Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phân hủy chất hoạt động bề mặt (las linear ankylbenzo sulfonate)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ****** HỒ BÍCH DUYÊN Đề tài: TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT LAS - LINEAR ANKYLBENZO SULFONATE

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

******

HỒ BÍCH DUYÊN

Đề tài:

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY

CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT (LAS - LINEAR

ANKYLBENZO SULFONATE)

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS NGUYỄN LAN HƯƠNG

HÀ NỘI - 2011

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu luận văn khoa học của tôi Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực, các số liệu tính toán được hoàn thành chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

Để hoàn thành luận văn thạc sỹ này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết

ơn và kính trọng sâu sắc tới TS Nguyễn Lan Hương – Giảng viên Bộ môn

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa

Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn đang công tác tại phòng thí nghiệm Viện CNSH và CNTP đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại phòng

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, tháng 09 năm 2011

Học viên

Hồ Bích Duyên i Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 1

DANH MỤC BẢNG 2

DANH MỤC HÌNH VẼ 3

MỞ ĐẦU 4

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT TẨY RỬA 6

1.1.1Chất tẩy rửa là gì? 6

1.1.2 Cơ chế tẩy rửa 6

1.1.3 Một số chất tẩy rửa thường gặp 7

1.2 CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT VÀ LAS 9

1.2.1 Chất hoạt động bề mặt 9

1.2.1.1 Lịch sử ra đời 9

1.2.1.2 Định nghĩa 10

1.2.1.3 Cấu tạo 11

1.2.1.4 Phân loại 12

1.2.1.5 Cơ chế tẩy rửa 13

1.2.2 Giới thiệu về LAS 14

1.2.2.1 Cấu trúc, thành phần 14

1.2.2.2 Tính độc của LAS 16

1.2.2.3 Tình hình tiêu thụ LAS trên thế giới 16

1.3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS 17

1.4 MỘT SỐ VI SINH VẬT PHÂN HỦY LAS 18

1.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHỨA LAS TRÊN THẾ GIỚI 20

1.6 THỰC TRẠNG Ô NHIỄM NƯỚC DO CHẤT TẨY RỬA TẠI VIỆT NAM 22

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

2.1 VẬT LIỆU 26

2.1.1 Mẫu thí nghiệm 26

2.1.2 Hóa chất 26

Hồ Bích Duyên ii Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

2.1.3 Thiết bị 26

2.1.4 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu 27

2.1.4.1 Môi trường hoạt hóa Nutrient borth (NB) 27

2.1.4.2 Môi trường khoáng thử hoạt tính (MK) 27

2.1.4.3 Môi trường nhân giống 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy LAS 28

2.2.2 Xác định đường cong sinh trưởng theo độ đục 29

2.2.3 Phân loại tế bào bằng cách nhuộm Gram 30

2.2.4 Phương pháp định tính thử khả năng phân hủy LAS 31

2.4.2.1 Phương pháp cấy chấm điểm 31

2.4.2.2 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch 31

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng LAS 32

2.2.5.1 Phương pháp Methylene Blue Active Substance (MBAS) 32

2.2.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) 35

2.2.6 Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng phân hủy LAS 37

2.2.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 37

2.2.6.2 Ảnh hưởng của pH 37

2.2.6.3Ảnh hưởng của tốc độ lắc 37

2.2.6.4 Ảnh hưởng của nồng độ LAS 38

2.2.7 Định tên vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử 38

2.2.7.1 Phương pháp tách chiết DNA 38

2.2.7.2 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 40

2.2.7.3 Phương pháp PCR 40

2.2.7.4 Phương pháp tinh sạch PCR bằng KIT Bioner – Hàn Quốc 41

Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 PHÂN LẬP VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS 43

3.1.1 Đặc điểm hình thái của các chủng phân lập 43

3.1.2 Hoạt tính phân hủy LAS của các chủng lựa chọn 46

Hồ Bích Duyên iii Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

3.1.3 Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng lựa chọn 46

3.2 ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA CÁC CHỦNG TRÊN MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG 48

3.3 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS 49

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 49

3.3.2 Ảnh hưởng của pH 50

3.3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng phân huỷ LAS 50

3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ LAS 51

3.4 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS CỦA CHỦNG L2 XÁC ĐỊNH BẰNG HAI PHƯƠNG PHÁP MBAS VÀ HPLC 54

3.5 ĐỊNH TÊN CHỦNG L2 VÀ L9 BẰNG KỸ THUẬT 16S rDNA 55

3.5.1 Tách chiết DNA và sản phẩm PCR 55

3.5.2 Kết quả định tên chủng 56

Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

4.1 KẾT LUẬN 59

4.2 KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

PHỤ LỤC 63

Hồ Bích Duyên 1 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Linear Ankylbenzo Sulfonate

Chất hoạt động bề mặt

Methyllene Blue Active Subtance

High Performance Liquid Chromatography

Hồ Bích Duyên 2 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Số liệu mức tiêu thụ bình quân các chất giặt tẩy năm 1996 [4] 9

Bảng 1.2 Thành phần các đồng đẳng LAS thương mại [21] 15

Bảng 1.3 Khả năng phân hủy LAS của một số chủng trên thế giới 19

Bảng 1.4 So sánh khả năng phân hủy LAS của một số nhà máy theo phương pháp vật lý, sinh học [11] 20

Bảng 2.1 Thành phần của một phản ứng PCR 40

Bảng 2.2 Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi 41

Bảng 2.3 Điều kiện của một phản ứng PCR 41

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng 47

Bảng 3.2 Một số yếu tố ảnh hưởng tới khả năng phân hủy LAS 51

Bảng 3.3 Khả năng phân hủy LAS sau 4 ngày nuôi chủng L2 được xác định bằng phương pháp MBAS và HPLC 54

Bảng 3.4 Kết quả phân tích giải trình tự hai chủng L2 và L9 57

Hồ Bích Duyên 3 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Một số loại xà bông chứa chất tẩy rửa 7

Hình 1.2 Một số sản phẩm chăm sóc cá nhân chứa chất tẩy rửa 8

Hình 1.3 Cấu tạo của xà phòng và chất hoạt động bề mặt 11

Hình 1.4 Cấu tạo hóa học của 10 CHĐBM phổ biến 13

Hình 1.5 Cơ chế tẩy rửa của CHĐBM 14

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học LAS 15

Hình 1.7 Sản phẩm LAS thương mại 15

Hình 1.8 Sơ đồ phân hủy LAS [20] 18

Hình 1.9 Sơ đồ xử lý nước thải ở nhà máy P&G 24

Hình 1.10 Toàn cảnh ô nhiễm tại cửa sông Phú Lộc 25

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng canh trường .29

Hình 2.2 Phản ứng giữa AS và MB 32

Hình 2.3 Sơ đồ xác định hàm lượng LAS 33

Hình 2.4 Đường chuẩn LAS đo mật độ quang ở bước sóng 650 nm 34

Hình 2.5 Sơ đồ hoạt động của thiết bị HPLC 36

Hình 2.6 Qui trình tách chiết DNA 39

Hình 2.7 Qui trình tinh sạch PCR 42

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc của 8 chủng phân lập từ mẫu M1 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường MK quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại 40 44

