Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ trong chẩn đoán trước sinh các lệnh bội nhiễm sắc thể thường gặp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- LÊ THỊ LIỄU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ FISH TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LÊ THỊ LIỄU

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH)

TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LÊ THỊ LIỄU

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ (FISH)

TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

1 PGS TS Quản Lê Hà

2 BS Ngô Diễm Ngọc

Hà Nội - 2011

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến Phó Giáo sư Tiến sỹ Quản Lê Hà và Bác sỹ Ngô Diễm Ngọc, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đối với Ban giám hiệu trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học, các cán bộ, nhân viên Viện Đào tạo Sau đại học Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã dành cho tôi sự hỗ trợ

vô cùng quý báu trong quá trình học tập và làm luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các đồng nghiệp khoa Di truyền và Sinh học phân tử, Bệnh viện Nhi trung ương đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các bệnh nhi và các gia đình bệnh nhi, những người đã góp phần lớn nhất cho sự thành công trong đề tài của tôi

Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Lê Thị Liễu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi Các

số liệu được sử dụng tham khảo có nguồn trích dẫn rõ ràng, các kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực

Lê Thị Liễu

PAP-A Pregnancy associated plasma protein-A

SSC Saline Sodium Citrate

β-hCG β-human chorionic gonadotropin

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Lịch sử nghiên cứu 3 1.1.1 Thế giới: 3

1.1.2 Việt Nam 4

1.2 Chẩn đoán trước sinh 5 1.2.1 Khái niệm 5

1.2.2 Mục đích 5

1.2.3 Các chỉ định chẩn đoán di truyền trước sinh 6

1.2.3.1 Tuổi mẹ 6

1.2.3.2 Tiền sử mang thai 7

1.2.3.3 Hình ảnh siêu âm 7

1.2.3.4 Xét nghiệm sinh hóa 8

1.3 Một số bệnh di truyền liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể 9 1.3.1 Thể ba nhiễm 13 9

1.3.1.1 Nguyên nhân và tần số 9

1.3.1.2 Biểu hiện lâm sàng 9

1.3.2 Thể ba nhiễm 18 10

1.3.2.1 Nguyên nhân và tần số 10

1.3.2.2 Biểu hiện lâm sàng 11

1.3.3 Hội chứng Down 11

1.3.3.1 Nguyên nhân và tần số 11

1.3.3.2 Biểu hiện lâm sàng 12

1.3.4 Hội chứng Turner 12

1.3.4.1 Nguyên nhân và tần số 12

1.3.4.2 Biểu hiện lâm sàng 13

1.3.5 Hội chứng Kleinerfelter 13

1.3.5.1 Nguyên nhân và tần số 13

1.3.5.2 Biểu hiện lâm sàng 13

1.4 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) 14 1.4.2 Khái niệm 14

1.4.3 Nguyên lý 14

1.4.4 Các loại kỹ thuật FISH 15

1.4.5 Các loại ADN dò 16

1.4.6 Ứng dụng của kỹ thuật FISH 18

1.4.6.1 Chẩn đoán trước sinh 18

1.4.6.2 Phát hiện bất thường nhiễm sắc thể ở một số hội chứng di truyền.18 1.4.6.3 Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể trong ung thư 19

1.5 Các kỹ thuật di truyền khác 20 1.5.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch ối 20

1.5.2 Kỹ thuật QF-PCR 20

1.5.3 Kỹ thuật Multiplex Ligation Dependent Probes Amplification 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Đối tượng và địa điểm nghiên cứu 22 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất nghiên cứu 22 2.2.1 Trang thiết bị 22

2.2.2 Dụng cụ 22

2.2.3 Hóa chất 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Tư vấn trước chọc ối 23

2.3.2 Quy trình lấy mẫu dịch ối 23

2.3.2.1 Quy trình chọc hút dịch ối 23

2.3.2.2 Quy trình vận chuyển mẫu dịch ối 24

2.3.3 Kỹ thuật FISH trên mẫu dịch ối 24

2.3.4 Phân tích kết quả 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật FISH trong chẩn đoán

3.1.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý mẫu dịch ối 29

3.1.1.1 Nghiên cứu thời gian xử lý trypsin 30

3.1.1.2 Nghiên cứu thời gian xử lý KCl 0,56% 30

3.1.2 Nghiên cứu xác định lượng probe thích hợp 31

3.1.3 Nghiên cứu xác định nồng độ SSC thích hợp 32

3.2 Chẩn đoán trước sinh sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ 35 3.3 Đối chiếu kết quả FISH và kết quả phân tích NST từ tế bào ối 39 3.4 Đối chiếu kết quả của kỹ thuật FISH và kết quả sàng lọc ban đầu 43 KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 47

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Những hội chứng bất thường NST và tỷ lệ được phát hiện bằng kỹ thuật

FISH 19

Bảng 2.1 Màu tín hiệu của các đầu dò (probe) 26

Bảng 3.1 Kết quả nghiên cứu thời gian xử lý trypsin 30

Bảng 3.2 Kết quả nghiên cứu thời gian xử lý KCl 0,56% 31

Bảng 3.3 Kết quả nghiên cứu lượng probe sử dụng cho mỗi vùng lai 32

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu nồng độ SSC cho quá trình rửa sau lai 33

