lệ acid amin cân Ďối với Ďầy Ďủ các loại acid amin cần thiết Hơn nữa, tại Việt Nam, với sản lượng bia ngày càng tăng, sẽ tạo ra nguồn bã nấm men thải lớn khoảng 43.000 tấn/năm (tương ứng với sản lượng bia 3,5 tỷ lít /năm - 2015) Hiện nay, bã nấm men bia chủ yếu Ďược sấy thành dạng bột khô hoặc sử dụng bã nấm men ướt làm thức ăn chăn nuôi với hệ số tiêu hóa thấp, hơn nữa bã nấm men còn gây ô nhiễm môi trường Để tăng hiệu quả sử dụng của bã nấm men bia, người ta thường thủy phân protein bã nấm men bia Tuy nhiên, các kỹ thuật thủy phân protein bã nấm men bia mới dừng ở phương pháp tự phân và thủy phân gián Ďoạn bằng enzyme Trong Ďiều kiện Ďó, mức Ďộ thủy phân không cao và chất lượng sản phẩm thủy phân còn hạn chế bởi vị Ďắng Bởi vậy, xuất phát từ mục Ďích sử dụng hiệu quả bã nấm men bia Ďể tạo sản phẩm ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, chúng tôi tiến hành thực

hiện Ďề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu xác lập điều kiện và giải pháp công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân protein bã nấm men bia nhằm ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm”

Mục tiêu của luận án

Xác lập Ďược Ďiều kiện và giải pháp công nghệ tối ưu cho quá trình thủy phân protein bã nấm men bia Ďạt mức Ďộ thủy phân cao và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân thấp nhằm bổ sung vào một số sản phẩm thực phẩm

Nội dung nghiên cứu của luận án

Để Ďạt Ďược mục tiêu Ďề ra, luận án thực hiện các nội dung nghiên cứu sau Ďây:

 Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện thích hợp để xử lý và thủy phân protein bã nấm men bia

- Nghiên cứu Ďiều kiện xử lý bã nấm men bia bằng NaOH

- Nghiên cứu lựa chọn các Ďiều kiện thích hợp Ďể thủy phân protein bã nấm men bia: Lựa chọn chế phẩm protease, các yếu tố thủy phân, một số giải pháp nhằm nâng cao mức Ďộ thủy phân và giảm Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân

- Thủy phân protein bã nấm men bia theo các kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn, chảy tràn liên tục và tuần hoàn liên tục nhằm mục Ďích lựa chọn Ďiều kiện thủy phân thích hợp khi áp dụng giai Ďoạn sốc nhiệt và tự phân trước quá trình thủy phân bằng chế phẩm enzyme

 Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bã nấm men bia

- Tối ưu hóa quá trình thủy phân gián Ďoạn

- Tối ưu hóa quá trình thủy phân chảy tràn liên tục

- Tối ưu hóa quá trình thủy phân tuần hoàn liên tục

 Đánh giá chất lượng sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia

 Ứng dụng sản phẩm thủy phân trong công nghệ sản xuất bánh cracker

Ý nghĩa khoa học, những đóng góp mới và thực tiễn của luận án

 Đóng góp mới của Ďề tài:

- Đã xác lập Ďiều kiện tối ưu thủy phân protein bã nấm men bia trên mô hình tuần hoàn liên tục sử dụng thiết bị ống lồng ống

- Đã minh chứng Ďược bằng thực nghiệm quá trình thủy phân protein bã nấm men bia trong một thiết bị có thể tích nhất Ďịnh thì mức Ďộ thủy phân thấp hơn so với hệ thống nhiều thiết

bị mắc nối tiếp có tổng thể tích bằng thể tích của thiết bị Ďơn lẻ

 Ý nghĩa khoa học:

- Kết quả nghiên cứu Ďã xác Ďịnh Ďược vai trò ảnh hưởng của tỷ lệ acid amin kỵ nước Ďối với Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia, là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu về protein và acid amin thuộc lĩnh vực chế biến thực phẩm

- Đã minh chứng bằng thực nghiệm khi dùng hai hoặc nhiều chế phẩm protease cùng công năng tác Ďộng lên một quá trình hoặc một cơ chất thì mức Ďộ thủy phân cao hơn và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân thấp hơn khi chúng tác Ďộng Ďơn lẻ

 Ý nghĩa thực tiễn:

- Đã Ďưa ra giải pháp tối ưu thủy phân protein bã nấm men bia cho các nhà máy bia Việt Nam, nhằm nâng cao giá trị gia tăng của bã nấm men bia và giảm thiểu tác hại gây ô nhiễm môi trường trong ngành công nghiệp sản xuất bia

- Đã Ďề xuất một giải pháp khả thi ứng dụng sản phẩm thủy phân Ďể làm bánh mặn cracker,

mở ra khả năng có thể sử dụng vào các sản phẩm thực phẩm khác, làm tăng giá trị dinh dƣỡng và cảm quan cho sản phẩm thực phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BÃ NẤM MEN BIA

1.1.1 Nấm men sử dụng trong sản xuất bia

Nấm men sử dụng trong sản xuất bia thường Ďược chia làm hai loại: Nấm men chìm

và nấm men nổi [9, 12, 58] Nấm men chìm có thể sử dụng hoàn toàn Ďường raffinoza trong khi Ďó nấm men nổi chỉ sử dụng Ďược 1/3 Ďường này [5, 12, 15] Nấm men chìm

Ďược sử dụng trong sản xuất bia lager, thường là Saccharomyces pastorianus hoặc

Saccharomyces carlsbergensis, với Ďiều kiện lên men ở nhiệt Ďộ 8 – 150C trong các bồn

hình trụ Ďáy côn [32], nấm men nổi Saccharomyces cerevisiae Ďược sử dụng trong quá

trình sản xuất bia ale, với nhiệt Ďộ lên men 16 -250C Trong sản xuất bia, nấm men Ďược sử dụng Ďến Ďời thứ sáu thì xả bỏ, Ďược gọi là bã nấm men bia, là nguồn chất thải rắn lớn thứ hai sau bã malt Tuy là nguồn chất rắn thải nhưng bã nấm men bia Ďược coi là một nguồn cung cấp protein cho ngành công nghiệp thực phẩm [122]

1.1.2 Thành phần hóa học của bã nấm men bia

Đã có nhiều nghiên cứu phân tích thành phần hóa học của bã nấm men bia ở dạng tươi và khô Bã nấm men bia có thành phần chủ yếu là protein, gluxit, lipit, chất hòa tan không chứa nitơ, chất tro (Bảng 1.1)

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của bã nấm men bia

P2O5 25 ÷ 60; CaO – 1 ÷ 8; MgO – 4 ÷ 6; Na2O – 0.5 ÷ 2; SO3 - 0.5 ÷ 6; SiO2 – 1 ÷ 2;

Fe2O3 – 0.05 ÷ 0.7 [86, 135, 139, 144] Rõ ràng là, bã nấm men bia là nguồn nguyên liệu

có giá trị cho sản xuất các sản phẩm cao Ďạm, có khả năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Ngoài ra, bã nấm men bia rất giàu vitamin nhóm B, theo số liệu tổng hợp của một số nghiên cứu ở Bảng 1.2 cho thấy hàm lƣợng vitamin B5 chứa nhiều nhất Tất cả các vitamin nhóm B là nguồn nguyên liệu giá trị cho chế biến một số sản phẩm chức năng

Bảng 1.2 Thành phần vitamin của bã nấm men bia

Loại vitamin

Hàm lƣợng vitamin Tính trong 1 g nấm men bia khô [12] μg/g chất khô [32]

Bã nấm men bia khô

và mannoprotein trong thành tế bào [120] Giữa hai lớp màng phía ngoài có chứa các enzym invertase, photphatase acid, β-glucosidase, protease [32] Bởi vậy, khi sản xuất các

sản phẩm cao Ďạm từ bã nấm men bia, quá trình tự phân Ďược thực hiện Ďể tận dụng nguồn enzyme nội bào

Bảng 1.4 Một số loại enzyme trong nấm men bia

tham khảo

[12]

Glucoamylase (amyloglucosidase) Tinh bột, dextrin,  -glucosit

Maltase (  -glucosidase) Maltoza, saccaroza, maltotrioza,

p-nitrophenyl-  -glucosit, melezittoza

Isomaltose (Oligo 1,6-glucosidase) Isomaltoza saccaroza,  -methyl glucosit,

p-nitrophenyl-  -glucosit

Invertase (  -fructofuranozase) Sacaroza, raffinoza

Melibioase (  -galactosidase) Melibianoza, raffinoza, p-nitrophenyl-

-galactosit Zymase Hệ enzym chuyển hoá Ďường Ďơn giản

thành etylic

Protease serine, protease aspartyl,

protease metallo Protein

[76, 103]

1.1.3 Thành phần bất lợi của bã nấm men bia

Với giá trị dinh dưỡng protein cao, hàm lượng vitamin nhóm B, các nguyên tố vi lượng và loại enzyme Ďa dạng, nhưng bã nấm men bia còn tồn tại một số nhược Ďiểm sau: Thành tế bào nấm men dày, khoảng 25 nm [82, 120], chiếm khoảng 25-30% khối lượng khô tế bào, là lớp vỏ bao quanh tế bào nấm men bia Do Ďó, khi cho gia súc ăn trực tiếp, hệ số sử dụng bã nấm men bia thấp, thủy phân tế bào nấm men bia là cần thiết nhằm nâng cao mức Ďộ thủy phân [58]

Thứ hai, bã nấm men bia có hàm lượng acid nucleic cao, chứa khoảng 6 - 10 g/100g chất khô Cặn của acid nucleic có thể giữ trong thận, trong khớp, bàng quang và gây ra bệnh gút Trong trường hợp sử dụng quá 130g nấm men/ngày, kéo dài 1 tuần, acid uric trong máu sẽ tăng 4,8 – 8,3 mg/100g và lượng acid nucleic tăng gấp Ďôi trong nước tiểu Theo khuyến cáo, giới hạn acid nucleic cho phép 2g/người/ngày [11]