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của 6 chủng phân lập từ mẫu M2 sau 2 ngày nuôi cấy trên môi trường MK quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại 40 45

Hình 3.3 Vòng thử hoạt tính theo phương pháp cấy chấm điểm 46

Hình 3.4 Hình thái tế bào của các chủng quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần 47

Hình 3.5 Đường cong sinh trưởng (A): L1; (B): L2; (C): L7; (D): L9 48

Hình 3.6 % LAS còn lại của các chủng với cùng nồng độ LAS ban đầu, sau 6 ngày nuôi (A):100ppm;(B):300ppm;(C):500ppm;(D):700ppm(bảng 3, 4, 5, 6 – phụ lục)52 Hình 3.7 Khả năng phân hủy LAS của các chủng khi thay đổi nồng độ 53

Hình 3.8 Kết quả tách chiết DNA của hai chủng L2 và L9 55

Hình 3.9 Sản phẩm PCR của hai chủng L2 và L9 55

Hồ Bích Duyên 4 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

MỞ ĐẦU

Đồng hành với sự phát triển kinh tế, khoa học kỹ thuật, đời sống của con người ngày càng được nâng cao thì mức độ tàn phá thiên nhiên ngày càng nghiêm trọng, một trong những ảnh hưởng của con người đến tự nhiên chính là hiện tượng ô nhiễm môi trường Trong đó, tình trạng ô nhiễm nước nghiêm trọng đang diễn ra ở nhiều nơi, đặc biệt là tại các đô thị đang phát triển như Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Bình Dương,… nơi có dân cư đông đúc và nhiều khu công nghiệp lớn Hầu hết sông hồ ở các thành phố này đều bị ô nhiễm bởi chất thải từ khu dân cư và các khu công nghiệp Phần lớn lượng nước thải đều không được được qua hệ thống xử

lý hoặc thu gom đến một nhà máy xử lý nước thải chung, mà thải thẳng vào các ao

hồ, sông suối

Hiện nay trên thế giới có khoảng 6 tỷ người sinh sống vì vậy lượng nước thải sinh hoạt hàng ngày lên tới hàng trăm tỷ m3 Cùng với lượng nước thải đó là hàng trăm ngàn tấn các chất hữu cơ, dầu mỡ, chất dinh dưỡng (giàu nitơ, phot pho…), vi sinh vật Tuy nhiên phần lớn lượng chất thải này không được xử lý mà thải trực tiếp

ra môi trường Ở Việt Nam cũng vậy, hàng ngày có hàng triệu m3 nước thải được đổ vào môi trường do hoạt động sinh hoạt gia đình của con người, đó là chưa kể đến các hoạt động công nghiệp, nông nghiệp… mà phần lớn lượng nước thải trong sinh hoạt trong số này không được xử lý mà đổ trực tiếp ra môi trường đất hay nước Điều này không chỉ gây nguy hại cho môi trường xung quanh do sự phân hủy các chất dinh dưỡng mà còn nguy hiểm hơn khi các chất ô nhiễm này ngấm xuống tầng nước ngầm gây ô nhiễm nước ngầm vốn là nguồn nước sinh hoạt của nhiều người dân

Các chất tẩy rửa đi vào nước thải sinh hoạt qua quá trình tắm giặt, gội và rửa

Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu sử dụng chất tẩy rửa càng tăng Trong chất tẩy rửa thành phần chất hoạt động bề mặt chiếm tỷ trọng lớn, các chất này không những gây ra ô nhiễm mà còn ảnh hưởng đến khả năng hòa tan oxy trong hệ thống

xử lý nước thải, dẫn đến giảm khả năng phân hủy sinh học của hệ thống xử lý Hàng năm trên thế giới sử dụng khoảng hơn 4 triệu tấn chất hoạt động bề mặt, trong đó

Hồ Bích Duyên 5 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Linear Alkylbenzo Sulfonate (LAS) chiếm khoảng 50% Đã có nhiều phương pháp đưa ra để loại bỏ chất này ra khỏi nước thải, trong đó phương pháp sinh học có nhiều triển vọng nhất Sự phân hủy sinh học LAS đã được tiến hành trong hơn 30 năm qua, nhiều chủng vi khuẩn đã được phân lập từ các khu vực bị ô nhiễm LAS để

xử lý nước thải của khu vực đó Ở châu Âu 99% các chất hoạt động bề mặt chính được loại bỏ bằng các hệ thống xử lý

Ở nước ta, chưa có nghiên cứu về việc sử dụng vi sinh vật có khả năng phân hủy các chất tẩy rửa có trong nước thải Vì vậy, việc “Tuyển chọn vi khuẩn có khả

năng phân hủy chất hoạt động bề mặt Linear Ankylbenzo Sulfonate (LAS)” là rất

cần thiết

Hồ Bích Duyên 6 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT TẨY RỬA

1.1.2 Cơ chế tẩy rửa

Cơ sở lý hóa của việc làm sạch các vết bẩn từ bề mặt chất mang là do việc hấp phụ của chất hoạt động bề mặt lên các bề mặt nhiễm bẩn, hay sự hấp phụ chọn lọc của các hợp chất chelat lên các hạt bẩn phân cực

Tính chất hóa học của bề mặt chất tẩy rửa/chất lỏng và bề mặt phân cách chất bẩn/chất lỏng bị thay đổi khi có sự hấp phụ của hợp chất tẩy rửa Mức độ hấp phụ phụ thuộc vào nồng độ các chất hoạt động bề mặt, vào các chất khác có trong dung dịch, vào nhiệt độ và đặc biệt phụ thuộc vào loại bề mặt chất tẩy rửa hay các chất bẩn Sự hấp phụ này là điều kiện tiên quyết cho việc làm sạch các vết bẩn Sự hấp phụ xảy ra càng mạnh thì sự tẩy rửa càng tốt

Hồ Bích Duyên 7 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

1.1.3 Một số chất tẩy rửa thường gặp

a Xà phòng:

Hình 1.1 Một số loại xà bông chứa chất tẩy rửa

Xà bông là chất tẩy rửa đầu tiên xuất hiện trong nền văn minh nhân loại Cách đây 2500 năm trước công nguyên người Sumer đã tự tìm cho mình công thức chế biến xà bông: “tro (than) đun với dầu” Sau đó người Ai Cập đã cải tiến bằng một chất xút tự nhiên – chất Trona (1 lớp vỏ khô cứng bên bờ hồ nước mặn) hòa vào các chất mỡ Cho tới cuối thế kỷ 18 thì cuộc cách mạng về xà bông nổ ra khi Chervereul đã thành công khi giải thích được phản ứng hóa học giữa chất kiềm và triglyxerit [4]