Bảng 3.5 Tuổi mẹ và tuần thai của các đối tượng nghiên cứu 35

Bảng 3.7 Đối chiếu kết quả FISH và kết quả phân tích NST từ tế bào ối 40

Bảng 3.8 Đối chiếu kết quả phân tích NST từ tế bào ối với 43

Bảng 3.9 Đối chiếu kết quả FISH với kết quả sàng lọc ban đầu 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Bộ Kit probe cho NST 13, 18, 21,X, Y (AneuVysion, Vysis) 4

Hình 1.2 Hình ảnh trẻ mắc hội chứng Patau 10

Hình 1.3 Khuôn mặt của trẻ mắc hội chứng Edward 11

Hình 1.4 Khuôn mặt của trẻ mắc hội chứng Down 12

Hình 1.5 Nguyên lý kỹ thuật FISH 15

Hình 1.6 Các loại kỹ thuật FISH 16

Hình 1.7 Kỹ thuật FISH 17

Hình 1.8 Kỹ thuật FISH phát hiện bất thường NST 18

Hình 1.9 Kỹ thuật FISH ứng dụng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp 20

Hình 2.1 Thủ thuật chọc hút dịch ối 24

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh 27

Hình 2.3 Sơ đồ nghiên cứu 28

Hình 3.1 Quy trình kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh 34

Hình 3.2 Hình ảnh kết quả kỹ thuật FISH (mẫu FAF.8) 37

Hình 3.3 Hình ảnh kết quả kỹ thuật FISH (mẫu FAF.5) 38

Hình 3.4 Hình ảnh kết quả kỹ thuật FISH (mẫu FAF.13) 39

Hình 3.5 Công thức NST (Karyotype) thai nhi bình thường 42

Hình 3.6 Công thức NST (Karyotype) thai nhi bất thường số lượng NST 42

MỞ ĐẦU

Bệnh di truyền là những bệnh liên quan đến bất thường của bộ máy di truyền ở mức độ tế bào là các nhiễm sắc thể (NST) hoặc ở mức độ phân tử là các gen Bất thường NST bao gồm bất thường về số lượng và bất thường về cấu trúc Trong đó, bất thường về số lượng NST chiếm ưu thế, và phần lớn là những lệch bội của các NST thường (NST 13, 18, 21) và NST giới (NST X, Y) Bất thường ở mức độ phân

tử chủ yếu do đột biến gen dẫn tới rối loạn về cấu trúc gen

Trẻ em sinh ra mắc các bệnh di truyền là một gánh nặng cho gia đình cũng như cho toàn xã hội Vì vậy, việc nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật để chẩn đoán trước sinh cho những thai phụ có nguy cơ cao và cho những gia đình có tiền sử sinh con mắc bệnh di truyền đang trở thành vấn đề cấp thiết nhằm nâng cao chất lượng

xã hội Hiện nay, cùng với sự tiến bộ của siêu âm trong chẩn đoán các dị tật về hình thể của thai nhi, các kỹ thuật hiện đại về di truyền, sinh học phân tử ngày càng phát triển và được ứng dụng để sàng lọc, chẩn đoán trước sinh các bệnh di truyền một cách hiệu quả

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH: Fluorescence in situ hybridization), là

kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và sinh học phân tử, sử dụng các đầu dò đặc hiệu lai với NST ở kỳ giữa, hoặc nhân tế bào ở gian kỳ, nhằm phát hiện các bất thường NST Kỹ thuật FISH được sử dụng trong chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện các lệch bội NST thường gặp, như hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edward, hội chứng Turner, hội chứng Kleinerfelter…

Trên thế giới, kỹ thuật FISH đã được nghiên cứu và ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh từ khá lâu Tuy nhiên, tại Việt Nam kỹ thuật FISH vẫn chưa được phổ biến rộng rãi Từ năm 2007, Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Bệnh viện Nhi trung ương là một trong các đơn vị đầu tiên ở miền Bắc đã nghiên cứu và triển khai

kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh

Dựa trên cở sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể thường gặp” với các nội dung sau:

1 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong chẩn đoán trước sinh các lệch bội nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X,

Thời kỳ tiền băng được mô tả đặc điểm bằng sự hình dung về nhiễm sắc thể người vào năm 1879 (Arnold 1879), sự tạo thành thuật ngữ “chromosome” (bắt nguồn từ “chroma” = màu sắc và “soma” = cơ thể) vào năm 1888 (Waldeyer 1888),

sự xác định chính xác số lượng NST người vào năm 1956 (Tijo và Levan 1956) [20] Năm 1959, Lejeune đã khám phá ra thể ba nhiễm 21 (trysomy 21) trong hội chứng Down, Ford và cộng sự cùng Jacobs và Strong khám phá ra bộ nhiễm sắc thể XXY của người bị hội chứng Klinerfelter và bộ nhiễm sắc thể XO của người bị hội chứng Turner

Thời kỳ băng NST bắt đầu với sự phát minh ra phương pháp nhuộm băng Q (Q – banding) của bác sỹ Lore Zech vào năm 1968 Những bất thường về cấu trúc NST như chuyển đoạn, đảo đoạn, mất đoạn, thêm đoạn được phát hiện nhiều hơn kể

từ đó Sau đó, phương pháp nhuộm băng G (G – banding) ra đời và được coi là tiêu chuẩn vàng của tất cả các kỹ thuật di truyền tế bào [15], [20]

