Vai trò của mô hình chăn nuôi tại hộ gia đình trong việc lan tràn vi khuẩn kháng kháng sinh trong cộng đồng

Nội dung của đề tài - Tối ưu hoá quy trình phân lập và xác định E.coli sinh ESBL tại điều kiện - Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm vi khuẩn E.coli sinh ESBL trong phân người và vật nuôi

I Đặt vấn đề

1 Giới thiệu

Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn đã trở thành một vấn đề mang ý nghĩasức khỏe cộng đồng Vi khuẩn kháng thuốc hiện nay làm chết ít nhất 50.000 ngườimỗi năm trên khắp châu Âu, nước Mỹ, và hàng trăm nghìn người trên các khu vựckhác Do hiện tượng kháng thuốc lượng kháng sinh được sử dụng trong phòng, chữabệnh cho người trên toàn cầu đã tăng g ần 40% từ năm 2000 đến 2010 [15] Chính từmối quan ngại này, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã chọn chủ đề cho ngày Sứckhỏe toàn cầu năm 2011 với thông điệp: “Kháng thuốc; Không hành động hôm nay,không có phương pháp điều trị ngày mai”

Báo cáo năm 2014 của tổ chức Y tế thế giới đưa vi khuẩn Escherichia coli

kháng cephalosporin thế hệ thứ ba, bao gồm cả kháng kháng sinh beta-lactam(ESBL) phổ rộng và fluoroquinolon vào danh sách những vi khuẩn kháng khángsinh quan trọng và cần có các phương pháp kiểm soát [26]

Enzym phân hủy beta-lactam phổ rộng (ESBL) tìm thấy lần đầu tiên năm

1983 tại Đức Hiện nay, enzym beta-lactam mới thường gặp nhất là ESBL nhóm

TEM, SHV và CTX-M Những enzym này được tìm thấy chủ yếu ở Klebsiella spp

và Escherichia coli với các tính chất đề kháng với các kháng sinh thế hệ mới:

ceftazidime, ceftriaxone, aztreonam, và oxyimino-beta-lactam khác CTX-M lànhóm ESBL lớn thứ hai và ngày càng trở nên quan trọng Nhiều nghiên cứu chothấy các đột biến của CTX-M lan truyền rộng rãi hơn so với các đột biến của TEM

và SHV, các biến thể của CTX-M cũng phổ biến ở nhiều quốc gia khác nhau Có 5nhóm lớn của CTX-M bao gồm: CTX-M 1,2,8,9 và 25 [15] Các type của nhómCTX-M rất khác nhau tùy theo từng vùng trên thế giới

Khi các chủng vi khuẩn sinh ESBL thì đồng nghĩa với việc chúng là gánhnặng thực sự trong điều trị nhiễm trùng trực khuẩn gram (-) Những vi khuẩn sinhESBL có thể mắc do lây truyền từ người sang người, hoặc do được chọn lọc quaviệc dùng kháng sinh Nhờ mang những men này mà vi khuẩn có khả năng kháng

lại các kháng sinh trước đây đã từng tiêu diệt nó Các kết quả nghiên cứu trên thếgiới đều mô tả một bức tranh chung về sự gia tăng nhanh chóng của các trực khuẩnđường ruột sinh ESBL

E.coli tồn tại tự nhiên trong môi trường, thực phẩm và đường tiêu hóa của người và động vật Đa số các chủng E.coli không gây bệnh, có một số chủng lại có

khả năng gây ngộ độc thực phẩm, nhiễm khuẩn tiêu hóa, tiết niệu, nhiễm trùng

máu E.coli lây nhiễm có thể do vô tình ăn hoặc uống phải hoặc do lây từ người

sang người qua tiếp xúc Các nghiên cứu đã chỉ ra thực phẩm có nguồn gốc độngvật và gia súc gia cầm nuôi làm thực phẩm có thể là nguồn lây nhiễm vi khuẩn

E.coli sinh ESBL sang người Chăn nuôi gia súc gia cầm ở Việt Nam bước đầu

cũng đã có những quy mô công nghiệp vừa và nhỏ nhưng chủ yếu vẫn là tại hộ giađình Trong khi đó, người dân chưa có đầy đủ kiến thức và thực hành đúng về chănnuôi an toàn Người chăn nuôi đã dùng kháng sinh như một “thần dược” mà khôngnghĩ đến hậu quả Họ dùng kháng sinh không chỉ để phòng và điều trị bệnh nhiễmkhuẩn mà còn được dùng với mục đích hỗ trợ tăng trưởng Điều này là một trongnhững nguyên nhân gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một tăng

cao tại Việt Nam Từ những cơ sở trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Vai trò của

mô hình chăn nuôi t ại hộ gia đình trong việc lan tràn vi khuẩn kháng kháng sinh trong cộng đồng”.

2 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu chung: Tìm hiểu sự lan tràn của vi khuẩn kháng kháng sinh loạiESBL trong cộng đồng hộ gia đình với mô hình chăn nuôi gà trang trại vừa và nhỏ.Mục tiêu cụ thể:

1 Tối ưu hoá quy trình phân lập và xác định E coli sinh ESBL tại điều kiện

phòng thí nghiệm

2 Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm vi khuẩn E coli sinh ESBL trong phân

người và vật nuôi tại các hộ gia đình với hai mô hình chăn nuôi trang trại vừa vànhỏ

3 Đánh giá sự tương đồng về mặt di truyền của các chủng E coli sinh ESBL

phân lập từ hai mô hình chăn nuôi bằng phương pháp dịch tễ học phân tử

3 Nội dung của đề tài

- Tối ưu hoá quy trình phân lập và xác định E.coli sinh ESBL tại điều kiện

- Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm vi khuẩn E.coli sinh ESBL trong phân

người và vật nuôi tại hộ gia đình

 Phân lập được các vi khuẩn E.coli sinh ESBL từ phân người và phân gà.

 Kỹ thuật PCR phát hiện gen kháng kháng sinh CTX-M nhóm 1,2,8,9

 Giải trình tự gen tìm blaCTX-M

 Tính đa kháng thuốc của các chủng phân lập được

1.2 Quá trình lịch sử ra đời các loại kháng sinh và sự đề kháng kháng sinh

Hình 1: Lịch sử ra đời của các nhóm kháng sinh chính [26]

Năm 1906, Paul Ehrlich, một nhà hóa học người Đức quan tâm về lĩnh vựckhoa học hoá trị liệu, đã tìm ra cấu trúc hóa học của atoxyl Từ đó ông đã thửnghiệm điều trị cho chuột và xây dựng lý thuyết ”viên đạn thần kỳ”, lý thuyết đãgiúp ông giành giải Nobel năm 1908 Năm 1909, Paul Ehrlich và cộng sự đã pháthiện ra chất Salvarsan, có khả năng chống lại vi khuẩn gây bệnh giang mai, nhưng

chưa thực sự an toàn cho người sử dụng

Năm 1928, ở bệnh viện Saint Marie, Fleming đã phát hiện ra sự kiện nấm

Pencillium có khả năng diệt được Staphylococcus aureus Năm 1940 nhóm nghiên

cứu ở Oxford đã tinh chế được penicillin và mở ra kỷ nguyên dùng kháng sinh đểđiều trị bệnh nhiễm trùng [1]