Để sản phẩm thủy phân từ bã nấm men bia Ďược ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, Ďộ Ďắng của bã nấm men bia là nhược Ďiểm tồn tại cuối cùng cần phải quan tâm Độ Ďắng này là do các chất nhựa Ďắng trong hoa houblon bám trên bề mặt tế bào bã nấm men bia [133] Theo Briggs và cộng sự hoa houblon chứa 15 – 21% nhựa Ďắng tính theo chất khô của hoa, trong Ďó có các chất nhựa mềm tan trong hexan chiếm 90%, còn lại là các chất nhựa cứng tan trong este và methanol Thành phần chính của nhựa mềm là các α và β-acid Ďắng và các chất nhựa mềm khác Các α và β-acid Ďắng có thể Ďược coi như là các

Ďồng phân hỗ biến, sự chuyển từ dạng cấu trúc này sang cấu trúc khác diễn ra rất nhanh Các acid này ít tan trong nước Ở 25oC Ďộ tan của humulon là 6mg/l, của lupulon là 1,5 mg/l, Ďộ tan tăng lên theo nhiệt Ďộ Do Ďó, cần có giải pháp loại bỏ hoặc giảm Ďến mức tối

Ďa Ďộ Ďắng của hoa houblon trong bã nấm men bia

1.1.4 Tình hình tận thu bã nấm men bia

Theo Ďiều tra của Huige, trên thế giới, bã nấm men bia Ďược thu gom sau quá trình lên men phụ trong sản xuất bia, khoảng 1,5 Ďến 3 kg bã nấm men/hl bia [18, 57, 58] Trong khi Ďó, việc ứng dụng chưa Ďược tận dụng hiệu quả so với thành phần giá trị dinh dưỡng của chúng [59] Trong khi Ďó, tại Việt Nam, với tốc Ďộ phát triển nhanh của ngành công nghiệp sản xuất bia, lượng bã nấm men bia lớn Phần lớn lượng bã nấm men bia này Ďược bán cho các hộ gia Ďình chăn nuôi làm thức ăn thô cho tôm, cá và các loại gia súc, gia cầm Tuy nhiên, việc sử dụng như vậy không những không tận dụng triệt Ďể nguồn dinh dưỡng quý giá có trong bã nấm men bia mà còn gây ô nhiễm môi trường, Ďặc biệt là các hộ nuôi tôm cá Nếu bã nấm men khi thả xuống ao hồ chăn nuôi tôm cá, tế bào nấm men vẫn tiếp tục hoạt Ďộng tạo ra các sản phẩm trao Ďổi chất không có lợi cho môi trường sinh sống của tôm cá Về lâu dài, Ďiều này sẽ ức chế sự phát triển của tôm cá Ďồng thời gây ra sự ô nhiễm môi trường Do Ďó, nhiều nước trên Thế giới (Đức, Pháp, Mỹ Nhật…) Ďã nghiên cứu tận thu nguồn bã nấm men bia trong sản xuất thức ăn chăn nuôi như theo Ferreira và cộng sự

bã nấm men bia là nguồn dinh dưỡng (trong chăn nuôi, cho con người, sản phẩm tự phân

và thủy phân, nuôi cấy vi sinh vật); là các loại thực phẩm chức năng (trong sản xuất các loại Ďồ uống lên men, các chất tăng mùi vị, β – glucan, các loại enzyme [28, 31, 50])

1.1.4.1 Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu của Oliva – Teles và Rumsey cho thấy bã nấm men bia sấy khô có thể thay thế 50% hàm lượng protein bột cá Ďể làm thức ăn chăn nuôi Một số sản phẩm thương mại có bổ sung bã nấm men sấy khô trong chăn nuôi như: GroBiotic – A và GroBioticR[87] Ngoài ra, trong chăn nuôi cá, bã nấm men bia chứa β – glucan ở thành tế bào, acid nucleic, oliosaccharides là những chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, chống nhiễm

trùng gây ra bởi vi khuẩn Treptococcus [135] Một số nghiên cứu sử dụng bã nấm men bia

trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc [21]

1.1.4.2 Trong sản xuất sản phẩm chiết xuất nấm men và sản phẩm thủy phân

Chiết xuất nấm men Ďược sản xuất bằng các phương pháp như tự phân hay thủy phân bằng các chế phẩm protease Một số sản phẩm chiết xuất nấm men thương mại có hàm lượng protein g/100 chiết xuất nấm men như sau: Meridian là 48,6%; sản phẩm Vegemite

(hãng Kraft ) là 28,3% và Aussiemite là 10% Một số công ty khác cũng tận thu bã nấm men bia Ďể sản xuất chiết xuất nấm men như: Công ty Nippon (Nhật) với tên thương mại là

HU, HUP-2 HUAP; Fould – Springer (Pháp); Gist – Brocades (Newzealand)

1.1.4.3 Trong sản xuất dược phẩm

Theo Thammakiti và Zechner – Krpan, β – glucan trong thành tế bào bã nấm men bia Ďược tách chiết Ďể ứng dụng sản xuất thực phẩm chống mỡ máu β–glucan là hỗn hợp sinh học tự nhiên bao gồm β 1-3, 1- 6 glucan và manna oligosaccharide Ďược chiết xuất từ thành

tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae β–glucan giúp kích thích hệ thống miễn dịch tự

nhiên, tăng cường hoạt Ďộng của các Ďại thực bào và kích thích tiết nhiều cytokines (chất hoạt hoá tế bào) nhằm tiêu diệt các mầm bệnh xâm nhập từ bên ngoài Vì vậy, β-glucan Ďã Ďược ứng dụng Ďể bào chế các loại thuốc chữa vết thương, thuốc chống u bướu [74] β–glucan giúp giảm hệ số chuyển Ďổi thức ăn, kích thích tiêu hoá, phòng các bệnh Ďường ruột, nhiễm trùng do vi khuẩn, virut, làm giảm cholesterol trong máu β–glucan là giải pháp thay thế kháng sinh trong phòng trị bệnh vật nuôi an toàn và hiệu quả β–glucan chịu Ďược nhiệt Ďộ 1200C nên có thể dùng làm thức ăn ép viên Hiện nay, trên thị trường có một số sản phẩm từ nấm men bia như: BETA GLUCAN 25, BETA GLUCAN 40, sản phẩm chứa 25 % β 1 – 3 và 1 – 6 –glucan

Bã nấm men bia còn Ďược tận thu Ďể sản xuất các thực phẩm bổ sung B complex Mỗi viên cung cấp Ďầy Ďủ 7 loại vitamin B từ tự nhiên (B1, B2, B3, B5, B6, axit folic và B12) cần thiết cho cả phụ nữ và nam giới [58]

bã nấm men bia Ďể thu nhận chế phẩm Investase hay nghiên cứu của Tống Thị Anh Đào và

cộng sự thu nhận enzyme Superoxit dismutaza theo công nghệ nghiền tế bào nấm men

1.2.1 Ứng dụng của sản phẩm thủy phân protein

Sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia có nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, ngành dược, chăn nuôi và làm môi trường nuôi cấy Dựa vào Ďặc tính chức năng của sản phẩm thủy phân Ďể lựa chọn cho các mục tiêu ứng dụng Ví dụ như Ďộ thẩm

thấu của sản phẩm thủy phân là quan trọng trong các sản phẩm công thức dinh dưỡng cho người già và trẻ sơ sinh (chủ yếu tác dụng Ďường tiêu hóa), sản phẩm thực phẩm cho các vận Ďộng viên thể thao [44, 118] Trong khi Ďó, Ďặc tính nhũ hóa của sản phẩm thủy phân Ďược ứng dụng trong sản xuất sản phẩm dạng nhũ tương Tính hòa tan của sản phẩm thủy phân lại Ďược ứng dụng trong công nghệ Ďồ uống và thực phẩm [46] Nghiên cứu của Seo

và cộng sự Ďã Ďề cập Ďến việc sử dụng protease Ďể sản xuất sản phẩm thuỷ phân protein và Ďược ứng dụng rộng rãi trong sản xuất nước giải khát, thức ăn kiêng, xì dầu, Ďiều chế các sản phẩm thuỷ phân ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm, bổ sung vào thức ăn gia súc,…hoặc các sản phẩm thuỷ phân protein chứa các peptide chống tăng huyết áp, làm giảm Ďau, kích thích miễn dịch, peptide tăng khả năng hấp thụ canxi Trên thị trường, sản phẩm thủy phân bã nấm men Ďược xếp vào nhóm protein thủy phân thực vật, là phụ gia Ďược sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp gia vị sau mì chính [58] Sản phẩm thủy phân bã nấm men có vai trò quan trọng, không những phục vụ cho mục Ďích nâng cao sức khỏe của con người mà còn là nguồn nguyên liệu thiết yếu trong ngành công nghệ sinh học và thực phẩm Tại Nhật Bản, sản phẩm thủy phân Ďược bổ sung vào các sản phẩm mì ống, bánh mì, bánh nướng làm tăng hàm lượng protein trong sản phẩm hoặc Ďược cô Ďặc thành các viên Ďạm, sử dụng Ďể nấu các bữa ăn nhanh hay như các chất gia vị Ďược chế biến sẵn có nhiều tiện ích như tiết kiệm Ďược thời gian, tái tạo năng lượng nhanh, tránh béo phì Do Ďó, trong thực tế, sản phẩm thủy phân protein

bã nấm men bia Ďã có những ứng dụng thực tiễn sau:

Trong sản xuất mì gói: Sử dụng dạng bột hoặc dạng sệt Ďể bổ sung vào mì gói, thông thường khoảng từ 1-10% khối lượng gói gia vị, Ďể nước súp ngon hơn, ngọt hơn và giống

vị nước xương hơn [58, 122]

Trong sản xuất các sản phẩm của trẻ em: Các bậc cha mẹ thường rất lo lắng cho trẻ em nên thường chọn những loại thực phẩm an toàn tự nhiên cho trẻ em Vì vậy sản phẩm thủy phân bã nấm men bia, chứa nhiều loại acid amin không thay thế, là lựa chọn hoàn hảo cho tất cả sản phẩm thực phẩm dành cho trẻ em Không những giúp trẻ ăn ngon miệng mà còn

là nguồn bổ sung thêm protein an toàn [44, 95]

Trong sản xuất các sản phẩm thịt như xúc xích, thịt ướp muối, dăm bông: Sản phẩm thủy phân có vị ngọt, có thành phần các acid amin tương Ďối giống thịt bò nên khi sử dụng có thể tăng vị ngon, giảm chi phí sản xuất, tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, nồng Ďộ sản phẩm thủy phân bổ sung từ 0,1 – 0,5% [58, 122]

