Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện vi sinh vật và công nghệ sinh học đại học quốc gia hà nội

i LỜI CAM ĐOAN Tôi- TUẤN HOÀNG VIỆT xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài: “Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi- TUẤN HOÀNG VIỆT xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề

tài: “Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội” là công trình nghiên cứu

và sáng tạo do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS DƯƠNG VĂN HƠP Số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa công

bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác

ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi Tuấn Hoàng Việt xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS DƯƠNG VĂN HỢP –Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học–Đại học Quốc gia

Hà Nội đã hướng dẫn chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm- Đại học Bách Khoa Hà Nội- đã chỉ dạy tận tình trong suốt quá trình tôi theo học

Bên cạnh đó người thân và bạn bè luôn là động lực, là nguồn động viên tôi đặc biệt là gia đình đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Vi sinh vật probiotic 3

1.1.1 Lịch sử probiotic 3

1.1.2 Định nghĩa probiotic 4

1.1.3 Lựa chọn các chủng probiotic 4

1.1.4 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic 5

1.1.5 Công thức chế phẩm probiotic 6

1.2 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic 6

1.2.1 Vai trò của probiotic 6

1.2.2 Cơ chế tác động 7

1.3 Các phương pháp lên men vi sinh vật 9

1.3.1 Phân loại dựa vào tính chất canh trường 9

1.3.1.1 Lên men chìm 9

1.3.1.2 Lên men bề mặt 10

1.3.1.3 Lên men xốp 11

1.3.2 Phân loại dựa vào cách nạp liệu và thu hồi bán thành phẩm 12

1.3.2.1 Lên men theo mẻ 12

1.3.2.2 Lên men bán liên tục 12

1.3.2.3 Lên men liên tục 13

1.4 Môi trường và thông số lên men vi sinh vật chủ yếu 13

1.4.1 Môi trường lên men vi sinh vật 13

1.4.2 Các thông số lên men vi sinh vật chủ yếu 15

1.5 Chất mang và phát triển sinh khối vi sinh vật dạng bột 16

1.5.1 Chất mang 16

1.5.1.1 Polysaccarit 16

1.5.1.2 Đường và các dẫn xuất của đường 17

1.5.1.3 Sữa gầy 18

1.5.2 Chất bổ trợ 18

1.5.2.1 Glutamat natri 18

1.5.2.2 Các chất chống oxy hóa 18

1.5.2.3 Sữa đậu nành len men 19

1.5.2.4 Glyxerol 19

1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam 19

1.6.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới 19

1.6.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam 20

1.7 Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đại học Quốc Gia Hà Nội 21

iv

Chương 2: VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

1.1 Nguồn vi sinh vật 23

1.2 Hóa chất và trang thiết bị sử dụng 23

1.2.1 Hóa chất 23

1.2.2 Máy móc và dụng cụ 24

1.3 Môi trường nghiên cứu 24

1.3.1 Môi trường MRS (g/l): 24

1.3.2 Môi trường LB (g/l): 25

2.1 Lựa chọn một số thông số lên men chủ yếu 26

2.1.1 Kiểm tra pH thích hợp cho sự sinh trưởng 26

2.1.2 Kiểm tra nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng 26

2.1.3 Lựa chọn tỷ lệ chủng giống 26

2.1.4 Lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp 27

2.1.5 Lựa chọn tốc độ sục khí thích hợp 27

2.1.6 Lựa chọn thời gian lên men 27

2.2 Xây dựng đường chuẩn OD và mật độ 27

2.3 Nghiên cứu xây dựng các thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75l 28

2.4 Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis 30

2.5 Nghiên cứu thiết lập các chất mang thích hợp cho từng chủng vi sinh vật 31

2.5.1 Xây dựng công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis 31

2.5.1 Xây dựng công thức chất mang cho chủng Lactobacillus acidophilus 32

2.6 Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm tối ưu 33

2.7 Nghiên cứu công thức phối trộn sản phẩm đa chủng 33

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Lựa chọn một vài thông số lên men 34

3.1.1 Chủng Bacillus subtilis 34

3.1.1.1 Dải pH thích hợp cho sự sinh trưởng 34

3.1.1.2 Dải nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng 35

3.1.1.3 Thời gian lên men thích hợp 36

3.1.1.4 Tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis 36

3.1.1.5 Tốc độ sục khí 37

3.1.1.6 Tỷ lệ chủng giống 37

3.1.2 Chủng Lactobacillus acidopilus 38

3.1.2.1 Dải pH thích hợp cho sự sinh trưởng của chủng L.acidophilus 38

3.1.2.2 Dải nhiệt độ thích hợp cho chủng Lactobacillus acidophilus 39

3.1.2.3 Thời gian lên men thích hợp của chủng Lactobacillus acidophilus 39

3.1.2.4 Tốc độ khuấy thích hợp cho chủng Lactobacillus acidophilus 40

3.1.2.5 Tỷ lệ chủng giống 40

3.2 Xây dựng các thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít 41

3.2.1 Thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít của chủng Bacillus subtilis 41

3.2.2 Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis 42

3.2.3 Thông số nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít của chủng Lactobacillus acidophilus 43

v

3.3 Lựa chọn các công thức chất mang thích hợp cho từng chủng vi sinh vật 44

3.3.1 Công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis 44

3.3.1.1 Công thức 1 44

3.3.1.2 Công thức 2 45

3.3.1.3 Công thức đối chứng 1 46

3.3.1.4 Công thức đối chứng 2 47

3.3.1.5 Công thức đối chứng 3 48

3.3.1.5 Sản phẩm của Việt Nam 49

3.3.2 Công thức chất mang cho chủng Lactobacillus acidophilus 50

3.3.2.1 Công thức 1 51

3.3.2.2 Công thức 2 52

3.3.2.3 Công thức đối chứng 1 54

3.3.2.4 Công thức đối chứng 55

3.3.2.5 Công thức đối chứng 3 56

3.3.2.6 Sản phẩm của Đan Mạch 57

3.3.2.7 Sản phẩm của Việt Nam 58

3.3.2.8 So sánh tính ổn định giữa sản phẩm của luận văn và sản phẩm thương mại lưu hành trên thị trường 59

3.4 Nghiên cứu điều kiện bảo quản sản phẩm tối ưu 60

3.5 Công thức phối trộn sản phẩm đa chủng 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC 70

vi

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1 Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic 8

Hình 2: Quy trình nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít 28

Hình 3: Các bước pha loãng dung dịch huyền phù vi sinh vật 30

Hình 4: Sơ đồ mô tả phương pháp lên men bán liên tục (Fed-batch cultivation) (A) và liên tục (Continuous cultivation) (B) 31

Hình 5: Thời gian lên men chủng Bacillus subtilis 36

Hình 6: Kết quả thử nghiệm tốc độ khuấy cho chủng Bacillus subtilis 36

Hình 7 : Kết quả thử nghiệm tốc độ sục khí của chủng Bacillus subtilis 37

Hình 8: Tỷ lệ chủng giốngcho chủng Bacillus subtilis 37

Hình 9: Thời gian lên men của chủng Lactobacillus acidophilus 40

Hình 10: Kết quả thử nghiệm tốc độ khuấy cho chủng Lactobacillus acidophilus 40

Hình 11: Tỷ lệ chủng giốngcho chủng Lactobacillus acidophilus 41

Hình 12: Kết quả lên men chủng Bacillus subtilis trong nồi lên men 75 lít 42

Hình 13: Thử nghiệm lên men bán liên tục 43

Hình 14: Đường cong sinh trưởng của chủng Lactobacillus acidophilus trên nồi lên men 75 lít 43

