Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin viêm não nhật bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào vero

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHK21 Baby hamster kidney cells tế bào có nguồn gốc từ thận chuột hamster sơ sinh miễn dịch liên kết gắn enzym JEVAX Vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt,

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đặc điểm virút viêm não Nhật Bản 3

1.1.1 Hình thể 3

1.1.2 Cấu trúc 3

1.2 Vắcxin VNNB 5

1.2.1 Các vắcxin VNNB được sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn 5

1.2.1.1 Vắcxin VNNB bất hoạt từ não chuột 5

1.2.1.2 Vắcxin VNNB bất hoạt từ tế bào thận chuột Hamster tiên phát 6

1.2.1.3 Vắcxin VNNB sống giảm độc lực 7

1.2.2 So sánh công nghệ sản xuất vắcxin VNNB trên não chuột và trên tế bào 7

1.2.3 Tế bào Vero trong ứng dụng sản xuất vắcxin 8

1.3 Quy trình sản xuất vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero (JECEVAX) tại VABIOTECH 9

1.4 Căn cứ và cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cở sở trong kiểm định chất lượng vắcxin JECEVAX 11

1.4.1 Yêu cầu chung 11

1.4.2 Căn cứ và cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin JECEVAX 12

1.4.2.1 Kiểm tra thành phần hóa học 13

1.4.2.2 Kiểm tra tính an toàn và công hiệu 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

2.2 Vật liệu 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm 19

2.2.3 Trang thiết bị 20

2.2.4 Dụng cụ 21

2.3 Phương pháp 22

2.3.1 Kiểm tra tính chất vật lý 22

2.3.2 Soi vắcxin 22

2.3.3 Kiểm tra thể tích đóng lọ vắcxin 23

2.3.4 Kiểm tra pH 23

2.3.5 Kiểm tra hàm lượng Thimerosal 23

2.3.6 Kiểm tra hàm lượng Formaldehyde 25

2.3.7 Kiểm tra hàm lượng Protein 25

2.3.8 Kiểm tra hàm lượng ADN tồn dư 26

2.3.9 Kiểm tra vô khuẩn 28

2.3.10 Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử PFU 29

2.3.11 Kiểm tra bất hoạt giai đoạn bán thành phẩm thô 30

2.3.12 Kiểm tra hàm lượng kháng nguyên virút VNNB bằng kỹ thuật ELISA 30

2.3.13 Kiểm tra bất hoạt bán thành phẩm tinh chế 33

2.3.14 Kiểm tra chất gây sốt 34

2.3.15 Kiểm tra an toàn chung chuột nhắt và chuột lang 34

2.3.16 Kiểm tra an toàn đặc hiệu 34

2.3.17 Kiểm tra công hiệu 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 39

3.1 Kết quả phân tích các thành phần hóa học trong kiểm định vắcxin JECEVAX 39

3.1.1 Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 39

3.1.2 Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP cuối cùng 42

3.1.3 Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX thành phẩm 43

3.2 Kết quả kiểm tra tính an toàn và công hiệu trong kiểm định vắcxin JECEVAX 49

3.2.1 Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP thô 49

3.2.2 Kiểm tra giai đoạn vắcxin BTP tinh khiết 51

3.2.3 Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX BTP cuối cùng 54

3.2.4 Kiểm tra giai đoạn vắcxin JECEVAX thành phẩm 54

3.3 So sánh kết quả kiểm định chất lượng vắcxin JECEVAX tại VABIOTECH, NICVB 60

3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin JECEVAX 62

3.4.1 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở về thành phần hóa học 62

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

4.1 Kết luận 68

4.2 Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Học viên

Nguyễn Vũ Thu Hương

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến:

Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Viện Đào tạo Sau Đại học, Viện Công

nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm đã giúp đỡ tạo điều kiện và hoàn tất các thủ tục cho tôi hoàn thành và bảo vệ luận văn

Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1, phòng Quản lý chất lượng

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập, thực tập và hoàn thành luận văn

Trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn, tôi đã được sự dạy dỗ và giúp

đỡ rất nhiệt tình của các thầy cô giáo, bạn bè và đồng nghiệp Cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

GS.TS Huỳnh Thị Phương Liên, Cố vấn khoa học, Công ty TNHH MTV

Vắcxin và Sinh phẩm số 1, ngườithầy đã hướng dẫn tôi các kỹ thuật kiểm định vắcxin, truyền đạt kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học, đạo đức của người làm công tác kiểm định và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, công tác và hoàn thành luận văn

PGS TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh

học phân tử, Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và giúp

đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

TS Đỗ Tuấn Đạt, Giám đốc Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số

1; TS.Nguyễn Quế Anh, Phó Giám đốc chất lượng Công ty TNHH MTV Vắcxin

và Sinh phẩm và số 1; ThS Nguyễn Thị Thu Hằng, Phó phòng Quản lý chất

lượng,Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm và số 1 đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Các đồng nghiệp của tôi ở Phòng Quản lý chất lượng,Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm và số 1, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình học tập cũng như thực hiện luận văn tốt nghiệp

Các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học – Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người luôn động viên

và giúp đỡ trong suốt quá trình làm luận văn

Hà Nội, ngày 28 tháng 09 năm 2015

Học viên

Nguyễn Vũ Thu Hương

DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHK21 Baby hamster kidney cells (tế bào có nguồn gốc từ thận chuột

hamster sơ sinh)

miễn dịch liên kết gắn enzym)

JEVAX Vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên não chuột JECEVAX Vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero

lưỡng bội từ người)

Standard deviation (độ lệch chuẩn)

PFU Plaque forming unit (tạo đám hoại tử)

PRNT Plaque reduction neutralization test (trung hòa giảm đám hoại

tử)

NICVB National institute for control of vaccine and biologicals (Viện

Kiểm định Vắcxin và Sinh phẩm y tế)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả kiểm tra hàm lƣợng AND tồn dƣ vắcxin JECEVAX TP 48 Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra chất gây sốt (từng thỏ) vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 52 Bảng 3.3 Kết quả kiểm tra chất gây sốt (từng thỏ) vắcxin JECEVAX TP 58 Bảng 3.4 So sánh kết quả kiểm định chất lƣợng vắcxin JECEVAX tại

VABIOTECH, NICVB và tiêu chuẩn của TCYTTG 60

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1.Mô hình cấu trúc hạtvirút VNNB [9] 4

Hình 1.2.Sơ đồ sắp xếp Genom của virút VNNB [9] 4

Hình 1.3 Hình ảnh hạt virút VNNB tinh khiết quan sát dưới kính hiển vi điện tử JEM - T8 độ phóng đại 120.000 lần 5

Hình 3.1.Kết quả kiểm tra pH vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 39

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra Formaldehyde vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 40 Hình 3.3.Kết quả kiểm tra Thimerosal vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 41

Hình 3.4.Kết quả kiểm trahàm lượng Protein vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 42

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra pH vắcxin JECEVAX BTP cuối cùng 43

Hình 3.6.Kết quả kiểm tra thể tích đóng ống vắcxin JECEVAX TP 44

Hình 3.7.Kết quả kiểm tra pH vắcxin JECEVAX TP 45

Hình 3.8.Kết quả kiểm tra hàm lượng Thimerosal vắcxin JECEVAX TP 46

Hình 3.9.Kết quả kiểm tra hàm lượng Formaldehyde vắcxin JECEVAX TP 47

Hình 3.10.Kết quả kiểm tra hàm lượng Protein vắcxin JECEVAX TP 48

Hình 3.11 Kết quả Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB bằng phương pháp tạo đám hoại tử PFU vắcxin JECEVAX BTP thô trước bất hoạt 50