Trong sản xuất snack: Thông thường snack phải bổ sung các vị như thịt heo, thịt gà, thịt nướng… Sử dụng sản phẩm thủy phân bã nấm men bia có thể tạo ra vị ngọt Ďạm Một số

loại sản phẩm thủy phân Ďược bổ sung thêm vị gà, bò, heo nên có thể sử dụng Ďược trực tiếp Ďể phun lên bánh snack [44, 95]

Sản xuất hạt nêm: Hạt nêm thường Ďược bổ sung sản phẩm thủy phân với thành phần từ 5%, vị ngọt Ďạm sẽ tăng, sản phẩm thủy phân nấm men Ďược nhà sản xuất Ďưa vào sẵn các vị gà, heo, bò Ďể dễ dàng sử dụng Một số hãng sản xuất hạt nêm lớn như Knorr, Ajinomoto Ďều sử dụng nhiều sản phẩm thủy phân [44, 95]

1-Sản xuất các loại nước sốt: Nước sốt Ďể ướp thịt, cá, chiên, khi nướng hoặc chiên, bổ sung sản phẩm thủy phân có mùi thơm của thịt nướng, làm tăng cường mùi vị của Ďồ nướng hoặc chiên [58, 122]

Ứng dụng trong Ďồ chay: Sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia là sản phẩm từ vi sinh vật, hoàn toàn sử dụng Ďược cho Ďồ chay Ďể tạo vị “ngọt thịt” Không những tạo ra vị ngọt thịt mà còn bổ sung protein rất tốt cho sức khỏe [44, 95]

Ứng dụng trong thực phẩm lên men: Khi sử dụng trong các thực phẩm lên men như dưa muối, cà muối…, với nồng Ďộ bổ sung sản phẩm thủy phân từ 0,5% tới 1% trong quá trình lên men sẽ hỗ trợ các vi sinh vật phát triển mạnh hơn, tăng tốc Ďộ lên men, Ďồng thời bổ sung thêm vị ngọt Ďạm cho sản phẩm lên men Sản phẩm lên men Ďiển hình thường sử dụng sản phẩm thủy phân bã nấm men bia và chiết xuất nấm men chính là Kimchi Hàn Quốc [58, 122] hay trong sản xuất hoa quả lên men [109]

Bổ sung vào các sản phẩm bánh: Sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia có thể sử dụng trong tất cả các loại bánh mì, bánh ngọt, bánh mặn, bánh bích quy, bánh cracker… với tỉ lệ 0,1%-0,5% tạo hiệu ứng làm tròn vị và tạo vị ngon Ďặc trưng của sản phẩm [58, 122]

Trong chăn nuôi: Sản phẩm thủy phân protein bã nấm men làm thức ăn cho cá trong nghiên cứu của Ferreira và cộng sự; cho gia súc theo nghiên cứu [86, 121] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoàng Anh và cộng sự lại Ďề cập Ďến ứng dụng sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi

1.2.2 Hàm lượng acid amin trong sản phẩm thủy phân protein

Theo nghiên cứu của Shallenberger [116], sản phẩm thủy phân protein gồm chủ yếu

là các acid amin, một số peptide khối lượng phân tử nhỏ

Có nhiều loại acid amin trong sản phẩm thủy phân Ďã Ďược công bố, Bảng 1.5 là thành phần và hàm lượng các loại acid amin trong chiết xuất nấm men

Bảng 1.5 Hàm lượng acid amin trong sản phẩm chiết xuất nấm men và so sánh với protein

121, 138] có hàm lượng acid amin lớn hơn so với sản phẩm chiết xuất nấm men từ nấm

men bánh mì [53] hay từ Candida Utilis [147]

1.2.3 Nguyên nhân gây đắng của sản phẩm thủy phân protein

Sản phẩm thủy phân protein, trong Ďó có sản phẩm thủy phân nấm men thường bị hạn chế bởi vị Ďắng, gây ảnh hưởng Ďến tính cảm quan của sản phẩm thực phẩm ứng dụng Giải pháp kỹ thuật, cũng như công nghệ Ďể làm giảm Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân là vấn Ďề cần Ďược nghiên cứu và giải quyết Vị Ďắng trong sản phẩm thủy phân protein thường liên quan tới các acid amin kỵ nước hay các peptide chứa các acid amin kỵ nước ở Ďầu mạch Đa số các acid amin dễ hòa tan trong nước và thường không màu, nhiều loại

có vị ngọt kiểu Ďường như glycine, alanine, valine, serine, histidine, tryptophan; một số

loại có Ďộ Ďắng như isoleucine, arginine hoặc không có vị như leucine [62] Độ Ďắng của sản phẩm thủy phân phụ thuộc vào loại chế phẩm protease sử dụng và mức Ďộ thủy phân [64] Theo Adler – Nissen Ďa số các sản phẩm thủy phân bằng enzyme Ďều có Ďộ Ďắng và thay Ďổi theo mức Ďộ thủy phân Trong khi Ďó, nghiên cứu của Seo và cộng sự, cho rằng sản phẩm thủy phân bằng Flavourzyme chứa ít peptide Ďắng Một số nghiên cứu khác Ďã công bố, Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân là do sự hình thành các peptide có khối lượng phân tử nhỏ mà chứa các gốc acid amin kỵ nước [130] Hoặc Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân có thể là do tính kỵ nước, cấu trúc không gian, khối lượng phân tử của các peptide [79, 80]

1.2.3.1 Độ đắng của sản phẩm thủy phân gây ra bởi tính kỵ nước

Bảng 1.6 Đánh giá vị cảm quan của các acid amin theo các mức thị hiếu khác nhau

Aspartic acid Chua (+) Chua (+) Chua (+)

Glutamic acid Chua (+) Chua (+) Chua (+)

Asparagine Ngọt (+) Ngọt (+) Đắng/ngọt (+)

Theo Shallenberger [116]

(Các mức thị hiếu là hài lòng (+), không hài lòng (-), rất không hài lòng (x) và mùi sulfur (S)

Theo Shallenberger acid amin thường có vị chua, ngọt và Ďắng, tùy dạng tồn tại của chúng ở dạng D- hoặc L-, vị của các loại acid amin, một số acid amin có vị khác nhau khi tồn tại ở dạng D-, L- hoặc D.L- Như leucine có vị ngọt dạng D-, nhưng lại có Ďộ Ďắng khi chúng tồn tại dạng L-; glutamine lại ngọt ở dạng D- và mặn Ďắng ở dạng L- (Bảng 1.6) Bên cạnh Ďó, một số nghiên cứu của Dougherty; Izawa; Peter Amala Sujith ; Rocharake; Teruyoshi Matoba; lại công bố Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân có liên quan Ďến hàm lượng các acid amin kỵ nước, bao gồm isoleucine, leucine, arginine, cysteine, methionine, phenylalanine, tryptophan và histidine

1.2.3.2 Độ đắng của sản phẩm thủy phân do một số peptide

Nghiên cứu của Alder – Nissen cho rằng, peptide Ďắng trong sản phẩm thủy phân không cảm nhận Ďược rõ bằng Ďộ Ďắng của các acid amin kỵ nước Peptide có Ďộ Ďắng phụ thuộc lớn vào trình tự sắp xếp của loại acid amin trong phân tử peptide, ví dụ như: peptide Phe – Pro có Ďộ Ďắng hơn peptide Pro – Phe và Gly – Phe – Pro có Ďộ Ďắng hơn Phe – Pro – Gly Một số peptide có khối lượng phân tử nhỏ tồn tại trong sản phẩm thủy phân cũng gây Ďộ Ďắng, vì trong phân tử của chúng có chứa các acid amin có Ďộ Ďắng hay các acid amin kỵ nước Một số nghiên cứu khác Ďã công bố Ďộ Ďắng của peptide dựa vào số lượng gốc acid amin kỵ nước, có khoảng 206 loại peptide có Ďộ Ďắng, Ďặc biệt là những peptide

có chứa từ 2 – 15 gốc acid amin kỵ nước [106, 130] Điều này là cơ sở nghiên cứu của Saha; Rocharake và Ney, kết quả Ďã công bố với những peptide có giá trị Q (Ney [116]) >

1400 cal/mol và khối lượng phân tử < 6kDa thì có Ďộ Ďắng Trong khi Ďó, các peptide có giá trị Q thuộc khoảng Q < 1300 cal/mol và khối lượng phân tử > 6kDa không có Ďộ Ďắng Tuy nhiên, nghiên cứu của Cho lại công bố Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân phụ thuộc vào khối lượng phân tử, không phụ thuộc giá trị Q Bên cạnh Ďó, Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phan do cấu trúc không gian của các peptide [79], một nghiên cứu khác của Teruyoshi Matoba lại khẳng Ďịnh chỉ có acid amin kỵ nước Ďược gắn ở vị trí liên kết cuối N – hoặc C- trong phân tử peptide mới làm cho peptide Ďó có Ďộ Ďắng

1.2.2.3 Một số phương pháp xác định độ đắng của sản phẩm thủy phân

Độ Ďắng của sản phẩm thủy phân thường xác Ďịnh theo phương pháp cảm quan bao gồm phân tích vị hòa tan [89, 115] phân hạng sử dụng thang Ďiểm [92, 102], sử dụng chất chuẩn caffeine [47, 83], sử dụng chất chuẩn quinine [80, 87], thang Ďường thẳng [23] Phân tích vị Ďắng bằng cảm quan sử dụng chất chuẩn phenylthiourea bằng kỹ thuật dựa trên sự pha loãng nối tiếp của mẫu, trong Ďó các ngưỡng vị tương Ďối của các hợp chất Ďược xác Ďịnh [60] Phương pháp sử dụng chất chuẩn caffeine hoặc quinine tương tự phương pháp phân hạng sử dụng thang Ďiểm, trong Ďó panelist Ďược gán với một nồng Ďộ caffein từ một vài mẫu chuẩn Ďược mô tả tốt nhất về Ďộ Ďắng [70] Trong thang Ďường thẳng, hội Ďồng