Hình 15: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức 1 45

Hình 16: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức 2 46

Hình 17: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức ĐC 1 47

Hình 18: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức ĐC 2 48

Hình 19: Kết quả kiểm tra mật độ của chủng B.subtilis ở công thức ĐC 3 48

Hình 20: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis sản phẩm của VN so với sản phẩm trong luận văn 50

Hình 21 Kết quả kiểm tra mật độ chủng L acidophilus công thức 1 lần 1 51

Hình 22: Kết quả kiểm tra mật độ L acidophilus công thức 1 lần 2 52

Hình 23: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 2 lần 1 53

Hình 24: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 2 lần 2 53

Hình 25: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus 54

vii

công thức đối chứng 1 lần 1 54

Hình 26: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 55

đối chứng lần 2 55

Hình 27: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus 56

công thức đối chứng 2 56

Hình 28: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus 56

công thức đối chứng 3 56

Hình 29: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Đan Mạch 57

Hình 30: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Việt Nam 59

Hình 31: So sánh tính ổn định giữa sản phẩm của luận văn và sản phẩm 60

thương mại 60

Hình 32: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tương ứng ở điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 °C) 61

Hình 33: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tương ứng ở điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( 4 - 8 ° C) 62

Hình 34: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tương ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng 63

viii

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ 6

Bảng 2: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường 21

Bảng 3: Hóa chất sử dụng 23

Bảng 4: Trang thiết bị và dụng cụ 24

Bảng 5: Môi trường nhân chủng, nuôi cấy và cấy đếm (môi trường MRS) 25

Bảng 6: Môi trường nhân chủng, nuôi cấy và cấy đếm (môi trường LB) 25

Bảng 7: Các công thức cơ chất cho chủng Bacillus subtilis 32

Bảng 8: Các công thức cơ chất cho chủng Lactobacillus acidophilus 33

Bảng 9: Kết quả thử nghiệm nuôi Bacillus subtilis trong bình tam giác 34

Bảng 10: Kết quả thử nghiệm nuôi Bacillus subtilis ở các nhiệt độ khác nhau 35

Bảng 11: Kết quả thử nghiệm nuôi Lactobacillus acidophilus trong bình 38

tam giác ở các pH môi trường khác nhau 38

Bảng 12: Kết quả thử nghiệm nuôi Lactobacillus acidophilus ở các nhiệt độ 39

Bảng 13: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức 1 44

Bảng 14: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức 2 45

Bảng 15: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC 1 46

Bảng 16: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC 2 47

Bảng 17: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis công thức ĐC 3 48

Bảng 18: Kết quả kiểm tra mật độ Bacillus subtilis sản phẩm của VN 49

Bảng 19: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 1 51

Bảng20: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus công thức 2 52

Bảng 21: Kết quả kiểm tra mật độ L acidophilus công thức đối chứng 1 54

Bảng 22: Kết quả kiểm tra mật độ L acidophilus công thức đối chứng 2 55

Bảng 23: Kết quả kiểm tra mật độ L.acidophilus công thức đối chứng 3 56

Bảng 24: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Đan Mạch 57

Bảng 25: Kết quả kiểm tra mật độ Lactobacillus acidophilus trong sản phẩm của Việt

ix

Nam 58

Bảng 26: Kết quả kiểm tra mật độ L.acidophilus trong sản phẩm của luận văn và sản

phẩm thương mại 59 Bảng 27: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tương ứng ở điều kiện ngăn đá tủ lạnh ( -20 ° C) 60 Bảng 28: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tương ứng ở điều kiện ngăn mát tủ lạnh ( 4 - 8 ° C) 61 Bảng 29: So sánh tính ổn định của sản phẩm đối với các công thức chất mang tương ứng ở điều kiện nhiệt độ phòng 62 Bảng 30: Bảng tổng hợp kết quả kiểm nghiệm đa chủng 64

1

MỞ ĐẦU

Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khỏe hệ thống tiêu hóa của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh sinh đường ruột được coi là một giải pháp rất hữu hiệu Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất phong phú về chủng loại và số lượng, chính điều này là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn đến những rối loạn trong chuyển hóa và hấp thu Bởi vậy, viêc sử dụng các biện pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân bằng tối

ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước quan tâm Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm Biện pháp cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử dụng kháng sinh liều thấp Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuoi ngày càng bị hạn chế( kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước thuộc EU cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi- Hector Cervanter, 2006), nên nhu cầu tìm ra các giải pháp thay thế kháng sinh ngày càng trở nên cấp bách Một trong những giải pháp hữu hiệu nhất hiện nay là probiotic Probiotic- theo Fuller (1992) [21]- là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích trong thức ăn nhằm cải thiện sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ

Nhu cầu sinh khối vi sinh vật probiotic trong nước không chỉ dùng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi lợn, gà, nuôi trồng thủy hải sản mà còn được dùng trong sản xuất thực phẩm chức năng dưới dạng men tiêu hóa Cho dù chưa có con số thống kê chính xác giá trị thực tế này nhưng nếu ước tính giá trị 1% của thức ăn chăn nuôi thì con số có thể đến hàng chục triệu USD Thực tế hiện nay phần lớn các sản phẩm probiotic được nhập từ các nước trong khu vực ( Thái Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc,

Ấn độ) và các nước phát triển như Mỹ, Anh, Pháp, Bỉ

Các nghiên cứu trong nước đã được thực hiện tại các trường Viện thông qua các đề tài khoa học đã đưa ra được kết quả lựa chọn chủng giống vi sinh vật, xây dựng quy trình lên men thí nghiệm và bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu quả sử

2

dụng sản phẩm probiotic trên gia súc, gia cầm với những kết quả thành công ban đầu Một trong những khâu quan trọng trong nghiên cứu sản xuất sinh khối probiotic là quá trình lên men đảm bảo vô trùng và đạt hiệu suất cao, sau đó là bước phát triển sản phẩm đảm bảo độ sống sót cao theo thời gian bảo quản Như vậy sản phẩm cuối cùng sẽ có chất lượng phụ thuộc vào tất cả các thông số lên men và quá trình phát triển sản phẩm Cho đến nay các nghiên cứu trong nước theo hướng phát triển đến sản phẩm cuối cùng đạt chất lượng cao và ổn định vẫn còn hạn chế đặc biệt ở quy mô thử nghiệm cũng như bán sản xuất

Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic đa chủng tại viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội”. với mục tiêu xác định các thông số quan trọng trong công nghệ lên men và phát triển sản phẩm probiotic từ đó đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm probiotic đơn chủng cũng như đa chủng đạt chất lượng cao và ổn định, do đó có tính cạnh tranh cao với các sản phẩm ngoại nhập

Đề tài này được thực hiện thành công sẽ mở ra triển vọng trong việc sản xuất các sản phẩm sinh học chất lượng cao, đáp ứng với yêu cầu ngày càng cao của ngành chăn nuôi hữu cơ (hoàn toàn dựa vào các nguyên liệu từ thiên nhiên) theo

hướng công nghiệp ở nước ta, hạn chế nhập khẩu

3

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi sinh vật probiotic

1.1.1 Lịch sử probiotic

Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh

Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng

minh được rằng sự có mặt Lactobacillus trong đường tiêu hóa sẽ hạn chế các nội

độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới

115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908)

Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic [20]

Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [21] Cùng năm đó, các nhà nghiên

cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm

bệnh táo bón thường xuyên Các nhà khoa học đại học Havard phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quyết định trong quá trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [20] Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất Khái niệm chung probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập niên 80 [21]

Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc Lactobacillus

1.1.3 Lựa chọn các chủng probiotic

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật với tiêu chuẩn đầu tiên là phải an toàn cho quá trình sản xuất và ứng dụng, có khả năng sống sót và bám dính trong đường tiêu hóa vật chủ Các tiêu chuẩn lựa chọn này được hợp lý hóa thông qua các thí nghiệm in vitro, từ đó sẽ tuyển chọn được các chủng có tiềm năng như là nguồn probiotic

Các chủng vi sinh vật probiotic được lựa chọn theo các tiêu chuẩn chủ yếu sau:

 Tính bám dính trên bề mặt đường tiêu hóa hoặc các tế bào biểu mô: Các chủng probiotic phải bám dính được vào thành ruột non, khu trú tốt trong đường tiêu hoá và sinh sôi nảy nở Khả năng bám dính được xem là một yêu cầu quan trọng để tăng khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ biểu mô

và tăng khả năng miễn dịch của vật chủ Đặc tính này làm tăng khả năng cạnh tranh của các chủng probiotic với các vi sinh vật bất lợi khác

 Hoạt tính kháng khuẩn chống lại các vi khuẩn gây bệnh: Lựa chọn được các chủng có khả năng sản sinh các chất kháng khuẩn là đặc tính quan trọng nhất

5

trong phát triển probiotic Các chủng probiotic cần có hoạt tính ức chế vi

khuẩn gây bệnh như E coli, Salmonella và Campylobacteria Hoạt tính kháng khuẩn của chúng có thể theo nhiều cơ chế khác nhau như:

+ Sản sinh ra các chất Bacteriocin

+ Làm giảm độ pH bởi tạo ra axit lactic

+ Tạo ra H2O2

+ Làm giảm độc tố theo các cơ chế khác nhau

+ Khả năng làm giảm sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh trên bề mặt + Cạnh tranh dinh dưỡng với các vi khuẩn gây bệnh

 Khả năng tồn tại trong môi trường axit dạ dày: Khoang miệng và dạ dày của vật chủ là nơi có môi trường axit pH từ 2-3 và có mặt các enzym tiêu hoá (amylaza, proteaza, lysozym…) Các chủng vi sinh vật được coi như là nguồn probiotic phải tồn tại được trong điều kiện này Hiện nay các công ty đã khuyến cáo dùng

vỏ bọc (microcapsute) với chế phẩm probiotic nhằm tăng khả năng sống của vi khuẩn probiotic khi đi qua khoang miệng và dạ dày

 Khả năng chịu muối mật: Thông thường, muối mật trong dịch tiêu hoá của động vật dao động 1-3% Để tồn tại và phát triển, các chủng probiotic phải có khả năng tồn tại và phát triển với nồng độ muối mật ≥ 2%, ngoài ra một số chủng

probiotic (Nấm men, Bacillus và Lactobacillus) có khả năng sinh enzym tiêu

hoá như: amylaza, xenlulaza và proteaza, lipaza và phytaza có vai trò làm tăng khả năng tiêu hoá thức ăn và hấp thu chất dinh dưỡng của vật chủ

1.1.4 Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic

 Vi khuẩn lactic: gồm 2 chi vi khuẩn chủ yếu là Lactobacillus và

Bifidobacterium

Các loài thuộc chi Lactobacillus: L acidophilus, L amylovorus, L brevis, L casei,

L casei subsp rhamnosus (Lactobacillus GG), L caucasicus, L crispatus, L delbrueckii subsp bulgaricus (L bulgaricus), L fermentum (L fermenti), L gasseri, L helveticus, L johnsonii, L lactis, L leichmannii, L paracasei, L plantarum, L reuteri, L rhamnosus

6

Các loài thuộc chi Bifidobacterium: B adolescentis, B bifidum, B breve, B

infantis, B lactis (B animalis), B licheniformis, B longum

 Một số vi sinh vật probiotic khác không phải vi khuẩn lactic Lactobacillus và

Bifidobacterium: Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae

1.1.5 Công thức chế phẩm probiotic

Như đã trình bày ở phần trên có 3 đối tượng chủ yếu cho nghiên cứu phát

triển chế phẩm là vi khuẩn lactic, vi khuẩn Bacillus và nấm men Vai trò cũng như

cơ chế tác động của chúng lên vật chủ rất khác nhau, cụ thể có trong bảng sau:

Bảng 1: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic lên vật chủ

bám vào biểu mô

- Sinh các axit hữu cơ, tăng hiệu

quả hấp thu chất dinh dưỡng

- Sinh enzym phân giải các cơ chất như tinh bột, xenluloza;

kích thích tiêu hoá

- Sinh axit hữu cơ, kích thích tiêu hoá

- Hấp thu chất độc và cạnh tranh dinh dưỡng,

vị trí bám trên biểu mô với vi sinh vật gây bệnh

Tuỳ thuộc vào từng loại sản phẩm mà có thành phần vi sinh vật khác nhau

1.2 Vai trò và cơ chế hoạt động của probiotic

1.2.1 Vai trò của probiotic

Từ khi kháng sinh bị cấm sử dụng như chất kích thích sinh trưởng trong thức

ăn chăn nuôi ở một số nước thuộc khối liên minh châu Âu (bắt đầu là Thụy Điển vào năm 1986) thì probiotic được coi là một trong những nguồn thay thế có triển vọng nhất vì có nhiều đặc tính ưu việt Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, Patterson (2003) [22] đã tổng kết các ảnh hưởng có lợi của probiotic đối với đời sống động vật thể hiện ở các khía cạnh sau:

- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có lợi cho vật chủ

7

- Tăng cường khả năng miễn dịch

- Giảm phản ứng viêm

- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh

- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi

- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B

- Tăng hấp thu chất khoáng

- Làm giảm cholesterol huyết thanh

- Làm tăng năng suất vật nuôi

- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải

Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi trường

Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức khỏe người tiêu dùng

1.2.2 Cơ chế tác động

Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch (Steiner, 2006)[23] Minh họa cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1

Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật ruột là cạnh tranh vị trí bám dính Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các

vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E coli,

Salmonella Một số nấm men probiotic (Saccharomyces cereviese; S.boulardii)

không chỉ tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà còn gắn kết các vi khuẩn

có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại) thông qua các cơ quan thụ cảm mannose

và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột (Czerucka và Rampal, 2002) [15] Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì

sự sinh sôi với số lượng lớn của một loài vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn cơ chất cho phát triển

8

Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic còn sản sinh các chất kìm hãm vi khuẩn nhƣ lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng nhƣ một

số axit hữu cơ khác Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu

là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1994) [14]

Cạnh tranh loại trừ: các sinh vật probiotic khóa chặt các vị trí thụ cảm do

đó loại trừ đƣợc các vi sinh vật gây bệnh

Các vi sinh vật probiotic

cƣ ngụ và nhân lên trong ruột, ngăn cản sự bám dính và phát triển của các

vi sinh vật gây bệnh

Hình 1 Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic

9

Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú Giữa hệ vi sinh vật ruột

và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng của hệ vi sinh vật ruột Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas và ctv, 1999) [16] Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng miễn dịch vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ

1.3 Các phương pháp lên men vi sinh vật

Có nhiều cách để phân loại các phương pháp lên men

 Dựa vào thành phần đồng nhất hay không đồng nhất của canh trường người ta chia ra lên men bề mặt, lên men bề sâu, và bán rắn

 Dựa vào cách nạp liệu và thu hồi bán thành phẩm sau khi lên men người ta chia ra lên men gián đoạn, liên tục và bán liên tục