Cho đến những năm 1970, nhiều loại thuốc kháng khuẩn mới được phát triển

Các phân lớp hoàn toàn mới cuối cùng của thuốc kháng sinh được phát hiện trongnhững năm 1980

1.3 Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh

Hình 2: Các đích tác đ ộng của kháng sinh trên tế bào vi khuẩn

1.3.1 Ức chế sinh tổng hợp vách

Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp bộ khung peptidoglycan (murein)làm cho vi khuẩn sinh ra sẽ không có vách và do đó dễ bị tiêu diệt, ví dụ kháng sinhnhóm beta-lactam, vancomycin [1]

1.3.2 Gây rối loạn chức năng màng nguyên tương

Chức năng quan trọng nhất của màng nguyên sinh chất đối với tế bào là thẩmthấu chọn lọc; khi kháng sinh tác động vào màng sinh chất sẽ làm cho các thànhphần trong bào tương của vi khuẩn bị thoát ra ngoài làm cho nước từ bên ngoài môi

trường vào trong, dẫn đến chết; ví dụ polymyxin, colistin [1]

1.3.3 Ức chế sinh tổng hợp protein

Kháng sinh tác động lên các tiểu phần của riboxom ở vi khuẩn Kháng sinhgắn vào tiểu phần 30S (streptomycin) sẽ ngăn cản hoạt động của ARN thông tinhoặc ức chế chức năng của ARN vận chuyển (như tetracycline) Kháng sinh gắn vàotiểu phần 50S như erythromycin, chloramphenicol, làm cản trở sự liên kết, hìnhthành các chuỗi acid amin tạo phân tử Protein cần thiết cho tế bào sống [1]

1.3.4 Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic

Kháng sinh có thể ngăn cản sự sao chép của ADN mẹ tạo ADN con nhưnhóm quinolon hoặc gắn ARN-polymerase ngăn cản sinh tổng hợp ARN nhưrifampicin hoặc bằng cách ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết để

ngăn cản hình thành nên các nucleotide như sulfamid và trimethorpim

Như vậy, mỗi kháng sinh chỉ tác động lên một điểm nhất định trong thành

phần cấu tạo, ảnh hưởng đến một khâu nhất định trong các phản ứng sinh học khácnhau của tế bào vi khuẩn, dẫn đến ngừng trệ sự sinh trưởng và phát triển của tếbào Nếu vi khuẩn không bị ly giải hoặc bị nắm bắt (thực bào) tiêu diệt, thì khikhông còn tác động của kháng sinh (ngừng thuốc) vi khuẩn sẽ có thể hồi phục trởlại (reversible) [1]

Chỉ 10 năm sau khi kháng sinh được sử dụng rộng rãi đã phát hiện hiện

tượng kháng chất kháng sinh của nhiều loại vi khuẩn (Bảng 1)

Bảng 1: Các mốc thời gian phát hiện đề kháng kháng sinh[25]

2 Vi khuẩn kháng thuốc

2.1 Định nghĩa vi khuẩn kháng thuốc

Là hiện tượng vi khuẩn có khả năng phát triển trong sự có mặt của thuốchoặc các chất hóa học mà ở nồng độ bình thường có thể ức chế sự phát triển của nó[29]

2.2 Phân loại kháng thuốc

Có hai kiểu kháng thuốc: Kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc thu được.Kháng thuốc tự nhiên là một đặc trưng của từng chủng vi sinh vật nhất địnhđối với một số kháng sinh nhất định nào đó Tính chất này đã có sẵn trước khi sửdụng các kháng sinh đó Điều này liên quan đến phổ tác dụng của kháng sinh, có thểđặc trưng cho từng loài Kháng thuốc tự nhiên là thông tin di truyền có sẵn trongnhiễm sắc thể Về mặt sinh hoá có cơ chế quan trọng: đó là tính thấm của tế bào và

sự thiếu vắng phân tử đích [3]

Kháng thuốc thu được xuất hiện trong chọn lọc tự nhiên các chủng đề khángcủa quần thể vi sinh nhạy cảm khi sử dụng kháng sinh Một vi sinh vật trở thành

kháng thuốc khi có thể phát triển được với hàm lượng cao đáng kể của kháng sinh

ấy so với quần thể vi sinh vật mà nó có nguồn gốc Khi mức độ đề kháng tăng lên,chúng thoát khỏi sự điều trị bệnh không chữa được – đề kháng lâm sàng [3]

Về mặt di truyền học, kháng thuốc mới nhận có thể là do sự thay đổi gennhiễm sắc thể (đột biến nhiễm sắc thể), có thể do tiếp nhận gen plasmid (đề khángplasmid hay ngoài nhiễm sắc thể)

Kháng thuốc do đột biến nhiễm sắc thể: Dưới tác dụng của kháng sinh việctiêu diệt các vi khuẩn mẫn cảm tạo ra sự tuyển chọn ngẫu nhiên các đột biến mớixuất hiện, làm cho vi khuẩn có khả năng phát triển nhân lên Đột biến kiểu này ít ổnđịnh và ít di truyền Kiểu đột biến này chịu ảnh hưởng của từng nhóm kháng sinh.Kiểu kháng thuốc này chiếm khoảng 10% tổng số vi sinh vật kháng thuốc, xuất hiệnchủ yếu đối với các kháng sinh: aminosid, chloramphenicol… và các kháng sinh tácdụng với các Mycobacteria

Kháng thuốc plasmid: là kiểu kháng thuốc rất phổ biến, chiếm 90% số vi sinhvật kháng thuốc Kháng thuốc plasmid là hiện tượng đa kháng thuốc do nhân tố R(Resitance factor-plasmid) Nhân tố R chính là các plasmid chứa các gen điều khiểntính kháng thuốc Các gen này thông qua các cơ chế di truyền – tải nạp, biến nạp,tiếp hợp – chuyển tải thông tin di truyền kháng thuốc từ tế bào này sang tế bàokhác, loài vi khuẩn này sang loài vi khuẩn khác

Hiện tượng kháng chéo là hiện tượng vi khuẩn khi kháng một kháng sinh thìđồng thời kháng luôn một số kháng sinh khác có cấu trúc tương tự Trong thực tếlâm sàng đã phân l ập được các chủng vi khuẩn mang một kiểu xác định thể khángthuốc do plasmid giống nhau kháng lại ampicillin, chloramphenicol và cả

trimotoprim/ sulfametoxezol Plasmid này được truyền từ E.coli sang cho Salmonella (nhờ tiếp hợp).

Quá trình truyền chất liệu di truyền – nhân tố R theo cơ chế tiếp hợp xảy ratrong 3 giai đoạn:

- Giai đoạn tiếp cận, tạo giao nạp

- Giai đoạn bơm vật liệu di truyền qua cầu giao nạp

- Giai đoạn tái tổ hợp vật liệu di truyền ở tế bào nhân tạo thành hệ vô tínhkháng thuốc của vi sinh vật.