Từ thời kỳ này, sự sản xuất công nghiệp trở nên dễ dàng hơn, việc sử dụng xà bông trở thành phổ biến Thị trường sản xuất các sản phẩm tẩy rửa cũng ngày càng

đa dạng về chủng loại để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng, chẳng hạn như:

9 Các sản phẩm để giặt quần áo hay các loại vải có màu sắc

9 Các chất làm mềm vải

9 Các chất lau chùi gia dụng

9 Các dạng sản phẩm để chăm sóc cá nhân

Hồ Bích Duyên 8 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

b Sản phẩm chăm sóc cá nhân:

Hình 1.2 Một số sản phẩm chăm sóc cá nhân chứa chất tẩy rửa

Xã hội ngày càng phát triển thì nhu cầu chăm sóc cá nhân ngày càng đòi hỏi cao Đây là động lực thúc đẩy cho ngành cho sản xuất mỹ phẩm ra đời Hàng loạt các sản phẩm làm đẹp ra đời như dầu gội đầu, dầu xả, kem đánh răng, sữa tắm… đa dạng về chủng loại và hương thơm mang lại nguồn doanh thu cao

Trong quá trình sản xuất sản dầu gội thì chất hoạt động bề mặt là 1 nguyên liệu lý tưởng vì: khả năng tạo bọt cao khi có chất nhờn, không gây kích ứng cho da (α-olefinsulfonat), không cay mắt (sulfosuccinat)…

Trong quá trình sản xuất kem đánh răng thì chất tẩy rửa giúp: tẩy mảng bám trên răng, tạo bọt, hòa tan và phân tán các mùi hương không tan trong nước…Theo

số liệu thống kê năm 1996 mức tiêu dùng trung bình 4,5kg chất tẩy rửa mỗi người dân trong một năm [4]

Hồ Bích Duyên 9 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Bảng 1.1 Số liệu mức tiêu thụ bình quân các chất giặt tẩy năm 1996 [4]

Khu vực Mức tiêu thụ(kg/người dân/năm)

Cuối thế kỷ 18 khi ngành sản xuất xà bông phát triển rầm rộ các nhà khoa học mở ra hướng nghiên cứu về những sản phẩm thay thế chất hữu hiệu hơn cả xà bông có được nhờ tổng hợp các hóa chất Fritz Guinther đã thành công khi sáng chế

ra chất tẩy rửa tổng hợp đầu tiên là Ankylnaphatalen Tuy nhiên Ankylnaphatalen

có chuỗi phân tử quá ngắn không thể đáp ứng đầy đủ được những đặc tính của chất tẩy rửa [4]

Một thời gian sau Bertch khám phá este chất axit béo từ dầu cây thầu dầu kèm theo việc sunphua hóa, làm phát sinh một chất mang những đặc tính thấm ướt tuyệt vời (chất butyleste sulfonat) tuy nhiên hiệu quả giặt tẩy chưa cao [4]

Hồ Bích Duyên 10 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Cho tới năm 1946, sự phát hiện ra Ankylbenzen Sulfonate (ABS) đã tạo ra một bước ngoặc quan trọng và trở thành chất hoạt động bề mặt “nổi tiếng” nhất sau

xà bông bởi tính chất ít cảm ứng với chất vôi, hiệu quả cao trong việc tẩy rửa Nhưng nhược điểm của ABS là nó có khả năng phân giải sinh học yếu tạo ra những khối bọt lớn trên các dòng thải gây ảnh hưởng tới môi trường Chính vì vậy mà ABS dần bị cấm sử dụng ở một số quốc gia, đầu tiên là Đức, Pháp, Ý, Nhật

Sau đó, Linear Alkylbenzo Sulfonate (LAS) đã được tìm ra để thay thế cho ABS LAS đã trở thành một tác nhân làm sạch chính để tẩy rửa quần áo hầu hết trên thế giới LAS có khả năng phân hủy nhanh hơn so với chuỗi tương tự tetrapropyl benzene sulfonate của ABS LAS được đưa vào thị trường thế giới năm 1964 và được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay Ở Việt Nam, mãi đến ngày 01/01/1998, theo chỉ thị của Thủ tướng Chính phủ thì tất cả các cơ sở sản xuất, kinh doanh mới phải sử dụng LAS thay thế cho dodexyl benzen sunfonic axit (DBSA) trong công nghiệp chất tẩy rửa tổng hợp [2, 4]

Cùng với sự phát triển của các chất hoạt động bề mặt, các hợp chất tẩy rửa cũng được cải thiện Dần dần, các cách thiết lập công thức được phong phú hơn, chẳng hạn bằng cách thêm các tác nhân ngăn ngừa các hạt bẩn bám lại, các chất tẩy quang học và enzyme, các chất hoạt hóa làm trắng…

1.2.1.2 Định nghĩa

Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) là thành phần không thể thiếu trong các sản phẩm chất tẩy rửa Nhiệm vụ của nó là đảm bảo tẩy đi các vết bẩn và những chất lơ lửng trong nước giặt để ngăn cản sự bám lại của chúng trên bề mặt tẩy rửa

Nhờ có một số tính chất đặc biệt như khả năng tẩm ướt, tạo bọt, làm ổn định huyền phù, nhũ tương, nên các hợp chất hoạt động bề mặt được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp (dệt nhuộm, tuyển nổi quặng, khai thác dầu mỏ, chế hoá kim loại, sản xuất polyme, sơn, sợi hoá học, da, vật liệu cho phim ảnh, thuốc nhuộm, mỹ phẩm ), trong nông nghiệp (điều chế huyền phù, nhũ tương của các chất bảo vệ thực vật ), trong kỹ thuật chữa cháy (bọt chữa cháy) và trong đời sống

Hồ Bích Duyên 11 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

gia đình (chất tẩy rửa tổng hợp ) Chính vì vậy, hàng ngày chúng ta thải ra một lượng đáng kể CHĐBM mà chủ yếu là CHĐBM anion gây ô nhiễm môi trường nước Cùng với sự phát triển không ngừng của nền kinh tế thế giới, việc sử dụng các CHĐBM cũng tăng đáng kể Lượng CHĐBM sử dụng trong năm 2006 lên tới 9,3 triệu tấn tăng 232,5% so với năm 1996 (4 triệu tấn) (LAS chiếm khoảng 2,8 triệu tấn) [4] Trong đó, theo điều tra của Đức, số lượng CHĐBM sử dụng cho ngành mỹ phẩm chiếm khoảng gần 50% lượng chất hoạt động bề mặt sử dụng trong các ngành công nghiệp Như vậy, sự phát triển nhanh chóng của mỹ phẩm cũng kéo theo sự tăng trưởng của chất hoạt động bề mặt

CHĐBM dùng để làm giảm sức căng bề mặt của một chất lỏng Nếu có nhiều hơn hai chất lỏng không hòa tan thì CHĐBM làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai chất lỏng đó Khi hòa CHĐBM vào trong một chất lỏng thì các phân tử của CHĐBM có xu hướng tạo đám (micelle, được dịch là mixen), nồng độ mà tại đó các phân tử bắt đầu tạo đám được gọi là nồng độ tạo đám tới hạn