1.3.1 Phân loại dựa vào tính chất canh trường

1.3.1.1 Lên men chìm

Lên men chìm hay lên men bề sâu dùng môi trường dịch thể Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng Phương pháp này dùng cho cả vi sinh vật kị khí

và hiếu khí Đối với nuôi vi sinh vật kị khí trong quá trình nuôi không cần sục khí chỉ thỉnh thoảng đảo trộn còn với vi sinh vật hiếu khí chỉ sử dụng được oxygen hòa tan trong môi trường nên phải sục khí liên tục Đây là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khoảng nửa cuối thế kỉ XX và cho kết quả rất to lớn đối với công nghệ vi sinh

Ngày nay phương pháp nuôi cấy chìm được dùng phổ biến trong công nghệ

vi sinh để sản xuất men bánh mì, protein đơn bào, các chế phẩm vi sinh làm phân bùn, thuốc trừ sâu, các enzyme, các acid amin, vitamin, các chất kháng sinh, các chất kích thích sinh học v.v

10

Không thể có môi trường nuôi cấy chung cho tất cả các chủng vi sinh vật, vì vậy cần phải chọn thành phần môi trường, tỷ lệ các chất dinh dưỡng sao cho thích hợp với từng chủng

Phương pháp lên men chìm có một số ưu điểm:

 Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền

 Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp

 Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn

 Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá

 Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng của môi trường, tránh sự lãng phí chất dinh dưỡng nằm lại trong khối môi trường chất rắn mà vi sinh vật không sử dụng được

Song phương pháp lên men chìm cũng có một số nhược điểm sau:

 Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ Vì vậy, những thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín

và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối (trong nuôi cấy bề mặt có thể loại

bỏ phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn còn dùng được)

 Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được ôxy hoà tan trong môi trường Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy

1.3.1.2 Lên men bề mặt

Trong lên men bề mặt, vi sinh vật mọc trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm Vi sinh vật phát triển sẽ lấy những chất dinh dưỡng trong môi trường và sử dụng oxygen phân tử của không khí để hô hấp Để đảm bảo cho vi sinh vật mọc đều trên bề mặt môi trường

và sử dụng được nhiều chất dinh dưỡng sinh ra enzyme, những lớp môi trường rắn cần phải mỏng (chỉ dày khoảng 2-5 cm) Điều này dẫn đến một nhược điểm cơ bản của phương pháp này cần phải có mặt bằng sản xuất lớn và chi phí lao động chân tay nhiều

11

Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzyme thường dùng môi trường rắn, một số trường hợp có thể dùng môi trường lỏng Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô… hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này Môi trường lỏng thường là rỉ đường, dịch thủy phân từ thóc mầm, nước bã rượu… có pha thêm muối khoáng

Để đảm bảo đủ các chất dinh dưỡng trong môi trường người ta có thể bổ sung các nguồn N, P, K hoặc các chất sinh trưởng (nước khoai tây, cao ngô,…) Trong phương pháp nuôi bề mặt hay nuôi nổi các cơ thể tồn tại ở bề mặt môi trường, do đó mà các tế bào hướng về khoảng không khí được cung cấp đầy đủ ôxy

Ở các váng nấm, chất dinh dưỡng của môi trường chỉ được hấp thu nhờ các tế bào chìm và được chuyển vào sợi nấm Sự tạo váng trong phương pháp nuôi bề mặt dẫn tới một trạng thái sinh lí có ý nghĩa quan trọng đối với việc sản xuất các chất trao đổi nhất định của nấm, ví dụ như sản xuất acid citric hay các enzyme Tuy nhiên người ta vẫn cố gắng đạt đến trạng thái sinh lí tương ứng với nuôi cấy chìm

1.3.1.3 Lên men xốp

Phương pháp lên men này thường thích hợp cho một số nấm mốc và xạ khuẩn Việc lên men thường được tiến hành trên các khay phẳng xếp chồng lên nhau và ủ trong các buồng chứa vô trùng đóng kín, giống được cấy vào bằng cách thổi bào tử vào bên trong buồng chứa Một hình thức khác là nuôi hệ sợi nấm trên các cơ chất rắn như lúa mì, cám hoặc lúa nước trong các thùng quay chậm Phương pháp này được dùng để sản xuất một số enzyme

Theo phương pháp này, giống vi sinh vật hiếu khí sau khi cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành phần môi trường Vi sinh vật sử dụng ôxy của không khí để hô hấp đồng thời thải CO2 ra môi trường xung quanh và toả nhiệt Phương pháp này thường thích hợp cho các quá trình nuôi cấy nấm mốc, một số xạ khuẩn và vi khuẩn cũng có thể sản xuất theo phương pháp này

12

Nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường rắn hoặc bán rắn có cơ chất dinh dưỡng là cám có trộn các loại bột ngũ cốc, đậu tương và một số thành phần dinh dưỡng khác Nguồn carbon cho môi trường dinh dưỡng là các loại hạt như ngô, gạo,

mì, đại mạch, đậu tương được nghiền vỡ thành mảnh kích thước khoảng 1 - 3 mm

Độ ẩm của môi trường khoảng 55 - 60% Khi vi sinh vật phát triển sẽ thải CO2 gây hiện tượng toả nhiệt làm nóng và khô môi trường Cần phải thông gió, phun mù hoặc làm ẩm trực tiếp để giữ cho độ ẩm tương đối của không khí khoảng 90%

Nhược điểm của phương pháp:

 Tốn nhiều diện tích mặt bằng, khó cơ khí hoá và tự động hoá

 Chi phí nhân công, điện nước cho một đơn vị sản phẩm cao

1.3.2 Phân loại dựa vào cách nạp liệu và thu hồi bán thành phẩm

1.3.2.1 Lên men theo mẻ

Trong phương pháp nuôi không liên tục (batch - cultivation) hay còn gọi là nuôi gián đoạn, thông thường vi sinh vật sinh trưởng đến khi nào một thành phần chủ yếu của môi trường dinh dưỡng bị giới hạn Khi đó culture chuyển từ pha luỹ thừa sang pha cân bằng Sinh trưởng gắn liền với sự thay đổi kéo dài của điều kiện nuôi, sự giảm chất dinh dưỡng và sự tăng khối lượng tế bào Trong quá trình đó trạng thái sinh lí của tế bào cũng thay đổi Thông thường việc tạo thành sản phẩm mong muốn liên quan với một trạng thái sinh lí nhất định trong pha sinh trưởng Không thể duy trì được trạng thái này trong một thời gian dài

Trong suốt thời gian lên men mẻ, sản lượng nhiệt, sự sản xuất kiềm hoặc acid, và sự tiêu thụ oxygen sẽ biến thiên từ các tốc độ rất thấp ở lúc bắt đầu tới các tốc độ rất cao trong suốt pha log muộn Vì vậy, điều chỉnh môi trường của một hệ thống như thế khó hơn nhiều so với quá trình liên tục mà ở trạng thái ổn định các tốc độ sản xuất và tiêu thụ là hằng số Lên men gián đoạn thực hiện theo từng mẻ nên thường có năng suất thấp và chu kỳ sản xuất bị kéo dài

1.3.2.2 Lên men bán liên tục

Lên men bán liên tục ( fed- batch cultivation) được xem là hệ thống trung gian giữa quá trình nuôi cấy mẻ và nuôi cấy liên tục Thuật ngữ lên men gián đoạn

13

bổ sung được dùng để mô tả các nuôi cấy mẻ được cung cấp dinh dưỡng liên tục (hoặc nối tiếp nhau) bằng môi trường mới mà không bỏ dịch cũ nuôi cấy Như vậy, thể tích của loại nuôi cấy này tăng lên theo thời gian