Nhân tố R gốm 2 phần: phần xác định tính kháng thuốc (R-determinant) vàphần truyền tải gen kháng thuốc (Resistance transfere factor) Các nhân tố R-plasmid là những đơn vị di truyền ngoài nhiễm sắc thể, bao gồm những phân tửADN dạng vòng khép kín có độ lớn khác và có khả năng tự sao chép, tồn tại trongcác tế bào vi khuẩn và nấm men Plasmid quyết định nhiều đặc tính sinh lý của vikhuẩn Người ta đã biết 29 kiểu plasmid khác nhau xác định 35 kiểu kháng khángsinh và các chế phẩm hoá trị liệu khác [3]

3 Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh trên thế giới và xu hướng

Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới năm 2014 [25], có 7 loại vi khuẩnkháng kháng sinh đang hiện hành và được quan tâm

 Escherichia coli: kháng cephalosporin thế hệ thứ ba, bao gồm cả kháng

beta-lactam phổ rộng (ESBL) và fluoroquinolon;

 Klebsiella pneumoniae: kháng cephalosporin thế hệ thứ ba, bao gồm cả

kháng beta-lactam phổ rộng (ESBL) và carbapenem;

 Staphylococcus aureus: kháng thuốc kháng khuẩn beta-lactam (methicillin, methicillin-resistant S aureus [MRSA]);

 Streptococcus pneumoniae: kháng hoặc nhạy cảm với penicillin (hoặc

cả hai);

 Nontyphoidal Salmonella (NTS): kháng fluoroquinolon;

 Các loài Shigella: kháng fluoroquinolon;

 Neisseria gonorrhoeae: giảm tính nhạy cảm cephalosporin thế hệ thứ

nhiễm trùng máu gây ra bởi các chủng Staphylococcus aureus kháng methicillin

(MRSA), ở các nước này thấy tỉ lệ kháng gần 50% [EARS_NET 2013]

Lượng kháng sinh được sử dụng trong phòng, chữa bệnh cho người trên toàncầu đã tăng g ần 40% từ năm 2000 đến 2010

Về tác động trong tương lai của vi khuẩn kháng thuốc, dựa trên giả thuyếtkháng thuốc tăng cao và tăng trưởng kinh tế đến năm 2050, mỗi năm có 10 triệungười chết do vi khuẩn kháng thuốc [15]

Hình 3 Ước tính số ca tử vong mỗi năm do vi khuẩn kháng kháng sinh

so với các căn nguyên gây chết khác [15]

Hình 4 Ước tính số người chết vì vi khuẩng kháng kháng sinh mỗi năm,

tính vào năm 2050 trên toàn thế giới [15]

4 Tình hình vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam

Theo báo cáo năm 2008-2009 của Bộ Y tế Việt Nam phối hợp với Dự án Hợptác toàn cầu về kháng kháng sinh (GARP-Viet Nam) và Đơn vị Nghiên cứu lâmsàng ĐH Oxford [2]

Tỉ lệ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Gram âm:

Biểu đồ 1 Tỉ lệ kháng sinh của các chủng Gram âm tại Việt Nam [2]

Năm 2009, nghiên cứu đã công bố 30-70% các vi khuẩn gram âm đượcphân lập từ bệnh viện kháng với các kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 và 4, xấp xỉ40-60% kháng với các kháng sinh nhóm aminoglycoside và fluoroquinolon Gần40% các chủng Acinetobacter giảm nhạy cảm với imipenem [2]

Tình hình về sử dụng kháng sinh trong điều trị

Tại tất cả các bệnh viện, kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 chiếm một phầnđáng kể trong tổng chi phí về thuốc kháng sinh(39.5%) Các nhóm kháng sinh khácchiếm một phần tương đối cao trong tổng chi phí bao gồm: carbapenem (12.3%),cephalosporin thế hệ 2 (11.8%), penicillin phối hợp với chất ức chế enzym beta-lactam (6.7%) và fluoroquinolon (6.5%) Mặc dù carbapenem ít được sử dụng hơncác kháng sinh sinh khác nhưng giá của các kháng sinh nhóm này tương đối cao dẫnđến chi phí cho nhóm kháng sinh này chiếm một phần đáng kể trong tổng chi phí vềthuốc kháng sinh tại các bệnh viện ở Việt Nam [2]

Biểu đồ 2 Chi phí cho việc sử dụng kháng sinh tại các bệnh viện [2]

Như vậy, chi phí trung bình cho việc sử dụng thuốc kháng sinh của mỗi bệnhviện ở Việt Nam trong năm 2008 là 1,93 triệu Đôla Mỹ, trong khi thu nhập bình

quân đầu người hàng năm là 1.024 Đôla Mỹ và tổng thu nhập quốc dân khoảng 77,7

tỷ Đôla Mỹ Con số này phản ánh thực trạng chi phí cho việc dùng thuốc kháng sinhtrong điều trị là một gánh nặng kinh tế đối với ngân sách quốc gia dành cho y tế [2]

Tỉ lệ kháng kháng sinh của Escherichia coli

E coli giảm nhạy cảm với cephlosporin thế hệ 3 và có tỉ lệ kháng cao với

cotrimoxazole dao động từ 60-80% tại hầu hết các bệnh viện [2]

Biểu đồ 3 Tỉ lệ kháng của E.coli với một số kháng sinh thường dùng

trong điều trị [2]

5 Thực hành sử dụng kháng sinh ở Việt Nam

Một nghiên cứu dựa trên cộng đồng được tiến hành năm 2003 cho thấy rằng,78% kháng sinh được mua tại các nhà thuốc tư nhân mà không có đơn, 67% thamkhảo tư vấn dược sỹ trước khi sử dụng và 11% tự quyết định về việc dùng thuốc; chỉ

có 27% nhân viên dược có kiến thức đúng về kháng sinh và kháng kháng sinh [2]

Đã có các qui chế về việc cấm bán thuốc kháng sinh không có đơn, tuy nhiên cácqui chế này đến nay vẫn chưa có hiệu lực Đối với trẻ bệnh, các bà mẹ thường tựmua thuốc điều trị [2] Năm 1999 kháng sinh được sử dụng phổ biến nhất bao

áp lực về thời gian thăm khám, thiếu kiến thức, thiếu khả năng chẩn đoán, lợinhuận kinh tế đối với người kê đơn Một thách thức lớn là xác định và thay đổi cấutrúc khuyến khích đối với việc kê đơn không hợp lý Hơn nữa, chi phí mà ngườibệnh phải tự chi trả chiếm tỉ trọng lớn trong tổng chi phí y tế, do đó người dân có xuhướng tìm kiếm cách thức rẻ nhất cho việc chăm sóc sức khoẻ [2].