1.2.1.3 Cấu tạo

Một phân tử CHĐBM gồm hai phần: một phần không tan trong nước (thường chứa mạch hydrocacbon dài có thể là gốc alkyl, aryl) và một phần tan trong nước (thường chứa các nhóm -OH, -ONa, -COOH) Tính chất ưa nước làm cho toàn

bộ phân tử CHĐBM tan trong nước Khi kết hợp hai tính chất trên của CHĐBM, sẽ tạo ra hoạt tính bề mặt tác động lớn vào giao diện (bề mặt các phân tử này có tác động tiếp xúc của các pha) không khí/nước hoặc dầu/nước

Hình 1.3 Cấu tạo của xà phòng và chất hoạt động bề mặt

Thông thường cả hai tính chất hấp thụ và tính làm sạch tăng lên khi tăng chiều dài mạch của phần kỵ nước Cấu trúc của phần kỵ nước cũng ảnh hưởng đáng

kể đến tính chất của CHĐBM Chất hoạt động bề mặt với mạch alkyl ít phân nhánh

Hồ Bích Duyên 12 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

thường cho tính làm sạch tốt hơn, nhưng đặc tính thấm ướt kém Ngược lại khi độ phân nhánh của mạch alkyl tăng lên, chất hoạt động bề mặt có tính thấm ướt tốt nhưng không thỏa mãn tính tẩy rửa Với một chất chứa một lượng nguyên tử cacbon xác định trong mạch, đặc tính thấm ướt tăng lên rõ rệt khi nhóm ưa nước chuyển vào giữa mạch, hoặc khi độ phân nhánh tăng nhưng đồng thời lại giảm sự hấp phụ

và đặc tính tẩy rửa

Tính thấm nước và tính tan bọt của các CHĐBM là hai tính chất quan trọng,

nó làm dễ thấm ướt với nước đối với các vật Tính tạo bọt tạo điều kiện các chất bẩn phân tán dễ trong môi trường và làm tăng bề mặt tiếp xúc với bề mặt cần tẩy rửa

Một CHĐBM thích hợp cho chất tẩy rửa phải có các đặc tính sau:

- Hấp phụ chọn lọc

- Tách được các chất bẩn

- Độ nhạy cảm với nước cứng thấp

- Có khả năng chống chất bẩn kết tủa lại

- Tính thấm ướt tốt; Tính hòa tan cao; Có đặc tính tạo bọt mong muốn

- Không độc hại đối với người sử dụng; Không gây ô nhiễm môi trường

- Sử dụng được nguồn nguyên liệu dễ kiếm…

1.2.1.4 Phân loại

Dựa theo nguồn gốc các CHĐBM có thể chia thành 2 nhóm

* Nhóm 1: các loại chất hoạt động cổ điển được sản xuất từ các loại dầu mỡ động vật thực vật giàu thành phần acid béo như mỡ bò, cừu, dầu cọ, dầu dừa

* Nhóm 2: phong phú và đa dạng có tính chất như nhóm trên (khả năng thấm ướt, giảm sức căng bề mặt, tính tẩy rửa) có tên chung là các chất tẩy rửa tổng hợp

Hồ Bích Duyên 13 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Trong đó, chất hoạt động bề mặt tổng hợp thành 3 loại (dựa theo đặc tính của nhóm ưa nước):

- Loại anionic: là loại có nhóm phân cực bị phân ly thành ion âm trong dung dịch, chủ yếu là nhóm -SO3, -OSO3 (-SO3Na, -OSO3Na) có thể sử dụng trong môi trường acid yếu và nước cứng

- Loại cationic là loại có nhóm phân cực bị phân ly thành ion dương trong dung dịch, thường là dẫn xuất của muối amoni bậc 4

- Loại nonionic (trung tính ): có nhóm phân cực không bị ion hóa trong dung dịch nước Bao gồm nhóm: -OH , ete, este

- Loại lưỡng tính: có tính lưỡng cực, có khả năng chuyển thành anionic, cationic hoặc non-ionic trong dung dịch phụ thuộc vào pH (acid hay kiềm) của nước

Hình 1.4 Cấu tạo hóa học của 10 CHĐBM phổ biến

1.2.1.5 Cơ chế tẩy rửa

Chất tẩy rửa hòa tan các chất bẩn không tan trong nước (như dầu mỏ ) vào dung dịch nước Cả chất tẩy rửa và dầu mỡ có cấu tạo giống nhau (gồm một đầu kị nước và một đầu ưa nước)

Hồ Bích Duyên 14 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Phần kỵ nước ( gốc hydrocacbon ) " hấp thụ " hay " hòa tan " lên các hạt dầu

mỏ, còn phần ưa nước của các phân tử chất tẩy rửa hướng ra ngoài với nước, tương tác này tạo thành hạt keo tích điện âm, các hạt keo này cùng dấu không kết hợp với nhau được và cũng không trở lại

Hình 1.5 Cơ chế tẩy rửa của CHĐBM

Khi chất dầu mỡ gặp chất tẩy rửa có trong xà phòng có cấu trúc tương tự thì kết hợp với nhau tạo thành khối cầu hỗn hợp dầu mỡ và xà phòng mang điện tích

âm tách ra khỏi bề mặt vật liệu

Khả năng hoạt động bề mặt phụ thuộc vào :

- Bản chất của nhóm phân cực

- Vị trí của nhóm phân cực trong mạch cacbon: nhóm phân cực ở đầu mạch thường

có khả năng tẩy rửa tốt hơn ở giữa mạch, nhóm phân cực thông dụng là -COONa, -SO3Na Nhóm kỵ nước có cấu tạo mạch thẳng khả năng hoạt động bề mặt tốt hơn mạch nhánh, nhóm có thành phần hỗn hợp alkyl và arese tốt hơn alkyl hoặc aryl đơn thuần

1.2.2 Giới thiệu về LAS

1.2.2.1 Cấu trúc, thành phần

LAS bao gồm một vòng thơm sulfonate được cố định với một chuỗi linear alkyl ở vị trí para Sản phẩm thương mại là hỗn hợp đồng đẳng chứa 10 - 13 nguyên

Hồ Bích Duyên 15 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

tử C trong chuỗi ankyl Mỗi một đồng đẳng bao gồm những đồng phân vị trí do cố định vòng phenyl vào nguyên tử C của chuỗi alkyl

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học LAS

Bảng 1.2 Thành phần các đồng đẳng LAS thương mại [21]

Phenyl C10 13

Phenyl C11 30

Phenyl C12 33

Phenyl C13 24 Đặc điểm LAS

- Dạng lỏng sệt

- Màu nâu sáng

- Mùi hắc đặc trưng

Hình 1.7 Sản phẩm LAS thương mại

Hồ Bích Duyên 16 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

1.2.2.2 Tính độc của LAS

LAS cũng có độc tính nhất định nhưng chưa tới mức có hại cho sức khoẻ con người Mặc dù chưa được liệt kê vào bảng danh mục các độc chất, nhưng LAS cũng

gây ra một số cảnh báo đối với người sử dụng nếu hít phải (hắt hơi, ho, đau họng,

thở khó, buồn nôn, ói mửa), dính vào mắt (xót mắt, đỏ mắt, mờ mắt)