Hình 3.12.Kết quả kiểm tra Chất gây sốt trên 3 thỏ của vắcxin JECEVAX BPT tinh khiết 52

Hình 3.13.Kết quả hàm lượng kháng nguyên virút VNNB vắcxin JECEVAX BTP tinh khiết 53

Hình 3.14.Kết quả kiểm tra An toàn chung trên chuột lang vắcxin JECEVAX TP 55

Hình 3.15.Kết quả kiểm tra An toàn chung trên chuột nhắt vắcxin JECEVAX TP 56

Hình 3.16.Kết quả kiểm tra An toàn đặc hiệu vắcxin JECEVAX TP 57

Hình 3.17 Kết quả kiểm tra chất gây sốt 3 thỏ vắcxin JECEVAX TP 58

Hình 3.18 Kết quả kiểm tra Công hiệu vắcxin JECEVAX TP 59

MỞ ĐẦU

Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh nhiễm virút cấp tính làm tổn thương hệ thống thần kinh trung ương, có ổ bệnh trong thiên nhiên Tác nhân gây

nên là virút VNNB (Japanese encephalitis virus), cách truyền bệnh là do muỗi đốt

(vectơ) các động vật mang virút (ổ chứa) điển hình là lợn, chim di cư, rồi sau đó truyền bệnh cho người là vật chủ cuối cùng Bệnh lưu hành ở hầu hết các nước châu

Á, Trung Á và Ấn Độ Năm 1998, bệnh VNNB đã lan đến phía Bắc châu Úc Như vậy, cho đến nay gần 3 tỷ người sống trong vùng có lưu hành dịch, hàng năm trên thế giới có khoảng 50.000 trường hợp mắc với tỉ lệ tử vong 5-30% và 30-50% khỏi bệnh đã để lại di chứng thần kinh suốt đời, là gánh nặng cho gia đình và xã hội [30] Bệnh VNNB không thể thanh toán được do chu kỳ truyền bệnh trong thiên nhiên không bao giờ chấm dứt

Bệnh VNNB chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, điều trị triệu chứng là chủ yếu,

do đó biện pháp hữu hiệu nhất là tiêm vắcxin VNNB để phòng bệnh Nhật Bản là nước đầu tiên nghiên cứu, sản xuất vắcxin này Năm 1954, vắcxin VNNB đã được

sử dụng tại Nhật Bản, sản phẩm là dạng vắcxin thô điều chế từ não chuột gây nên nhiều phản ứng quá mẫn, nhưng cũng đã cứu được nhiều người mắc phải căn bệnh này Sau hơn 30 năm nghiên cứu, năm 1986 Nhật Bản đã có vắcxin bất hoạt, tinh khiết sản xuất từ não chuột nhờ phát minh công nghệ tinh chế bằng phương pháp hóa lý của Takaku, vắcxin có khả năng bảo vệ cao và phản ứng phụ thấp Đầu những năm 1990, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương đã tiếp thu chuyển giao công nghệ sản xuất vắcxin VNNB từ viện BIKEN-Nhật Bản và đã sản xuất thành công vắcxin này Đến năm 1997, vắcxin VNNB đã được đưa vào Chương trình tiêm chủng mở rộng để đáp ứng nhu cầu phòng bệnh tích cực cho cộng đồng đặc biệt là trẻ em Vắcxin VNNB đã góp phần phòng bệnh hiệu quả, làm giảm tỷ lệ mắc và di chứng xuống 40-50% [6]

Tuy nhiên, để tiến kịp với công nghệ mới về sản xuất vắcxin trên tế bào nhằm thay thế vắcxin có nguồn gốc từ não chuột với lý do:

- Theo khuyến cáo của Tổ chức y tế thế giới cần phải dần dần từng bước thay thế vắcxin có nguồn gốc từ mô thần kinh (não chuột) bằng vắcxin sản xuất trên tế bào

- Để chủ động nguồn nguyên liệu đầu vào cho sản xuất, tế bào Vero đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu chứng minh đạt tất cả các tiêu chuẩn an toàn để sản xuất vắcxin dùng cho người

- Luật bảo vệ động vật của thế giới hạn chế tối đa giết động vật thí nghiệm Công ty TNHH MTV Vắcxin và Sinh phẩm số 1 đã nghiên cứu phát triển thành công quy trình sản xuất vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt sản xuất trên tế bào Vero Vì vậy, yêu cầu cấp bách cho việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin viêm não Nhật Bản sản xuất trên tế bào Vero nhằm quản lý và đảm bảo chất lượng tốt, về an toàn và công hiệu cho người sử dụng, do vậy chúng tôi thực hiện đề tài:

“Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin viêm não Nhật Bản

bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đặc điểm virút viêm não Nhật Bản

1.1.1 Hình thể

Virút VNNB là một Flaviviridae thuộc họ Togaviridae, có vỏ bọc được cấu tạo bởi glycoprotein, có hình khối cầu đối xứng, kích thước trung bình của virút khoảng 40-50 nm Virút VNNB có tỷ trọng 1,19-1,20g/cm3 trong đường và 1,22-1,24g/cm3trong cesium chlorua Hệ số lắng là 200S Trọng lượng phân tử là 60-70x106 Dalton

 Protein cấu trúc bao gồm:

- Protein màng (Membrane Protein: M): Còn gọi là V1, là một polypeptid có trọng lượng phân tử 8700 Da, gồm 75 axit amin

- Protein lõi (Nuleocapsid Protein: C) còn gọi là V2, là một polypeptid

có trọng lượng phân tử 13500 Da, gồm 136 axit amin

- Protein vỏ (Envelop Protein: E) còn gọi là V3, là glycoprotein có trọng lượng phân tử 53000 Da gồm 500 axit amin V3 đóng vai trò quan trọng cho

sự xâm nhiễm của virút VNNB và sự khác nhau về độc lực của virút VNNB trong

tự nhiên Protein vỏ còn giúp virút nhận ra những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào cảm thụ, kích thích cơ thể sinh kháng thể, dịch thể và đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào Kháng nguyên ngưng kết hồng cầu được gắn trên bề mặt protein E

Hình 1.1.Mô hình cấu trúc hạtvirút VNNB [9]

 Protein không cấu trúc NS có 2.638 axit amin, gồm 7 Protein ký hiệu: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5

Hình 1.2.Sơ đồ sắp xếp Genom của virút VNNB [9]

 Quan sát hạt virion dưới kính hiển vi điện tử thấy:

- Vỏ bọc là một màng lipid kép của protein E và protein M

- Những hạt gai nhỏ trên bề mặt hạt virút là những glycoprotein mang hoạt tính ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hoà

- Nucleocapsit có đường kính 25-30 nm, hệ số lắng 120 – 140 S gồm ARN và Protein

Hình 1.3 Hình ảnh hạt virút VNNB tinh khiết quan sát dưới kính hiển vi

điện tử JEM - T8 độ phóng đại 120.000 lần 1.2 Vắcxin VNNB

Hơn 20 năm nay, Việt Nam đã tự sản xuất được vắcxin VNNB và được Bộ Y

tế quyết định đưa vào chương trình tiêm chủng mở rộng Quốc Gia từ năm 1997, nhờ đó số ca mắc VNNB trước năm 1995 khoảng 70-75% trong số viêm não do virút đến nay chỉ còn 10-15%