Một lượng lớn dược phẩm được sử dụng trên động vật bao gồm kháng sinh,vitamin và các thuốc diệt ký sinh trùng Trong đó, kháng sinh chiếm phần lớn nhất(70% trong tổng số thuốc) được sử dụng trên động vật [2]

Theo báo cáo của Bộ Nông Nghiệp tình hình sử dụng kháng sinh trong chănnuôi chưa hợp lý Việc lựa chọn kháng sinh và liều dùng được quyết định chủ yếudựa trên kinh nghiệm của chủ hộ (44%), 33% theo hướng dẫn của bác sỹ thú y,17% theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các chủ hộ chăn nuôi không tuân thủ theoqui chế về việc ngừng sử dụng kháng sinh trước khi thu hoạch sản phẩm từ độngvật [2]

Trong chăn nuôi, kháng sinh được sử dụng rộng rãi với mục đích kích thíchtăng trưởng “nhằm giúp động vật tiêu hoá thức ăn dễ dàng, giúp phát triển khoẻmạnh”, hoặc phòng bệnh và điều trị

6. Escherichia coli và E coli sinh enzym beta-lactam phổ rộng

6.1 Giới thiệu về vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885 Chi E.coli gồm nhiều loài Trong đó, E.coli có vai trò quan trọng nhất E.coli là trực khuẩn Gram

âm, hầu hết có long roi E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, hiếu kị khí tuỳ tiện, lên men nhiều loại đường và có sinh hơi E.coli

có cả 3 nhóm kháng nguyên: kháng nguyên O gồm gần 160 yếu tố, kháng nguyên Kđược chia thành 3 loại: A, B và L; kháng nguyên H gồm hơn 50 yếu tố Dựa vào

cấu trúc kháng nguyên, E.coli được chia thành các tuýp huyết thanh Với sự tổ hợp

của các yếu tố kháng nguyên sẽ có rất nhiều tuýp huyết thanh khác nhau, mỗi tuýphuyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K

Dựa vào tính chất gây bệnh, E.coli được chia thành các loại:

EPEC ( Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột.

ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột.

EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột.

EAEC (Enteroadherent E.coli): E.coli bám dính đường ruột.

EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột.

Trong đường tiêu hoá, E.coli chiếm khoảng 80% các vi khuẩn hiếu khí Nhưng E.coli cũng là vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nó đứng đầu trong các vi khuẩn gây ỉa

chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên

gây nhiễm khuẩn huyết E.coli có thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm

màng não, nhiễm khuẩn vết thương [1]

Vi khuẩn hội sinh và gây bệnh E coli có thể phân loại thành bốn nhóm chính

khác nhau: A, B1, B2 và D dựa vào 3 gien đánh dấu chính là chuA, yjaA andTspE4.C2 [7] Gần đây dữ liệu từ phân tích giải trình tự gien đa điểm (loci)(multilocus sequence typing) cho thấy 4 nhóm chính có thể được chia nhỏ hơn

thành 7 nhóm bao gồm: A0, A1, B1, B22, B23, D1 and D2 Ở người,

chủng E.coli nhóm A chiếm ưu thế (40,5%), tiếp theo là các chủng B2 (25,5%),

trong khi các chủng B1 và D (khoảng 17% mỗi nhóm) ít thường ít gặp hơn Ở động

vật, E.coli nhóm B1 (41%) là phổ biến nhất, tiếp theo là nhóm A (22%), B2 (21%),

và ít phổ biến nhất là D (16%) [8] Vi khuẩn E Coli A và B1 thường là các vi khuẩn

hội sinh không mang gen độc tính, tồn tại trong ruột già của người và động vật,cũng như ở trong môi trường Ngược lại, nhóm B2 và nhóm D, thường là nhữngchủng gây bệnh và mang gen mã hóa độc lực (virulent factors) gây bệnh ngoàiđường ruột (ví dụ: nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm não…)

hơn so với nhóm A và B1 [16] Sự phân bố của các nhóm E.coli trên người và động

vật phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn uống, khối lượng cơ thể, và cấu trúc ruột củavật chủ

thành 7 nhóm bao gồm: A0, A1, B1, B22, B23, D1 and D2 Ở người,

chủng E.coli nhóm A chiếm ưu thế (40,5%), tiếp theo là các chủng B2 (25,5%),

trong khi các chủng B1 và D (khoảng 17% mỗi nhóm) ít thường ít gặp hơn Ở động

vật, E.coli nhóm B1 (41%) là phổ biến nhất, tiếp theo là nhóm A (22%), B2 (21%),

và ít phổ biến nhất là D (16%) [8] Vi khuẩn E Coli A và B1 thường là các vi khuẩn

hội sinh không mang gen độc tính, tồn tại trong ruột già của người và động vật,cũng như ở trong môi trường Ngược lại, nhóm B2 và nhóm D, thường là nhữngchủng gây bệnh và mang gen mã hóa độc lực (virulent factors) gây bệnh ngoàiđường ruột (ví dụ: nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm não…)

hơn so với nhóm A và B1 [16] Sự phân bố của các nhóm E.coli trên người và động

vật phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn uống, khối lượng cơ thể, và cấu trúc ruột củavật chủ

thành 7 nhóm bao gồm: A0, A1, B1, B22, B23, D1 and D2 Ở người,

chủng E.coli nhóm A chiếm ưu thế (40,5%), tiếp theo là các chủng B2 (25,5%),

trong khi các chủng B1 và D (khoảng 17% mỗi nhóm) ít thường ít gặp hơn Ở động

vật, E.coli nhóm B1 (41%) là phổ biến nhất, tiếp theo là nhóm A (22%), B2 (21%),

và ít phổ biến nhất là D (16%) [8] Vi khuẩn E Coli A và B1 thường là các vi khuẩn

hội sinh không mang gen độc tính, tồn tại trong ruột già của người và động vật,cũng như ở trong môi trường Ngược lại, nhóm B2 và nhóm D, thường là nhữngchủng gây bệnh và mang gen mã hóa độc lực (virulent factors) gây bệnh ngoàiđường ruột (ví dụ: nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm não…)

hơn so với nhóm A và B1 [16] Sự phân bố của các nhóm E.coli trên người và động

vật phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn uống, khối lượng cơ thể, và cấu trúc ruột củavật chủ

thành 7 nhóm bao gồm: A0, A1, B1, B22, B23, D1 and D2 Ở người,

chủng E.coli nhóm A chiếm ưu thế (40,5%), tiếp theo là các chủng B2 (25,5%),

trong khi các chủng B1 và D (khoảng 17% mỗi nhóm) ít thường ít gặp hơn Ở động

vật, E.coli nhóm B1 (41%) là phổ biến nhất, tiếp theo là nhóm A (22%), B2 (21%),

và ít phổ biến nhất là D (16%) [8] Vi khuẩn E Coli A và B1 thường là các vi khuẩn

hội sinh không mang gen độc tính, tồn tại trong ruột già của người và động vật,cũng như ở trong môi trường Ngược lại, nhóm B2 và nhóm D, thường là nhữngchủng gây bệnh và mang gen mã hóa độc lực (virulent factors) gây bệnh ngoàiđường ruột (ví dụ: nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn máu, viêm não…)

hơn so với nhóm A và B1 [16] Sự phân bố của các nhóm E.coli trên người và động

vật phụ thuộc vào khí hậu, chế độ ăn uống, khối lượng cơ thể, và cấu trúc ruột củavật chủ

vào các nhóm penicillin và cephalosporin [13] Từ 1970 tới nay, một loạt các cấutrúc khác đã được mô tả và phân nhóm theo vòng cấu trúc như sau [9].