Năm 1986, thí nghiệm đầu tiên sử dụng kỹ thuật di truyền tế bào phân tử được

áp dụng trên nhiễm sắc thể người đã đánh dấu sự bắt đầu của thời kỳ di truyền tế bào phân tử Kỹ thuật chính được sử dụng là kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) [20]

Năm 1993, Học viện di truyền Mỹ (American College of Medical Genetic) đã

áp dụng kỹ thuật FISH sử dụng cho chẩn đoán trước sinh [16]

Năm 1997, Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) đã công nhận bộ Kit probe cho NST 13, 18, 21, X, Y của hãng AneuVysion (Vysis) dùng cho chẩn

đoán trước sinh [16]

Hiện nay, kỹ thuật FISH được ứng dụng rộng rãi trên thế giới trong chẩn đoán trước sinh, chẩn đoán sau sinh một số bệnh di truyền, chẩn đoán ung thư

Cuối năm 2007, bệnh viện Từ Dũ, thành phố Hồ Chí Minh đã bắt đầu áp dụng

kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh một số bệnh di truyền [3]

Năm 2007, khoa Di truyền và Sinh học phân tử, bệnh viện Nhi trung ương đã nghiên cứu và áp dụng kỹ thuật FISH cho chẩn đoán trước sinh Hiện nay, khoa Di truyền và Sinh học phân tử, bệnh viện Nhi trung ương là đơn vị đầu tiên ở miền Bắc

đã triển khai thành công và sử dụng thường quy kỹ thuật FISH trong chẩn đoán trước sinh một số lệch bội NST thường gặp cho các thai phụ có nguy cơ cao [5], [6]

1.2 Chẩn đoán trước sinh

1.2.1 Khái niệm

Chẩn đoán trước sinh là chẩn đoán tình trạng của phôi thai trước khi trẻ được sinh ra Đây là một vấn đề được đặc biệt quan tâm trong chẩn đoán di truyền Có nhiều phương pháp chẩn đoán khác nhau

Chẩn đoán khác với sàng lọc trước sinh: chẩn đoán là xác định nguyên nhân, các bất thường của thai nhi, còn sàng lọc chỉ có giá trị xác định nguy cơ thai bị dị tật Sau khi sàng lọc, những trường hợp có nguy cơ cao bị dị tật, cần phải tiến hành các xét nghiệm chẩn đoán xác định trước khi có chỉ định [2]

1.2.2 Mục đích

Chẩn đoán trước sinh nhằm:

- Khẳng định cho những gia đình có nguy cơ về nguy cơ không bị bệnh của thai nhi khi có kết quả chẩn đoán là bình thường

- Cung cấp thông tin cho các cặp vợ chồng khi có chưa có những thông tin gia đình có nguy cơ bị bệnh, giúp cho họ có sự lựa chọn khi mang thai

- Giúp các cặp vợ chồng có sự chuẩn bị về tâm lý đối với việc sinh ra trẻ bị bệnh

- Giúp các bác sỹ, các cặp vợ chồng chuẩn bị kế hoạch cho cuộc đẻ, quản lý, chăm sóc thai nhi khi đã được chẩn đoán là bị bệnh

- Cung cấp thông tin cho các cặp vợ chồng có sự lựa chọn đối với các trường hợp thai nhi bị bệnh nặng có chỉ định đình chỉ mang thai

Có nhiều tranh luận xung quanh vấn đề đình chỉ thai Tuy nhiên, cũng cần lưu ý rằng, một tỷ lệ lớn các trường hợp chẩn đoán trước sinh cho kết quả bình thường và chỉ một số ít có chỉ định đình chỉ mang thai

Chẩn đoán trước sinh bao gồm cả các xét nghiệm sàng lọc và xét nghiệm chẩn đoán

1.2.3 Các chỉ định chẩn đoán di truyền trước sinh

1.2.3.1 Tuổi mẹ

Phụ nữ sinh con sau 35 tuổi có nguy cơ đẻ con bất thường cao hơn so với phụ

nữ trẻ tuổi hơn Nếu như nguy cơ nền (Risk background) sinh con bị Down của người phụ nữ ở độ tuổi 20 là 1/1000 thì nguy cơ của người ở tuổi 30 là 1/625 và tuổi trên 35 là 1/250 Vì vậy, các khuyến cáo kinh điển khuyên các phụ nữ có thai từ

35 tuổi trở lên nên làm xét nghiệm di truyền để chẩn đoán trước sinh [11] Tuy nhiên, nếu chỉ tính yếu tố mẹ cao tuổi để làm xét nghiệm sàng lọc trước sinh thì sẽ

bỏ sót nhiều trường hợp bị Down Thực tế chỉ có 30% trẻ bị Down sinh ra từ bà mẹ trên 35 tuổi, bởi họ chỉ chiếm 15% trong tống số các bà mẹ [11] Do vậy, việc sàng lọc một số hội chứng di truyền phổ biến được tiến hành thông qua siêu âm thai 12 tuần và xét nghiệm sàng lọc huyết thanh mẹ (test sàng lọc bộ hai- Double test hay test sàng lọc bộ ba- Triple test) được phối hợp sử dụng để tính nguy cơ thực sự sinh con bất thường về nhiễm sắc thể (NST) liên quan đến tuổi của mẹ Ví dụ, một phụ

nữ 28 tuổi có thai ở tuần 15, kết quả Triple test nguy cơ cao với Down có thể xem xét để chọc ối làm xét nghiệm nhiễm sắc thể, trong khi một người phụ nữ 35 tuổi có cùng tuổi thai nhưng kết quả Triple test chỉ mang nguy cơ của một người phụ nữ 20 tuổi thì không cần thiết phải làm các xét nghiệm dịch ối [13] Như vậy có thể tránh được một thủ thuật có tính xâm lấn, giảm nguy cơ cho mẹ và thai Với các tiến bộ của khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực siêu âm và các xét nghiệm sinh hóa, tuổi mẹ