Đối với động vật các nhà khoa học đã tiến hành một số thí nghiệm để theo dõi ảnh hưởng của LAS trên động vật thủy sinh Các thí nghiệm cho thấy khi sống trong môi trường nước có LAS, cá hồi hấp thụ khá mạnh loại hóa chất này Qua các kết quả phân tích người ta cũng thấy hàm lượng LAS trong mô của mang cá là lớn nhất, sau đó là ở gan và nội tạng, tiếp theo là ở đầu (óc và mắt cá), thịt (cơ) và da Tuy nhiên hàm lượng LAS chưa tới mức gây ảnh hưởng xấu tới các hoạt động sinh

lý của cá Một điểm đáng chú ý trong thịt cá là hàm lượng LAS thấp nhất mà con người khi ăn chỉ đụng tới thịt cá là chính Như vậy nguy cơ nhiễm độc (nếu có) cũng sẽ giảm thiểu Cho tới nay người ta vẫn coi LAS là vô hại Nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy phải sau hàng chục năm những cái lợi và hại của việc sử dụng một loại hóa chất nào đó mới được hiểu rõ như trường hợp của thuốc trừ sâu DDT và các chất làm lạnh CFC Như vậy việc theo dõi độc tính của LAS vẫn rất cần thiết [13]

1.2.2.3 Tình hình tiêu thụ LAS trên thế giới

- Từ năm 1964 LAS chính thức được đưa vào sử dụng trên thị trường thế giới

Ở Việt Nam, mãi đến ngày 01/01/1998, LAS được thay thế cho dodxeyl benzene sunfonic axit (DBSA) [2]

- Từ 1987 – 1991, tại Mỹ, mỗi năm tiêu thụ khoảng 364 – 415 nghìn tấn [12]

- Năm 1990, tính trên toàn thế giới tiêu thụ 2 tỷ tấn [21]

- Năm 1994, tính riêng Châu Âu, Bắc Mỹ và Nhật Bản đã tiêu thụ 950 nghìn tấn [4]

- Năm 1995, lượng LAS sản xuất tại Đông Âu 410 nghìn tấn và trên toàn thế giới 2,6 tỷ tấn [4]

- Năm 2006, lượng LAS tiêu thụ trên thế giới vào khoảng 2,8 tỷ tấn [4]

Hồ Bích Duyên 17 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

1.3 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY LAS

Chuỗi ankyl có thể phân hủy dễ dàng chính là nguyên nhân tại sao LAS được

sử dụng rộng rãi Sự phân giải sinh học sinh học của nó nhanh gấp 40-50 lần ABS nhánh trong cùng điều kiện giống nhau Tuy nhiên, sự phân hủy của một số chất hoạt động bề mặt bao gồm cả LAS giới hạn trong khoảng nồng độ 20-50 mg/l và nó chỉ tự phân giải ngay khi tác động ô nhiễm đã biến mất (khi mức oxy hòa tan được tái lập)[4] Thậm chí thấp hơn nồng độ này, LAS vẫn khó có thể phân hủy vì khoảng 1/3 LAS có thể hấp phụ vào bùn trong thiết bị phản ứng và không được xử

lý Ở nồng độ cao hơn, như dòng nước thải của các nhà máy sản xuất chất tẩy rửa ( nồng độ LAS có thể lên tới 50000 mg/l), ở nồng độ này LAS ức chế sự phân hủy sinh học [20]

Theo Larson với nồng độ LAS thấp (trong khoảng 1-100µg/l), thời gian bán

rã trong nước và tầng đáy (nơi mà thời gian cư trú thay đổi tính theo ngày cho đến tuần) được quan sát từng ngày hay ít hơn Trong lúc đó, ở đất và lớp dưới bề mặt thời gian tồn tại có thể từ tháng cho tới năm, thời gian bán rã thay đổi từ ít hơn một ngày cho tới vài tuần [21]

Con đường phân hủy tổng quát của LAS đã được xác lập ở hình 1.8, sự phân hủy bắt đầu với việc oxy hóa đoạn cuối của chuỗi alkyl, cắt một axit carboxylic, sau

đó mở vòng chuyển nhóm sulfate thành sulfate vô cơ

Để LAS phân hủy theo con đường hình 1.8, hệ thống hiếu khí sẽ có lợi thế so với hệ thống kị khí vì thực tế giai đoạn đầu tiên của sự phân hủy, sự oxy hóa ở đoạn cuối của chuỗi alkyl, đòi hỏi oxy

Hồ Bích Duyên 18 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Hình 1.8 Sơ đồ phân hủy LAS [20]

1.4 MỘT SỐ VI SINH VẬT PHÂN HỦY LAS

Sau khi LAS được đưa vào sản xuất một cách rộng rãi thì vấn đề về môi trường đã khiến các kỹ sư nghiên cứu, tìm tòi ra các phương pháp xử lý nước thải

có chứa LAS sử dụng công nghệ sinh học thân thiện với môi trường Dưới đây là bảng thống kê một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy LAS của một số báo cáo [9, 10, 17, 23]

Hồ Bích Duyên 19 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Bảng 1.3 Khả năng phân hủy LAS của một số chủng trên thế giới

Chủng Khả năng phân hủy

85,2% (sau 8 ngày)

Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subtilis, Bacillus

aglomerans, Bacillus cereus, Bacillus alvae

Có thể sống trong môi trường chứa 1500 ppm LAS Không có báo cáo kết quả đầy đủ

Pseudomonas beteli

Acinetobacter johnsoni

Pseudomonas betel và Acinetobacter johnsoni

96,4% (sau 10 ngày) 97,2% (sau 10 ngày) 97,6% (sau 10 ngày)

Hồ Bích Duyên 20 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Bảng 1.4 So sánh khả năng phân hủy LAS của một số nhà máy theo phương pháp

Từ bảng trên có thể thấy khả năng phân hủy LAS theo phương pháp sinh học

cho hiệu quả cao hơn theo phương pháp vật lý từ 2-5 lần, tùy theo nồng độ LAS ban

đầu

1.5 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ NƯỚC THẢI CHỨA LAS TRÊN THẾ GIỚI

Để xử lý nước có chứa nồng độ chất tẩy rửa cao, trước đây người ta đã tìm ra

một số phương pháp hóa học và lý học như :

Phân tách chất tẩy rửa anion bằng cách hấp phụ để tạo thành một polyme đặc

trưng không hòa tan trong nước Cặn polymer-chất tẩy rửa được phân tách trong

thiết bị xử lý thông thường polymer-chất tẩy rửa được cô đặc cuối cùng đưa vào nơi

xử lý nước thải nguy hiểm với chi phí cao [14]