-β-Lactam có chứa vòng 5 cạnh bão hòa

 β-Lactam chứa vòng thiazolidine gọi là penam

 β-Lactam chứa vòng pyrrolidine gọi là carbapenam

 β-Lactam có chứa nhân oxazolidine gọi là oxapenam hoặc clavam

- β-Lactam có chứa vòng 5 cạnh không bão hòa

 β-Lactam chứa vòng 2,3-dihydrothiazole được gọi là penem

 β-Lactam chứa vòng 2,3-dihydro-1H-pyrrole được gọi là carbapenem

- β-Lactam có chứa vòng 6 cạnh không bão hòa

 β-Lactam chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine được gọi làcephem

 β-Lactam chứa vòng 1,2,3,4-tetrahydropyridine được gọi làcarbacephem

 β-Lactam chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-oxazine được gọi làoxacephem

- β-Lactam không chứa nhân monobactam

Hình 6 Các nhóm cấu trúc Beta-lactam 6.2.2 Enzym β-lactam

Enzym beta-lactama (β-lactamse) là các enzym được sinh ra bởi một số vikhuẩn kháng các kháng sinh β-Lactam như penicillin, cephamycin, vàcarbapenem, … Enzym Beta-lactam kháng kháng sinh bằng cách phá vỡ cấu trúccủa kháng sinh Thông qua quá trình thủy phân, các enzyme lactam phá vỡ vòng β-Lactam mở, khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử

Có 3 loại là: Enzym lactam phổ rộng (ESBL), AmpC-type lactamase và Carbapenemase

beta-18

Hình 6 Các nhóm cấu trúc Beta-lactam 6.2.2 Enzym β-lactam

Enzym beta-lactama (β-lactamse) là các enzym được sinh ra bởi một số vikhuẩn kháng các kháng sinh β-Lactam như penicillin, cephamycin, vàcarbapenem, … Enzym Beta-lactam kháng kháng sinh bằng cách phá vỡ cấu trúccủa kháng sinh Thông qua quá trình thủy phân, các enzyme lactam phá vỡ vòng β-Lactam mở, khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử

Có 3 loại là: Enzym lactam phổ rộng (ESBL), AmpC-type lactamase và Carbapenemase

beta-18

Hình 6 Các nhóm cấu trúc Beta-lactam 6.2.2 Enzym β-lactam

Enzym beta-lactama (β-lactamse) là các enzym được sinh ra bởi một số vikhuẩn kháng các kháng sinh β-Lactam như penicillin, cephamycin, vàcarbapenem, … Enzym Beta-lactam kháng kháng sinh bằng cách phá vỡ cấu trúccủa kháng sinh Thông qua quá trình thủy phân, các enzyme lactam phá vỡ vòng β-Lactam mở, khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử

Có 3 loại là: Enzym lactam phổ rộng (ESBL), AmpC-type lactamase và Carbapenemase

beta-18

Hình 6 Các nhóm cấu trúc Beta-lactam 6.2.2 Enzym β-lactam

Enzym beta-lactama (β-lactamse) là các enzym được sinh ra bởi một số vikhuẩn kháng các kháng sinh β-Lactam như penicillin, cephamycin, vàcarbapenem, … Enzym Beta-lactam kháng kháng sinh bằng cách phá vỡ cấu trúccủa kháng sinh Thông qua quá trình thủy phân, các enzyme lactam phá vỡ vòng β-Lactam mở, khử hoạt tính kháng khuẩn của phân tử

Có 3 loại là: Enzym lactam phổ rộng (ESBL), AmpC-type lactamase và Carbapenemase

beta-6.2.2.1 Enzym beta-lactam phổ rộng

Năm 1983 lần đầu tiên phát hiện ra enzym beta-lactam phổ rộng từ chủng vi

khuẩn K pneumonia mang gen đột biến của SHV-1ở Đức Enzyme này có thể thủy

phân oxyimino-cephalosporin và được gọi SHV-2 ESBL là enzyme beta-lactamthủy phân cephalosporin phổ rộng Những cephalosporin bao gồm cefotaxime,ceftriaxone và ceftazidime, cũng như aztreonam oxyimino-monobactam Các gensinh ESBL thường được mã hóa trên plasmid của vi khuẩn

Phân loại ESBL: TEM, SHV, CTX-M, OXA và một số loại khác.

TEM : TEM-1 là một trong những enzyme beta-lactam thường gặp nhất ở vi

khuẩn Gram âm 90% TEM-1kháng ampicillin được phát hiện ở vi khuẩn E coli, ngoài ra còn phát hiện thấy kháng ampicillin và penicillin trong H influenzae và N gonorrhoeae TEM loại enzyme beta-lactam thường được tìm thấy trong E coli, K pneumoniae và cũng đư ợc tìm thấy ở các loài khác của vi khuẩn Gram âm khác với

tần số ngày càng tăng Các axit amin thay thế ở vị trí 104, 164, 238, 240 và sinh racác kiểu hình ESBL, nhưng ESBL phổ rộng thường có nhiều hơn một sự thay thếamino acid Dựa trên sự kết hợp khác nhau của các thay thế amino acid, hiện có 140enzyme TEM-l Trong đó TEM-10, TEM-12, và TEM-26 là một trong những phổbiến nhất tại Hoa Kỳ

SHV : SHV-1 có đến 68% các axit amin giống với TEM-1 và có một cấutrúc tổng thể gần giống nhau Các SHV-1 beta-lactam thường được tìm thấy trong

K pneumoniae ESBL trong nhóm này cũng có những thay đổi axit amin phổ biến

nhất tại các vị trí 238 và 240 Hiện nay có đến 60 loại SHV được tìm thấy, trong đóSHV-5 và SHV-12 là một trong những phổ biến nhất

CTX-M : Các enzym này được đặt tên riêng vì các tác động lớn của chúngđối với cefotaxime hơn so với chất oxyimino-beta-lactam khác (ví dụ, ceftazidim,ceftriaxon, hoặc cefepim) Thay vì phát sinh do đột biến, nhóm này đại diện choviệc các plasmid thu nhặt lại của các gen sản sinh enzym beta-lactam thường được

tìm thấy trên các nhiễm sắc thể của loài Kluyvera Nhóm enzym này không có sự

liên quan chặt chẽ đến TEM hoặc SHV beta-lactam Chúng chủ yếu được tìm thấy

trong các chủng Salmonella enterica serovar Typhimurium và E coli, nhưng cũng

đã được mô tả trong các loài khác của Enterobacteriaceae[11] Enzym này được phát hiện lần đầu tiên ở vi khuẩn E coli từ Munich, Đức vào năm 1989 Các

enzyme này thủy phân cefotaxime hơn so với ceftazidim, do đó tên CTX-M(cefotaximase, Munich) Hiện nay đã bi ết đến hơn 128 CTX-M enzym Loại enzymnày được phân làm 5 nhóm dựa trên sự tương đồng về các amino acid Các thànhviên trong cùng nhóm có sự tương đồng > 94% Các nhóm khác nhau thì có sựtương đồng ≤ 90% [24]

Hình 7 Phân nhóm CTX-M [6]