đã không còn là chỉ định chính yếu trong chẩn đoán trước sinh và số trường hợp lệch bội NST đã được phát hiện nhiều và chính xác hơn

Một số trung tâm chẩn đoán trước sinh thực hiện xét nghiệm dịch ối cho những phụ nữ trẻ mang thai đôi Một người phụ nữ 32 tuổi, mang thai đôi khác

trứng, có nguy cơ sinh ít nhất một đứa con mắc hội chứng Down, tương đương với nguy cơ của một người phụ nữ 35 tuổi mang một thai Tuy nhiên, cần cân nhắc giữa nguy cơ sinh con bất thường ở người mang thai đôi và nguy cơ của quá trình chọc

ối, do tai biến chọc ối cao gấp đôi so với những trường hợp thai đơn [11]

1.2.3.2 Tiền sử mang thai

Những người có tiền sử sinh con bất thường về NST cần được tư vấn làm xét

nghiệm di truyền trước sinh Đối với thai phụ có tiền sử đẻ con bị Down, nguy cơ sinh con bị Down ở lần này tăng hơn so với người sinh con bình thường khác là 0,75% Như vậy nếu môt người 36 tuổi , có thai lần 2, lần đầu đẻ con bị Down thì nguy cơ sinh con Down sẽ được tính bằng : nguy cơ nền của tuổi 36 ( 0,5%) cộng với 0,75%, là 1,25 % (1/80)

Những người có tiền sử sảy thai, thai lưu nhiều lần cũng nên tư vấn làm xét nghiệm di truyền [12] Trường hợp mẹ có tiền sử thai lưu hoặc sinh con mang bất thường cấu trúc NST mới phát sinh (bố mẹ có công thức NST bình thường), thường không liên quan đến việc tăng tỷ lệ tái mắc ở các lần sinh sau Tuy nhiên, các xét nghiệm chẩn đoán trước sinh vẫn nên được chỉ định vì có nguy cơ bố mẹ mang các bất thường cấu trúc NST ở dạng khảm, dòng tế bào bất thường có tỷ lệ thấp Cả vợ

và chồng nên được làm công thức NST trước khi mang thai lần sau nếu cặp vợ chồng đó có tiền sử thai lưu hoặc sảy thai từ hai lần trở lên

1.2.3.3 Hình ảnh siêu âm

Siêu âm đo độ dày da gáy thai nhi ở tuần thứ 12-15 đang được Tổ chức Thai- Sản quốc tế (Fetal Mathernal Foundation) khuyến cáo và tích cực chuyển giao kỹ thuật để áp dụng tại nhiều quốc gia do giá trị sàng lọc bất thường cao Có nguy cơ thai nhi bị Down, dị tật thần kinh, dị tật tim mạch khi độ dày da gáy lớn hơn 2,5mm [12], [18] Ở tuổi thai sớm, độ dày da gáy >2,5 mm hay nang bạch huyết vùng cổ thai (Hygroma) là những yếu tố cần được xem xét để làm xét nghiệm NST Đối với tuổi thai lớn hơn (18-22 tuần), siêu âm hình thể thai có thể phát hiện những bất thường lớn về cấu trúc các cơ quan Cần chỉ định làm xét nghiệm di truyền xem các

dị tật này có kèm theo bất thường về NST hay không trước khi khuyên gia đình

đình chỉ hoặc giữ thai , bởi tiên lượng sẽ nặng nề hơn nhiều nếu trẻ có dị tật liên quan đến bất thường về NST Bất thường NST thường được phát hiện thấy ở những trường hợp có kết hợp nhiều dị tật bẩm sinh, bệnh lý của ống thần kinh, u nang mạch bạch huyết, dị tật tim, bất thường của chi, thoát vị ổ bụng, tắc tá tràng, giãn não thất, bộ mặt bất thường, hoặc kết hợp với thai chậm phát triển trong tử cung và

sự thay đổi của khối lượng nước ối [18] FISH cho hội chứng DiGeorge để tìm mất đoạn nhánh dài NST 22 nên được chỉ định nếu siêu âm phát hiện thấy thai nhi có bất thường về tim mạch