Một phương pháp tương tự phương pháp trên nhưng dựa trên sự keo tụ

cation Chất hoạt động bề mặt anion như LAS bị kết lắng như bùn Nhưng nhược

điểm chính là chi phí cao để loại bỏ bùn và keo tụ [14]

Hồ Bích Duyên 21 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Phân hủy hóa học các chất tẩy rửa bằng cách oxi hóa, sử dụng ozone hay

H2O2(hydrogen peroxide) Sử dụng ozone đắt và chủ yếu phù hợp ứng dụng làm sạch nước thải sau khi xử lý [14]

Kỹ thuật “oxi hóa ẩm áp suất thấp”(low pressure wet oxidation) được nghiên cứu để chi phí rẻ hơn những phương pháp ở trên nhưng trong giới hạn tuyệt đối nó vẫn đắt Thử nghiệm với dòng nước thải chất hoạt động bề mặt cao từ nhà máy sản xuất chất tẩy rửa bị đình chỉ [14]

Một giải pháp tương tự là oxi hóa xúc tác nhiệt nước thải nguy hiểm ở

400-700oC Khả năng oxi hóa cao chất tẩy rửa trung tính được ghi nhận Tuy nhiên, giá thành xử lý cao [14]

Quá trình dựa trên sự đông tụ và đóng cặn của chất tẩy rửa và chất gây ô nhiễm khác Cần thiết một bước bổ sung làm sạch bằng phương pháp xúc tác điện hoặc màng thẩm thấu ngược (RO) để loại bỏ hoàn toàn chất tẩy rửa, cần điều chỉnh bông tụ mỗi ngày để đạt được sự phân tách tốt Sự loại bỏ cặn độc đã được cô đặc tốn kém

Quá trình phân tách màng 2 giai đoạn, bao gồm màng vi hay siêu lọc sau đó

RO Nước được tinh sạch RO có thể quay vòng để sử dụng trong các đơn vị sản xuất, cần làm sạch và thay thế thường xuyên màng lọc Sự loại bỏ dòng cô đặc tốn kém

Những phương pháp khác như bay hơi tự nhiên hay bắt buộc cũng được sử dụng, nhưng chúng đắt và có những ảnh hưởng không mong muốn về mặt sinh thái học

Nhìn chung các phương pháp hóa lý nói trên hoặc là đắt tiền, hoặc là có những ảnh hưởng không mong muốn về mặt sinh thái Chính vì vậy, người ta tập trung nghiên cứu theo hướng sử dụng công nghệ sinh học Để giảm thiểu những vấn

đề xảy ra từ nước thải ô nhiễm, quá trình sinh học cố định vi sinh vật được tận dụng vào qui mô công nghiệp nhờ tăng số lượng Cố định vi khuẩn vào chất mang trơ

Hồ Bích Duyên 22 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

được sử dụng rộng rãi trong hệ thống xử lý nước thải, hệ thống cố định tế bào có thể giữ mật độ tế bào cao, thậm chí dưới điều kiện rửa trôi [13, 14]

Nước thải sinh hoạt chứa LAS được thải thẳng ra sông, hồ nước sạch Ở những nơi này, vi khuẩn có mặt tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc phân huỷ LAS Tuy nhiên, tập hợp vi khuẩn này chỉ có thể phân hủy được LAS ở nồng

độ tử 1 - 100µg/g Những nơi có nồng độ LAS ở mức cực đại trong nhà máy xử lý nước thải đô thị người ta đã sử dụng biện pháp ủ hiếu khí bùn để loại bỏ LAS Bằng cách này trên 97% LAS được loại bỏ trong khoảng thời gian ngắn Có khoảng 50 – 90% LAS được loại bỏ sau 3 – 9 giờ [20]

Đối với nước thải công nghiệp có nồng độ LAS cao (400mg/L) thì người ta áp dụng xử lý sinh học Ví dụ xử lý nước thải tại nhà máy ở Honduras: nước thải có nồng độ LAS xấp xỉ 350mg/L được xử lý bằng hệ thống tuyển nổi khí có bổ sung chất trùng hợp hoạt động bề mặt cationic [20] Trong khi đó ở đất nước Indonesia người ta lại áp dụng rộng rãi phương pháp khôi phục sinh học (biodemediation) tại các nhà máy dầu ở Indonesia và trong nhiều ngành công nghiệp khác nhờ sự góp

mặt của tập hợp vi khuẩn: Pseudomonas aeroginosa, Bacillus subitilis, Bacillus

aglomerans, Bacillus cereus, Bacillus alvae mà sự phân hủy chất hoạt động bề mặt

trong hệ thống nước thải tại các nhà máy này đạt hiệu quả cao [23]

Bên cạnh đó có nhiều nghiên cứu đã cho thấy sự phân hủy LAS nhờ các chủng

vi khuẩn phân lập được từ các khu vực này nếu đem đi để xử lý cho khu vực khác thì hiệu quả bị giảm sút nhiều Họ chưa giải thích được lý do tại sao, chỉ dự đoán rằng có thể ở khu vực khác nhau các vi sinh vật có ảnh hưởng tới các chủng đưa vào Chính vì vậy mà khi cần xử lý môi trường ở khu vực nào thì cần phân lập hệ sinh vật kích hoạt hệ vi sinh vật ở tại khu vực đó [13, 14]

1.6 THỰC TRẠNG Ô NHIỄM NƯỚC DO CHẤT TẨY RỬA TẠI VIỆT NAM

Trong quá trình phát triển không ngừng của xã hội, loài người đã đạt được nhiều thành tựu to lớn trong các lĩnh vực kinh tế xã hội với một trình độ khoa học

Hồ Bích Duyên 23 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

kỹ thuật hiện đại, nhưng đồng thời cũng gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng cho môi trường, đặc biệt là môi trường nước Ô nhiễm môi trường do nước thải sinh hoạt, nước thải các khu công nghiệp gây ra được các chuyên gia môi trường đánh giá đang ở mức rất nghiêm trọng Số liệu thống kê mới đây cho thấy, trung bình một ngày Hà Nội thải 458000 m3 nước thải, trong đó 41% là nước thải sinh hoạt, 57% nước thải công nghiệp, 2% nước thải bệnh viện Chỉ có khoảng 4% nước thải được

xử lý, phần lớn nước thải không được xử lý đổ vào các sông Tô Lịch và Kim Ngưu gây ô nhiễm nghiêm trọng 2 con sông này và các khu vực dân cư dọc theo sông [2]

Việc thu gom và xử lý nước thải tập trung đang còn gặp nhiều bất cập và hạn chế Công tác xử lý nước thải chưa được đẩy mạnh, tại một số đô thị cũng có xây dựng một số trạm xử lý nước thải cục bộ cho các bệnh viện như (Hà Nội, Hải Phòng, Quảng Ninh, Huế, Đà Nẵng ) nhưng do nhiều nguyên nhân như thiết kế, vận hành, bảo dưỡng, không có kinh phí mà nhiều trạm xử lý sau một thời gian ngắn hoạt động đã xuống cấp và ngừng hoạt động Do đó, các kế hoạch đầu tư cho các dự án xây dựng các trung tâm xử lý nước thải phải đi đôi với việc hoàn chỉnh việc xây dựng lại hệ thống thoát nước thải để thu gom và dẫn chúng đến các trung tâm xử lý.…