1.3.2.3 Lên men liên tục

Trong quá trình lên men liên tục (Continuous cultivation), nguồn dinh dưỡng đầu vào được bổ sung liên tục va dịch lên men (gồm các tế bào va sản phẩm tạo ra ) được lấy bớt ra liên tục và như vậy tạo được cân bằng hợp lí Phương thức cung cấp dinh dưỡng này làm cho các điều kiện trong bioreactor (buồng lên men) luôn ở trạng thái ổn định, do đó sản phẩm tạo ra tốt hơn Môi trường đi ra có thể lắng tế bào rồi lấy bổ sung nó cho bioreactor

1.4 Môi trường và thông số lên men vi sinh vật chủ yếu

1.4.1 Môi trường lên men vi sinh vật

Nuôi cấy vi sinh vật ở bất cứ quy mô nào (phòng thí nghiệm, nhân giống cấp

1, 2, 3 hay trong nồi lên men) đều phải đảm bảo đầy đủ các nguyên tố dinh dưỡng cho vi sinh vật hoạt động nhân sinh khối tạo sản phẩm

Nguyên tố dinh dưỡng của vi sinh vật để là: các nguyên tố đa lượng, vi lượng

và các vitamin Tuy vậy trong lên men công nghiệp cũng có chỗ khác biệt đáng lưu ý Người ta không bổ sung nguyên tố vi lượng ở dạng dung dịch tinh khiết vào môi trường lên men, mà có sự bổ sung cùng lúc với các nguyên tố đa lượng Các nguyên tố đa lượng được bổ sung dưới dạng hợp chất (rỉ đường, cao ngô, gạo ) Thông thường các tạp chất này chứa một lượng các nguyên tố vi lượng cần thiết và

đủ để dùng cho vi sinh vật

 Các hợp chất cung cấp nguồn Cacbon: Cacbon chiếm một phần rất lớn trong

tế bào vi sinh vật, chính vì vậy những hợp chất chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sống của vi sinh vật Nguồn thức ăn chủ yếu của vi sinh vật là hydratecacbon Các hợp chất có phân tử thấp như một số đường thì vi sinh vật có thể đồng hóa trực tiếp Còn các hợp chất cao phân tử (tinh bột, cellulose,…) sẽ được phân hủy nhờ các enzyme do vi sinh vật tiết ra

 Dầu thực vật: Các loại dầu (dầu dừa, dầu lạc, dầu đậu tương, dầu hướng

14

dương ) được dùng trong nuôi cấy vi sinh vật với vai trò là nguồn dinh dưỡng carbon, ngoài ra còn là chất phá bọt trong quá trình lên men Khi nuôi cấy vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme lipase, sẽ phân hủy các chất dầu này thành glycerin và các acid béo Lượng chất béo bổ sung vào môi trường phải rất phù hợp với hoạt động sống của vi sinh vật, nếu bổ sung quá nhiều

sẽ làm chậm quá trình đồng hóa nguồn carbohydrate của vi sinh vật

 Các hợp chất cung cấp nguồn Nitrogen: Nitơ tham gia vào tất cả các cấu trúc trong tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện mọi chức năng của hoạt động sống Nguồn nitơ là nguồn dinh dưỡng quan trọng không kém nguồn carbon

 Các nguyên tố khoáng: Trong công nghệ lên men, người ta nhận thấy vai trò của dinh dưỡng khoáng rất lớn, nó ảnh hưởng nhiều đến chất lượng của quá trình lên men Trong số dinh dưỡng khoáng, người ta đặc biệt chú ý đến vai trò của phospho (P) Khi lên men công nghiệp, người ta thường bổ sung P dưới dạng bột đậu, bột bắp, bã rượu, hay ở dạng phosphate vô cơ Với các chất khoáng khác như: Mg, Na, Fe vi sinh vật sẽ nhận từ môi trường dinh dưỡng ở dạng muối vô cơ hoặc có khi ngay cả trong nước pha môi trường dinh dưỡng Vì vậy khi pha môi trường người ta thường dùng nước máy mà không dùng nước cất Các nguyên tố vi lượng như: Mn, Mo, Co thường có mặt trong các nguyên liệu tự nhiên ban đầu khi đưa vào môi trường lên men như dịch trái cây, nước chiết các loại hạt

 Tùy vai trò của các nguyên tố khoáng rất quan trọng, nhưng trong quá trình lên men cũng chứ cần một lượng thích hợp, nếu vượt quá giới hạn sẽ giảm hiệu quả của quá trình lên men Vì vậy khi thiết kế nồi lên men, người ta chế tạo từ thép carbon, bên trong nồi còn quét lớp keo bảo vệ

 Nước: Nước là thành phần chính của tế bào và thể hiện nhiều vai trò khác nhau Chất lượng nước rất quan trọng trong sản xuất các sản phẩm từ vi sinh vật Trong sản xuất vaccine, nguồn nước phải qua nhiều công đoạn làm tinh sạch, chưng cất rồi mới được sử dụng để nuôi các chủng vi sinh vật Lên men trong môi trường nước có ưu điểm là độ đồng nhất cao, dễ dàng theo dõi pH

15

và nhiệt độ, nhược điểm là khi chiết suất sản phẩm thì tỉ lệ nước cao gây tốn kém năng lượng và thời gian

1.4.2 Các thông số lên men vi sinh vật chủ yếu

 Lượng giống cấp: Nếu lượng giống cấy quá ít thì điều kiện lên men sẽ kéo dài Ngoài ra, trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, các vi sinh vật nhiễm trong môi trường dễ phát triển và có thể làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và chất lượng sản phẩm Ngược lại, nếu lượng giống cấy quá nhiều thì

sẽ làm tăng chi phí cho quá trình nhân giống Trong công nghệ lên men thực phẩm, lượng giống cấy quá nhiều sẽ làm thay đổi tỉ lệ sản phẩm phụ tạo thành trong canh trường lên men, từ đó giá trị cảm quan của thực phẩm lên men sẽ bị thay đổi Các nhà sản xuất cần xác định lượng giống cấy thích hợp bằng phương pháp thực nghiệm

 Nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, hoạt tính trao đổi chất của

vi sinh vật và chất lượng của thực phẩm lên men Các nhà sản xuất cần chọn nhiệt độ lên men thích hợp để tăng năng suất và chất lượng sàn phẩm cao nhất, đồng thời tiết kiệm được chi phí sản xuất

 Sự cung cấp oxy: Nhu cầu trao đổi oxygen của một sinh vật phụ thuộc vào đặc điểm của tế bào và điều kiện môi trường nuôi Việc cung cấp oxy cho quá trình lên men hiếu khí là bắt buộc vì nó ảnh hưởng quyết định đến năng suất và chất lượng sản phẩm cần thu nhận Đối với môi trường rắn, người ta thổi không khí vô trùng đi qua lớp canh trường trong thiết bị nuôi cấy Còn đối với môi trường lỏng, người ta sục không khí vào canh trường, kết hợp với sự khuấy trộn

 Yếu tố pH: Trong quá trình lên men, pH thay đổi do sự vận chuyển các chất qua màng tế bào, từ đó làm thay đổi nồng độ ion H+ trong canh trường (môi trường chỉ chiếm một phần thể tích trong bình lên men) và một số vi sinh vật sinh tổng hợp acid hữu cơ rồi tiết ra bên ngoài tế bào Khi đó, một số phân tử protein hoà tan trong canh trường có thể bị đông tụ