1.2.3.4 Xét nghiệm sinh hóa

Các chỉ số sinh hóa của huyết thanh mẹ trong ba tháng đầu hay ba tháng giữa thai kỳ có thể phản ánh nguy cơ sinh con mắc bất thường NST Xét nghiêm hai thông số (Double test) đo trong ba tháng đầu thai kỳ gồm chỉ số PAP-A (prenancy associated plasma protein-A) và β-hCG (β-human chorionic gonadotropin) Xét nghiệm ba thông số (Triple test) được làm trong ba tháng giữa thai kỳ (từ 15 đến 18 tuần) bao gồm α-fetoprotein (MSAFP), Estradiol không kết hợp và β- hCG tự do [18] Kết quả xét nghiệm cho biết nguy cơ sinh ra trẻ bị trisomy 21 (Hội chứng Down), trisomy 18 (Hội chứng Edward), nứt đốt sống và một số bất thường di truyền khác tương ứng với tuổi mẹ… Nhóm các thông số này có thể phát hiện được 60% các trường hợp thai mắc hội chứng Down, với tỷ lệ dương tính giả khoảng 5% Việc đo độ dày da gáy thai nhi được khuyến cáo thực hiện thường quy ở tuổi thai 12-15 tuần, thời gian chọc ối khoảng tuần thai 16 – 18 tuần [10] Sự phối hợp giữa

độ dày da gáy và Double test hoặc Triple test giúp tăng khả năng phát hiện hội

chứng Down và giảm bớt tỷ lệ dương tính giả

Nếu trong họ hàng có người mắc hội chứng Down (HC Down), không nhất thiết phải làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh, nhưng có thể có giá trị tiên lượng 97% trường hợp Down điển hình là có 3 NST số 21, xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho những lần sinh sau là không cần thiết [22] Nếu không có công thức NST của người mắc HC Down đó và họ là anh hoặc chị ruột của cặp vợ chồng thì nên làm công thức NST của thai phụ và chồng Nếu một cặp vợ chồng có quan hệ họ

hàng xa với người mắc HC Down, nguy cơ sinh con mắc HC Down của họ chỉ bằng với nguy cơ mắc HC Down trong quần thể Nếu một cặp vợ chồng được phát hiện

là người bình thường mang chuyển đoạn NST cân bằng của NST 21, cần thiết phải được làm chẩn đoán trước sinh Nếu một người có từ hai mối quan hệ trở lên với người mắc HC Down, nên tư vấn cho họ làm xét nghiệm chẩn đoán trước sinh

1.3 Một số bệnh di truyền liên quan đến lệch bội nhiễm sắc thể

Bệnh di truyền là những bệnh liên quan đến bất thường của bộ máy di truyền ở mức độ tế bào là các nhiễm sắc thể (NST) hoặc ở mức độ phân tử là các gen, trong

đó các bất thường NST chiếm khoảng 30% Bộ NST của người bình thường có 46 NST, xếp thành 22 cặp NST tương đồng, và 1 cặp NST giới, XX ở người nữ hoặc

XY ở người nam Bất thường NST bao gồm bất thường về số lượng và bất thường

về cấu trúc Trong đó, bất thường về số lượng NST chiếm ưu thế, và phần lớn là những lệch bội của các NST thường: Trisomy 13 gặp trong hội chứng Patau, Trysomy 18 gặp trong hội chứng Edward, Trysomy 21 gặp trong hội chứng Down

và của NST giới X: monosomy X gặp trong hội chứng Turner, XXY gặp trong hội

mẹ truyền cho hoặc mới phát sinh Sự xuất hiện thể ba nhiễm 13 liên quan chặt chẽ đến tuổi mẹ Trên 95% trường hợp thai mang thể ba nhiễm bị sẩy ngẫu nhiên trong thai kỳ

Tần số chung của thể ba nhiễm là 1/5000 – 1/10000 trẻ sinh

1.3.1.2 Biểu hiện lâm sàng

Trẻ có khuôn mặt điển hình với đầu nhỏ, mắt nhỏ, tai ở vị trí thấp và biến dạng Trẻ thường bị điếc, sứt môi hai bên, đôi khi bàn chân vẹo, 6 ngón ở bàn tay

hoặc bàn chân Thường có dị tật ở tim, ở ống tiêu hóa Tiên lượng khoảng 80% trẻ thể ba nhiễm này chết trong năm đầu Trong các trường hợp khảm, các biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và có thể sống lâu hơn [27]

Hình 1.2 Hình ảnh trẻ mắc hội chứng Patau (a): Khuôn mặt; (b): Bàn tay

thừa ngón sau trục

1.3.2 Thể ba nhiễm 18

1.3.2.1 Nguyên nhân và tần số

Thể ba nhiễm 18 (Hội chứng Edwards) được Edwards và cộng sự mô tả năm

1960 Thể tam nhiễm 18 là loại thể tam nhiễm được gặp phổ biến vào hàng thứ hai trong số các trường hợp thể tam nhiễm của NST thường Khoảng 80% là trường hợp thể ba nhiễm thuần: 47,XX(XY),+18 Khoảng 10% ở thể khảm: 46,XX(XY)/47,XX(XY),+18 Khoảng 10% ở thể chuyển đoạn hoặc thể ba nhiễm kép, ví dụ: 48,XXY,+18 [14]

Tuổi mẹ có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ sinh con thể ba nhiễm 18, tuổi bố cũng

có thể ảnh hưởng Trên 95% trường hợp thai mang thể tam nhiễm 18 bị sẩy ngẫu nhiên trong thai kỳ [27]