Hiện tại ở nước ta ước tính đã có khoảng 60-70 nhà máy xử lý nước thải tập trung tại các khu công nghiệp – khu chế xuất (KCN-KCX), trong số 171 KCN-KCX đưa vào hoạt động (tổng số có 223 KCN-KCX có quyết định thành lập) Theo thông

làng nghề chưa có trạm XLNT, có nơi đã xây dựng trạm xử lý nước thải (XLNT) nhưng không hoạt động hoặc đi vào hoạt động nhưng hiệu quả của nó đến đâu trong việc bảo vệ môi trường vẫn là ẩn số Công nghệ XLNT thường dùng là phương pháp bùn hoạt tính và lọc sinh học

Ở Việt Nam có rất nhiều công ty hoạt động trong ngành mỹ phẩm như: Công

ty TNHH Procter & Gamble (P&G), Unilever, LG Vina, công ty cổ phần bột giặt Net…hầu hết là các công ty liên doanh với nước ngoài Mặt hàng sản xuất chủ yếu

là bột giặt, xà phòng thơm, sữa tắm, dầu gội đầu, nước xả vải…là những sản phẩm

Hồ Bích Duyên 24 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

không thể thiếu trong các hộ gia đình Do sản lượng tiêu thụ lớn kéo theo hoạt động sản xuất phát triển dẫn đến lượng LAS được thải ra môi trường ngày càng nhiều Có hai cách chính mà LAS được thải vào môi trường đó là: nước thải sinh hoạt từ các hộ gia đình và nước thải từ các nhà máy sản xuất chất tẩy rửa Nước thải chủ yếu ô nhiễm về mặt hóa học do chứa chất hoạt động bề mặt, hàm lượng cặn lơ lửng cao…do đó biện pháp xử lý nước thải được các nhà máy sử dụng đó là phương pháp sinh học[3]

Hình 1.9 Sơ đồ xử lý nước thải ở nhà máy P&G

Theo “Phê duyệt quy hoạch phát triển ngành công nghiệp hóa chất Việt Nam đến năm 2010 (có tính đến năm 2010)” của thủ tướng chính phủ năm 2005 thì: giai đoạn đến hết năm 2010 đầu tư một nhà máy LAB công suất 30.000 tấn/năm cung cấp cho các cơ sở sản xuất LAS, nghiên cứu đầu tư một hoặc hai nhà máy sản xuất hóa mỹ phẩm cao cấp Giai đoạn từ 2011 – 2020 nghiên cứu sản xuất một số chủng loại chất hoạt động bề mặt [6] Như vậy có thể thấy được sự gia tăng sử dụng và nghiên cứu một cách mạnh mẽ chất hoạt động bề mặt ở Việt Nam Do đó nguồn nước ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng nhất là ở các khu đô thị, khu công nghiệp và nguy cơ hơn cả là tại các nhà máy sản xuất chất tẩy rửa, cấp thiết phải nghiên cứu

xử lý nguồn nước ô nhiễm này

Song chắn

Bể lắng cát

Bể điều hoà lưu

Bể lắng đợt 1

Sân phơi bùn

Bể Aeroten

Bể lắng đợt 2

Bể khử trùng

Nước

thải đầu  

Nước thải đầu

Bùn hồi

Hồ Bích Duyên 25 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Bằng chứng là nước thải của Khu công nghiệp Thái Nguyên biến Sông Cầu thành màu đen, mặt nước sủi bọt trên chiều dài hàng chục cây số Nước thải sinh hoạt cả địa bàn Thanh Khê (Đà Nẵng), một phần nước thải từ bãi rác Khánh Sơn và nước xả của trạm xử lý nước thải Phú Lộc thải vào sông Phú Lộc làm cho nước sông ở đây bị ô nhiễm trầm trọng, bốc mùi hôi thối, nước sông đen ngòm…Trong khi đó hệ thống xử lý nước thải Phú Lộc thuộc vào loại lớn của thành phố với công suất 20.000 m3 nước thải/ngày đêm Công suất này dường như không đảm bảo xử lý hết nguồn thải tại đây Thêm vào đó, hiệu quả của trạm Phú Lộc cũng cần phải bàn lại, mùi hôi thối và hiện tượng "tuyết bay" tại cửa sông Phú Lộc đã khiến người dân hoài nghi trong nước thải còn tồn dư những hoá chất khó tan

Hình 1.10 Toàn cảnh ô nhiễm tại cửa sông Phú Lộc

Trước thực trạng đó, các mô hình xử lý nước thải nói chung và nước thải có chứa chất hoạt động bề mặt nói riêng đang cần được tính đến khi xử lý nước thải

Hồ Bích Duyên 26 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU

- LAS (Việt Nam)

- Hóa chất tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật như: Pepton, NaCl, NH4Cl,

KH2PO4 (Trung Quốc); Cao nấm men, Na2B4O7, (Đức)…

- Hóa chất tách chiết DNA, chạy điện di và tiến hành phản ứng PCR: Base, EDTA (Etylendiamine tetracetic acid), SDS (Sodium dodecyl sunphat), Na-acetate, Isopropanol, proteinase K, ethanol

- Máy ly tâm (Sigma, Đức)

- Kính hiển vi (YS 100, Nikon, Nhật Bản)

Hồ Bích Duyên 27 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

2.1.4 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

2.1.4.1 Môi trường hoạt hóa Nutrient borth (NB)

Cao nấm men: 5g

Pepton : 5g

Cao thịt : 1,5g NaCl : 1,5g

2.1.4.2 Môi trường khoáng thử hoạt tính (MK)

Na2HPO4.12H2O : 7,53g

KH2PO4 : 1,5g

NH4Cl : 1,0g

NaCl : 0,5g

Bổ sung 500 ml nước, chuẩn pH = 7, 4 bằng NaOH 4N

Bổ sung thêm: MgSO4.7H2O: 0,492g

Hồ Bích Duyên 28 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy LAS

Sau một thời gian nuôi tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn có trong dịch nuôi

Phân lập vi sinh vật trong dịch nuôi

Sử dụng phương pháp phân lập vi sinh vật trên môi trường thạch trên đĩa petri Pha loãng canh trường ở các nồng độ khác nhau, sau đó trang các dịch đã pha loãng trên đĩa petri có sẵn môi trường thạch MK với 100 ppm LAS

Tiến hành pha loãng:

Dùng pipet hút 1 ml canh trường cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất đã thanh trùng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng 10-1 Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1hút tiếp 1 ml và cho vào các ống nghiệm chứa 9 ml nước cất thanh trùng, ta có độ pha loãng 10-2, tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết

Hồ Bích Duyên 29 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Hình 2.1 Phương pháp pha loãng canh trường