1.2.1 Các vắcxin VNNB được sản xuất và sử dụng trên quy mô lớn

1.2.1.1 Vắcxin VNNB bất hoạt từ não chuột

Loại vắcxin này được sản xuất ở một số nước như Nhật Bản, Thái Lan, Đài Loan và Việt Nam Vào những năm 1940 khi mới bắt đầu nghiên cứu sản xuất vắcxin này ở dạng thô, chứa toàn bộ protein não chuột và hàm lượng myelin cao nên tỷ lệ gây viêm não dị ứng cao Ngày nay, áp dụng các công nghệ tinh chế hiện đại đã loại trừ hầu như hoàn toàn myelin Hai chủng virút VNNB dùng để sử dụng sản xuất vắcxin là Nakayama và Beijing-1 Vắcxin đã được thử nghiệm và sử dụng rộng rãi ở Thái Lan, Nhật Bản, Việt Nam… nơi có lưu hành nhiều tuýp VNNB khác nhau đều có đáp ứng kháng thể, mặt khác thử nghiệm nhiễm chéo trên chuột với các chủng virút VNNB lưu hành ở Châu Á cho thấy chủng Beijing-1 là chủng tạo

dại lưu hành ở các vùng khác nhau Vì lý do này mà một số hãng sản xuất vắcxin VNNB đã thay chủng Nakayama bằng chủng Beijing-1 trong sản xuất vắcxin từ não chuột

Quy trình tinh chế thành công vắcxin VNNB bất hoạt từ não chuột được công bố bởi các viện nghiên cứu Nhật Bản và đạt được vắcxin tinh khiết hiện nay Quy trình vắcxin từ não chuột ở Nhật Bản, Thái Lan và Việt nam theo công nghệ này: gây nhiễm trên não chuột, thu hoạch não chuột liệt, nghiền đồng nhất, ly tâm, siêu ly tâm, tủa protamin sulfat, bất hoạt formalin, thử nghiệm bất hoạt và tinh chế bởi phương pháp cô đặc, siêu ly tâm, tủa amoni sulfat, siêu ly tâm trong sacharose gradient Tiêu chuẩn quốc gia của Nhật Bản quy định khả năng gây miễn dịch tối thiểu và hiệu lực ở chuột (so với một vắcxin mẫu chuẩn), tổng hàm lượng protein tối đa (80 µg/ml) và protein cơ bản myelin (2ng/ml) trong một số quy định khác Kháng nguyên VNNB tinh khiết, bất hoạt được pha loãng với môi trường TCM199 (là dung dịch giàu acid amin và vitamin, là chất bền vững cho kháng nguyên virút VNNB) Vắcxin VNNB dạng dung dịch có chất bảo quản là thimerosal Ở Nhật Bản, vắcxin được sử dụng chủ yếu dưới dạng dung dịch Để xuất khẩu, vắcxin được đông khô rồi được hoàn nguyên bằng nước cất vô trùng

Ở Việt Nam, nhận chuyển nhượng công nghệ sản xuất vắcxin VNNB của viện BIKEN thuộc trường đại học Osaka- Nhật Bản từ năm 1989, Viện VSDTTƯ

đã sản xuất thành công vắcxin VNNB bất hoạt, tinh khiết từ não chuột theo phương pháp hóa lý của Takaku với chủng virút Nakayama, NIH, Nhật Bản

1.2.1.2 Vắcxin VNNB bất hoạt từ tế bào thận chuột Hamster tiên phát

Vắcxin VNNB bất hoạt điều chế từ tế bào thận chuột tiên phát (PHK) chỉ được sản xuất ở Trung Quốc Từ 1986, khi thay thế vắcxin từ phôi gà có khả năng gây miễn dịch kém hơn Nghiên cứu sản xuất vắcxin từ nuôi cấy tế bào nhằm tránh các Myelin của não chuột và các phản ứng dị ứng liên quan đến protein não chuột

Vắcxin được điều chế từ nuôi cấy tế bào thận chuột đất vàng Hamster tiên phát Gây nhiễm virút VNNB trên tế bào PHK, sau đó nước nổi của nuôi cấy tế bào này được thu hoạch và được bất hoạt với fomalin 0,5% và chất bền vững là albumin người, sau đó cô đặc vắcxin bất hoạt qua siêu lọc tiếp đến là siêu ly tâm Trong một

thử nghiệm thực địa, một liều 1,0ml vắcxin tiêm dưới da đạt tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh tương đương với chủng Beijing-3 (P3), tỷ lệ đáp ứng kháng thể chéo với virút Nakayama

1.2.1.3 Vắcxin VNNB sống giảm độc lực

Các chủng virút VNNB giảm độc lực được nghiên cứu bằng cách cấy chuyển chủng virút hoang dại, nuôi cấy và nhân lên nhiểu lần trên các dòng tế bào khác nhau như PHK, phôi gà, và tế bào biểu bì phôi chuột Mất độc tính thần kinh ở chuột, chuột đất vàng hoặc lợn bước đầu cho thấy khả năng sử dụng an toàn trên người Trung Quốc đã nghiên cứu giảm độc lực virút VNNB trong tế bào PHK và phát triển virút VNNB sống giảm độc lực, vắcxin từ chủng SA14-14-2, an toàn và

có khả năng đáp ứng miễn dịch Hiệu quả của vắcxin được đánh giá trên thực địa và được cấp phép lưu hành ở Trung Quốc năm 1988

Tế bào PHK được giữ tại ngân hàng tế bào gốc (MCB) Viện Sinh học Chengdu Tế bào một lớp được gây nhiễm với virút SA14-14-2 trong môi trường có chứa 0,25% albumin người, gentamicin và kanamicin Nồng độ gây nhiễm khoảng

108,2TCID50/ml được gặt vào thời điểm 78 đến 96 giờ, lọc thô, và vắcxin dung dịch được đông khô Chất bền vứng là Gelatin và sacharoza Vắcxin đông khô được hoàn nguyên với PBS vô trùng (pH 7,4-7,6)

Vắcxin phải đảm bảo tiêu chuẩn không có các tác nhân độc hại, không gây độc thần kinh trên chuột trưởng thành, và ổn định không trở lại độc tính thần kinh sau khi gây nhiễm vào não chuột đang bú

Chưa theo dõi đầy đủ về mức độ an toàn cũng như đột biến gen của virút viêm não trong loại vắcxin sống giảm độc lực sản xuất từ chủng SA14-14-2, đây chính là điều cần quan tâm

1.2.2 So sánh công nghệ sản xuất vắcxin VNNB trên não chuột và trên tế bào

So sánh vắcxin sản xuất từ não chuột và trên tế bào cho thấy việc nuôi và cung cấp chuột phải được tổ chức và quản lý tốt Chuột phải đạt tiêu chuẩn chất lượng để sản xuất loại trừ 11 loại virút gây bệnh cho chuột Một não chuột 3-4 tuần tuổi chỉ được 4-5 liều vắcxin Vì vậy, muốn sản xuất được nhiều vắcxin thì phải có hệ thống

hợp nên sản lượng hạn chế Sản xuất vắcxin trên tế bào tổ chức thực hiện dễ dàng hơn, nguyên liệu đầu là tế bào được nhân lên theo yêu cầu từ ngân hàng tế bào sản xuất (WCB) Như vậy, chủ động được nguyên liệu đầu vào, nhà xưởng đảm bảo sạch sẽ hơn để đạt được GMP của TCYTTG