Ďánh giá cường Ďộ Ďắng trên một thang Ďo Ďiểm ngang So sánh với sử dụng chất chuẩn caffeine hay quinine thì phenylthiourea Ďã không Ďược sử dụng do có Ďộc tính Đa số, các nghiên cứu cảm quan Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân Ďều sử dụng chất chuẩn caffeine hoặc quinine Một số nghiên cứu khác, như Geisenhoff Heidi Ďã công bố xác Ďịnh Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân theo phương pháp xác Ďịnh khối lượng phân tử peptide mà Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân còn liên quan Ďến hàm lượng acid amin kỵ nước Nghiên cứu của Gomez cho thấy giữa Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân có liên quan Ďến hàm lượng acid amin kỵ nước Vậy nên, nghiên cứu mối liên hệ giữa Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân với hàm lượng acid amin kỵ nước là phù hợp hơn

THỦY PHÂN PROTEIN

1.3.1 Tác nhân thủy phân protein

Tác nhân Ďược sử dụng trong quá trình thủy phân protein thường bao gồm tác nhân hóa học và enzyme, tùy vào từng mục Ďích sử dụng của sản phẩm thủy phân Ďể lựa chọn tác nhân phù hợp

1.3.1.1 Tác nhân hóa học

a Tác nhân axit

Nhiều nhà nghiên cứu Ďã sử dụng dung dịch HCl nồng Ďộ 6 – 10 N Ďể thủy phân protein với Ďiều kiện thủy phân 100 – 180oC, thời gian thuỷ phân 24 – 72 giờ [48, 71, 136, 147] Sản phẩm thủy phân Ďược trung hòa bằng dung dịch NaOH hoặc Na2CO3 Phương pháp này cho mức Ďộ thuỷ phân cao từ 85 – 90 %, sản phẩm giàu acid amin và dễ bảo quản [26, 136] Tuy nhiên, thủy phân bằng axit có nhiều nhược Ďiểm do quá trình thủy phân ở nhiệt Ďộ cao và nồng Ďộ axit HCl Ďặc, một số acid amin bị phá huỷ trong quá trình thuỷ phân Tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, tổn thất của các acid amin chứa lưu huỳnh lớn (10 – 30%) Các acid amin bị phân huỷ một phần như threonine, serine, methionine, cysteine Hơn nữa, sử dụng tác nhân axit trong quá trình thủy phân làm tăng chi phí năng lượng và Ďầu tư thiết bị do phải chịu nhiệt và chống axit ăn mòn, Ďặc biệt việc sử dụng HCl Ďặc Ďộc hại và ô nhiễm môi trường [136] Mặt khác, theo nghiên cứu của Huige, khi nồng Ďộ HCl

và nhiệt Ďộ cao thường xảy ra phản ứng giữa Cl2 và HCl với chất béo trong tế bào nấm men sinh Ďộc tố monochloropropanol và dichloropropanol là tác nhân gây ung thư

Quá trình thủy phân protein bằng axit H2SO4 Ďược Ďưa ra bởi theo nghiên cứu của Kristinsson và Rasco Sản phẩm thủy phân có hàm lượng muối thấp hơn so với thuỷ phân bằng HCl Tuy nhiên, sản phẩm thuỷ phân bằng H2SO4 có vị thường kém hơn khi dùng HCl

b Tác nhân kiềm

Kiềm Ďược nhiều nghiên cứu sử dụng với nồng Ďộ 4 – 8 N, nhiệt Ďộ 100 – 110 oC, thời gian 24 – 36 giờ Ďể thủy phân bã nấm men bia, phương pháp này cho mức Ďộ thủy phân cao và bảo toàn Ďược tryptophan [136] Tuy nhiên, ở Ďiều kiện này xảy ra hiện tượng racemic hoá, làm giảm giá trị dinh dưỡng của sản phẩm thủy phân do giảm hàm lượng các acid amin cysteine, serine và threonine [84] Ngoài ra, còn xảy ra quá trình oxy hoá một số acid amin khác, kiềm xúc tác cho phản ứng tạo lysinoalanine làm giảm lysine trong sản phẩm thuỷ phân Một số nghiên cứu khác của Andreu và Behalová Ďã cho thấy, quá trình thủy phân nấm men bằng kiềm giảm hàm lượng RNA Ďáng kể, tuy nhiên tổn thất protein lớn Các tác giả Ďã chứng minh hiệu quả của các hợp chất amoni trong việc giảm RNA sinh khối

Mỗi một loại chế phẩm protease có tính Ďặc hiệu riêng, nên sản phẩm thủy phân protein cũng có nhiều chức năng, tùy vào mục Ďích sử dụng sản phẩm thủy phân Ďể sử dụng loại chế phẩm protease phù hợp [ 40, 143] Với mục Ďích của luận án này là sản phẩm thủy phân protein bã nấm men bia Ďạt chất lượng cho ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nên nhóm nghiên cứu sử dụng tác nhân enzyme Ďể tiến hành thủy phân protein bã nấm men bia bằng chế phẩm protease Nhóm nghiên cứu Ďã tìm hiểu bản chất của enzyme protease, Ďể lựa chọn loại chế phẩm protease cho nghiên cứu

a Enzyme protease

Enzyme protease thuộc nhóm enzyme protease xúc tác thuỷ phân liên kết peptide CO-NH-) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự

(-Người ta phân loại nhóm enzyme này theo nhiều cách khác nhau [2, 11, 12, 17]

Dựa vào vị trí của liên kết peptide ở nội mạch hay ở Ďầu mạch thì enzym protease Ďược chia thành 2 nhóm: endopeptidase và exopeptidase

- Nhóm endopeptidase phân tách các protein thành các chuỗi peptide ngắn hơn Endopeptidase Ďược chia thành bốn nhóm dựa vào Ďộng học cơ chế xúc tác

+ Serine protease: Là những proteinase có nhóm –OH của gốc serin trong trung tâm hoạt Ďộng có vai trò Ďặc biệt quan trọng Ďối với hoạt Ďộng xúc tác của enzyme Enzyme thuộc nhóm này thường hoạt Ďộng mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính Ďặc hiệu cơ chất tương Ďối rộng Lớp enzyme này Ďược chia thành 2 nhóm nhỏ hơn Ďó là chymotrypsin và substilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme của Ďộng vật có vú như: chymotrypsin, trypsin, elastase hay kallikrein Nhóm enzyme substilisin gồm các enzyme của vi khuẩn như substilisin

+ Cysteine protease: Là những proteinase có nhóm – SH trong trung tâm hoạt Ďộng Các enzyme thuộc nhóm này thường hoạt Ďộng mạnh ở pH trung tính, có tính Ďặc hiệu rộng và chỉ hoạt Ďộng Ďược khi nhóm –SH không bị bao vây như Papain, Bromelin, một vài protein Ďộng vật và proteinase ký sinh trùng Các cysteine proteinase thường hoạt Ďộng ở vùng pH trung tính, có tính Ďặc hiệu cơ chất rộng

+ Aspartic protease: Là những enzyme có chứa nhóm cacboxyl trong trung tâm hoạt Ďộng, thường hoạt Ďộng mạnh ở pH trung tính như pepsin, renin, cathepsin, chymosin…

+ Metallo protease: Là nhóm enzyme có nhóm kim loại ở trung tâm hoạt Ďộng, Ďược tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các sinh vật bậc cao hơn Các metallo protease thường hoạt Ďộng mạnh nhất ở vùng pH trung tính và hoạt Ďộ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Dựa vào tính chất của môi trường hoạt Ďộng (pH của môi trường) có thể chia thành

3 loại protease:

- Protease kiềm tính (pH = 8,0 – 11,0)

- Protease trung tính (pH = 6,0 – 7,5)

- Protease axit tính (pH < 6,0)

Tuy nhiên cách phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thực sự chính xác vì

pH tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố khác nữa

Dựa vào quá trình thuỷ phân có thể chia thành proteinase và peptidase [140, 142]

- Proteinase: Là enzym thuỷ phân liên kết peptide ở giữa chuỗi mạch polypeptide Vì vậy,

nó cắt phân tử protide thành những Ďoạn protein có phân tử lượng nhỏ hơn (pepton, polypeptide) Enzyme này xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết peptide bên trong phân

tử protide Hoạt Ďộ tối ưu Ďạt Ďược khi pH = 4.6 – 4.9, nhiệt Ďộ tối ưu là 50 – 60oC, nhóm enzyme này chỉ bị vô hoạt khi nhiệt Ďộ lớn hơn 70oC Ở 50oC, dưới tác dụng của enzyme này sản phẩm tạo thành chủ yếu là các pha thấp phân tử (peptide, polypeptide), còn ở 60oC thì sản phẩm chủ yếu thuộc nhóm phân tử lượng trung bình

- Peptidase: Là nhóm enzyme thủy phân liên kết peptide ở 2 Ďầu của phân tử protide Đầu

tiên tạo thành các dipeptide rồi thành acid amin tự do Trong quá trình thủy phân mối liên kết peptide ở Ďầu amin hoặc Ďầu cacboxyl sẽ dần dần bị thuỷ phân Các enzyme này có tính Ďặc hiệu rất cao Ví dụ: Dipeptidase thì thuỷ phân dipeptide còn polypeptidase thì thuỷ phân polypeptide có từ ba acid amin trở lên Aminopeptidase chỉ thể hiện hoạt lực xúc tác khi cơ chất có nhóm – NH2 tự do, còn cacboxylpeptidase chỉ hoạt Ďộng thuỷ phân khi cơ chất có nhóm –COOH tự do Tất cả các peptidase kém bền nhiệt hơn proteinase nhưng lại hoạt Ďộng tốt trong môi trường kiềm Hoạt Ďộng tốt nhất ở pH = 7-8 và nhiệt Ďộ khoảng 40 – 42oC Trong dung dịch nước, enzyme này hoạt Ďộng yếu dần khi tăng nhiệt Ďộ lên 50oC và biến tính phi thuận nghịch nhanh chóng ở nhiệt Ďộ 60oC

b Một số chế phẩm protease thương mại của hãng Novo Nordisk Đan Mạch

- Papain: Được chiết xuất từ nhựa quả Ďu Ďủ, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62

Nhiệt Ďộ tối ưu 50 – 60oC, dải pH hoạt Ďộng 5,0 – 9,0, Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Chế phẩm có dạng bột

- Bromelain: Được chiết xuất từ quả dứa, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt

Ďộ tối ưu 50 – 60o

C, dải pH hoạt Ďộng 5,0 – 9,0, Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Chế phẩm có dạng bột