Môi trường được thanh trùng ở 121oC trong 30 phút Môi trường đã thanh trùng được phân phối vào các hộp peptri vô trùng Chiều dày lớp thạch trong hộp là 0,5 cm

Phân lập vi sinh vật:

+ Hút 100 µl dịch mẫu đã pha loãng cho vào đĩa petri có môi trường thạch MK + Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch đến khi bề mặt thạch khô

+ Làm tương tự như vậy với các độ pha loãng khác

+ Ủ các đĩa thạch trên ở 30oC, sau một thời gian nhất định ta sẽ thu được các khuẩn lạc riêng rẽ

+ Tiến hành cấy zích zắc vài lần trên đĩa petri có chứa môi trường thạch

MK từng khuẩn lạc cho tới khi các khuẩn lạc tạo thành là thuần khiết + Sau đó cấy từng khuẩn lạc vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch

MK đã được thanh trùng

2.2.2 Xác định đường cong sinh trưởng theo độ đục

Nguyên tắc: Khi vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng làm cho môi

trường trở nên đục Độ đục của môi trường tỷ lệ với số lượng tế bào có trong dịch nuôi Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được

Hồ Bích Duyên 30 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

quan hệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục Do vậy, có thể xác định gián tiếp mật độ tế bào thông qua đo độ đục

Cách tiến hành: Cấy một khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn vào bình tam

giác 250 ml có chứa 50 ml môi trường NB đã thanh trùng Nuôi 300C, 180 rpm Sau 2h lấy dịch đo OD ở bước sóng 600 nm một lần Khi giá trị OD đo được khá ổn định, 4h lấy mẫu đo một lần

Mục đích: Xác định được pha log, từ đấy ta chọn được khoảng thời gian tốt

nhất để tiếp giống đồng thời chuyển sang môi trường MK để nuôi cấy

2.2.3 Phân loại tế bào bằng cách nhuộm Gram

Nguyên tắc:

Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ Phần lớn vi sinh vật bắt màu bền vững Khả năng bắt màu bằng phương pháp nhuộm Gram cho đến nay vẫn chưa được khẳng định Có nhiều giả thuyết đưa ra nhưng trong đó giả thuyết về cấu tạo hóa học được chấp nhận tuyệt đối hơn cả Thuyết này cho rằng khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan tới muối magie của axit ribonucleic Khi nhuộm màu Gram muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại triphenylmetan (như tím gelatin, tím Kristal hoặc tím metyl…) chịu được tác dụng của cồn Nghĩa là không bị mất màu dưới tác dụng của cồn gọi là vi sinh vật Gram dương Ngược lại những vi sinh vật không giữ màu khi xử lý bằng cồn gọi là vi sinh vật Gram âm

Làm tiêu bản vi sinh vật - -> cố định vết bôi - -> nhỏ tím gelatin lên vết bôi (giữ 1- 2 phút) - -> đổ hết thuốc đi rồi nhỏ dung dịch lugol lên tiêu bản (để trong 1 phút) - -> đổ hết thuốc đi rồi nhúng trong cồn 95o trong 30 – 40 giây - -> rửa lại bằng nước cất (cho dòng chảy nhẹ qua tiêu bản, tránh không cho dòng nước xối trực tiếp lên vết bôi) - -> làm khô vết bôi - -> nhuộm bổ sung bằng fucsin loãng trong 1

Hồ Bích Duyên 31 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

– 2 phút - -> rửa lại bằng nước, đợi khô sau đó đem quan sát Dùng vật kính dầu (độ phóng đại 1000) để quan sát

2.2.4 Phương pháp định tính thử khả năng phân hủy LAS

2.4.2.1 Phương pháp cấy chấm điểm

Sau khi phân lập được từng chủng vi sinh vật theo phương pháp ở trên, tiến hành cấy chấm điểm từng khuẩn lạc trên đĩa petri chứa môi trường thạch

9 Ủ trong tủ nuôi 300C, 36h

9 Đổ dung dịch Methylene Blue (MB) lên đĩa petri

Nếu xung quanh khuẩn lạc của chủng nào có vòng sáng thì chủng đó có hoạt tính phân hủy LAS

Lựa chọn ra các chủng có hoạt tính lớn nhất

2.4.2.2 Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch

Mục đích xác định khả năng phân hủy LAS của các chủng ở điều kiện khác nhau

9 Tiến hành đục lỗ thạch

9 Bơm 100 µl dịch nuôi của từng chủng sau khi đã ly tâm loại bỏ sinh khối vào từng lỗ thạch

9 Nuôi trong tủ nuôi 30oC, 18h

9 Đổ dung dịch MB lên đĩa petri

Xung quanh lỗ thạch nào có vòng sáng lớn hơn thì khả năng phân hủy ở điều kiện đó tốt hơn

Hồ Bích Duyên 32 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

2.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng LAS

2.2.5.1 Phương pháp Methylene Blue Active Substance (MBAS)

• Dựng đường chuẩn của LAS và giá trị mật độ quang

Pha các dung dịch:

- Pha dung dịch LAS gốc nồng độ 1g/l: hòa 1g LAS vào 750ml nuớc cất, điều chỉnh

pH lên 7,0 bằng NaOH 0,1N, định mức bằng nước cất lên 1l

- Pha dung dịch chuẩn LAS nồng độ 10mg/l: pha loãng dung dịch gốc 100 lần bằng

nước cất

- Dung dịch thuốc nhuộm MB 3,13 mM: cho 0,1 g MB vào 100 ml dung dịch đệm

tetraborate 10 mM, pH= 5 ÷ 6, dung dịch này chứa trong lọ tối màu

- Dung dịch đệm tetraborate 50 mM, pH 10,5: hòa 19g Na2B4O7.10H2O vào 850 ml nước cất, điều chỉnh pH tới 10,5, định mức lên 1l bằng nước cất

Hồ Bích Duyên 33 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Dựng đường chuẩn LAS-OD

Hình 2.3 Sơ đồ xác định hàm lượng LAS

Từ giá trị OD đo được tương ứng với nồng độ của LAS xây dựng được mối quan

hệ giữa giá trị mật độ quang và nồng độ LAS

Hồ Bích Duyên 34 Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Hình 2.4 Đường chuẩn LAS đo mật độ quang ở bước sóng 650 nm

Theo đồ thị trên ta có phương trình biểu thị mối quan hệ giữa hàm lượng LAS và giá trị mật độ quang như sau:

y = 0,2916.x – 0,0038 (1)

Trong đó:

y: giá trị OD đo được

x: nồng độ LAS có trong mẫu kiểm tra

• Xác định nồng độ LAS có trong mẫu kiểm tra

Muốn xác định được nồng độ LAS có trong mẫu kiểm tra thì mẫu đem đi xác định ta cần có nồng độ LAS nằm trong khoảng 0-2,5 mg/L

- Lấy 5ml dịch nuôi sau mỗi ngày nuôi

- Ly tâm 6000 v/phút, 15 phút

- Thu dịch trong, loại bỏ sinh khối