Sau nhiều năm nghiên cứu, các tác giả Trung Quốc đã tạo được một chủng VNNB giảm độc lực SA14-14-2, chủng này nhân lên tốt trên tế bào PHK SA14-14-

2 được dùng để sản xuất vắcxin VNNB sống giảm độc lực cho thấy có khả năng bảo

vệ đến gần 70% Tuy nhiên về mặt an toàn thì còn phải được chứng minh đầy đủ Vắcxin bất hoạt được nuôi cấy trên tế bào PHK đã sử dụng chủng Beijing-3 và sản xuất tại Viện sản xuất các sản phẩm sinh học Bắc Kinh, Thượng Hải, Vũ Hán

và Thành Đô Loại vắcxin bất hoạt này an toàn nhưng hiệu quả bảo vệ < 70%

Do tính ưu việt về công nghệ, nhà xưởng… nên đầu thế kỷ 21, nhiều nhà sản xuất đã nghiên cứu về vắcxin trên tế bào Vero như Biken, Kaketsuken, Nhật Bản, Viện vắcxin và huyết thanh Bắc Kinh (Trung Quốc), Intercell (Áo) Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên thực địa vắcxin VNNB bất hoạt và bước đầu đánh giá về tỷ lệ đáp ứng kháng thể > 80% Các vắcxin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào Vero của Nhật Bản đã được sử dụng rộng rãi tại Nhật Bản và nhiều nước khác

1.2.3 Tế bào Vero trong ứng dụng sản xuất vắcxin

Dòng tế bào thường trực Vero được thiết lập từ năm 1962 do hai tác giả người Nhật Bản là Yasumura và Kawakita, có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu Phi trưởng thành, tế bào này được giữ dưới dạng tế bào gốc MCB đời P122 Sau đó dưới sự điều hành của TCYTTG, hệ thống tế bào (WHO seed lot) có mã số CCL81

Mỹ giữ quyền kinh doanh tế bào Vero CCL81 đời 123 coi như ngân hàng tế bào của

Mỹ, tiếp tục nhân truyền đến đời 131 thì thiết lập ngân hàng tế bào sản xuất (WCB)

Tế bào Vero rất an toàn và giá thành thấp hơn so với tế bào lưỡng bội người hay tế bào thận khỉ tiên phát Dòng tế bào Vero đã được nghiên cứu và chứng minh:

an toàn và tinh khiết, không gây u bướu, không biến đổi gen qua nhiều đời cấy chuyển đến WCB Các mẫu thử MCB và WCB đều đạt tất cả các yêu cầu: vô trùng, Mycoplasma âm tính, mẫu kiểm tra trên kính hiển vi điện tử không quan sát thấy thành phần giống virút, thử nghiệm in vitro không chứng minh có nhiễm với virút,

không phát hiện các mầm bệnh từ bò, không phát hiện thấy Porcin Parvovirút, không phát hiện tạo u đến đời cấy chuyển 169, xác định nguồn gốc từ thận khỉ xanh Phi châu

Tại Việt Nam, công ty VABIOTECH đã mua dòng tế bào Vero CCL81 của TCYTTG để thiết lập Hệ thống Ngân hàng tế bào Vero của VABIOTECH (Ngân hàng tế bào gốc và Ngân hàng tế bào sản xuất) dùng cho sản xuất vắcxin Vắcxin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero đã được nghiên cứu sản xuất thành công tại VABIOTECH và đang thực địa thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2

Tế bào Vero mà VABIOTECH mua về đã được kiểm tra chất lượng đầy đủ các thử nghiệm an toàn đối với dòng tế bào thường trực Tuy nhiên, trước khi đưa vào sản xuất thì tế bào Vero phải được kiểm tra và phải đạt yêu cầu đối với các thử nghiệm sau: thử nghiệm kiểm tra vô khuẩn kiểm tra Mycoplasma, kiểm tra virút hấp phụ hồng cầu và kiểm tra virút ngoại lai

- Kiểm tra vô khuẩn: Không có sự phát triển của nấm và vi khuẩn

- Kiểm tra virút hấp phụ hồng cầu: Không có virút hấp phụ hồng cầu

- Kiểm tra Mycoplasma: Không có sự phát triển của Mycoplasma

- Kiểm tra virút ngoại lai: Không có hủy hoại tế bào (CPE) trong các chai tế bào trên các dòng tế bào khác nhau

1.3 Quy trình sản xuất vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero (JECEVAX) tại VABIOTECH

Quy trình sản xuất và kiểm định vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Tế bào Vero kín 1 lớp

Rửa tế bào Vero bằng Hank’s 2 lần

Cấy hỗn dịch virút 104 PFU/ml

Hấp phụ 36,5 ± 0,5oC, 50-60 phút

Hút cạn dịch virút

Cho môi trường duy trì TCM 199

Gặt nước nổi nhiều lần

Bất hoạt formalin 2-8oC, 30 ngày

BTP thô đã bất hoạt

Ly tâm loại xác tế bào

Cô đặc qua màng Pellicon casette

Tủa bằng Protamin sulfate

Ly tâm thu nước nổi

Siêu ly tâm trong đệm sucrose

Kiểm tra bất hoạt

Tính chất vật lý Xác định pH Hàm lượng Formaldehyde Hàm lượng Thimerosal Hàm lượng Protein

Vô khuẩn Bất hoạt Chất gây sốt Hàm lượng kháng nguyên virút

Tính chất vật lý Xác định pH Thử nghiệm vô khuẩn

Dán nhãn, đóng hộp

Vắcxin thànhphẩm

Tính chất vật lý Soi vắcxin Kiểm tra thể tích đóng ống

pH Hàm lượng Thimerosal Hàm lượng Formaldehyde Hàm lượng Protein

Hàm lượng ADN tồn dư

Vô khuẩn

An toàn chung trên chuột lang

An toàn chung trên chuột nhắt

An toàn đặc hiệu Chất gây sốt Công hiệu

1.4 Căn cứ và cơ sở xây dựng tiêu chuẩn cở sở trong kiểm định chất lƣợng vắcxin JECEVAX

1.4.1 Yêu cầu chung

Trong sản xuất vắcxin, kiểm tra chất lượng vắcxin là rất quan trọng bởi vì vắcxin là sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật sống có cấu trúc phân tử phức tạp,

dễ bị biến tính bởi nhiệt độ, thời gian Và cùng một lúc nó được dùng cho nhiều người khỏe mạnh nên nếu vắcxin không đạt yêu cầu về chất lượng sẽ ảnh hưởng thậm chí để lại hậu quả vô cùng tai hại cho hàng triệu người Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắcxin phải được thực hiện trong từng loạt sản phẩm ở từng công đoạn (từ nguyên liệu đầu đến thành phẩm)

Để đảm bảo chất lượng vắcxin cần nghiêm túc thực hiện và giám sát, kiểm định nguyên liệu đầu, giám sát quy trình sản xuất trong từng công đoạn và tuân theo thực hành sản xuất tốt (GMP) Việc kiểm tra đánh giá chất lượng vắcxin đòi hỏi tính khách quan và chính xác trung thực của người thực hiện, phải có tay nghề và trình