 Tốc độ khuấy: cánh khuấy giúp oxy hòa tan, các thành phần trong thiết bị lên

16

men được phối trộn đều với nhau, tạo điều kiện cho chất dinh dưỡng và khí oxy thấm vào trong tế bào, cho phép trao đổi nhiệt tốt hơn Do đó lựa chọn tốc độ khuấy đối với từng chủng vi sinh vật là một yếu tố hết sức quan trọng

 Thời gian lên men: Phụ thuộc vào giống vi sinh vật, dạng sản phẩm cần thu nhận và nhiều yếu tố khác Khi thu nhận các sản phẩm trao đổi chất như acid amin, acid hữu cơ, dung môi hữu cơ, enzyme….thời gian lên men thường kéo dài từ 1 đến 3 ngày Ngược lại, đối với nhóm thực phẩm lên men, thời gian lên men và tàng trữ có thể kéo dài hàng tuần, hàng tháng và thậm chí hàng năm Các nhà sản xuất sẽ định thời gian lên men và tàng trữ bằng thực nghiệm

1.5 Chất mang và phát triển sinh khối vi sinh vật dạng bột

1.5.1 Chất mang

1.5.1.1 Polysaccarit

Được coi là chất bảo vệ tế bào,tránh sự tấn công của thực khuẩn thể, chống lại quá trình làm khô, bảo vệ khỏi các chất độc Có khả năng kháng khuẩn và tránh được áp suất thấp Những polysaccarit điển hình là tinh bột hay các dextran

Mặc dù không thấm qua thành tế bào Nhưng chúng được hấp thụ lên bề mặt

tế bào VK làm thành 1 lớp dính nhằm ức chế sự phát triển của tinh thể đá ở bên ngoài và giữ cấu trúc vô định hình của đá chỉ được nằm ngoài tế bào

Với chế phẩm pro dùng cho người và vật nuôi thường sử dụng là tinh bột ngũ cốc Ưu điểm của tinh bột ngũ cốc:

 Là nguồn thức ăn thông thương của người, gia súc, gia cầm nên khi dùng làm chất mang chỉ là bổ sung thêm nguồn VSV vào thức ăn

 Chứa một nguồn dinh dưỡng ồn định cho VSV: C, N…

 Thời gian bảo quản lâu dài

 Thông dụng và rẻ tiền

 Ngoài việc sủ dụng một loại tinh bột, người ta có thể phối hợp 2 hay nhiều loại tinh bột khác nhau để đạt hiệu quả tối đa

17

1.5.1.2 Đường và các dẫn xuất của đường

Có rất nhiều loại đường: glucoza, fructoza, lactoza, mantoza, saccaroza Các dẫn xuất của đường: là các rượu có gốc đường( vd:sorbitol…) và đường khử (vd: trehalose) Các đường này đều có tác dụng bảo vệ đối với rất nhiều loại vi khuẩn lactic trong quá trình sấy và bảo quản Các loại đường khác nhau trong chế phẩm có ảnh hưởng với loại đường từng được bổ sung vào môi trường nuôi cấy trước đó Sự khác nhau trong khả năng bảo vệ của các loại đường đối với các tác nhân khi sấy và bảo quản chê phẩm là do sự xâm nhập hiệu quả hay không hiệu quả của từng loại đường Điều đó liên quan đến loại đường được hấp thụ

Ví dụ: Sorbitol có ảnh hưởng rất mạnh đến L.bungarisus, L.plantarum trong

quá trình bảo quản là do cơ chế bảo vệ cơ bản của sorbitol đối với tế bào khô là ngăn chặn sự phá hủy của màng tế bào bằng cách tương tác và ngăn chặn sự oxy hóa lipit nhờ vào đặc tính chống oxy hóa của nó Đồng thời nó còn ổn định cấu trúc protein từ đó duy trì liên kết để hình thành phức sorbitol- protein

Trehalose có khả năng bảo vệ tế bào khô tốt hơn 1 số loại đường Trehalose

có thể bảo vệ Ribosome, cô lập màng sinh học và bảo vệ nguyên vẹn tế bào khỏi ảnh hưởng của quá trình lạnh đông và sấy Bên cạnh việc bảo vệ cấu trúc protein trong quá trình sấy Trehalose và các Hydrocacbon khác còn có thể giảm thiểu sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ đối với màng tế bào bằng cách luôn chuyển nước giữa các đầu Lipit Hiện tượng này ngăn chặn sự biến đổi pha và tạo lỗ để hỗ trợ khi hydrat hóa trở lại

Tuy nhiên giá thành của hỗn hợp chất độn cần qun tâm khi sản xuất ở quy

mô công nghiệp vì thế trong thực tế saccarit hoặc glucoza có những đặc tính tương

tự Trehalose thường được bổ sung vào chất độn trong quá trình bảo quản tế bào khô Điều đó cũng đưa lại hiệu quả nhưng khả năng bảo vệ còn phụ thuộc vào loại đường ở dịch trong môi trường nuôi cấy ban đầu

1 số aa, các oligosaccarit, các peptit mạch ngắn Đây chính là các chất bán thấm Nhất là chúng có khả năng xâm nhập vào thành tế bào, không xâm nhập được qua màng nguyên sinh chất Dạng hợp chất bán thấm này làm nguyên sinh chất co lại trước khi lạnh đông và đặc thành 1 lớp đệm nằm giữa thành tế bào nguyên sinh chất chống lại sự phát triển của tinh thể đá Vì vậy làm thành lớp bảo vệ cơ học cho màng tế bào

Bổ sung sữa gầy cùng tác nhân bảo vệ sẽ làm tăng khả năng bảo vệ tế bào trong quá trình sấy cũng như quá trình bảo quản chế phẩm Khả năng bảo quản của các chất đối với tế bào trong suốt quá trình sấy và đông khô có liên quan đên sự có mặt của các nhóm amin, nhóm R hoặc cả hai Sự ổn định cấu trúc protein của vi khuẩn đạt được thông qua mối liên hệ giữa nhóm amin của tác nhân bảo vệ và nhóm carboxyl của protein vi khuẩn

1.5.2 Chất bổ trợ

1.5.2.1 Glutamat natri

Có khả năng bảo vệ sự tồn tại và giữ hoạt lực của các loại vi sinh vật Probiotic với nồng độ rất nhỏ khoảng 1% Đó là sự liên kết giữa nhóm amin của glutamate và cacbon của protein tại thành tế bào

1.5.2.2 Các chất chống oxy hóa

Được coi là một cơ chất có tác dụng gây cản trở quá trình oxi hóa bình thường của dầu và chất béo.Khả năng tự oxi hóa của phosphor lipit ở thành tế bào

19

có thể bị ngăn chặn bới các chất chống oxi hóa tự nhiên Ảnh hưởng đó liên quan mật thiết tới nồng độ của chúng trong môi trường

1.5.2.3 Sữa đậu nành len men

Có thể sử dụng trong quá trình tạo chế phẩm probiotic bởi ngoài chứa 1 lượng lớn protein, đậu nành còn chứa tinh bột, oligosaccarit, 1 số chất chống oxi hóa như flavonoit; Bởi vậy nó có khả năng rất tốt trong quá trình sấy phun và sấy đông khô các vi sinh vật probiotic

1.5.2.4 Glyxerol

Glyxerol là một chất bổ trợ cho chế phẩm probiotic bởi đó là chất có khả năng xâm nhập vào màng tế bào, khiến màng tế bào dẻo dai hơn và kết hợp được với H2O để chống lại sự thoát hơi H2O quá nhiều Đồng thời ngăn chặn hình thành các tinh thể đá bên trong tế bào khi làm lạnh