Tần số chung của thể ba nhiễm 18 là 1/4000 – 1/8000 trẻ sinh

1.3.2.2 Biểu hiện lâm sàng

Trẻ sinh ra thường nhẹ cân, thường đẻ non có trán hẹp, sọ dài và to, khe mắt hẹp, tai ở vị trí thấp, ít quăn và nhọn nên trông giống tai chồn, miệng bé, hàm nhỏ

và lùi ra sau Bàn tay rất đặc biệt: ngón cái quặp vào lòng bàn tay, bàn tay nắm lại, ngón trỏ chùm lên ngón nhẫn Bàn chân vẹo Hầu hết các trẻ này đều mắc các dị tật bẩm sinh quan trọng như tật tim bẩm sinh, thoát vị rốn, thoát vị hoành

Trẻ bị mắc thể ba nhiễm 18 tiên lượng rất xấu, thường chết ngay sau khi đẻ hoặc chỉ sống trung bình 10 tuần

Hình 1.3 Khuôn mặt của trẻ mắc hội chứng Edward (a): nhìn thẳng; (b): nhìn

nghiêng; (c): bàn tay với ngón trỏ đè lên ngón giữa

1.3.3 Hội chứng Down

1.3.3.1 Nguyên nhân và tần số

Hội chứng Down là trường hợp bất thường NST được gặp phổ biến nhất Năm

1846, Seguin lần đầu tiên mô tả những đặc điểm hình thái của bệnh với tên gọi

“Furfuraceous Idiocy” Năm 1959, Lejeune và cộng sự đã phát hiện ở những bệnh nhân mắc hội chứng Down có 47 NST và thừa một NST 21 [20]

Khoảng 92% trường hợp là thể ba nhiễm 21 thuần: 47,XX((XY),+21 Khoảng 2-3% trường hợp là thể khảm với 2 dòng tế bào: 46,XX(XY)/47,XX(XY),+21 [14] Khoảng 4% trường hợp là do chuyển đoạn không cân bằng với các NST tâm đầu khác trong bộ NST (hay gặp là NST 13,14,15 hoặc NST 21,22)

Tần số của hội chứng Down gặp khoảng 1/700-1/800 trẻ sơ sinh

Bên cạnh các nguyên nhân do tác động của các tác nhân trong môi trường, tuổi

mẹ có vai trò quan trọng đối với tỷ lệ con mắc bệnh Down Nguy cơ con bị mắc bệnh Down tăng nhanh theo tuổi mẹ [27]

1.3.3.2 Biểu hiện lâm sàng

Trẻ mắc hội chứng Down có khuôn mặt khá điển hình với đầu nhỏ, ngắn, mặt tròn, gốc mũi tẹt, khe mắt xếch, nếp quạt, lưỡi to, dầy, hay nứt nẻ, thường thè ra ngoài Tai nhỏ, có khi biến dạng, cổ ngắn, gáy phẳng rộng, 50% trẻ này có rãnh khỉ trong lòng bàn tay Trẻ thường gặp dị tật tim như thông liên thất, thông liên nhĩ,

dị tật ống tiêu hóa, chủ yếu là hẹp tá tràng, không hậu môn, phình to đại tràng Trẻ bị bệnh Down thường chết sớm vì tật của tim hoặc tật của ống tiêu hóa, thường bị nhiễm khuẩn, dễ cảm ứng với bệnh bạch cầu Bệnh nhân nam mắc hội chứng Down bị vô sinh, một số ít bệnh nhân nữ sinh được con

Hình 1.4 Khuôn mặt của trẻ mắc hội chứng Down (a): nhìn thằng; (b): nhìn

nghiêng; (c): bàn tay với rãnh khỉ

1.3.4 Hội chứng Turner

1.3.4.1 Nguyên nhân và tần số

Tần số xuất hiện hội chứng này là 1/5000 trong số trẻ gái sinh sống Bất thường NST ở những người mắc hội chứng Turner khá đa dạng Khoảng 50% bệnh nhân có karyotype 45,X Khoảng từ 30% đến 40% ở dưới dạng khảm, phổ biến là 46,XX/45,X, dạng 46,XY/45,X ít gặp hơn (khoảng 5%) Khoảng 10% đến 20%

bệnh nhân có bất thường NST X như mất đoạn một phần hoặc toàn bộ nhánh ngắn của NST X Sự đa dạng này giải thích sự khác biệt rất lớn trong biểu hiện kiểu hình của những người mắc hội chứng này [27]

1.3.4.2 Biểu hiện lâm sàng

Người mắc hội chứng này có kiểu hình là nữ với các biểu hiện đặc trưng sau: lùn cân đối, nhi hóa về giới tính và loạn sản buồng trứng, mang một số các dị tật như dị dạng ở đầu gối, cổ tay và bàn tay Bệnh nhân có khuôn mặt hình tam giác, lỗ tai ngoài quay về phía sau, cổ rộng và có “màng”, ngực rộng và có hình khiên Có thể quan sát thấy tình trạng phù bạch mạch ở bàn tay và bàn chân của trẻ mắc hội chứng này sau sinh Nhiều bệnh nhân bị bệnh tim bẩm sinh [14]

Bệnh nhân mắc hội chứng này có tuổi thọ bình thường, trừ những trường hợp

có tật nội quan nặng chết ở thời kỳ mới sinh Các bệnh nhân này thường thiểu năng trí tuệ nhẹ hoặc bình thường, hầu hết đều vô sinh, tuy nhiên có trường hợp có thai sinh con (gặp ở trạng thái khảm)