độ chuyên môn Phải tuân thủ chặt chẽ các quy trình, các kỹ thuật phương pháp của TCYTTG, DĐVN và NICVB quy định, nhằm đảm bảo độ chính xác cao

Chất lượng của vắcxin thành phẩm được đánh giá ở các khâu: phòng thí nghiệm, thử nghiệm lâm sàng, thực địa [9]

- Đánh giá phòng thí nghiệm: rất quan trọng, bao gồm các thử nghiệm định lượng các thành phần hoá học và tính an toàn, công hiệu Các thử nghiệm này được thực hiện theo thường quy thống nhất toàn cầu hoặc trong một quốc gia

- Đánh giá lâm sàng là yêu cầu bắt buộc đối với một loại vắcxin mới và được thực hiện với hai nội dung chính là an toàn và đáp ứng miễn dịch

- Đánh giá thực địa là xác định hiệu quả bảo vệ của vắcxin thể hiện bằng khả năng bảo vệ trong cộng đồng đã được gây miễn dịch để kháng lại tác nhân gây bệnh

Trong phạm vi luận án này, chúng tôi đánh giá vắcxin tại phòng thí nghiệm về thành phần hóa học, tính an toàn và công hiệu của vắcxin viêm não Nhật Bản bất hoạt, sản xuất trên tế bào Vero được sản xuất tại VABIOTECH (JECEVAX) ở các giai đoạn: Bán thành phẩm thô, bán thành phẩm tinh khiết, bán thành phẩm cuối cùng và thành phẩm

1.4.2 Căn cứ và cơ sở để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định vắcxin JECEVAX

Thành phần hóa học, tính an toàn và công hiệu là những yếu tố quyết định đồng thời về chất lượng của một loạt vắcxin Nếu loạt vắcxin không đạt một trong những yếu tố trên thì không được phép xuất xưởng Là sản phẩm dùng cho người

và không phải cho 1 cá thể mà dùng cho hàng loạt người trong cộng đồng, đặc biệt

là trẻ em Vì vậy phải đảm bảo tuyệt đối an toàn

Mỗi loại vắcxin đều có yêu cầu, quy trình sản xuất khác nhau, vì vậy việc xây dựng tiêu chuẩn cơ sở trong kiểm định về hóa học, tính an toàn và công hiệu là rất thiết thực và quan trọng để đáp ứng yêu cầu và điều kiện của mỗi loại vắcxin

Chúng tôi căn cứ theo những tiêu chuẩn sau đây để xây dựng tiêu chuẩn cho vắcxin JECEVAX:

- Tiêu chuẩn của TCYTTG cho vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên tế bào (TRS-963, Annex 1) [30]

- Tiêu chuẩn của DĐVN 4 áp dụng cho vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên não chuột [1]

- Tiêu chuẩn cơ sở của vắcxin VNNB bất hoạt, sản xuất trên não chuột (JEVAX®)

1.4.2.1 Kiểm tra thành phần hóa học

 Giai đoạn vắcxin BTP tinh khiết

- Kiểm tra tính chất vật lý: trải qua quá trình tinh chế, vắcxin ở giai đoạn tinh

khiết cần phải có màu sắc, trạng thái đặc trưng Tiêu chuẩn của JEVAX®

cho phép

là “Dung dịch trong, có màu vàng nhạt” DĐVN 4 và TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này

- Kiểm tra pH: cần có pH giống như của máu trong cơ thể người Tuy nhiên, do

những lý do ổn định của các thành phần kháng nguyên có trong vắcxin, pH có thể điều chỉnh cho phù hợp Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “6,8 - 7,4” DĐVN 4

và TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này

- Kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde: JECEVAX dùng formaldehyde để bất

hoạt virút, trải qua quá trình tinh chế cũng đã loại bỏ được hầu hết formaldehyde Tiêu chuẩn của JEVAX®

cho phép là “≤ 0,01 % w/v” DĐVN 4 không quy định cho tiêu chuẩn này TCYTTG khuyến cáo theo cơ quan quản lý quốc gia

- Kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal: Thimerosal là hợp chất hữu cơ có chứa thủy

ngân, thường được dùng làm chất bảo quản Dạng thủy ngân trong thimerosal không phải là loại gây nên ngộ độc vì đã thủy phân trong nước không còn ở dạng tự

do để phản ứng trong cơ thể người Tiêu chuẩn của JEVAX®

cho phép là “≤ 0,012

% w/v” DĐVN 4 không quy định cho tiêu chuẩn này TCYTTG khuyến cáo theo

cơ quan quản lý quốc gia

- Kiểm tra hàm lƣợng Protein: Protein trong vắcxin tinh khiết chính là kháng

nguyên đặc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch Các protein này có nguồn gốc là

vi sinh vật gây bệnh vì thế nó phải làm mất hoặc làm giảm hoạt tính Tiêu chuẩn của JEVAX® không áp dụng tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này DĐVN 4 không khuyến cáo tiêu chuẩn cho tiêu chí này TCYTTG không quy định tiêu chuẩn

 Giai đoạn vắcxin BTP cuối cùng

- Kiểm tra tính chất vật lý: nhận biết được màu sắc, trạng thái đặc trưng của

dung dịch Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “Dung dịch trong, không màu” DĐVN 4 và TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này

- Kiểm tra pH: độ pH trung tính tương đồng với pH trong cơ thể để không thể

xảy ra các phản ứng ngoài ý muốn, đảm bảo vắcxin có độ an toàn cao Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “6,8 - 7,4” DĐVN 4 và TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này

 Giai đoạn vắcxin thành phẩm

- Kiểm tra tính chất vật lý: kiểm tra bằng mắt để nhận biết được màu sắc, trạng

thái đặc trưng của dung dịch Tiêu chuẩn của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là

“Dung dịch trong, không màu” TCYTTG không quy định cho tiêu chuẩn này

- Soi vắcxin: mỗi loạt vắcxin phải kiểm tra bằng mắt thường để đàm bảo vắcxin

không có dấu hiệu bất thường như dị vật (nếu có) trong dung dịch vắcxin Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN 4 và TCYTTG đều là “Không có dị vật”

- Kiểm tra thể tích đóng lọ: để xác định thể tích đóng lọ thực có đủ như thể tích

đóng lọ quy định Tiêu chuẩn của JEVAX®

cho phép là “Thể tích vắcxin đóng trong

1 lọ không được nhỏ hơn thể tích công bố trên nhãn” DĐVN 4 và TCYTTG không

khuyến cáo cho tiêu chuẩn này

- Kiểm tra pH: pH phải trung tính tương đồng với pH trong cơ thể để không thể

xảy ra các phản ứng ngoài ý muốn, đảm bảo vắcxin có độ an toàn cao Tiêu chuẩn của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là “6,8 - 7,4” TCYTTG khuyến cáo theo tiêu chuẩn của cơ quan quản lý quốc gia

- Kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde: Formaldehyde là hóa chất có tác dụng

làm bất hoạt virút và làm bền vững kháng nguyên Tiêu chuẩn của JEVAX®

, DĐVN 4, TCYTTG cho phép là “≤ 0,01 % w/v”

- Kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal: Thimerosal là hợp chất hữu cơ có chứa thủy

ngân, thường được dùng làm chất bảo quản Dạng thủy ngân trong thimerosal không phải là loại gây độc vì đã thủy phân trong nước không còn ở dạng tự do để phản ứng trong cơ thể người Vắcxin chứa thimerosal là an toàn với người sử dụng với hàm lượng thấp [9] Tiêu chuẩn của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là “≤ 0,012

% w/v” TCYTTG khuyến cáo theo cơ quan quản lý quốc gia

- Kiểm tra hàm lƣợng Protein: Protein trong vắcxin tinh khiết chính là kháng

nguyên đặc hiệu để kích thích đáp ứng miễn dịch Các protein có cấu trúc phân tử

phức tạp, dễ dàng bị biến tính do nhiệt độ và thời gian vì thế nó cần được kiểm tra một cách nghiêm túc đối với từng loạt Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN 4 cho phép là “≤ 80g/ml” và theo khuyến cáo của TCYTTG là theo tiêu chuẩn của cơ quan quản lý quốc gia

- Kiểm tra hàm lƣợng ADN tồn dƣ: Vắcxin VNNB sản xuất trên tế bào Vero

cần được xác định ADN tồn dư, TCYTTG quy định lượng ADN tồn dư phải < 10 ng/ liều Trong quá trình tinh chế cần phải loại bỏ AND của tế bào Vero Tiêu chuẩn của TCYTTG cho phép là “< 10 ng/ liều”

1.4.2.2 Kiểm tra tính an toàn và công hiệu

 Giai đoạn vắcxin BTP thô

- Kiểm tra vô khuẩn: Đây là thử nghiệm quan trọng được TCYTTG khuyến cáo

để kiểm soát chất lượng vắcxin nhằm phát hiện tác nhân ngoại lai là các vi sinh vật sống nhiễm vào sản phẩm Kiểm tra vô khuẩn phải được thực hiện ở nhiều giai đoạn trong quá trình sản xuất Ở giai đoạn BTP thô tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN 4, TCYTTG, đều yêu cầu “Không có sự phát triển của nấm và vi khuẩn sau 14 ngày

theo dõi”

- Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB: hiệu giá virút VNNB được xác định bằng

phương pháp tạo đám hoại tử PFU Hiệu giá được sử dụng như 1 chỉ số theo dõi tính ổn định của quy trình sản xuất Tiêu chuẩn của JEVAX® cho phép là “Hiệu giá virút trong bán thành phẩm thô ≥ 107 PFU/ml”, hiệu giá gây nhiễm là 107 PFU/ml TCYTTG và DĐVN 4 khuyến cáo nhà sản xuất thiết lập tiêu chuẩn này

- Kiểm tra bất hoạt: Ở giai đoạn sản xuất vắcxin BTP thô, vắcxin sẽ được bất

hoạt bằng formaldehyde và sau khi bất hoạt phải kiểm tra bất hoạt để xác định virút VNNB đã được bất hoạt, không có khả năng gây bệnh Kiểm tra bất hoạt được thực

hiện ngay sau khi kết thúc bất hoạt Tiêu chuẩn của JEVAX® là “100% chuột phải sống khỏe mạnh, không liệt, không có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi”

DĐVN4 và TCYTTG không khuyến cáo cho tiêu chuẩn này

 Giai đoạn vắcxin BTP tinh khiết

- Kiểm tra vô khuẩn: Kiểm tra vô khuẩn cũng cần phải được thực hiện ở giai

triển trên môi trường kiểm tra trong suốt thời gian theo dõi Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN4 và TCYTTG cho phép là “Không có sự phát triển của nấm và vi khuẩn sau 14 ngày theo dõi”

- Kiểm tra bất hoạt: Kiểm tra bất hoạt để xác định virút VNNB đã được bất

hoạt sau quá trình bất hoạt, không có khả năng gây bệnh Vắcxin BTP tinh khiết được gây nhiễm trên tế bào, sau 14 ngày gặt nước nổi và gây nhiễm trên chuột nhắt trắng, theo dõi chuột trong 14 ngày để chứng minh rằng không còn virút sống Tiêu chuẩn của JEVAX®, TCYTTG cho phép là “Tế bào phát triền bình thường, không

có hủy hoại tế bào (CPE) trong 14 ngày theo dõi 100% chuột sống khỏe mạnh, tăng cân, không liệt, không có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi” DĐVN4 không

khuyến cáo cho tiêu chuẩn này

- Kiểm tra chất gây sốt: Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện để phát hiện

các thành phần gây sốt có trong sản phẩm Chất gây sốt được xác định gián tiếp qua thí nghiệm đo thân nhiệt của thỏ thí nghiệm trước và sau khi tiêm vắcxin Nếu vắcxin không an toàn phản ứng đầu tiên là sốt Tiêu chuẩn của JEVAX®

cho phép là

“Nhiệt độ tăng của từng thỏ ≤ 0,6o

C Tổng nhiệt độ tăng của 3 thỏ sau 3 giờ theo dõi  1,3oC” DĐVN4 và TCYTTG không khuyến cáo cho tiêu chuẩn này

- Kiểm tra hàm lƣợng kháng nguyên virút VNNB: sử dụng kỹ thuật ELISA để

xác định hàm lượng kháng nguyên virút VNNB Hàm lượng kháng nguyên phải đủ

để có thể tạo ra kháng thể đặc hiệu sinh ra đáp ứng miễn dịch JEVAX® không áp dụng tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này DĐVN 4 không khuyến cáo tiêu chuẩn cho chỉ tiêu này TCYTTG không quy đinh tiêu chuẩn

 Giai đoạn vắcxin BTP cuối cùng

- Kiểm tra vô khuẩn: Thử nghiệm này cần được thực hiện ở giai đoạn vắcxin

BTP cuối cùng trước khi chuyển sang giai đoạn vắcxin thành phẩm để có thể đảm bảo được rằng vắcxin không nhiễm nấm và vi khuẩn Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN4 và TCYTTG cho phép là “Không có sự phát triển của nấm và vi khuẩn sau

14 ngày theo dõi”

 Giai đoạn vắcxin thành phẩm

- Kiểm tra vô khuẩn: Vắcxin phải vô khuẩn, không có vi khuẩn hoặc nấm phát

triển trên môi trường kiểm tra trong suốt thời gian theo dõi Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN4 và TCYTTG cho phép là “Không có sự phát triển của nấm và vi khuẩn sau 14 ngày theo dõi”

- Kiểm tra an toàn: Kiểm tra an toàn chung được tiến hành trên chuột nhắt trắng

và chuột lang (đây là những động vật rất nhạy cảm được sử dụng để đánh giá tính

an toàn của vắcxin), tiêm vào phúc mạc Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN4 cho phép là “100% chuột sống khỏe mạnh, tăng cân, không có dấu hiệu bệnh lý sau 7 ngày theo dõi” Khuyến cáo của TCYTTG là theo tiêu chuẩn của cơ quan quản lý quốc gia An toàn đặc hiệu thử trên chuột nhắt trắng Swiss, tiêm thẳng vào não chuột Thử nghiệm đạt yêu cầu là qua thời gian theo dõi chuột phải khỏe mạnh, tăng trọng bình thường Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN4 cho phép là “100% chuột sống khỏe mạnh, tăng cân, không liệt, không có dấu hiệu bệnh lý sau 14 ngày theo dõi” TCYTTG không khuyến cáo cho chỉ tiêu này