- Pancreatin: Thành phần enzyme bao gồm trypsin, amylase và lipase, ribonuclease, và

protease, Ďược sản xuất bởi các tế bào ngoại tiết của tuyến tụy lợn Sự kết hợp của các enzyme cho phép nó thủy phân protein, tinh bột và chất béo Pancreatin sẽ chuyển Ďổi không thấp hơn 25 lần trọng lượng của tinh bột khoai tây vào carbohydrate hòa tan trong 5 phút trong nước ở 40o

C, thủy phân không ít hơn 25 lần trọng lượng của nó với casein trong

60 phút ở pH 7,5 ở 40oC

- Neutrase 0,8L: Được sản xuất từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens, thuộc nhóm

endoprotease EC 3.4.24.28 Điều kiện tối ưu của Neutrase là: Nhiệt Ďộ 40oC – 50oC, pH 7,0 Chế phẩm Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Chế phẩm này không chứa amylase, chứa một lượng β-glucanase không xác Ďịnh Cần ion kẽm cho hoạt Ďộng của nó, ion Ca2+

có tác dụng làm bền enzym, enzym bị ức chế bởi EDTA Neutrase bị vô hoạt ở 85oC trong

2 phút

- Flavourzyme 500MG: Được sản xuất từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Flavourzyme vừa

thuộc nhóm endoprotease và exoprotease Điều kiện tối ưu của Flavourzyme là: Nhiệt Ďộ

45oC – 55oC, pH 6 – 8 Chế phẩm Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Chế phẩm dạng bột màu trắng nâu (trong từng lô, từng Ďợt sản xuất thì mức Ďộ Ďậm nhạt của màu sắc của chế phẩm có thể khác nhau) Flavourzyme có thể thuỷ phân trên 70% mối liên kết peptide, sản phẩm thuỷ phân bằng Flavourzyme thơm ngon, không có Ďộ Ďắng khi thuỷ phân ở mức Ďộ vừa phải Chế phẩm không có các chất Ďộc hại, hàm lượng muối thấp

- Alcalase 2,4 AU/g: Là sản phẩm Ďược sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, thuộc

nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt Ďộ tối ưu 30 – 65oC, dải pH hoạt Ďộng 7,0 – 9,0, Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4o

C Chế phẩm có dạng lỏng, màu nâu Ďen, sánh

- Protamex®: Là sản phẩm Ďược sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, có hoạt tính

1,5 AU/g, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt Ďộ tối ưu 35 – 60oC, dải pH hoạt Ďộng 5,5 – 7,5, Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4o

C Chế phẩm có dạng bột

- Savinase® 12T: Là sản phẩm Ďược sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, có hoạt

tính 12KNPU-S/g, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt Ďộ tối ưu 30 – 70oC, dải

pH hoạt Ďộng 8,0 – 10,0, Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Chế phẩm có dạng bột

- Esoperase® 0,8L: Là sản phẩm Ďược sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis, có hoạt

tính 8KNPU-E/g, thuộc nhóm endoprotease EC 3.4.21.62 Nhiệt Ďộ tối ưu 30 – 70oC, dải

pH hoạt Ďộng 8,0 – 12,5, Ďược bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC Chế phẩm có dạng lỏng Trong thực tế, các chế phẩm protease Ďược sản xuất từ nguồn vi sinh vật, Ďược sử dụng nhiều, bởi giá thành thấp, hiệu quả sử dụng cao, dẫn Ďến chi phí sản xuất thấp

Mặc dù, tác nhân enzyme là lựa chọn thích hợp cho sản xuất sản phẩm thủy phân protein ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, nhưng sản phẩm thủy phân thường có độ đắng Để giảm độ đắng, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện bằng phương pháp tách chiết (sử dụng cồn như butyl alcohol, ethanol và isopropyl) [85] hay sử dụng chất hấp thụ [72] Trong khi đó, nghiên cứu của Adler – Nissen lại dựa vào tính chất của các peptide kỵ nước, không bị hòa tan ở pH đẳng điện, do đó chúng được loại bỏ bằng kết tủa đẳng điện Tuy nhiên, loại đắng bằng phương pháp tách chiết hay kết tủa đẳng điện đều sử dụng hóa chất, không phù hợp khi sản phẩm thủy phân ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm [65] Nên sử dụng các chế phẩm protease được các nhà nghiên cứu sử dụng rộng rãi và phổ biến cho quá trình thủy phân protein [61]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân và độ đắng của sản phẩm thủy phân

Có nhiều yếu tố cần quan tâm trong quá trình thủy phân protein bằng chế phẩm protease Như nhiệt Ďộ và pH, bởi mỗi chế phẩm protease có pH và nhiệt Ďộ tối ưu khác nhau Các yếu tố khác như cơ chất, tỷ lệ cơ chất/ nước, tỷ lệ enzyme/cơ chất, thời gian thủy phân cũng ảnh hưởng không nhỏ Ďến hiệu quả thủy phân protein và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân Mặc dù tỷ lệ bã nấm men bia/nước không có ảnh hưởng bằng các yếu tố khác trong quá trình thủy phân, nhưng vẫn có một số nghiên cứu cho thấy nó có ảnh hưởng quan trọng trong quá trình thủy phân, nếu nồng Ďộ cơ chất cao, không thuận lợi cho quá trình thủy phân bán liên tục hoặc liên tục Do Ďó, trong quá trình thủy phân protein, tỷ lệ bã nấm men bia/nước Ďược khảo sát và kết quả Ďạt Ďược cho hiệu quả thủy phân cao là 1: 1 [67, 93], 10% (w/w) [35], 15% (w/w) và 20 % (w/w) [71]

1.3.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân

Hiệu quả quá trình thủy phân có thể Ďược xác Ďịnh bằng cách:

- Tỷ lệ thu hồi chất rắn trong sản phẩm thủy phân, chất rắn là các thành phần acid amin và các peptide có khối lượng phân tử nhỏ [71]

- Mức Ďộ thủy phân (DH) (Ďược tính bằng tổng hàm lượng acid amin tạo thành trong sản phẩm thủy phân/tổng hàm lượng protein tổng của nguyên liệu ban Ďầu) [93, 145]

- Tỷ lệ protein hòa tan thu hồi trong sản phẩm thủy phân [71, 145]

a Loại và tỷ lệ chế phẩm protesase/cơ chất Ďược sử dụng có ảnh hưởng không nhỏ Ďến hiệu quả thủy phân:

Theo Hoàng Kim Anh và Trần Ngọc Hiếu, Papain có Ďặc tính Ďặc hiệu rộng nhất, thủy

phân protein nấm men tăng hiệu suất thu dịch chiết lên tới 70%; Peptidase (Aspergillus) chuyển glutamine thành acid glutamic, làm tăng vị; Ribonuclease (Penicillium) chuyển acid nucleic thành các nucleotide; Deaminase (Aspergillus) chuyển acid adenylic thành acid inosinic; Glucanase (Bacillus) phân cắt các glucan có trong vách tế bào

Nghiên cứu của Tatjana Vukasinovic Milic cho thấy, khi khảo sát nồng Ďộ chế phẩm protease trong quá trình thủy phân nấm men bằng chế phẩm Papain (0,5; 1; 2,5; 5%) và Lyticase (0,005; 0,01; 0,02; 0,025%) Kết quả nghiên cứu Ďạt Ďược với nồng Ďộ chế phẩm Papain 2,5% và Lyticase 0,025% hàm lượng chất rắn thu hồi và hàm lượng protein hòa tan cao nhất tương ứng lần lượt là 61,95% và 56,38 mg/ml

Bên cạnh Ďó, ảnh hưởng của chế phẩm β – glucanase và Papain Ďến hiệu suất thu hồi

chất rắn trong sản xuất chiết xuất nấm mentừ Candida Utilis là Ďáng kể Kết quả cho thấy

sử dụng chế phẩm Papain Ďạt tỷ lệ thu hồi chất rắn cao nhất 68,6 ± 2,01% Với nồng Ďộ Papain Ďược sử dụng Ďể nghiên cứu là 0,1%; 0,2%; 0,3; 0,4%; 0,5%; 0,6% Kết quả cho thấy từ nồng Ďộ Papain 0,1% Ďến 0,2% hiệu suất thu hồi chất rắn tăng mạnh Ďạt 67,02% (ở 0,2% Papain), với nồng Ďộ enzyme > 0,2% hiệu suất thu hồi chất rắn hầu như không Ďổi [147]

Theo Seo và cộng sự Ďã tiến hành quá trình thủy phân protein Ďậu nành bằng chế phẩm Flavourzyme, Alcalase, Neutrase, Protamex, Papain và Bromelain ở các khoảng tỷ lệ E/S

là 0,5%; 1%; 2% Kết quả cho thấy, sau 3 giờ thủy phân, DH bằng protamex Ďạt giá trị cao nhất 28%, tiếp Ďến là DH bằng Alcalase, Flavourzyme, Papain, Neutrase và DH bằng Bromelain là thấp nhất 18% DH bằng Alcalase và bromelain không chênh lệch nhiều ở các tỷ lệ E/S khảo sát, trong khi Ďó DH bằng Flavourzyme, Papain, Neutrase lại tăng mạnh

ở tỷ lệ E/S là 1%, nếu tỷ lệ E/S > 1%, DH hầu như không Ďổi Ngược lại, nghiên cứu của

Barbara Dolinska và cộng sự, lại kết luận sử dụng chế phẩm Papain trong sản xuất sản phẩm thủy phân từ nấm men bánh mì cho mức Ďộ thủy phân cao nhất

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ E/S với khoảng khảo sát 5mAU/g, 15mAU/g, 25mAU/g, 35mAU/g Ďến mức Ďộ thủy phân protein Ďậu bằng chế phẩm Trypsin của Magdalena Karamac và cộng sự Kết quả cho thấy sau 2 giờ thủy phân, mức Ďộ thủy phân lớn nhất ứng với tỷ lệ E/S 35mAU/g, DH Ďạt giá trị 11,5% Trong khi Ďó, DH ở tỷ lệ E/S 5mAU/g là 7,1% Quá trình thủy phân gián Ďoạn protein nấm men bằng chế phẩm Papain

và Bromelanin cũng Ďược nghiên cứu [87] Kết quả mức Ďộ thủy phân bằng chế phẩm Papain (52,13 %) cao hơn chế phẩm Bromelanin (50,97 %)