1.6 Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt nam

1.6.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic trên thế giới

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh, probioic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đang được phát triển mạnh mẽ trên thế giới do những hiệu quả to lớn của nó trong việc tăng năng suất vật nuôi, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn, hạ giá thành sản xuất và bảo đảm an toàn vệ sinh thực phẩm Những loài vi khuẩn, nấm men đã được phân lập, nuôi cấy và bào chế dưới dạng chế phẩm vi sinh, probiotic, prebiotic

bổ sung vào thức ăn nhằm cải thiện khả năng tiêu hóa, hấp thu, nâng cao sức đề kháng và thay thế sử dụng kháng sinh, hóa dược trong thức ăn chăn nuôi

Nghiên cứu của Luc Shiming (1980) cho thấy chế phẩm Lactobacillus được

phân lập từ gà con khỏe mạnh có tác dụng phòng và trị bệnh pullorum (tiêu chảy cấp tính và ác tính hàng loạt ở gà)

Reverdin (1996) cho rằng Saccharomyces cerevisiae có tác dụng làm nâng

cao chất béo trong sữa dê Nghiên cứu khác cho thấy sử dụng chế phẩm probiotic trên gà đẻ làm tăng sản lượng trứng 5% (Mohal et al., 1995)

Cải thiện số ngày đẻ trứng, hệ số chuyển biến thức ăn, trọng lượng trứng và chất lượng lòng đỏ (Tortuero và Fernandez, 1995)

20

Nghiên cứu của Tortuero (1989) cho thấy bổ sung hỗn hợp L.acidophilus và

S.faecium cho gà thịt giai doạn 5-8 tuần tuổi đã cải thiện 2% tăng trọng và hiệu quả

1.6.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm probiotic ở Việt nam

Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây Phạm Ngọc Lan và ctv (2003) [9] đã phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và

CH156 có những tính chất probiotic gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus

salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% axit mật; sinh trưởng được ở môi

trường pH = 4.0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli)

có khả năng sử dụng như nguồn probiotic ứng dụng trong chăn nuôi Nguyễn Thị

Hồng Hà và ctv (2003) [7] đã sử dụng hai chủng Bifidobacterium bifidum và

Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotic, bước đầu đã nghiên cứu

được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có

số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn

Salmonella Nguyễn La Anh và ctv (2003) [5] đã phân lập được chủng vi khuẩn

lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất probiotic và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng

dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá Lê Tấn Hưng, Võ Thị Hồng Hạnh và ctv (2003) [8] đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm probiotic BIO I và BIO II Chế

phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men

Sacharomyces phối hợp với các enzym -amylaza và proteaza dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi Hiện nay chế

21

phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao

Sau đây là thông tin một số sản phẩm probiotic có mặt trên thị trường:

Bảng 2: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có mặt trên

thị trường

Vi sinh vật sử dụng và mật độ (CFU/g)

1.7 Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đại học Quốc Gia Hà Nội

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học (tiền thân là Trung tâm Công nghệ Sinh học) trực thuộc Đại học Quốc ha Hà Nội được thành lập vào ngày 24 tháng 5 năm 2007 theo quyết định số 661 QĐ- TTg của Thủ tướng Chính phủ

Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học ngày nay là một trong những viện hàng đầu về Công nghệ Sinh học và Vi sinh vật của Việt Nam, là đầu mối hợp tác nghiên cứu cơ bản và ứng dụng vi sinh vật trong cả nước và quốc tế

Viện gồm rất nhiều phòng, ban nhưng đặc biệt có Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) VTCC được thành lập năm 1996, là Bảo tàng giống vi sinh vật tự nhiên duy nhất và lớn nhất ở Việt Nam VTCC được Nhà nước hỗ trợ kinh phí thường xuyên để thực hiện nhiệm vụ phân lập, định danh, lưu giữ và bảo quản vi sinh vật từ các nguồn tự nhiên khác nhau ở Việt Nam VTCC tham gia hiệp hội Bảo tồn và sử dụng bền vững vi sinh vật châu Á (ACM) từ năm 2004 và là thành viên của Hiệp hội Bảo tàng giống Quốc tế từ năm 2008, VTCC đang lưu giữ nhiều

22

chủng vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và xạ khuẩn có khả năng ứng dụng trong công nghiệp để sản xuất các sản phẩm thương mại có giá trị cao như probiotics, enzyme sử dụng trong chăn nuôi, chế phẩm dùng trong đấu tranh sinh học, mỹ phẩm và các chất kháng khuẩn

23

Chương 2: VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu và trang thiết bị nghiên cứu

1.1 Nguồn vi sinh vật

 Các chủng vi sinh vật sử dụng trong đề tài được lấy từ Bảo tàng giống Vi sinh vật (VTCC) - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội Hai chủng nghiên cứu trong đề tài có số hiệu VTCCB- 880

(Bacillus subtilis) và VTCCB- 871 (Lactobacillus acidophilus)

1.2 Hóa chất và trang thiết bị sử dụng

1.2.1 Hóa chất

Bảng 3: Hóa chất sử dụng

Nồi lên men 5 lít, 10 lít, 75 lít Nhật

Và các dụng cụ thông dụng khác như: đèn cồn, que cấy, que trang,

1.3 Môi trường nghiên cứu

1.3.1 Môi trường MRS (g/l):

Các môi trường nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn

Lactobacillus acidophilus (L.acidophilus) được sử dụng theo công thức dưới đây

Các môi trường nuôi cấy, giữ giống và nghiên cứu các đặc tính của vi khuẩn

Bacillus subtilis (B.subtilis) được sử dụng theo công thức dưới đây

Bảng 6: Môi trường nhân chủng, nuôi cấy và cấy đếm (môi trường LB)

26

Phương pháp nghiên cứu

2.1 Lựa chọn một số thông số lên men chủ yếu

2.1.1 Kiểm tra pH thích hợp cho sự sinh trưởng

Tiến hành pha môi trường LB đối với chủng Bacillus subtilis ( môi trường MRS đối với chủng Lactobacillus acidophilus) sau đó dùng hóa chất H3PO4 (20 %) và NaOH (0.5M) để đưa môi trường với thể tích 60 ml/ bình về các mức pH môi trường: 2; 3.0; 3.5; 4.0; 4.5;5.0; 5.5; 6.0; 6.5; 7.0; 7.5; 8.0; 8.5; 9.0 Bổ sung 1 ml

chủng vào các bình thí nghiệm, nuôi trong vòng 46-48 giờ trong máy lắc ổn nhiệt

2.1.2 Kiểm tra nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng

Xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng ở các nhiệt độ:25; 30; 35; 37; 40;

45oC

Pha môi trường thích hợp rồi đưa vào 10 bình tam giác với thể tích 60ml/ bình Cho 1ml chủng vào các bình thí nghiệm, mỗi bình tam giác trong số 10 bình tam giác đã cho chủng được nuôi trong vòng 48 giờ với các mức nhiệt độ tương ứng, nuôi lắc 150 vòng/phút Trong thời gian nuôi cấy thử nghiệm tiến hành kiểm tra khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD 12 tiếng một lần kể từ tiếng thứ 24 sau khi bổ sung chủng vi sinh vật