- Kiểm tra chất gây sốt: Thử nghiệm chất gây sốt được thực hiện để phát hiện

các thành phần gây sốt có trong sản phẩm Chất gây sốt của vắcxin được xác định gián tiếp qua thí nghiệm đo thân nhiệt của thỏ thí nghiệm trước và sau khi tiêm vắcxin Nếu vắcxin không an toàn phản ứng đầu tiên là sốt Tiêu chuẩn của JEVAX® và DĐVN 4 cho phép là “Nhiệt độ tăng của từng thỏ ≤ 0,6oC Tổng nhiệt

độ tăng của 3 thỏ sau 3 giờ theo dõi  1,3oC” Khuyến cáo của TCYTTG là theo tiêu chuẩn của cơ quan quản lý quốc gia

- Kiểm tra công hiệu: Mục đích của kiểm tra công hiệu là xác định khả năng gây

miễn dịch của vắcxin Công hiệu của vắcxin viêm não Nhật Bản là xác định HGKT trung hoà bằng kỹ thuật trung hòa giảm đám hoại tử 50% (PRNT50) Chuột Swiss trắng gây miễn dịch 2 mũi cách nhau 1 tuần bằng vắcxin VNNB Lấy máu tim chuột sau lần thứ 2 tiêm là 1 tuần Thu thập huyết thanh sau đó xử lý huyết thanh và trung hòa với virút thử thách, thực hiện PRNT50 Tiêu chuẩn của JEVAX®, DĐVN4, TCYTTG cho phép là “HGKT trung hòa của vắcxin mẫu thử  HGKT trung hòa

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Kiểm định vắcxin JECEVAX về thành phần hóa học, tính an toàn và công hiệu

ở các giai đoạn BTP thô, BTP tinh khiết, BTP cuối cùng và thành phẩm

- Vắcxin JECEVAX được bảo quản ở điều kiện 2-8oC, hạn sử dụng 2 năm kể từ ngày sản xuất

- DIG High prime DNA labeling ADN detection starter kit II ROCHE

2.2.2 Vắcxin, sinh phẩm, động vật thí nghiệm

- Vắcxin JECEVAX được bảo quản ở điều kiện 2-8oC, hạn sử dụng 2 năm kể từ ngày sản xuất

- Chủng virút thử thách Beijing-1 VABIOTECH

- Tế bào BHK21 mọc 1 lớp trong các phiến tế bào VABIOTECH

- Tế bào Vero mọc 1 lớp trong các phiến tế bào 6 giếngVABIOTECH

- Bộ sinh phẩm ELISA-Ag để chuẩn độ kháng nguyên virút VNNB

2.2.3 Trang thiết bị

- Cân phân tích METTLERTOLED

- Pipet nhựa loại 2 ml, 5ml, 10 ml & 25 ml KIMBLE

- Pipettman các loại 100l, 200l, 1000l, 5000l EPPENDORF

- Đầu côn 300l, 1000l, 5000l BIOHIT, GREINER

- Giấy Parafilm ANH

- Quan sát trạng thái vắcxin bằng mắt qua hệ thống đèn chiếu sáng

- Soi trên nền trắng, đen dưới ánh đèn

- Phải theo dõi lọ liên tục trong 8 giây, chú ý đến các dị vật

2.3.2.2 Kết quả

- Ghi chép lại kết quả quan sát

2.3.3 Kiểm tra thể tích đóng lọ vắcxin

2.3.3.1 Các bước tiến hành

- Nguyên lý: Cân và đo tỷ trọng

- Dùng bơm tiêm sạch, bơm hết vắcxin trong lọ vào từng cốc sạch

- Cân từng thành phần đã hút được từ mỗi lọ

- Trộn các thành phần cân được, đo tỷ trọng

- Phương pháp: tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.33, trang PL-345 [1]

2.3.4.2 Kết quả

- Tính kết quả tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.33, trang PL-345 [1]

2.3.5 Kiểm tra hàm lƣợng Thimerosal

2.3.5.1 Các bước tiến hành

 Nguyên lý: Dựa trên cơ sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất

có cực đại hấp phụ ở bước sóng 480 nm Định lượng thimerosal bằng cách đo

độ hấp phụ của chất tạo thành ở bước sóng này

 Đánh dấu các bình nón theo bảng sau:

 Pha dung dịch thimerosal chuẩn 25; 50; 100; 150 µg/ml

- Cho 0,5 ml dung dịch thimerosal chuẩn 25 g/ml, 50 g/ml, 100 g/ml,

150 g/ml lần lượt vào mỗi 2 bình nón 4-5, 6-7, 8-9, 10-11

- Cho 0,5 ml mẫu thử vào mỗi bình nón 2-3

- Thêm nước cất pha tiêm vừa đủ 5 ml vào mỗi bình nón từ 1 đến 11, lắc đều

- Cho 5 ml dung dịch acid sulfuric vào mỗi bình nón từ 1 đến 11, lắc đều

- Thêm 10 ml dung dịch dithizon 0,002% vào mỗi bình nón từ 1 đến 11

- Lắc mạnh trong 5 phút Để yên cho tách thành 2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi

- Cho 10 ml nước cất pha tiêm vào mỗi bình, lắc mạnh Để yên cho tách thành

2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi

- Cho 10 ml dung dịch amoniac 60% vào mỗi bình, lắc mạnh Để yên cho tách thành 2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi Nhắc lại bước này 3 lần

- Màu của cacbon tetraclorid chuyển từ xanh lá cây sang màu vàng cam

- Cho 10 ml nước cất pha tiêm vào mỗi bình, lắc mạnh Để yên cho tách thành

2 lớp, hút bỏ lớp nước nổi

- Chuyển sang bình gạn, gạn lấy lớp cacbon tetraclorid

- Lọc qua giấy lọc, đo quang phổ bước sóng 480 nm

2.3.5.2 Kết quả

 Dựng đường chuẩn

- Căn cứ vào độ hấp phụ của dung dịch thimerosal chuẩn và hàm lượng thimerosal tương ứng để dựng phương trình đường chuẩn Xử lý số liệu theo chương trình vẽ đồ thị trong Excel của máy tính, xây dựng được phương

trình hồi quy tuyến tính thực nghiệm (phương trình đường chuẩn) y = ax + b

Dựa theo phương trình tính ra hàm lượng thimerosal có trong mẫu vắcxin

- Trong đó:

y: Hàm lượng thimerosal mẫu chuẩn(g/ml)

x: Độ hấp phụ quang tương ứng với từng hàm lượng thimerosal chuẩn

a, b: Hệ số của phương trình đường chuẩn

 Tính kết quả

- Công thức: Y = y T 100/1000000

- Trong đó: Y: Hàm lượng thimerosal có trong mẫu vắcxin (%)

y T = ax T + b

x T: Độ hấp phụ quang đo được của mẫu thử

y T: Hàm lượng thimerosal có trong mẫu thử (g/ml)

100: Đổi ra % 1000000: Hệ số qui đổi từ g ra g

2.3.6 Kiểm tra hàm lƣợng Formaldehyde

2.3.6.1 Các bước tiến hành

- Nguyên lý: Định lượng formaldehyd bằng cách đo cường độ màu của 3,5- diacetyl-1,4- dihydroluthidin ở bước sóng 415 nm Phức chất này được tạo thành do phản ứng của formaldehyd chứa trong mẫu thử với acetylaceton trong môi trường acid nhẹ [1]