Kết quả nghiên cứu của Trần Nhân Dũng và cộng sự cho thấy, khi quá trình thủy phân nấm men thải bằng enzyme Papain với nồng Ďộ (0 – 1%), ở nồng Ďộ enzyme là 0,4% hiệu suất thu hồi chất rắn Ďạt cao nhất khoảng 68-69%

Hiệu quả thủy phân Ďạt Ďược của từng nghiên cứu là khác nhau, tùy thuộc vào từng loại

cơ chất và chế phẩm protease Những năm gần Ďây, một số nghiên cứu Ďã chỉ ra Ďược hiệu quả thủy phân không cao khi chỉ sử dụng một chế phẩm protease [35, 71] Do Ďó, một số nghiên cứu Ďã Ďược thực hiện bằng việc sử dụng hỗn hợp hai chế phẩm protease trong quá trình thủy phân protein Quá trình thủy phân gián Ďoạn protein nấm men bằng hỗn hợp Flavourzyme và Protamex, với nồng Ďộ khảo sát từ 0,2%; 0,6%; 1% (w/w), các thí nghiệm Ďược thực hiện tổ hợp với nhau giữa các nồng Ďộ Kết quả cho thấy ở nồng Ďộ 0,6% Flavourzyme và 0,6% Protamex, nhiệt Ďộ 50oC, pH 7,0, tỷ lệ bã nấm men bia/nước 20% w/w, sau 12 giờ, mức Ďộ thủy phân gián Ďoạn cao nhất, 48,13% [71] Tương tự cho thấy trong nghiên cứu của Bayarjargal và cộng sự, quá trình thủy phân gián Ďoạn bã nấm men bia bằng hỗn hợp Pancreatin (2,5%) và Flavourzyme (2,5%) ở 50oC, trong thời gian 5 giờ,

pH 7,0, tỷ lệ bã nấm men bia/nước 10% w/w, hàm lượng protein hòa tan Ďạt 55,9% (tính theo sản phẩm thủy phân sấy khô) Mặt khác, trên Ďối tượng cơ chất khác với protein bã nấm men, Yongsheng Ma và cộng sự Ďã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ E/S của hỗn hợp Alcalase và Flavourzyme Ďến mức Ďộ thủy phân protein Ďậu nành Với khoảng tỷ lệ E/S nghiên cứu của Flavourzyme và Alcalase là 10, 15, 20, 25 LAPU/g, ở Ďiều kiện 50oC,

pH 7,0 Kết quả cho thấy, sau 3 giờ thủy phân, tại tỷ lệ E/S là 20 LAPU/g của Flavourzyme

và Alcalase cho mức Ďộ thủy phân cao nhất

Như vậy, nếu tăng tỷ lệ chế phẩm protease/cơ chất thì mức Ďộ thủy phân cao, nhưng lượng chế phẩm protease sử dụng nhiều làm tăng chi phí sản xuất Hơn nữa, tùy vào mục Ďích sử dụng sản phẩm thủy phân Ďể lựa chọn loại chế phẩm protease cũng cần cân nhắc

Do Ďó, trong sản xuất việc lựa chọn chế phẩm protease cần kiểm soát tỷ lệ E/S, giá thành

chế phẩm protease Ďược sử dụng thích hợp Ďể Ďạt mức Ďộ thủy phân cao với chi phí giá thành sản phẩm thấp

b Nhiệt Ďộ và pH cũng ảnh hưởng lớn Ďến hiệu quả thủy phân:

Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ thủy phân khảo sát 35oC, 40oC, 45oC, 50oC Ďến mức Ďộ thủy phân protein Ďậu hà lan bằng enzyme trypsin Kết quả cho thấy sau 2 giờ thủy phân, mức

Ďộ thủy phân lớn nhất ở khoảng nhiệt Ďộ từ 45o

C Ďến 50oC, DH Ďạt giá trị lần lượt là 12,2% và 12,3% Trong khi Ďó, DH ở nhiệt Ďộ 35o

C và 40oC chỉ Ďạt 7,4% và 8,6% [93]

c Ảnh hưởng của thời gian Ďến hiệu quả thủy phân:

Thời gian thủy phân là yếu tố cần kiểm soát trong quá trình thủy phân, thời gian thủy phân càng dài thì tăng khả năng thủy phân protein thành các peptide có khối lượng phân tử nhỏ và các acid amin Nhưng thời gian thủy phân cũng phụ thuộc vào tỷ lệ E/S và BNMB/N, nếu thời gian thủy phân quá dài mà mức Ďộ thủy phân không tăng, dẫn Ďến chi phí năng lượng tăng Đa số các nghiên cứu về Ďộng học quá trình thủy phân Ďược thực hiện theo thời gian Theo nghiên cứu của Yuping Guan và cộng sự, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian thủy phân Ďến hiệu suất thu hồi chất rắn trong sản xuất chiết xuất nấm men

từ Candida Utilis bằng chế phẩm Papain, với tỷ lệ E/S 0,2%, tỷ lệ bã nấm men bia/nước

15% w/w Kết quả cho thấy, từ 1 Ďến 6 giờ thủy phân, hiệu suất thu hồi chất rắn tăng mạnh Ďạt 69,26% (tại 6 giờ), tiếp tục thủy phân thì hiệu suất thu hồi chất rắn hầu như không Ďổi Nghiên cứu của Seo và cộng sự cho thấy ảnh hưởng lớn của thời gian thủy phân Ďến mức

Ďộ thủy phân protein Ďậu nành bằng chế phẩm Flavourzyme, Alcalase, Neutrase, Protamex, Papain và Bromelain Kết quả cho thấy, trong 1 giờ Ďầu thủy phân, mức Ďộ thủy phân bằng Flavourzyme, protamex và Alcalase là cao nhất, sau Ďó quá trình thủy phân bằng Flavourzyme giảm dần trong khi bằng Alcalase và Protamex tăng mạnh DH tăng chậm Ďều Ďối với quá trình thủy phân bằng Neutrase, Papain và Bromelain, sau 3 giờ thủy phân, mức Ďộ thủy phân protein Ďậu nành bằng Flavourzyme, Alcalase, Neutrase, Protamex, Papain và Bromelain lần lượt là 23%, 25%, 21%, 22%, 28%, 18% Mặt khác, một số tác giả nghiên cứu thủy phân protein sử dụng hỗn hợp hai hay nhiều chế phẩm protease theo thời gian Nghiên cứu của Hee JC và cộng sự, trong sản xuất men chiết xuất, với tỷ lệ E/S 0,6% Flavourzyme và 0,6% Protamex, tỷ lệ bã nấm men bia/nước 20% w/w, kết quả nghiên cứu cho thấy khi quá trình thủy phân bã nấm men bia từ 1 Ďến 12 giờ thì hiệu suất thu hồi chất rắn Ďạt 52,5%, sau 12 giờ thủy phân hiệu suất thu hồi chất rắn tăng chậm Nghiên cứu của Yongsheng và cộng sự Ďã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian Ďến nồng Ďộ protein hòa tan khi thủy phân protein Ďậu nành bằng hỗn hợp Alcalase và

Flavourzyme, kết quả cho thấy nồng Ďộ protein hòa tan tăng mạnh trong 10 giờ thủy phân

và không tăng khi tiếp tục tăng thời gian

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ đắng của sản phẩm thủy phân

Hiệu suất thuỷ phân bằng chế phẩm protease tối Ďa chỉ Ďạt 70 % [128] Đặc biệt, sự thuỷ phân hạn chế do tác dụng của các endoprotease từ vi khuẩn làm giải phóng ra các peptide kị nước có Ďính các gốc leucine và phenylalanine nên sản phẩm thuỷ phân từ protease thường có Ďộ Ďắng [71] Tương tự, theo Magdalena K và cộng sự khó khăn gặp phải trong quá trình thuỷ phân protein là sản phẩm thủy phân thường có Ďộ Ďắng, các

serine proteinase của Bacillus subtilis Ďặc hiệu ở vị trí amino acid thơm hoặc amino acid

kỵ nước

a Loại và tỷ lệ chế phẩm protesase/cơ chất Ďược sử dụng có ảnh hưởng Ďến Ďộ Ďắng quả thủy phân:

Tỷ lệ E/S cũng ảnh hưởng lớn Ďến Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân Thực vậy, theo nghiên cứu của Yongsheng và cộng sự Ďã thực hiện nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ E/S của hỗn hợp Alcalase và Flavourzyme Ďến Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân protein Ďậu nành, sau 2 giờ thủy phân ở tỷ lệ E/S là 20 LAPU/g sản phẩm thủy phân có Ďộ Ďắng thấp nhất Loại enzyme sử dụng cũng tác Ďộng lớn Ďến Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân, theo Seo và cộng sự Ďã tiến hành quá trình thủy phân protein Ďậu nành bằng chế phẩm Flavourzyme, Alcalase, Neutrase, Protamex, Papain và Bromelain ở cùng tỷ lệ E/S là 0,5%, sau 3 giờ thủy phân, Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân bằng chế phẩm Flavourzyme

là thấp nhất, tiếp Ďến là Papain, Neutrase và Protamex, Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân bằng Alcalase cao nhất

b Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ và pH Ďến Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân:

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt Ďộ và pH Ďến Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân protein Ďậu nành bằng hỗn hợp Alcalase và Flavourzyme pH Ďược khảo sát 6,5; 7,0; 7,5; 8,0, Ďiều kiện thủy phân 50o

C, tỷ lệ E/S là 20LAPU/g trong thời gian 3 giờ, kết quả Ďộ Ďắng của dịch thủy phân thấp nhất ở pH 7,0 [145] Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt Ďộ với khoảng khảo sát 45; 50; 55; 60oC, tỷ lệ E/S là 20LAPU/g trong thời gian 3 giờ và pH 7,0 Kết quả cho thấy từ 0 – 1 giờ, Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân thấp nhất ở nhiệt Ďộ 45oC, nhưng từ 2 giờ thủy phân trở Ďi, Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân thấp nhất ở 50o