1.3.5 Hội chứng Kleinerfelter

1.3.5.1 Nguyên nhân và tần số

Hội chứng này được Kleinerfelter và cộng sự miêu tả vào năm 1942 Hội chứng được gặp với tần số 1/1000 trẻ sơ sinh nam, 50% trường hợp Klinefelter có NST X thừa xuất phát từ mẹ và có sự gia tăng tỉ lệ theo tuổi mẹ Dạng khảm được thấy trong khoảng 15% trường hợp Mặc dù biểu hiện kiểu hình tương đối nhẹ nhưng người ta ước tính có tối thiểu 50% số thai mang karyotype 47,XXY bị sẩy ngẫu nhiên [27]

1.3.5.2 Biểu hiện lâm sàng

Người nam mắc hội chứng này có xu hướng cao trên trung bình, tay và chân dài không cân đối với cơ thể Khám lâm sàng bệnh nhân sau tuổi dậy thì cho thấy tinh hoàn nhỏ và hầu hết đều bị vô sinh do teo các ống sinh tinh Biểu hiện vú lớn (gynecomasty) được thấy trên khoảng một phần ba bệnh nhân Mặc dù người nam mắc hội chứng Klinefelter thường không bị chậm phát triển trí tuệ nhưng cũng có

biểu hiện khó khăn về học và có trí thông minh dưới mức trung bình Do biểu hiện của hội chứng không rõ ràng nên phần lớn bệnh nhân được chẩn đoán muộn, thường là sau tuổi dậy thì và đôi khi bệnh nhân đến khám với lý do vô sinh

1.4 Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH)

1.4.2 Khái niệm

Lai huỳnh quang tại chỗ (FISH-Fluorecense in situ hybrydization) là một kỹ thuật trung gian giữa di truyền tế bào và di truyền phân tử, sử dụng một trình tự ngắn, đặc hiệu của chuỗi ADN sợi đơn (gọi là những mẫu dò, probe) được đánh dấu huỳnh quang để lai với NST ở kỳ giữa, hoặc nhân tế bào ở gian kỳ Qua quá trình lai của đầu dò với trình tự bổ sung có thể phát hiện và định vị được trình tự đó qua phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang [1], [9], [20]

1.4.3 Nguyên lý

FISH là kỹ thuật lai ADN nhưng không cần phải tách chiết ADN ra khỏi NST hoặc tế bào [9] Kỹ thuật FISH được tiến hành với các bước cơ bản sau [8]:

- Thu thập và xử lý mẫu

- Biến tính, lai ADN dò với ADN đích ngay trên tiêu bản

- Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm huỳnh quang

- Phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang

Kỹ thuật FISH có thể thực hiện trên nhân tế bào ở kỳ giữa hoặc ở gian kỳ không qua thời gian nuôi cấy tế bào [3]

- Interphase FISH: Được sử dụng để phát hiện nhanh các bất thường NST không

qua nuôi cấy Cặp mồi được gắn trực tiếp vào nhân tế bào ở kỳ đầu của quá trình phân bào, do đó interphase FISH không cho phép quan sát hình dạng của NST, và thường được sử dụng để phát hiện các bất thường số lượng NST ở tế bào bào thai trong chẩn đoán trước sinh do ưu thế về thời gian, có kết quả sau 24-48h

- Metaphase FISH: Cặp mồi được gắn vào các NST ở kỳ giữa, khi hình thái các

NST được nhận biết rõ ràng nhất Metaphase FISH thường đựoc dùng để khẳng

định các bất thường về số lượng và cấu trúc NST khi nghi ngờ có bất thường NST trên công thức nhiễm sắc thể

Hình 1.5 Nguyên lý kỹ thuật FISH [20]

1.4.4 Các loại kỹ thuật FISH

Thông thường, mỗi bất thường của một NST được xác định bằng một ADN dò đặc hiệu Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, kỹ thuật FISH đã được cải tiến bằng cách sử dụng phức hợp ADN dò (trong một ADN dò chứa phức hợp 2, 3 hoặc nhiều hơn đoạn dò cho 2,3…NST; mỗi đoạn dò của từng NST trong phức hợp được đánh dấu bằng những màu sắc khác nhau) Sử dụng phức hợp ADN dò có thể kiểm tra được đồng thời bất thường của một số NST trong cùng một tế bào (ví dụ như phức hợp ADN dò của NST 13,21 hay NST 18, X, Y) Như vậy, cùng một lần

thực hiện kỹ thuật FISH trên cùng một tế bào có thể phát hiện được bất thường NST của các NST khác nhau mang lại hiệu quả kinh tế lớn [25]

Ngoài kỹ thuật FISH thông thường còn có kỹ thuật mFISH (multicolor FISH) mFISH là kỹ thuật FISH nhiều màu, trong đó mỗi một NST được đánh dấu bằng một màu riêng biệt Đối với nam giới có 24 màu cho 24 NST (22 NST thường, NST

X, NST Y); còn nữ giới có 23 màu cho 23 NST (22 NST thường, NST X) [21] Hiện nay, còn có kỹ thuật mBand FISH (multicolor banding FISH) Đây là kỹ thuật FISH với nhiều băng màu cho phép xác định bất kỳ một thay đổi nào trên vị trí băng của NST, đặc biệt là những bất thường cấu trúc do đảo đoạn quanh tâm hoặc đảo đoạn gần tâm mà đối với kỹ thuật băng thông thường không thực hiện được