- Phương pháp: tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.25, trang PL-339 [1]

2.3.6.2 Kết quả

- Tính kết quả tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.25, trang PL-339 [1]

2.3.7 Kiểm tra hàm lƣợng Protein

2.3.7.1 Các bước tiến hành

- Nguyên lý: Protein trong vắcxin được tủa bằng acid tricloracetic (TCA) Xác định lượng tủa để tính ra lượng protein có trong vắcxin (phương pháp Lowry) [1]

- Phương pháp: tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.34, trang PL-346 [1]

- Tính kết quả tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.34, trang PL-346 [1]

2.3.8 Kiểm tra hàm lƣợng ADN tồn dƣ

2.3.8.1 Các bước tiến hành

 Nguyên lý: Định lượng ADN tồn dư của tế bào Vero trong vắcxin được thực

hiện bằng cách tách chiết và lai với mẫu dò ADN được đánh dấu phóng xạ Các lai điểm ADN sẽ được hiển thị trên phim X-quang Hàm lượng ADN tồn dư sẽ được xác định bằng cách so sánh về mặt hình ảnh giữa ADN mẫu thử và ADN thang chuẩn

 Tách chiết và tinh sạch ADN từ mẫu

 Tách chiết ADN từ mẫu

- Chia mẫu ra ống nghiệm: 1 ml/ ống x 2 ống

- Cho 50 µl dung dịch SDS 10%/ ống nghiệm

- Cho 10 µl dung dịch Proteinase-K/ ống nghiệm

- Ủ trong bể ủ nhiệt ở 45oC, qua đêm

 Tinh sạch ADN từ mẫu

- Cho 560 µl dung dịch Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol/ ống nghiệm Ly tâm 3.000 vòng/ phút trong 15 phút Chuyển lớp bên trên sang ống nghiệm sạch Lặp lại bước này 1 lần

- Cho 56 µl dung dịch Sodium acetate 3M/ ống nghiệm, trộn đều

- Cho 1,2 ml dung dịch ethanol 100%/ ống nghiệm, trộn đều

- Ủ ở -20o

C, 30 phút

- Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 15 phút Loại bỏ nước nổi

- Cho 500 µl dung dịch ethanol 70%/ ống nghiệm Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 15 phút Loại bỏ nước nổi Lặp lại bước này 1 lần

- Để mở nắp cho khô

- Cho 50 µl dung dịch đệm TE/ ống nghiệm

 Lai AND probe với ADN mẫu

 Pha loãng mẫu ADN chuẩn gốc làm việc

- Chuẩn bị thang mẫu chuẩn AND

• Chuẩn bị màng: làm ẩm màng Lắp vào bio-dot

• Nhỏ vào mỗi giếng 200 µl dung dịch TE pH8

• Nhỏ vào mỗi giếng toàn bộ thể tích ADN mẫu và chuẩn

• Các giếng còn trống nhỏ 200 µl dung dịch TE pH8

• Cố định màng bằng tia UV, mỗi mặt 4 phút

• Cho 10ml dung dịch tiền lai vào ống lai và ủ ở 42oC trong vòng 5 phút, tiếp tục cho màng vào Ủ ở 42o

C trong vòng 30 phút

• Thay dung dịch tiền lai bằng 4ml dung dịch lai Ủ ở 42oC qua đêm

 Rửa màng sau lai:

- Rửa màng 4 lần trong 100 ml dung dịch SSC 2X/SDS 0,1%, mỗi lần 5 phút, lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng

- Rửa màng 2 lần trong 100 ml dung dịch SSC 0,5X/SDS 0,1%, mỗi lần

15 phút, lắc nhẹ ở 65oC

- Rửa màng trong dung dịch rửa màng và lắc nhẹ trong 5 phút

 Phát hiện ADN

- Bão hòa trong 90ml dung dịch bloking, lắc nhẹ trong 30 phút

- Pha loãng anti- digoxigenin-AP trong dung dịch blocking tỉ lệ 1:10.000 (75mU/ml): cho 2 µl ati-dioxigenin-AP trong 20ml dung dịch blocking, lắc nhẹ trong 30 phút

- Rửa màng 2 lần với 100ml dung dịch rửa, mỗi lần lắc nhẹ trong 15 phút

- Cân bằng trong 20ml dung dịch phát hiện, lắc nhẹ trong 5 phút

- Rửa màng với 100 ml dung dịch rửa, lắc nhẹ trong 5 phút Loại bỏ hoàn toàn dung dịch sau rửa

- Nhỏ 1ml dung dịch CSDP ready-to-use lên màng, để ở nhiệt độ phòng

- Phương pháp: tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.7, trang PL-320 [1]

2.3.9.2 Kết quả

- Tính kết quả tuân theo DĐVN 4, phụ lục 15.7, trang PL-320 [1]

2.3.10 Chuẩn độ hiệu giá virút VNNB bằng kỹ thuật tạo đám hoại tử PFU

2.3.10.1 Các bước tiến hành

 Pha loãng mẫu thử

 Pha loãng mẫu thử bậc 10 bằng dung dịch LE+BA

0,2 1,8

0,2 1,8

0,2 1,8

0,2 1,8

0,2 1,8

 Gây nhiễm trên tế bào

 Gây nhiễm trên tế bào

- Hút bỏ hết môi trường nuôi cấy trong giếng

- Cấy 200 l hỗn dịch virút đã pha loãng trên vào mỗi giếng (2 giếng/độ pha)

 Cho các phiến đã cấy vào tủ ấm CO2 (36,5°C ± 0,5°C; 4,5% ± 0,5% CO2) để tiếp xúc 90 phút Cứ 20 phút láng một lần cho virút tiếp xúc đều với tế bào

- Hút bỏ môi trường nuôi cấy trong các giếng

- Cho 0,5 ml dung dịch nhuộm cố định vào và để 30 - 45 phút ở nhiệt độ 22- 25°C

- Rửa phiến dưới vòi nước chảy Để khô và đọc kết quả

Hiệu giá virút (PFU/ml)= Số plaque trung bình

Độ pha loãng số ml hỗn dịch virút cấy

2.3.11 Kiểm tra bất hoạt giai đoạn bán thành phẩm thô

- Gây nhiễm chuột bằng vắcxin VNNB bán thành phẩm thô

- Liều gây nhiễm: 0,03ml/chuột Đường tiêm: tiêm não

2.3.11.2 Kết quả

- Theo dõi và ghi các dấu hiệu của chuột thử nghiệm trong 14 ngày

2.3.12 Kiểm tra hàm lƣợng kháng nguyên virút VNNB bằng kỹ thuật ELISA

2.3.12.1 Các bước tiến hành

 Nguyên lý

 Kháng thể IgG chuột kháng virút VNNB chủng Beijing-1gắn bản, kết hợp với kháng nguyên VNNB trong mẫu thử Sau đó cho cộng hợp IgG chuột kháng Beijing-1 gắn peroxidase sẽ tạo thành phức hợp kháng thể - kháng nguyên - cộng hợp Cơ chất OPD kết hợp với cộng hợp tạo thành phản ứng màu Mật độ quang học (OD) được đo trên máy đọc ELISA ở bước sóng 

= 490/620nm