C

Như vậy, dựa vào các nghiên cứu Ďã công bố cho thấy, Ďể thủy phân protein thường dùng các chế phẩm protease trung tính hoặc kiềm Papain Ďược lựa chọn nhiều, tuy nhiên giá thành Ďắt, Flavourzyme có hoạt tính endopeptidase và exopeptidase (có Ďặc hiệu của

aminopeptidase và carboxypeptidase) Ďược lựa chọn Ďể có Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân thấp nhất Với mục tiêu Ďạt mức Ďộ thủy phân lớn thì Alcalase (thuộc nhóm endopeptidase, là protease kiềm) Ďược lựa chọn cho nghiên cứu thủy phân protein bã nấm men bia Protamex thường Ďược sử dụng cho thủy phân protein từ Ďộng vật Neutrase có thành phần glucanase, tăng khả năng phá vỡ màng tế bào Do Ďó, trong luận án này, ba loại chế phẩm Flavourzyme, Alcalase và Neutrase Ďược sử dụng Ďể tiến hành khảo sát và nghiên cứu

PHÂN VÀ CHẤT LƯỢNG SẢN PHẨM THỦY PHÂN TỪ BÃ NẤM MEN BIA

1.4.1 Xử lý bã nấm men bia

1.4.1.1 Loại đắng bã nấm men bia

Mục Ďích: Lựa chọn Ďược giải pháp loại bỏ các acid Ďắng của hoa houblon trong bã nấm men bia nhằm giảm Ďộ Ďắng sản phẩm thủy phân

Sử dụng dung dịch muối ăn Ďể loại bỏ các acid Ďắng của hoa houblon trong bã nấm men bia cho hiệu quả cao [43] Tuy nhiên, gây ra sự tổn thất 2 - 4% protein và một phần lớn vitamin nhóm B Bên cạnh Ďó, trong nghiên cứu của Bishop [39], Ďã sử dụng các dung dịch H3PO4 0,1N; NaOH 0,1N; NaCl 0,9% và acid axetic 1% Ďể tiến hành nghiên loại bỏ các acid Ďắng của hoa houblon Kết quả cho thấy, Ďộ Ďục của dung dịch sau khi xử lý bằng NaOH 0,1N là cao nhất (OD=0,415), màu của nước rửa có màu vàng, chứng tỏ, khi xử lý bằng dung dịch NaOH 0,1N, thành phần isohumulones gắn trên bề mặt tế bào nấm men không bền và do vậy bị tách khỏi tế bào nấm men và chuyển vào trong dung dịch NaOH,

do Ďó bã nấm men bia sau xử lý bằng dung dịch NaOH 0,1N có Ďộ Ďắng thấp nhất Nhưng một số nghiên cứu cho thấy xử lý bã nấm men bia bằng dung dịch NaOH làm tế bào bã nấm men bia bị chết [58, 122, 133], là Ďiều không mong muốn trong sản xuất các sản phẩm cao Ďạm Hơn nữa, theo Tangluer và Erten các enzyme nội bào có ý nghĩa lớn cho quá trình tự phân bã nấm men bia, nên cần phải khảo sát nồng Ďộ dung dịch NaOH theo thời gian rửa với tiêu chí Ďộ Ďắng của bã nấm men bia thấp và tỷ lệ tế bào men sống cao

1.4.1.2 Phá vỡ thành tế bào bã nấm men bia

Mục Ďích: Do thành tế bào nấm men dày, ảnh hưởng lớn Ďến mức Ďộ thủy phân và thời gian của quá trình thủy phân Phá vỡ thành tế bào nấm men là bước quan trọng nhằm

nâng cao mức Ďộ thủy phân Hiện nay, một số phương pháp Ďược các nhà nghiên cứu và sử dụng như phương pháp cơ học, vật lý, hóa học, enzyme và tự phân

a Phương pháp cơ học và vật lý:

Phá vỡ tế bào bằng cách dùng áp suất cao Ďể Ďẩy nguyên liệu (dịch huyền phù tế bào dưới dạng bột nhão Ďược làm Ďông ở -20o

C) qua các lỗ hẹp của máy nén làm tế bào bị phá

vỡ do sự thay Ďổi pha và thay Ďổi thể tích cũng như do lực cắt của các tinh thể Ďá [45, 117, 134] Phương pháp này có thể sử dụng Ďể phá vỡ các tế bào ở quy mô lớn 100-1000 lít/giờ Trong nghiên cứu của Kelly và cộng sự, Ďã thực hiện phương pháp phá vỡ tế bào ở quy mô phòng thí nghiệm ứng dụng cho ngành công nghệ sinh học Tuy nhiên, phương pháp này bị hạn chế khi ứng dụng ở quy mô công nghiệp [77]

Có thể phá vỡ tế bào bằng cách dùng quả cầu thép hoặc bi thủy tinh Ďể nghiền [88]

Tỷ lệ và hiệu suất giải phóng enzyme phụ thuộc vào tốc Ďộ lắc và kích thước của các loại hạt cũng như Ďường kính của thiết bị Với cùng một thể tích hạt, thì sử dụng một lượng lớn các hạt nhỏ sẽ hiệu quả hơn một lượng tương Ďối nhỏ các hạt lớn, vì nó làm tăng sự va chạm giữa các hạt và các tế bào Theo nghiên cứu của Ren thực hiện quá trình phá vỡ màng tế bào nấm men bằng thiết bị nghiền bi với vận tốc lắc 18 m/s, kết quả Ďạt Ďược 100% tế bào nấm men bị phá vỡ trong vòng 72 giây ở nồng Ďộ 3,5 g (trọng lượng khô)/100ml Bên cạnh Ďó, trong nghiên cứu của Klimek – Ochab, khi thực hiện phá vỡ tế bào bằng nghiền bi với các hạt thủy tinh có Ďường kính 0,5mm, sau 3 phút nghiền, hiệu suất phá vỡ tế bào nấm men cao, nồng Ďộ protein Ďạt 175 µg/ml Đồng thời, kết quả Ďạt

nồng Ďộ protein hòa tan là 1,6 mg/g ± 0,1 với quá trình phá vỡ tế bào Lepista sp

Phá vỡ tế bào bằng siêu âm là kỹ thuật thích hợp và rất hiệu quả ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng khó ứng dụng ở quy mô sản xuất lớn [90] Theo nghiên cứu của Borthwick

và Gogate, khi sử dụng siêu âm Ďể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn rất hiệu quả, giải phóng các enzyme nội bào hoặc chỉ phá vỡ thành tế bào Nghiên cứu thực hiện phá vỡ tế bào

Aspergillus fumigatus bằng siêu âm với tần số cao > 16kHz, chu kỳ siêu âm Ďược khảo sát

ở 11 và 30 giây, tổng thời gian Ďể mẫu siêu âm Ďược khảo sát từ 1 - 3,5 phút Mẫu có tổng thời gian siêu âm dài thì hàm lượng protein càng giảm, cụ thể tổng thời gian siêu âm ở 1 phút và 3,5 phút thì hàm lượng protein Ďạt lần lượt là 258 µg/ml ± 75 và 300 µg/ml ± 54 (với chu kỳ siêu âm 11 giây); 87 µg/ml ± 8,5 và 41 µg/ml ± 4,3 (với chu kỳ siêu âm 30 giây) [81] Trong nghiên cứu của Jayarama Ďã sử dụng phương pháp siêu âm Ďể tách enzyme ribonuclease từ nấm men bia

Có thể phá vỡ tế bào bằng phương pháp xử lý nhiệt, dùng hơi nước tác Ďộng trực tiếp vào sinh khối nấm men ở nhiệt Ďộ khoảng 121oC Phương pháp xử lý nhiệt này nếu Ďể thời

gian lâu > 30 phút sẽ làm tổn thất protein, nếu < 30 phút thì không có hiệu quả nhiều [63] Gần Ďây, Ren và Tkac Ďã công bố quá trình xử lý nhiệt thường kết hợp với sốc nhiệt Ďể phá

vỡ tế bào Ďạt hiệu quả cao, nhưng ứng dụng phần lớn cho việc tách chiết các chất có hoạt tính sinh học, với phương pháp này dễ gây tổn thất một số acid amin, làm mất hoạt tính của các enzyme nội bào trong bã nấm men bia, dẫn Ďến quá trình tự phân không có tác dụng Nhưng khi chỉ sử dụng phương pháp sốc nhiệt Ďể phá vỡ tế bào, Maul và Ohta lại tiến hành trong khoảng nhiệt Ďộ dao Ďộng 50oC – 70oC, không làm mất hoạt tính của enzyme nội bào, là Ďiều kiện thích hợp cho ribonuclease trong nấm men bia hoạt Ďộng, dẫn Ďến hàm lượng acid nucleic trong sản phẩm thủy phân giảm Quá trình sốc nhiệt Ďược thực hiện lần

1 ở Ďiều kiện từ 1 – 3 phút ở 68oC, sau Ďó ủ trong 1 giờ ở 45 – 50oC và lần 2 thực hiện quá trình sốc nhiệt từ 1 – 3 phút ở 68oC, sau Ďó ủ trong 1 giờ ở 52 – 55oC [97, 103] Kết quả hàm lượng acid nucleic cũng giảm Ďáng kể từ 7% xuống còn 1% khối lượng chất khô Do

Ďó, Ďể nâng cao chất lượng sản phẩm thủy phân, nhóm tác giả nhận thấy phương pháp sốc nhiệt cần Ďược nghiên cứu

Theo Klimek – Ochab và cộng sự, các tế bào vi sinh vật Ďược xử lý trong 20ml dung dịch Ďệm chứa 50mmol /l Tris – HCl, chứa 10mmol/l EDTA và 30% (w/v) sucrose, sau Ďó

xử lý sốc nhiệt trong 20 phút, tiếp Ďến ly tâm, kết quả Ďạt Ďược dung dịch chiết có nồng Ďộ protein 565 µg/ml

b Phương pháp hóa học

Theo Zhener – Krpan và cộng sự, nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng NaOH với nồng 0,5 -0,7N làm phá vỡ tế bào nấm men cho hiệu quả cao Nghiên cứu của Suphantharika và cộng sự, thực hiện phá tế bào nấm men bia bằng dung dịch NaOH, hiệu suất thu hồi β – glucan cao, Ďạt 51% (w/w) Tuy nhiên, hàm lượng protein thu hồi lại thấp 1,6% (w/w), làm giảm giá trị sử dụng của protein do một số acid min bị phá hủy như lysine, cysteine và tryptophan Mặc dù có hiệu quả phá vỡ tế bào tốt, nhưng khi sử dụng acid hay kiềm sẽ làm tổn thất acid amin và β – glucan [91] Hơn nữa, với mục Ďích ứng dụng sản phẩm thủy phân trong công nghệ thực phẩm, nên phương pháp hóa học không Ďược sử dụng cho nghiên cứu trong luận án này

c Phương pháp enzyme

Ưu Ďiểm lớn của phương pháp phá vỡ tế bào bằng enzyme là do Ďiều kiện thủy phân nhẹ nhàng và tính Ďặc hiệu của chúng Như sử dụng enzyme lyticase 300U kết hợp với β – mercaptoethanol 0,1%, hàm lượng protein hòa tan Ďạt 0,8 mg/g ± 0,1 khi phá vỡ tế bào