OXA: Các enzym này được đặt tên OXA vì chúng ưu tiên thủy phân oxacillin

và cloxacillin Những enzyme kháng với ceftazidime và ít được ức chế bởi acid

clavulanic Chúng thường thấy ở P aeruginosa Không phải tất cả các enzym OXA

đều là ESBL.Trong số 244 OXA-type lactamase, ít nhất 16 OXA-type lactam được biết là có một kiểu hình ESBL

beta-Một số loại khác thuộc nhóm ESBL như:

SFO-1(Serratiafonticola),TLA-1(TLAhuicas(indiantribe)), BES-1 (Brazilian Extended-Spectrum ß-lactamase),GES-1 (Guyana Extended-Spectrum ß-lactamases), and BEL-1(BelgiumExtended-spectrumß-Lactamase)

6.2.2.3 Carbapenemase

Carbapenemase là một nhóm đa dạng của β-lactamase đang hoạt động khôngchỉ kháng lại các oxyimino-cephalosporin và cephamycins mà còn kháng lạicarbapenem

7 Thực trạng vi khuẩn sinh enzyme beta-lactam phổ rộng trên thế giới

Cho đến những năm 1990, phần lớn các ESBL phân lập được xác định trong lâmsàng ở người là SHV hoặc TEM Gần một thập kỷ sau đó, ESBL và AmpC beta-lactam đã xuất hiện trên toàn thế giới Hiện nay, CTX-M enzyme đã trở thành loại

phổ biến nhất của ESBL Một số nghiên cứu đã cho thấy sự xuất hiện của E.coli

sinh ESBL/AmpC ở động vật làm thực phẩm, và các chủng có liên quan từ các độngvật gần gũi với con người Năm 2002, phân lập được vi khuẩn mang gen blaCTX-M-14,blaCTX-M-2và blaCMY-2từ gia cầm khỏe mạnh tại Nhật Bản Và sự xuất hiện của cácloại ESBL khác nhau ở lợn và gia súc không lâu sau đó.

Số liệu thống kê của C.Ewers và cộng sự về tỷ lệ nhiễm ESBL ở 3 khu vực(Châu Á, châu Âu, Mỹ) và 4 vật chủ (Người, động vật nuôi trong gia đì nh, gia cầm,lợn) năm 2012 cho thấy có sự phân bố khác nhau giữa các vùng miền và giữa cácvật chủ [12]

Biểu đồ 4 Phân bố của các nhóm gen bla CTX-M trên thế giới [12]

Biểu đổ 4 cho thấy các nhóm gen thường gặp nhất là blaCTX-M-1, blaCTX-M-14,blaCTX-M-15, blaSHV-12, và blaCMY-2 Trong đó gen blaCTX-M-14, blaCTX-M-15có sự khácbiệt ở các khu vực địa lý khác nhau Gen blaCTX-M-14là một trong những loại beta-lactam phổ biến nhất ở động vật gần gũi với con người, gia cầm ở châu Á (30-33%),

và gia súc, lợn (14%) Ở châu Âu, gen blaCTX-M-14 ít phổ biến trong chăn nuôi 7%) và thậm chí còn không xuất hiện ở động vật gần gũi với con người Gen blaCTX- M-15chỉ phát hiện ở gia cầm ở các quốc gia châu Âu với số lượng không đáng kể,trong khi ở động vật gần gũi với con người tỷ lệ là 15% và bò/lợn là 8% Ở cácnước châu Á và Mĩ, gen blaCTX-M-15hiện diện trong tất cả các nhóm nghiên cứu GenblaCTX-M-1phổ biến rộng rãi các loài động vật ở châu Âu (động vật gần gũi với conngười: 28%, thịt gia cầm: 28%, gia súc và lợn: 72%), tuy nhiên ít được báo cáo ởcác khu vực và môi trường sống khác Ngược lại, gen blaCTX-M-1từ E coli chỉ chiếm

(4-7% ở người khu vực châu Âu Tuy nhiên, hai nghiên cứu mới đây của Hà Lan chothấy các blaCTX-M-1là loại ESBL phổ biến nhất ở người khỏe mạnh, gia cầm và thịt

gà bán lẻ [12]

Tháng 11 năm 2014, Benjamin Lazarus và cộng sự đã tổng hợp các dữ liệu từ

2301 tóm tắt và 34 bài báo để tìm hiểu xem sự lan truyền vi khuẩn gây độc ngoài

đường ruột Escherichia coli (ESCR-EC) kháng cephalosporin từ động vật dùng làm

thực phẩm (food-producing animals-FPAs) đến con người Trong đó, gia cầm ở HàLan đã được cho là một trong những nguồn có khả năng gây nhiễm sang con người

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng vi khuẩn E.coli gây bệnh ngoài đường ruột và

vi khuẩn E.coli phân lập được từ gia cầm có sự truyền lẫn nhau các yếu tố độc lực.

Vì vậy, các chủng kháng thuốc có khả năng chuyển gen gây nguy cơ truyền nhiễm

từ nguồn gia cầm sang con người [4]

Vi khuẩn sinh ESBL đã gia tăng m ột cách nhanh chóng trên toàn cầu trongmột thập kỷ qua (Biểu đồ 5) [15]

Biểu đồ 5 Tốc độ gia tăng của vi khuẩn sinh ESBL trên toàn thế giới[15]

Trong vòng 10 năm từ 2001 đến 2011, ở Châu Âu và châu Mỹ tỷ lệ vi khuẩnsinh ESBL chỉ tăng nhẹ và dao động dưới 10% Châu Phi và khu vực Tây Thái BìnhDương có tỷ lệ cao hơn, khoảng 20% Tuy nhiên một con số đáng báo động cho khuvực Đông Địa Trung Hải và Đông Nam Á, năm 2011, tỷ lệ này lên đến mức 60-

70% Trong đó, vi khuẩn E.coli chiếm đa số và gen CTX-M là phổ biến nhất [15].

Theo ước tính của WHO về số người khoẻ mạnh trong cộng đồng nhiễm vikhuẩn sinh ESBL ở các khu vực :

8 Thực trạng vi khuẩn sinh enzyme beta-lactam phổ rộng ở Việt Nam

Trong nghiên cứu của Thi Thu Hao Van và cộng sự năm 2004, từ 180 mẫu thịt,gia cầm, động vật có vỏ và 43 mẫu phân gà ở Hồ Chí Minh đã phân lập được 99

mẫu có vi khuẩn E coli 84% kháng với một hoặc nhiều thuốc kháng sinh, và đa

kháng (định nghĩa là kháng ít nhất 3 loại thuốc kháng sinh khác nhau) Tỷ lệ đakháng đã lên đ ến 89,5% trong các chủng phân lập từ thịt gà, 95% trong phân gà và75% trong thịt lợn Các kháng sinh bị kháng nhiều nhất là: tetracycline (77,8%),sulfafurazole (60,6%), ampicillin (50,5%), amoxicillin (50,5%), trimethoprim(51,5%), chloramphenicol (43,4%), streptomycin (39,4%), acid nalidixic (34,3%) vàgentamicin (24,2%) Ngoài ra, các chủng phân lập cũng kháng fluoroquinolone(ciprofloxacin 16,2%, norfloxacin 17,2%, và enrofloxacin 21,2%), đặc biệt vi khuẩn