2.1.3 Lựa chọn tỷ lệ chủng giống

Tiến hành thí nghiệm trên nồi lên men 5 lít nhằm xác định tỷ lệ chủng giống thích hợp sao cho thời gian lên men giảm và mật độ vi sinh vật trong dịch lên men đạt cao nhất Thể tích lên men được cố định là 2 lít Chủng giống được lấy từ ống lạnh sâu sau đó được chuyển vào bình tam giác 250 ml có chứa 150 ml môi trường

thích hợp (môi trường LB đối với chủng B.subtilis và môi trường MRS đối với chủng L.acidophilus Chủng được nuôi lắc theo thời gian tới 2/3 pha sinh trưởng

sau đó được đem đi kiểm tra OD và chia ra theo thể tích lên men từ 1% tới 10 % thể

so sánh kết quả giữa các mẻ lên men và đánh giá

2.1.5 Lựa chọn tốc độ sục khí thích hợp

B.subtilis là một chủng hiếu khí, trong quá trình lên men rất cần chú ý tới

điều này Tiến hành thí nghiệm trên nồi lên men 5 lít với 3 lít môi trường, chủng giống được cấp cố định 5% theo thể tích, điều kiện nhiệt độ, pH môi trường cố định trong từng thí nghiệm Điều chỉnh tốc độ sục khí trong từng thí nghiệm lần lượt là 0,

5, 10, 15, 20 lít/phút Theo dõi quá trình lên men, tiến hành so sánh và đánh giá kết quả giữa các mẻ lên men

2.1.6 Lựa chọn thời gian lên men

Tiến hành thí nghiệm trên nồi lên men 5 lít với 3 lít môi trường thích hợp Chủng giống được cấp cố định 5% theo thể tích, điều kiện nhiệt độ, pH môi trường phù hợp với từng chủng nghiên cứu Tiến hành thu dịch kiểm theo từng thời điểm

và lập đường cong sinh trưởng cho từng chủng

2.2 Xây dựng đường chuẩn OD và mật độ

Cách tiến hành: Nuôi cấy chủng trên môi trường thích hợp với

Sau 24 giờ nuôi cấy đem ly tâm thu tế bào, bỏ dịch Bổ sung nước muối sinh

lý vô trùng đến 1/10 thể tích ban đầu (dịch 10)

Từ dịch 10 tiến hành pha loãng với muối sinh lý ở các độ pha loãng 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 Lần lượt gọi là dịch 0, dịch 1, dịch 2, dịch 3

Đo OD và cấy đếm dịch các dịch tương ứng rồi dựng đường chuẩn OD và mật độ

Chủng giống chuẩn của bảo tàng giống vi sinh vật giữ ở điều kiện lạnh sâu

được hoạt hóa bằng cách nhân vào bình tam giác thể tích 250ml chứa 150 – 200ml

môi trường nuôi cấy thích hợp, nuôi lắc ở tốc độ và nhiệt độ thích hợp với từng

chủng

Sau 18 – 24 giờ tiến hành lấy mẫu nhuộm soi kiểm tra độ thuần chủng của

giống đồng thời đo OD và pH để chuẩn bị nuôi trên nồi lên men 75 lít

B2: Nuôi cấy trên nồi lên men 75 lít

Tiệt trùng nồi bằng hơi ở nhiệt độ 121 oC/ 20 phút

Tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 110 oC ± 1/ 30 phút

Làm nguội môi trường đến nhiệt độ nuôi cấy, cho chủng giống được nhân từ

29

bình tam giác ở trên vào nồi lên men, đặt chế độ khuấy, khí, nhiệt độ mong muốn Lấy mẫu kiểm tra OD và pH tại thời điểm sau chuyền chủng (0 giờ)

Sau 6 giờ lấy mẫu, nhuộm soi để kiểm tra độ thuần chủng

Sau 6 giờ lên men cứ 2 giờ lấy mẫu đo OD, pH

Đối với chủng Bacillus subtilis: khi tỷ lệ bào tử đạt ≥ 85% thì dừng lên men và

tiến hành thu sinh khối

Đối với chủng Lactobacillus acidopilus: khi pH dịch nuôi cấy ≤ 4.0 thì dừng

quá trình lên men và tiến hành thu sinh khối

B3: Cô đặc dịch lên men

Cô đặc dịch lên men bằng một trong hai phương pháp: lọc tiếp tuyến, ly tâm

B4: Trộn cơ chất

Sinh khối sau cô đặc được trộn với chất mang phù hợp (là chất bảo vệ tế bào, chống lại quá trình làm khô, làm lạnh phá vỡ tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển, bảo quản và sử dụng)

B5: Làm khô

Hỗn hợp chất mang và sinh khối được làm khô bằng máy đông khô nhằm bảo quản sản phẩm được thời gian dài và đảm bảo chất lượng sản phẩm

B6: Kiểm tra sản phẩm sau đông khô

Sản phẩm sau đông khô có dạng bột Kiểm tra mật độ vi sinh vật sống bằng phương pháp cấy gạt trên đĩa thạch

Cân chính xác 3g sản phẩm dạng bột vào ống fancol (V = 50ml), bổ sung dung dịch PBS (dung dịch muối sinh lý) vừa đủ 30g tức pha loãng tới 10-1, đem đi hoàn nguyên trong máy lắc ổn nhiệt (37oC, 150v/p) khoảng 15 – 30 phút Pha loãng dung dịch trên đến 10-n theo cách sau:[4]

30

Hình 3: Các bước pha loãng dung dịch huyền phù vi sinh vật

Sau khi pha loãng dung dịch trên tới 10-n , dùng pipet hút ra V(ml) dịch pha loãng, cấy trang ra đĩa thạch LB( MRS) số mũ mong muốn, ủ trong tủ ấm 37oC qua

đêm rồi đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa và tính được số lượng Bacillus

subtilis( Lactobacillus acidophilus) sống:

A = X : V : df

Trong đó: A là tổng số vi sinh vật/ g sản phẩm

X là số CFU/ đĩa thạch

V là thể tích dịch lấy ra từ ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-n

2.4 Lên men bán liên tục với chủng Bacillus subtilis

Bổ sung 150 ml giống vào nồi lên men 10 lít (Marubishi) có 4.8-4.9 lít môi trường LB đã được thanh trùng để đạt tổng thể tích là 5 lít Quá trình lên men được chia làm 2 giai doạn:

Giai đoạn 1: mục đích nhằm hoạt hóa chủng thêm 1 cấp nữa Duy trì điều kiện cấp khí ( 2.5lít/phút), tốc độ khuấy (250vòng/phút), nhiệt độ môi trường 370C,

cố định pH=8 trong suốt quá trình nuôi cấy Giai đoạn 1 kéo dài trong 3 giờ nuôi thì chuyển sang giai đoạn tiếp theo

Giai đoạn 2: Mục đích để quần thể vi khuẩn tăng sinh khối, đường được bổ

31

sung trực tiếp vào môi trường duy trì ở hàm lượng 3 g/l, sục khí 2.5-3.0 lít/phút, khuấy 200 - 400 vòng/phút Trong quá trình nuối cấy lấy mẫu để phân tích OD 600 Quá trình lên men kết thúc khi tỷ lệ bào tử trong dịch nuôi cấy đạt trên 80%, giá trị

OD tăng chậm hoặc không tăng, thời gian vào khoảng 20- 24 giờ

Hình 4: Sơ đồ mô tả phương pháp lên men bán liên tục (Fed-batch cultivation)

(A) và liên tục (Continuous cultivation) (B)

2.5 Nghiên cứu thiết lập các chất mang thích hợp cho từng chủng vi sinh vật

2.5.1 Xây dựng công thức chất mang cho chủng Bacillus subtilis

Tiến hành thử nghiệm trộn sinh khối sau khi cô đặc của chủng B.subtilis với

các loại cơ chất khác nhau được chọn làm giá thể Bảng thống kê sau đây cho ta biết

tỷ lệ các cơ chất được chọn trong thí nghiệm