Lepista sp [127] Garcia Ďã nghiên cứu sử dụng enzyme lysozyme và lysostaphin Ďể phá tế

bào Staphylococcus aureus Nghiên cứu Arturas lại sử dụng cellulase, mutanolysin,

proteases, mannase Ďể phá vỡ tế bào nấm men Gần Ďây, phá vỡ tế bào bằng enzyme Ďược thực hiện trong nhiều nghiên cứu [125] Tuy nhiên, nhược Ďiểm lớn của phương pháp phá

vỡ thành tế bào bằng chế phẩm enzyme là chi phí sản xuất cao vì giá thành enzyme Ďắt Nên ở quy mô công nghiệp phương pháp này ít Ďược sử dụng

d Phương pháp tự phân

Một số nghiên cứu Ďã công bố thời gian tự phân bã nấm men bia thường dài và hiệu quả thủy phân không cao Theo kết quả nghiên cứu của Bayarjargal và cộng sự, ở Ďiều kiện

45oC, pH 5,5 và sau 30 giờ, tỷ lệ chất rắn thu hồi Ďạt 13,7% và nồng Ďộ protein hòa tan Ďạt

49 mg/ml Bên cạnh Ďó, nghiên cứu của Tangluer và Erten, khi tự phân bã nấm men bia ở

50oC, pH 5,5 trong 24 giờ, tỷ lệ protein Ďạt 48,7%/chất rắn khô Mặt khác, quá trình tự phân là quá trình quan trọng cần Ďược thực hiện trước quá trình thủy phân bằng protease [128] Kết quả nghiên cứu Ďược minh chứng bằng hình ảnh chụp TEM tế bào nấm men bánh mì Ďã bắt Ďầu bị phá vỡ sau quá trình tự phân

Mặc dù quá trình tự phân Ďược coi là một quá trình thủy phân, nhưng kết quả ở các nghiên cứu Ďã công bố cho thấy trong quá trình tự phân các nhà nghiên cứu Ďều Ďề cập Ďến khả năng phá vỡ tế bào nấm men bia, dùng chính enzyme nội bào Ďể thực hiện quá trình tự phân [31, 96, 149] Hơn nữa, hiệu suất tự phân không cao, cần kết hợp với quá trình thủy phân bằng các chế phẩm protease Trong khi Ďó, ở mục 1.3.2, sử dụng chế phẩm protease cho quá trình thủy phân protein bã nấm men bia, Ďều ở môi trường kiềm, không phù hợp với pH 5,5 cho quá trình tự phân Điều Ďó, có nghĩa là quá trình tự phân và quá trình thủy phân bã nấm men bia không thể thực hiện Ďồng thời

1.4.2 Kỹ thuật thủy phân protein bã nấm men bia bằng chế phẩm protease

Kỹ thuật thủy phân protein bao gồm kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn, bán liên tục và liên tục Ưu và nhược Ďiểm của từng kỹ thuật thủy phân là khác nhau, tùy vào từng loại cơ chất, từng mục Ďích nghiên cứu cho việc ứng dụng sản phẩm thủy phân và dựa vào khả năng tài chính của từng doanh nghiệp

1.4.2.1 Một số nghiên cứu kỹ thuật thủy phân protein bã nấm men ở quy mô thí nghiệm

Ở Việt Nam, bã nấm men bia Ďược Ďề cập Ďến trong hội thảo Ďược tổ chức tại Thành phố Hồ Chí Minh do tổ chức xúc tiến thương mại Nhật Bản và Viện nghiên cứu rượu bia nước giải khát tổ chức, với nội dung chính Ďưa ra Ďịnh hướng tận dụng bã nấm men bia

[18] Sau hội nghị Ďó, lần lượt các công trình nghiên cứu về bã nấm men bia Ďược thực hiện, một số nghiên cứu như: “Nghiên cứu tận dụng nguồn nấm men bia dư thừa Ďể sản xuất men chiết xuất làm gia vị thực phẩm” năm 2003 [16]; Năm 2004, Trương Thị Hòa Ďã nghiên cứu Ďề tài “Sử dụng nấm men bia và nấm men Ďỏ trong công nghiệp chế biến thực phẩm và thức ăn gia súc”; Năm 2006, nghiên cứu của Lê Văn Việt Mẫn lại tiến hành tự phân bã nấm men bia Ďể thu nhận chế phẩm investase; Năm 2008 Ďề tài nghiên cứu “Chế biến nấm men từ phế liệu phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi” Như vậy, Ďa số các nghiên cứu thủy phân protein bã nấm men bia chỉ dừng lại ở kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn, chưa có nghiên cứu khoa học nào thực hiện quá trình thủy phân bã nấm men bia bằng kỹ thuật thủy phân liên tục Đồng thời, trên thế giới, bã nấm men bia cũng Ďược nghiên cứu Ďể sản xuất chiết xuất nấm men hay sản phẩm thủy phân bằng kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn Ďạt mức Ďộ thủy phân thấp, hoặc cao trên 50% nhưng thời gian thủy phân dài Một số nghiên cứu sản xuất chiết xuất nấm men và sản phẩm thủy phân từ bã nấm men bia (bằng kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn) Ďạt mức Ďộ thủy phân là 48,1% trong thời gian thủy phân 12 giờ [71]; 50% trong thời gian 10 giờ [35], một số tác giả nghiên cứu quá trình tự phân bã nấm men bia Ďạt mức Ďộ thủy phân thấp và thời gian tự phân cao khoảng 24 – 36 giờ [35, 126] Nghiên cứu của Misun và cộng sự kết luận rằng, kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn thường khó kiểm soát chất lượng sản phẩm thủy phân, thời gian thủy phân dài ảnh hưởng Ďến chất lượng sản phẩm thủy phân (bởi hàm lượng acid amin nhiều

dễ bị phân hủy và hỏng bởi nhiễm vi sinh vật) Như vậy, một lần nữa khẳng định rằng, cả

thế giới và Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu khoa học nào được công bố về quá trình thủy phân protein bã nấm men bia bằng kỹ thuật thủy phân liên tục Hơn nữa, một số

nghiên cứu Ďã làm nhưng chỉ Ďánh giá Ďơn lẻ Ďến mức Ďộ thủy phân hay Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân hoặc Ďánh giá Ďồng thời cả mức Ďộ thủy phân và Ďộ Ďắng của sản phẩm thủy phân nhưng trên Ďối tượng nghiên cứu khác, không phải bã nấm men bia hoặc là bã

nấm men bia nhưng là nấm men nổi Saccharomyces cerevisiae Trong khi Ďó, Ďối tượng nghiên cứu của luận án là nấm men chìm Saccharomyces carlsbergensis

1.4.2.2 Một số nghiên cứu kỹ thuật thủy phân liên tục ở quy mô thí nghiệm

Kỹ thuật thủy phân liên tục Ďược Misun và cộng sự tiến hành nghiên cứu trên cơ chất protein sữa cừu Kết quả cho thấy, sau 3 giờ thủy phân, mức Ďộ thủy phân và lượng enzyme sử dụng trong quá trình thủy phân liên tục so với quá trình thủy phân gián Ďoạn tương ứng là tăng 18,5% và giảm 50% Bên cạnh Ďó, một số nghiên cứu hệ thống thủy phân liên tục có sử dụng màng lọc, như quá trình thủy phân hemoglobin, sử dụng màng lọc ceramic có kích thước 10kDa [38], quá trình thủy phân liên tục của caseinnomacroppeptide

bằng enzyme trypsin với màng lọc ceramic có kích thước 3 kDa Ďể thu hồi các peptide hoạt tính [42], quá trình thủy phân liên tục protein các loại hạt chứa dầu bằng phương pháp vi sóng [54] và quá trình thủy phân liên tục protein Ďậu nành, với kích thước màng lọc 3 kDa [46, 143], Manuela A nghiên cứu quá trình thủy phân bã nấm men bia bằng màng lọc kDa hay nghiên cứu của Cui và Pieter lại thực hiện quá trình thủy phân liên tục gluten lúa mì Các quá trình thủy phân liên tục protein có sử dụng màng lọc thường Ďược thực hiện trong các nghiên cứu thu hồi peptide và có nguyên lý hoạt Ďộng Ďược minh họa hình 1.1

Hình 1.1 Sơ đồ nguyên lý quá trình thủy phân liên tục protein đậu nành

Theo Hình 1.1, cơ chất là protein Ďậu nành Ďược cấp vào bồn có cánh khuấy, sau Ďó Ďược chảy tự do xuống bồn thực hiện quá trình thủy phân (trong thiêt bị phản ứng) bằng hỗn hợp Alcalase và Flavourzyme, bồn phản ứng Ďược thiết kế hai vỏ, Ďược gia nhiệt tuần hoàn bằng nước nóng và có lắp thiết bị khuấy Dòng cơ chất Ďược bơm tuần hoàn liên tục qua màng lọc có kích thước 3 kDa, dòng sản phẩm thủy phân là các peptide có khối lượng phân tử ≤ 3 kDa Ďược thấm qua lớp màng Hệ thống có thiết bị Ďiều chỉnh pH online trên Ďường ống (dòng cơ chất tuần hoàn về bồn phản ứng) Hiệu quả thu hồi các peptide hoạt tính Ďạt 53% Như vậy, Ďa số các nghiên cứu về quá trình thủy phân liên tục protein Ďều ứng dụng Ďể sản xuất các peptide hoạt tính, nên kích thước màng lọc nhỏ Hơn nữa, ở quy

mô công nghiệp, quá trình sản xuất chiết xuất nấm men hay sản phẩm thủy phân vẫn dừng

ở kỹ thuật thủy phân gián Ďoạn hoặc tự phân hoặc kết hợp cả hai (mục 1.4.2.3)