E.coli phân lập từ gà có tỷ lệ kháng cao nhất (52,6-63,2%) Trong đó, 84,2% mẫu

phát hiện có mang gen TEM beta-lactam và 89,5% mang gen kháng tetracycline

tetA, tetB [24] Một nghiên cứu khác vào năm 2007, 180 mẫu thực phẩm tươi sống(thịt bò, thịt gà, thịt lợn và cá) ở thành phố Hồ Chí Minh đã đư ợc kiểm tra Kết quả

là hơn 90% mẫu phát hiện có E.coli với 83,8% kháng với ít nhất một thuốc kháng

72 chủng vi khuẩn E.coli và Klebsiella pneumoniae được thu thập ở bệnh viện Chợ

Rẫy và bệnh viện Thống Nhất, Hồ Chí Minh có hơn 80% mẫu kháng từ 4 đến 6kháng sinh Các gen blaCTX-M-15 và blaCTX-M-27 là phổ biến nhất, nằm trên plasmidvới kích thước 50-170 kb có khả năng chuyển gen [21]

Như vậy, tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam từ nguồn thực phẩm,

động vật, và con người khá cao, đặc biệt là tỷ lệ vi khuẩn E.coli sinh ESBL với loại

CTX-M Hơn thế nữa là các nghiên cứu cũng cho thấy các gen kháng kháng sinhnằm trên plasmid có khả năng chuyển gen, gây nguy cơ cao cho sự lan tràn vi khuẩnkháng kháng sinh trong cộng đồng

Hình 9 Mô hình các đường lây nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh [12]

Trên cơ sở những thông tin trên, nghiên cứu này chúng tôi tập trung tìm hiểu

mối tương quan giữa vi khuẩn E.coli mang gen CTX-M kháng kháng sinh ở gà và

người nuôi gà Ở Việt Nam, đặc biệt là khu vực phía Bắc, có hai mô hình chăn nuôi

gà tại hộ gia đình cung cấp thực phẩm điển hình là trang trại vừa tập trung với hàngnghìn con gà và hộ gia đình trang trại nhỏ với vài trăm con Nghiên cứu này sẽ so

sánh sự lan tràn vi khuẩn E.coli mang gen CTX-M kháng kháng sinh ở 2 mô hình

trên

Chương 2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Chọn chủ đích huyện Ba Vì, ngoại thành Hà Nội bởi các lý do sau: Ba Vì làmột trong những khu vực cung cấp thực phẩm cho trung tâm Hà Nội Nơi đây đặctrưng cho nông thôn phía Bắc: Thực phẩm khu vực này chủ yếu là tự cung tự cấp vàbán ra thị trường xung quanh Ngoài các hộ gia đình chăn nuôi gà nh ỏ lẻ, còn có các

hộ gia đình chăn nuôi v ới mô hình trang trại để cung cấp thực phẩm ra thị trường,

đó là mô hình trang trại nhỏ khoảng 100-200 con gà và mô hình trang trại vừa vớivài nghìn con Hai mô hình này tồn tại song song và phổ biến ở khu vực này.Qua khảo sát thực tế, chúng tôi đã lựa chọn 3 hộ gia đình có mô hình chănnuôi trang trại nhỏ và 1 hộ gia đình chăn nuôi mô hình trang trại vừa có trên địa bàn

để lấy mẫu nghiên cứu

2 Thiết kế nghiên cứu

Mô tả cắt ngang

3 Thời gian nghiên cứu

Các mẫu được thu thập làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau 6 tháng Lần 1: Tháng 6năm 2013, lần 2: Tháng 11 năm 2013, lần 3: Tháng 6 năm 2014

4 Đối tượng nghiên cứu

- Lấy mẫu phân của tất cả các thành viên ở hộ gia đình bao gồm cả ngừơilớn và trẻ nhỏ

- Lấy mẫu phân ở gà một cách ngẫu nhiên

Đây là một nghiên cứu mới ở Việt Nam, hiện tại chưa có số liệu công bố về tỷ

lệ vi khuẩn E.coli sinh ESBL ở người và gà trong hộ gia đình chăn nuôi Do đó,

nghiên cứu này lấy mẫu không xác xuất, chọn mẫu có chủ đích

- Mẫu thu thập ở (1) hộ gia đình có trang trại vừa Tổng số 38 mẫu phân gà

và 24 mẫu phân người

- Mẫu thu thập ở (3) hộ gia đình có trang trại nhỏ Tổng số 36 mẫu phân gà

và 51 mẫu phân người

6 Kỹ thuật lấy mẫu

Mẫu phân người: Tất cả các đối tượng nghiên cứ đều được cán bộ y tế tập

huấn kỹ thuật lấy mẫu Sau đó, đối tượng nghiên cứu tự lấy mẫu sử dụng tăm bônglấy mẫu có sẵn môi trường vận chuyển Carry- Blair

Hình 10: Que lấy mẫu

Mẫu phân gà: Bắt ngẫu nhiên từng con gà dùng tăm bông ngoáy hậu môn gà,

sau đó cho tăm bông vào ống thu thập mẫu

Tất cả mẫu được mã hóa, vận chuyển ngay về Phòng vi sinh vật thực phẩm vàsinh học phân tử- Viện Dinh dưỡng

7 Hóa chất, trang thiết bị và vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

7.1 Hóa chất

- Các loại thạch Macconkey, Mueller-Hinton, Seakem Gold

- Canh thang LB

- Kháng sinh cefotaxime

- Khoanh giấy kháng sinh: ceftazidime,30 μg (CAZ), cefotaxime,30 μg(CTX), Ceftazidime30 μg + Clavulanic Acid 10 μg (CAZ-CLA); Cefotaxime30 μg+ Clavulanic Acid, 10 μg (CTX-CLA), Ampicillin,10 μg (AMP), Streptomycin10μg(SM), Tetracycline 10μg (TC), Kanamycin 30μg (KM), Chloramphenicol30μg(CP), Gentamicin 10μg(GM), Trimethoprim 1.25 μg + Sulfamethoxazol 23.75

μg (SXT)Ciprofloxacin 5 μg (CPFX), Nalidixic acid 30 μg (NA), Fosfomycin200mcg (FOM), Cefoxitin 30 μg (CFX), Meropenem 10 μg (MEM)

- Các cặp mồi : CTX-M 1,2,8,9 , yjA, chuA, TspE4.C2, adk, fumC,gyrB, icd, mdh, purA, recA

- Bộ kit cho phản ứng PCR: enzyme Ex taq – TAKARA

- Bộ kit cho phản ứng Bigdye-PCR – TAKARA

- Bộ kit tách DNA

- Đệm BSA, TBE, NE, 10XH,TE, EDTA

- Dung dịch Sam, X-termination, Protease K, Sarkosyl, 2-propanol

- Enzyme XbaI, ApoI, PstI

- Phenylmethyl sulfomyl fluoride

- Redgel

- Ligation High ver.2

7.2 Thiết bị

- Máy PCR

- Máy giải trình tự gen ABI 3500

- Máy định danh tự động Vitek

- Máy dập khoanh giấy kháng sinh

- Máy PFGE Biorad II

- Máy đo hàm lượng DNA, nanodrop

- Máy ly tâm, máy voltek

8 Nội dung nghiên cứu và kỹ thuật xét nghiệm

8.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy

Theo trung tâm kiểm soát và phòng bệnh Hoa Kỳ (CDC), hàm lượng một sốkháng sinh sử dụng cho phân lập vi khuẩn kháng kháng sinh như sau [20]:

Bảng 2: Hàm lượng kháng sinh, vòng kháng khuẩn của một số loại

Bảng 3:Hàm lượng kháng sinh, vòng kháng khuẩn của một số loại

kháng sinh theo ASM [21]

Kích thước vòng kháng khuẩn MICs

Hiệp hội phòng thí nghiệm EU (European Union Reference

Laboratories-EURL) đưa ra hướng dẫn cho phân lập E.coli sinh ESBL và AmpC bằng thạch

Macconkey bổ sung 1 µg/ml cefotaxime [23]

Dựa trên các thông tin trên, chúng tôi quyết định sử dụng thạch Macconkey

bổ sung 1µg/ml cefotaxime để phân lập vi khuẩn E.coli sinh ESBL.