Hình 1.6 Các loại kỹ thuật FISH

- ADN dò đặc hiệu locus lai từng vùng của một NST: Loại ADN dò này chủ yếu phát hiện các đột biến gen, các rối loạn cấu trúc NST như: nhân đoạn nhỏ, mất đoạn nhỏ, mà phương pháp nhuộm băng không phát hiện được

- ADN dò toàn bộ một NST: ADN dò toàn bộ một NST là sự kết hợp của những ADN dò nhỏ hơn, mỗi ADN dò nhỏ hơn đó lai với một trình tự khác nhau dọc theo chiều dài của cùng một NST Điều này cho phép phân biệt các NST khác nhau dựa vào màu sắc của chúng Sử dụng thư viện ADN dò này các nhà khoa học

có thể nhuộm được toàn bộ NST Phương pháp này chủ yếu phát hiện rối loạn số lượng, cấu trúc NST (ví dụ khi phát hiện một phần NST này gắn thêm một phần NST khác trong trường hợp chuyển đoạn) [3]

Hình 1.7 Kỹ thuật FISH

1.4.6 Ứng dụng của kỹ thuật FISH

Kỹ thuật FISH được chỉ định trong các trường hợp

- Chẩn đoán trước sinh các bất thường số lượng NST ở thai nhi

- Phát hiện các mất đoạn nhỏ ở một số hội chứng di truyền

- Xác định các đoạn NST chưa rõ nguồn gốc

- Phát hiện các bất thường NST đặc hiệu trong ung thư

1.4.6.1 Chẩn đoán trước sinh

Kỹ thuật interphase FISH (FISH nhanh) được sử dụng để sàng lọc một số hội chứng di truyền thường gặp: hội chứng Down (trysomy 21), hội chứng Patau (trysomy 13), hội chứng Edward (trysomy 18), hội chứng Turner (monosomy

X), hội chứng Kleinerfelter (XXY)…

1.4.6.2 Phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể ở một số hội chứng di truyền

Hình 1.8 Kỹ thuật FISH phát hiện bất thường NST

Tỷ lệ gặp từ 1/5000 – 1/8000 trẻ đẻ sống, do mất một đoạn nhỏ trên nhiễm sắc thể tương ứng, không phát hiện được trên công thức nhiễm sắc thể thông

thường (standard) FISH giúp khẳng định các chẩn đoán lâm sàng, và chẩn đoán

trước sinh cho các gia đình có tiền sử sinh con mắc các hội chứng này [25] Những

hội chứng mất đoạn nhỏ và tỷ lệ phát hiện các mất đoạn này bằng kỹ thuật FISH được thể hiện ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Những hội chứng bất thường NST và tỷ lệ được phát hiện bằng kỹ

thuật FISH Hội chứng Vị trí Dấu hiệu lâm sàng Tỷ lệ phát hiện

Hội chứng Prader Willi 15q11.2

Chậm phát triển tinh thần Béo phì

Giảm năng tuyến sinh dục

70%

Hội chứng Angelman 15q11.2

Mất điều hòa Chậm phát triển tinh thần Cười không thích hợp

80%

Hội chứng DiGeorge 22q11.2

Bộ mặt bất thường Thiểu sản tuyến giáp, cận giáp

>95%

1.4.6.3 Phát hiện các bất thường NST đặc hiệu trong ung thư

- Bạch cầu cấp thể tủy hoặc thể lympho : đánh giá các thay đổi về nhiễm sắc

thể, đặc biệt sự có mặt của một số chuyển đọan đặc hiệu như chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 9 và 22 (Ph1), số 4 và 11, số 8 và 21… có giá trị phân loại và tiên lượng điều trị

- U nguyên bào thần kinh: đánh giá các thay đổi về NST, đặc biệt là sự lặp lại đoạn của gen NYMC, mất đoạn nhánh ngắn NST số 1, thêm đoạn nhánh dài NST số 7, có giá trị phân loại và tiên lượng điều trị

Hình 1.9 Kỹ thuật FISH ứng dụng trong chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp 1.5 Các kỹ thuật di truyền khác

1.5.1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch ối

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào dịch ối đã được công bố từ năm 1966 và trở thành thường quy từ thập niên 70 Karyotype từ tế bào dịch ối được xem là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán các bất thường về số lượng cũng như cấu trúc của nhiễm sắc thể thai nhi với độ chính xác cao [25]

Trong thời kỳ mang thai, các tế bào bong ra từ cơ thể của thai nhi được hòa lẫn trong dịch ối, và những tế bào này còn được gọi là các tế bào dịch ối Trong trường hợp người mẹ mang thai có nguy cơ cao sinh con mắc dị tật, các tế bào dịch

ối này được lấy ra để thực hiện các xét nghiệm di truyền

Các tế bào này được đem nuôi cấy trong các điều kiện thích hợp, sao cho chúng có thể bám dính tốt thành một lớp tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy Lớp tế bào này sau khi thu hoạch sẽ cho bộ nhiễm sắc thể của thai nhi Phân tích nhiễm sắc thể của thai nhi từ tế bào dịch ối là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong chẩn đoán trước sinh để phát hiện các bất thường liên quan đến bộ nhiễm sắc thể (NST)

1.5.2 Kỹ thuật QF-PCR

Kỹ thuật QF-PCR (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại ngắn (STR: Short Tandem Repeat) có tính đa hình cao trong dân số bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu có gắn huỳnh quang