8.2 Khảo sát điều kiện chạy PCR

Sử dụng enzyme Extaq của hãng Takara cho các loại phản ứng PCR Trong

đó điều kiện nhiệt độ kéo dài chuỗi DNA là 72oC Khảo sát nhiệt độ gắn mồi

- Đối với CTX-M nhóm 1,2,8 khảo sát tại các dải nhiệt độ 48oC, 52oC

và 55oC

- Đối với CTX-M nhóm 9 khảo sát tại các dải nhiệt độ 55oC, 58oC và

60oC

Hiệp hội phòng thí nghiệm EU (European Union Reference

Laboratories-EURL) đưa ra hướng dẫn cho phân lập E.coli sinh ESBL và AmpC bằng thạch

Macconkey bổ sung 1 µg/ml cefotaxime [23]

Dựa trên các thông tin trên, chúng tôi quyết định sử dụng thạch Macconkey

bổ sung 1µg/ml cefotaxime để phân lập vi khuẩn E.coli sinh ESBL.

8.2 Khảo sát điều kiện chạy PCR

Sử dụng enzyme Extaq của hãng Takara cho các loại phản ứng PCR Trong

đó điều kiện nhiệt độ kéo dài chuỗi DNA là 72oC Khảo sát nhiệt độ gắn mồi

- Đối với CTX-M nhóm 1,2,8 khảo sát tại các dải nhiệt độ 48oC, 52oC

và 55oC

- Đối với CTX-M nhóm 9 khảo sát tại các dải nhiệt độ 55oC, 58oC và

60oC

Hiệp hội phòng thí nghiệm EU (European Union Reference

Laboratories-EURL) đưa ra hướng dẫn cho phân lập E.coli sinh ESBL và AmpC bằng thạch

Macconkey bổ sung 1 µg/ml cefotaxime [23]

Dựa trên các thông tin trên, chúng tôi quyết định sử dụng thạch Macconkey

bổ sung 1µg/ml cefotaxime để phân lập vi khuẩn E.coli sinh ESBL.

8.2 Khảo sát điều kiện chạy PCR

Sử dụng enzyme Extaq của hãng Takara cho các loại phản ứng PCR Trong

đó điều kiện nhiệt độ kéo dài chuỗi DNA là 72oC Khảo sát nhiệt độ gắn mồi

- Đối với CTX-M nhóm 1,2,8 khảo sát tại các dải nhiệt độ 48oC, 52oC

và 55oC

- Đối với CTX-M nhóm 9 khảo sát tại các dải nhiệt độ 55oC, 58oC và

60oC

Hiệp hội phòng thí nghiệm EU (European Union Reference

Laboratories-EURL) đưa ra hướng dẫn cho phân lập E.coli sinh ESBL và AmpC bằng thạch

Macconkey bổ sung 1 µg/ml cefotaxime [23]

Dựa trên các thông tin trên, chúng tôi quyết định sử dụng thạch Macconkey

bổ sung 1µg/ml cefotaxime để phân lập vi khuẩn E.coli sinh ESBL.

8.2 Khảo sát điều kiện chạy PCR

Sử dụng enzyme Extaq của hãng Takara cho các loại phản ứng PCR Trong

đó điều kiện nhiệt độ kéo dài chuỗi DNA là 72oC Khảo sát nhiệt độ gắn mồi

- Đối với CTX-M nhóm 1,2,8 khảo sát tại các dải nhiệt độ 48oC, 52oC

và 55oC

- Đối với CTX-M nhóm 9 khảo sát tại các dải nhiệt độ 55oC, 58oC và

60oC

8.3. Sàng lọc và định danh vi khuẩn E.coli sinh ESBL

Các mẫu sau khi thu thập về sẽ cấy trên thạch Macconkey có bổ sung 1µg/mlkháng sinh cefotaxime, ủ ở 37oC trong 18 đến 24 giờ

Lựa chọn khuẩn lạc để tăng sinh thuẩn chủng trên thạch LB Sau đó sử dụng

hệ thống máy định danh vi khuẩn tự động Vitek (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Pháp)

để định danh vi khuẩn Phân tích và lưu giữ các chủng thuần

Hình 11 Hệ thống định danh vi khuẩn Vitek

8.4 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán

Mức độ nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn được xác định bằng kỹ thuậtkhoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên đĩa dựa trên tiêu chuẩn CLSI, 2012 Chủng

chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 được tiến hành song song với các

chủng vi khuẩn thử nghiệm

Để xác định các chủng vi khuẩn E.coli sinh ESBL, sử dụng 4 khoanh giấy

kháng sinh: ceftazidime 30 μg (CAZ), cefotaxime,30 μg (CTX), Ceftazidime 30 μg+ Clavulanic Acid 10 μg (CAZ-CLA); Cefotaxime 30 μg + Clavulanic Acid, 10 μg(CTX-CLA)

Các chủng E coli sinh ESBL, sau đó được đánh giá tính nhạy cảm với 12 loại

kháng sinh thông dụng khác Ampicillin 10 μg (AMP), Streptomycin10μg (SM),Tetracycline 10μg (TC), Kanamycin 30μg (KM), Chloramphenicol 30μg(CP),Gentamicin 10μg (GM), Trimethoprim 1.25 μg + Sulfamethoxazol 23.75 μg (SXT),Ciprofloxacin 5 μg (CPFX), Nalidixic acid 30 μg (NA), Fosfomycin 200mcg(FOM), Cefoxitin 30 μg (CFX), Meropenem 10 μg (MEM)

Hình 12 Máy dập khoanh giấy kháng sinh

8.5 Xác định nhóm gen CTX-M và phân loại nguồn gốc phát sinh loài bằng

ở 10,000 vòng/phút trong 2 phút Thu lại dịch làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR

- Chứng dương là: các chủng đã được xác định mang gien đích (Chứng âm lànước tinh khiết)

- Sử dụng PCR đơn mồi cho kỹ thuật phát hiện gen CTX-M và kỹ thuật PCR

đa mồi cho phát hiện nguồn gốc phát sinh loài

- Các đoạn mồi đặc hiệu:

 Trình tự mồi cho kỹ thuật PCR phân nhóm CTX-M: