Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ ứng dụng xử lý nước thải trong công nghiệp thực phẩm

Bên cạnh đó, nước thải của một số quá trình như chế biến thịt, gia cầm, thủy sản còn chứa một lượng lớn các hợp chất nitơ và các vi sinh vật gây bệnh [20].. Hàm lượng nitơ trong nước thả

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Lan Hương Các số liệu, những kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn này trung thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Hà Nội, ngày 21 tháng 10 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Hà Trang

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Lan Hương

đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ công tác tại Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Viện Đào tạo sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cơ quan nơi tôi công tác: Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực phẩm – Việt Trì về sự ủng hộ, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn

bè, đồng nghiệp trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện bản luận văn này Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 21 tháng 10 năm 2016

Nguyễn Thị Hà Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

4.1 Đối tượng 2

4.2 Phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 Sơ lược về ngành công nghiệp thực phẩm 3

1.2 Đặc tính chung nước thải ngành công nghiệp thực phẩm 3

1.3 Hiện trạng nước thải giết mổ ở Việt Nam 5

1.3.1 Tình hình giết mổ ở Việt Nam 5

1.3.2 Tình hình giết mổ tại địa bàn thành phố Việt Trì 6

1.3.3 Công nghệ giết mổ gia súc, gia cầm 6

1.4 Nguồn gốc và đặc tính của nước thải lò mổ 8

1.4.1 Nguồn gốc của nước thải lò mổ 8

1.4.2 Thành phần và tính chất nước thải giết mổ gia súc, gia cầm 8

1.5 Các nghiên cứu về xử lý nước thải lò mổ gia súc, gia cầm 10

1.5.1 Trong nước 10

1.5.2 Ngoài nước 11

a Xử lý kỵ khí 11

b Xử lý hiếu khí 12

1.6 Vai trò của vi sinh vật chuyển hóa nitơ trong nước thải 13

1.6.1 Quá trình amon hoá 14

1.6.2 Quá trình nitrat hóa 14

1.6.3 Quá trình phản nitrat 15

1.6.4 Quá trình anammox 16

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 22

2.2.2 Các phương pháp nuôi cấy 23

2.2.3 Phương pháp nhuộm Gram [8] 23

2.2.4 Các phương pháp phân tích 23

a Phương pháp xác định hàm lượng NH 4 + [15] 23

b Phương pháp xác định hàm lượng NO 2 - [15] 24

c Phương pháp xác định hàm lượng NO 3 [33] 24

d Phương pháp xác định khí N 2 [21, 27] 24

e Xác định pH [10] 25

f Phương pháp xác định BOD 5 25

g Phương pháp xác định COD [33] 25

h Phương pháp xác định hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng (TSS) [11] 25

h Phương pháp xác định nitơ tổng [33] 25

2.2.5 Định tên vi sinh vật bằng phương pháp sinh học phân tử 28

a Tách chiết DNA tổng số [4] 28

b Phương pháp điện di gel agarose [4] 29

c Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA [4] 29

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Đặc trưng của nước thải giết mổ gia cầm tại thành phố Việt Trì 31

3.2 Phân lập và đánh giá vi khuẩn chuyển hóa nitơ 32

3.2.1 Phân lập vi khuẩn chuyển hóa amon 32

3.2.2 Khả năng chuyển hóa amon 34

3.2.3 Phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitrit thành nitrat hóa 36

3.2.4 Khả năng chuyển hóa nitrit thành nitrat 37

3.2.5 Phân lập vi khuẩn phản nitrat hóa 38

3.2.6 Khả năng phản nitrat hóa 39

3.3 Định tên chủng vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử 41

3.3.1 Tách DNA tổng số 42

3.2.2 PCR phân đoạn gen 16S rRNA 43

3.3.3 Giải trình tự DNA 43

3.4 Bước đầu ứng dụng xử lý nước thải giết mổ gia cầm 44

3.4.1 Sự biến động của amon, nitrit, nitrat trong quá trình xử lý nước thải 44

3.4.2 Sự phản nitrat hóa 47

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

4.1 Kết luận 48

4.2 Kiến nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

MLVSS Mixed liquor volatile

suspended solid

Hàm lượng chất rắn lơ lửng dễ bay hơi

NOB Nitrite oxidation bacteria Vi khuẩn oxi hóa nitrit

sở hữu

chủ sở hữu

UASB Upflow Anaerobic Slugde

Blanket

Thiết bị xử lý kỵ khí với dòng chảy ngược qua lớp bùn hoạt tính

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng nitơ tổng trong nước thải công nghiệp thực phẩm 5

Bảng 1.2 Số lượng gia cầm được giết mổ tại thành phố Việt Trì 6

Bảng 1.3 Đặc tính chung của nước thải lò mổ gia cầm 9

Bảng 3.1 Đặc tính nước thải giết mổ gia cầm tại thành phốViệt Trì 31

Bảng 3.2 Địa điểm và số chủng phân lập có khả năng chuyển hóa cao nhất 32

Bảng 3.3 Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn nitrit hóa 32

Bảng 3.4 Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa nitrit thành

nitrat

36

Bảng 3.5 Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc vi khuẩn phản nitrat 38

Bảng 3.7 Mức độ tương đồng và định danh chủng Su, H5 và T4 43

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa các hợp chất nitơ 13

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng T1, T2, T4, T5 33

Hình 3.2 Đặc điểm tế bào của các chủng T1, T2, T4, T5 34

Hình 3.3 Hiệu suất chuyển hóa amon của các chủng T1, T2, T4, T5 34

Hình 3.4 Hiệu suất nitrit hóa của các chủng T1, T2, T4, T5 35

Hình 3.5 Tỷ lệ amon chuyển hóa của chủng T1, T2, T4 và T5 vào ngày thứ 7 35

Hình 3.6 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng H3 và H5 37

Hình 3.7 Đặc điểm tế bào của các chủng H3 và H5 37

Hình 3.8 Hiệu suất chuyển hóa nitrit của chủng H3 và H5 37

Hình 3.9 Hiệu suất nitrat hóa của chủng H3 và H5 38

Hình 3.10 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Su, Ha và U1 39

Hình 3.11 Đặc điểm tế bào của các chủng Su, Ha và U1 39

Hình 3.12 Hiệu suất chuyển hóa nitrat của các chủng Su, Ha và U1 40

Hình 3.13 Hiệu suất sinh khí nitơ của các chủng Su, Ha và U1 40

Hình 3.14 Điện di DNA tổng số các chủng T4, Su và H5 42

Hình 3.15 Điện di sản phẩm PCR của chủng T4, Su và H5 43

Hình 3.16 Khả năng chuyển hóa amon của chủng T4, H5 trong nước thải lò mổ 45

Hình 3.17 Khả năng chuyển hóa nitrit của chủng T4, H5 trong nước thải lò mổ 46

Hình 3.18 Khả năng nitrat hóa của chủng T4, H5 trong nước thải lò mổ 46

Hình 3.19 Khả năng phản nitrat của chủng Su trong nước thải lò mổ 47

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Công nghiệp thực phẩm luôn được xem là ngành công nghiệp quan trọng ở bất

kỳ quốc gia nào Phát triển công nghệ thực phẩm không chỉ cung cấp các sản phẩm đảm bảo cho nhu cầu ăn uống của người dân trong nước mà còn để xuất khẩu, góp phần thúc đẩy sự phát triển chung của nền kinh tế quốc dân [6] Trong quá trình chế biến thực phẩm một lượng lớn nước thải đã được thải ra môi trường Nước thải chế biến thực phẩm có đặc điểm là hàm lượng chất hữu cơ dễ phân hủy sinh học và chất rắn lơ lửng cao Bên cạnh đó, nước thải của một số quá trình như chế biến thịt, gia cầm, thủy sản còn chứa một lượng lớn các hợp chất nitơ và các vi sinh vật gây bệnh [20]

Nước thải lò mổ chứa nhiều thành phần phức tạp như: protein, chất béo và chất

xơ với hàm lượng ô nhiễm cao không đạt theo tiêu chuẩn xả thải QCVN40:2011/BTNMT Các chất rắn lơ lửng trong nước thải lò mổ (bao gồm: thịt, máu, mỡ, lông, móng…) cao làm tăng độ đục khiến ánh sáng khó chiếu xuống tầng đáy ảnh hưởng tới quá trình quang hợp của tảo và rong rêu Hàm lượng nitơ trong nước thải lò mổ cao, các hợp chất nitơ này tồn tại ở nhiều dạng khác nhau, chủ yếu là: amon (NH4+), nitrit (NO2-) và nitrat (NO3-) Hàm lượng nitơ trong nước cao gây

ra hiện tượng phú dưỡng tác động tiêu cực đối với môi trường như: cạn kiệt nguồn oxy hòa tan trong nước gây độc cho động - thực vật thủy sinh, ảnh hưởng xấu đến con người [40] Do đó, cần phải loại bỏ nitơ trước khi thải ra môi trường

Quy trình loại bỏ nitơ bao gồm 2 quá trình: nitrat hóa và phản nitrat hóa Quá trình nitrat hóa xảy ra theo 2 bước là giai đoạn nitrit và nitrat hóa Bước đầu tiên là giai đoạn nitrit hóa: amon được oxi hóa thành nitrit nhờ các vi khuẩn oxi hóa amon (AOB) Bước thứ 2 là giai đoạn nitrat hóa: nitrit được oxi hóa thành nitrat nhờ các

vi khuẩn oxi hóa nitrit (NOB) Trong quá trình phản nitrat: các hợp chất nitrat và nitrit sẽ bị khử hoàn toàn đến sản phẩm cuối cùng là khí N2 [37] Quy trình loại bỏ nitơ trong nước thải được thực hiện bởi rất nhiều loài vi khuẩn theo các con đường

khác nhau [31] [42] Với mong muốn thúc đẩy nhanh quá trình xử lý nitơ trong nước thải thực phẩm nói chung và nước thải lò mổ nói riêng, chúng tôi chọn đề tài:

“Tuyển chọn vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ ứng dụng xử lý nước thải trong công nghiệp thực phẩm”

Ý nghĩa thực tiễn

Thành công của đề tài đã góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm

vi sinh ứng dụng trong bảo vệ môi trường nhằm nâng cao hiệu suất và giảm thời

gian xử lý, tiết kiệm chi phí nhân công và thiết bị

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng

Nước thải lò mổ gia cầm tại thành phố Việt Trì

4.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ nước thải lò mổ gia

cầm và bước đầu đánh giá khả năng xử lý nước thải lò mổ

- Các thí nghiệm được tiến hành tại trường Đại học Bách khoa Hà Nội

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược về ngành công nghiệp thực phẩm

Tình hình phát triển kinh tế và việc mở rộng đầu tư vào ngành chế biến thực phẩm đã góp phần nâng cao mức tiêu thụ thực phẩm tại Việt Nam Theo tổ chức Giám sát kinh doanh Quốc tế (BMI) mức tiêu thụ bình quân theo đầu người tăng 4,3%/năm tính đến năm 2016 Ngành công nghiệp thực phẩm đóng hộp tăng 37,

về số lượng và 42,5 về giá trị Ngành sản xuất bánh k o tăng 27, về khối lượng

và 5 ,22 về giá trị [3] Như vậy, ngành công nghệ thực phẩm đang có nhiều triển vọng phát triển mạnh mẽ

1.2 Đặc tính chung nước thải ngành công nghiệp thực phẩm

Sự tăng trưởng và phát triển của ngành công nghệ thực phẩm đã kéo theo lượng nước sử dụng trong chế biến cũng tăng theo Ngành công nghiệp thực phẩm có nhu cầu sử dụng nước cao Trong quá trình chế biến rau - củ - quả lượng nước rửa chiếm 50 Nước là thành phần chính của các sản phẩm trong đồ uống, nước giải khát và các sản phẩm lên men Việc tăng lượng nước sử dụng khiến lượng nước thải cũng tăng theo [20]

Đặc tính chung của nước thải chế biến thực phẩm [20]:

- Không độc, chúng chứa rất ít các hợp chất gây độc, ngoài một số chất tẩy rửa

- Nước thải từ các nhà máy chế biến thực phẩm là chất hữu cơ

- Nước thải từ một số quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là từ quá trình chế biến thịt, gia cầm và chế biến hải sản chứa sinh vật gây bệnh

Nước thải từ quá trình chế biến chế biến rau - củ - quả chứa nhiều chất chất rắn

lơ lửng, đường, tinh bột và có thể chứa lượng tồn dư thuốc bảo vệ thực vật [20] Nước thải từ quá trình sản xuất bánh k o: Chứa hàm lượng chất hữu cơ cao chủ yếu là cacbonhydrat và chất béo, pH cao [20] Nước thải từ quá trình chế biến bánh nướng, bánh ngọt chứa nhiều chất rắn hữu cơ [20]

Nước thải từ quá trình sản xuất bia, rượu: Hàm lượng chất hữu cơ cao, pH dao động lớn Nước thải quá trình sản xuất bia, rượu chứa cacbonhydrat và nitơ tổng cao [21]

Nước thải từ quá trình chế biến sữa là sữa nguyên liệu hòa trong nước Chúng phát sinh từ quá trình thanh trùng hoặc khử trùng Nước thải từ các công đoạn rửa thiết bị và thùng chứa thường chứa sữa và các hóa chất tẩy rửa Nước thải chế biến sữa hình thành axit lactic và formic gây ăn mòn thiết bị [20]

Nước thải từ nhà hàng, bếp ăn chứa các chất thải rắn, các chất béo, các loại dầu mỡ, các chất hoạt động bề mặt, các axit và các vi khuẩn [20]

Nước thải lò mổ và các quá trình chế biến hải sản chứa máu, chất béo, protein [28] Chất thải từ quá trình chế biến cá và thịt chứa chất rắn hữu cơ, máu, chất béo và protein Hàm lượng protein trong nước thải lò mổ thường rất cao [20] Như vậy, nước thải của từng quá trình chế biến thực phẩm có các tính chất khác nhau Nước thải từ các quá trình sản xuất bánh k o, rau - củ - quả thường chiếm tỷ lệ cacbonhydrat (tinh bột, các loại đường) cao Nước thải quá trình chế biến sữa chứa tỷ lệ cacbonhydrat (đường lactoza), protein và chất béo cân đối Nước thải lò mổ và các quá trình chế biến thịt cá thường chứa hàm lượng protein và chất béo cao Các thành phần cacbonhydrat dễ dàng được các vi sinh vật lên men sinh axit, sau đó được chuyển hóa thành CO2 và H2O Các thành phần protein cũng dễ dàng được chuyển hóa thành các axit amin và tiếp tục được chuyển hóa thành amon Tuy nhiên quá trình chuyển hóa từ amon đến NO2, NO3 và chuyển hóa tiếp đến N2diễn ra chậm chạp Để thúc đẩy quá trình phân hủy và rút ngắn thời gian xử lý, người ta thường phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn bản địa có khả năng chuyển hóa nitơ cao để bổ sung vào quá trình xử lý nước thải

Hàm lương nitơ tổng (TN) trong nước thải ngành công nghiệp thực phẩm phụ thuộc vào từng quá trình chế biến Bảng 1.1 chỉ ra TN của nước thải của một số quá trình chế biến thực phẩm

Bảng 1.1 Hàm lượng nitơ tổng trong nước thải công nghiệp thực phẩm [33] Nước thải từ quá trình Hàm lượng nitơ tổng (mg/L)

1.3 Hiện trạng nước thải giết mổ ở Việt Nam

1.3.1 Tình hình giết mổ ở Việt Nam

Sản lượng thịt sản xuất tại Việt Nam đã tăng nhanh trong những năm gần đây Theo thống kê, cả nước hiện có 34.642 điểm giết mổ gia súc, gia cầm nhỏ lẻ Năm

2015, sản lượng thịt trâu, thịt bò, thịt lợn, thịt gia cầm, thịt dê – cừu đạt lần lượt là

5, nghìn tấn, 2 ,3 nghìn tấn, 3491,6 nghìn tấn, 908,1 nghìn tấn và 21,8 nghìn tấn So với năm 2013, tổng sản lượng thịt đã tăng xấp xỉ 10,4 [1] Tùy thuộc vào công nghệ giết mổ của từng cơ sở, lượng nước thải khi sản xuất 1 tấn thịt gia súc, gia cầm lần lượt 1,6 - 9 và 5,07 - 14 m3

nước thải [46] [45] Mặc dù, lượng thịt gia

cầm chỉ chiếm 1 nhưng lượng nước sử dụng trong giết mổ gia cầm chiếm gần

50 tổng lượng nước sử dụng trong giết mổ

1.3.2 Tình hình giết mổ tại địa bàn thành phố Việt Trì

Hiện nay tỉnh Phú Thọ chỉ có 2 hai cơ sở giết mổ gia súc tập trung đó là lò

mổ gia súc tại thị xã Phú Thọ và Công ty TNHH Trí Tuệ Trên địa bàn tỉnh Phú Thọ cũng có hơn 600 điểm giết mổ gia súc nằm rải rác trong các khu dân cư, trong đó thành phố Việt Trì (Phú Thọ) có hàng chục hộ giết mổ trâu, bò, lợn [17]

Thành phố Việt Trì có 5 điểm giết mổ gia cầm tập trung tại các chợ: chợ 5 tầng, chợ Vồ, chợ Minh Phương, chợ Trung tâm và chợ Nú Số lượng gia cầm được giết mổ được thống kê ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Số lượng gia cầm được giết mổ tại thành phố Việt Trì [17]

mà xả thải trực tiếp xuống cống rãnh của chợ và nhập vào vào cống rãnh thành phố

1.3.3 Công nghệ giết mổ gia súc, gia cầm

Công nghệ giết mổ gia súc, gia cầm nhìn chung có các công đoạn tương đối giống nhau Công nghệ giết mổ gia súc có thêm công đoạn tắm cho gia súc trước khi đưa vào gây mê bằng sốc điện trong khi công nghệ giết mổ gia cầm có thêm công đoạn móc diều và tuốt da chân

Gia súc, gia cầm nguyên liệu được chứng nhận về nguồn gốc xuất xứ và tình trạng sức khỏe đủ điều kiện giết mổ được đưa vào dây chuyền công nghệ sản xuất Hình 1.1 trình bày dây chuyền công nghệ giết mổ gia cầm

Hình 1.1 Dây chuyền giết mổ gia cầm [2]

Tiết rơi vãi, nước thải

Nước sạch

Nước thải Nước thải

Phân loại và kiểm soát

thú y

Bao gói và bảo quản

Gây mê bằng điện Cắt tiết Trụng Tuốt lông

Gia cầm được treo lên dây chuyền giết mổ và được vận chuyển qua các khâu chế biến liên tục Đầu tiên chúng được dịch chuyển đến bồn gây mê, ở đây có dòng điện vừa đủ để gây mê gia cầm Tiếp theo chúng được cắt tiết và tiếp tục được dịch chuyển trên dây chuyền cho tiết chảy ra hết và đi vào bồn trụng nước nóng Nhiệt

độ nước trụng khoảng 65- 68o

C Tiếp đến, gia cầm được đưa vào máy tuốt lông Sau khi tuốt lông, chúng được tuốt móng, lấy diều và móc lòng bằng phương pháp thủ công Sau đó chúng được rửa 2 lần để đảm bảo sạch hoàn toàn Gia cầm tiếp tục được dịch chuyển qua hệ thống nước lạnh, hỗn hợp nước muối và khí ozone để khử trùng Sau đó, chúng được làm ráo để giảm hàm lượng nước Gia cầm được phân loại và kiểm soát thú y trước khi đóng gói thành phẩm trong bao bì (PE+PA) và hút chân không Cuối cùng, thành phẩm được đưa vào kho bảo quản với nhiệt độ ±4 oC

1.4 Nguồn gốc và đặc tính của nước thải lò mổ

1.4.1 Nguồn gốc của nước thải lò mổ

Nước thải từ lò mổ bao gồm bắt nguồn từ:

- Dây chuyền sản xuất bao gồm các công đoạn trụng, rửa, làm lạnh, để ráo và nước vệ sinh thiết bị, nhà xưởng

- Nước vệ sinh chuồng trại nuôi tạm

- Nước sinh hoạt cho công nhân

Như vậy, bên cạnh một lượng lớn nước thải là từ dây chuyền sản xuất, còn

có một lượng không nhỏ nước vệ sinh chuồng trại nuôi tạm và nước thải sinh hoạt của công nhân nhà máy

1.4.2 Thành phần và tính chất nước thải giết mổ gia súc, gia cầm

Nước thải từ quá trình vệ sinh chuồng trại nuôi tạm: Nước thải từ quá trình này bắt nguồn từ lượng thức ăn thừa, phân và nước tiểu Nước thải này thường chứa nhiều cặn lơ lửng, hàm lượng chất hữu cơ và nitơ rất cao

Nước thải từ quá trình giết mổ: Nước thải từ dây chuyền sản xuất thường chứa thịt, mỡ, lông, móng, da Nước thải từ quá trình này bao gồm cả các thành phần chất vô cơ, hữu cơ và vi sinh vật

- Các chất vô cơ: amon, nitrat, nitrit, photpho, sunfat, sắt, kali, …

- Các hợp chất hữu cơ: protein, hydratcacbon, chất béo Nguồn gốc các thành phần này từ máu, mỡ, protein, phospho, chất tẩy rửa và chất bảo quản

bao gồm Erisipelothris insidiosa, Brucella, Samonella, E coli … Ngoài ra, nước thải còn chứa một lượng lớn trứng giun sáng điển hình như Fasciotahepatica,

Fasciola, Fasico losis buski, Ascaris suum, Cesphagostomum sp, Trichocephalus dentatus

Thành phần nước thải lò mổ khá phức tạp Đặc tính chung của nước thải lò

mổ gia cầm được chỉ ra trong bảng 1.3

Bảng 1.3 Đặc tính chung của nước thải lò mổ gia cầm [20]

TT Thành phần Đơn vị

40:2011/BTN

MT Cột B Phạm vi Trung bình

nhận sẽ làm cạn kiệt nguồn oxy hòa tan trong nước (do vi sinh vật sử dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ) Các chất rắn lơ lửng khiến nước đục hoặc có màu, làm hạn chế độ sâu tầng nước được ánh sáng chiếu xuống, gây ảnh hưởng tới quá trình quang hợp của tảo, rong rêu…

1.5 Các nghiên cứu về xử lý nước thải lò mổ gia súc, gia cầm

1.5.1 Trong nước

Các nghiên cứu về xử lý nước thải lò mổ đã được tiến hành trong những năm gần đây Ngô Thị Kim Toán đã phân lập và xác định được 3 chủng có khả năng xử

lý nitơ trong đó, Bacillus licheniformis - X6 416 có khả năng chuyển hóa 5,21%

NH4 + sau 20 ngày nuôi cấy, chủng Bacillus amyloliquefaciens - AB25566 chuyển hóa 97,28% và Pseudomonas pseudoalcaligenes - Z76666 chuyển hóa 7,14

lượng NO2- sau 20 ngày nuôi cấy [7]

Ngô Thị Phương Nam (200 ) đã nghiên cứu xử lý nước thải lò mổ gia súc bằng quá trình hiếu khí thể bám trên vật liệu polime tổng hợp Kết quả cho thấy với COD

và TN đầu vào lần lượt là 560 mg/L (tương ứng với OLR là 0,56 kg-COD/m3.ngày)

và 39,2 mg/L, tốc độ sục khí 0,5L/phút, hiệu quả xử lý COD và TN lần lượt đạt 90% và 29,9% Nồng độ sinh khối đạt 4,6 g-SS/L [8] Lê Công Nhất Phương (2012)

đã nghiên cứu xử lý nước thải giết mổ bằng kết hợp của hai nhóm vi khuẩn

Nitrosomonas và Anammox trong cùng một thiết bị chứa giá thể là sợi polyacrylic

và sợi bông tắm để xử lý ammonium trong nước thải giết mổ Hai nhóm vi khuẩn này có đặc tính sinh lý khác nhau nên việc sử dụng giá thể thích hợp cho hai nhóm

vi khuẩn này hoạt động chung trong cùng thiết bị Sử dụng giá thể sợi polyacrylic cho hiệu quả xử lý amon tốt hơn giá thể là sợi bông tắm Hiệu suất xử lý đạt 2 ở tải trọng 0,04 kgN-NH4/m3.ngày và 7, ở tải trọng 0,14 kgN-NH4/m3.ngày [5]

Lê Hoàng Việt (2014) đã đánh giá hiệu quả xử lý nước thải giết mổ gia súc của đĩa quay sinh học với giá thể ống nhựa dạng khối đĩa và lồng quay sinh học với giá thể bông tắm Kết quả cho thấy tại thời gian lưu 6h hiệu quả xử lý của lồng quay sinh học cao hơn đĩa quay sinh học, nước thải sau xử lý đạt tiêu chuẩn thải QCVN 40:2011/BTNMT cột B Khi xử lý nước thải giết mổ bằng phương pháp sinh học

hai giai đoạn: giai đoạn I là lồng quay sinh học và giai đoạn II là đĩa quay sinh học, nước thải sau xử lý đạt tiêu chuẩn thải QCVN 40:2011/BTNMT cột A Trần Thị

Thu Lan (2016) đã nghiên cứu phân lập chủng Bacillus velezensis M2 từ nước thải

giết mổ Kết quả cho thấy khi xử lý nước thải lò mổ với COD và TN đầu vào lần

lượt là 1260 mg/L và 137 mg/L bằng chủng B velezensis M2 trên quy mô bình tam

giác 500 mL nuôi lắc 200 vòng/phút với tỷ lệ cấp giống 3 sau 12 giờ hiệu suất xử

lý COD và TN tương ứng là 3,2 và 3,5 Lượng TN trong quá trình xử lý được chuyển hóa thành sinh khối vi sinh vật [16]

1.5.2 Ngoài nước

Nước thải lò mổ sau khi được xử lý sơ bộ sẽ xử lý bằng phương pháp sinh học Dựa vào hoạt động sống của vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn, chúng sử dụng các chất hữu cơ và vô cơ có trong nước thải như: C, N, P, K, … làm nguồn dinh dưỡng Chúng biến đổi các chất hữu cơ cao phân tử thành các hợp chất đơn giản hơn Các

vi sinh vật này sử dụng nguồn vật chất có trong nước thải để sinh trưởng và phát triển Phương pháp xử lý sinh học có thể ứng dụng làm sạch hoàn toàn nước thải chứa chất hữu cơ hòa tan hoặc phân tán nhỏ và một số hợp chất vô cơ Xử lý sinh học bao gồm xử lý hiếu khí, kỵ khí và tùy tiện [41]

a Xử lý kỵ khí

Xử lý kỵ khí đã được sử dụng để xử lý nước thải lò mổ Trong quá trình phân giải kỵ khí các chất hữu cơ được tập hợp các vi sinh vật chuyển hóa thành CH4 và

CO2 khi không xuất hiện O2 Xử lý kỵ khí có ưu điểm là thể tích bùn sinh ra thấp

(5-20 so với xử lý hiếu khí), đòi hỏi năng lượng thấp và có tiềm năng thu hồi năng lượng dưới dạng biogas Các công trình kỵ khí đã được áp dụng cho xử lý nước thải

lò mổ bao gồm thiết bị vách ngăn kỵ khí (ABR), lọc kỵ khí (AF), hồ kỵ khí (AL) và UASB [29, 41] Hiệu quả xử lý COD và BOD của thiết bị ABR đã đạt trên 0 [38], hiệu suất chuyển hóa TOC của hệ thống ABR and UV/H2O2 đạt trên 95%, riêng thiết bị ABR đã chuyển hóa TOC và TN lần lượt là 88,88% và 51,52% Tuy nhiên, hệ thống ABR đòi hỏi năng lượng cao nên khi tăng TOC làm chi phí xử lý tăng theo [29]

Mặc dù quá trình xử lý kỵ khí đem lại nhiều lợi ích tuy nhiên quá trình này cũng có nhược điểm là xử lý không hiệu quả các thành phần TN, TP và vi sinh vật gây bệnh nên đòi hỏi dòng ra phải được xử lý bổ sung Thông thường người ta sẽ kết hợp xử lý kỵ khí và hiếu khí để nâng cao hiệu quả quá trình và mang lại hiệu quả kinh tế cao [41]

b Xử lý hiếu khí

Nước thải sau quá trình xử lý kỵ khí được đưa sang bể hiếu khí để xử lý các chất dinh dưỡng như NO3-, NH4+, TP Trong các hệ thống hiếu khí chất hữu cơ cũng như chất dinh dưỡng được xử lý khi xuất hiện O2 Nước thải có mức độ ô nhiễm càng lớn thì tỷ lệ O2 càng cao [43] Các bể hiếu khí thông dụng là quá trình bùn hoạt tính (AS), thiết bị lọc quay (RBC) và thiết bị tuần tự theo mẻ (SBR)

Quá trình bùn hoạt tính được áp dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp nói chung và nước thải giết mổ nói riêng do hiệu quả kinh tế cao Mục đích của quá trình này là tạo ra các bông cặn sinh học gồm các tế bào vi sinh vật và các chất keo

vô cơ trong nước thải Sau đó loại các bông cặn được tách ra khỏi nước thải bằng quá trình lắng Hai cơ chế của quá trình này là hấp thụ và oxi hóa các chất hữu cơ [22] Bustillo-Lecompte và cộng sự (2014, 2015) đã đánh giá về hiệu quả và giá thành của quá trình AS cho xử lý nước thải giết mổ gia cầm Các thông số dòng vào TOC và TN lần lượt là 100 và 254 mg/L, hiệu quả xử lý TOC và TN đạt trên 5,03 TOC and 73,46 TN với HRT là ngày với chi phí giá thành là 4$/1kg TOC [27], [28] Do vậy nếu quá trình này được kết hợp với 1 quá trình khác để giảm TOC đầu vào sẽ tiết kiệm được chi phí

Kundu và cộng sự (2012) đã phân lập chủng nitrat hóa Achromobacter

xylosoxidans S18 từ nước thải giết mổ gia cầm và được bổ sung vào quá trình xử lý

nước thải này Kết quả cho thấy nước thải đầu vào có giá trị COD và N-NH4 lần lượt là 1820 ± 10 mg/L và 120 ± 5,5 mg/L, hiệu quả xử lý COD và N-NH4 tương

ứng là 88 ± 3% và 97 ± 2% Việc bổ sung chủng A xylosoxidans S1 đã nâng cao

hiệu quả xử lý nước thải giết mổ gia cầm [37] Nghiên cứu khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa nitơ Zhang và cộng sự đã phân lập được chủng vi khuẩn

Pseudomonas stutzeri không chỉ có khả năng chuyển hóa nitrit mà còn có khả năng

chuyển hóa amoni Sau thời gian 1 giờ, chủng vi khuẩn này đã chuyển hóa được amoni hoàn toàn thành dạng khí N2 với hiệu suất là 3 [48] Một nghiên cứu của

Zhang và cộng sự về việc sử dụng vi khuẩn Bacillus methylotrophicus trong xử lý

nitơ cho thấy trong môi trường ở điều kiện pH từ 7 đến và nhiệt độ là 37o

subtilis và Bacillus cereus, Bacillus licheniformis là một trong các chủng thuộc chi Bacillus có khả năng nitrat hóa và khử nitrat trong điều kiện hiếu khí, và lượng

amoni đã chuyển sang khí N2 là 33 sau 4 giờ nuôi cấy [36]

1.6 Vai trò của vi sinh vật chuyển hóa nitơ trong nước thải

Các hợp chất nitơ được chuyển hóa bởi các vi khuẩn theo các con đường khác nhau Hình 1.2 trình bày chu trình chuyển hóa nitơ của các vi sinh vật trong tự nhiên

Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa các hợp chất nitơ [5]

Các nhóm vi sinh vật tham gia vào quá trình chuyển hóa ni tơ bao gồm các nhóm vi sinh vật amon hoá, nitrat hóa, phản nitrat và anammox

1.6.1 Quá trình amon hoá

Protein là thành phần cơ bản của nguyên sinh chất tế bào, chứa khoảng 15 - 17,6 nitơ Trong nước thải có rất nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải protein

như: Bacillus cereus, B.pasteurianus, B.subtilis, Aeromonas hydrophyla,

A.proteolytica, Streptomyces erythreus, S.griseus, Thermonospora fusca, T.vulgaris Các vi sinh vật này sản sinh ra proteaza ngoại bào xúc tác cho quá

trình thủy phân protein thành peptid mạch thấp và các axit amin Các sản phẩm sau quá trình thủy phân protein trong nước thải một phần được vi sinh vật sử dụng để kiến tạo tế bào vi sinh vật, một phần tiếp tục được các vi khuẩn amon hóa phân giải tạo ra NH3, CO2 và nhiều sản phẩm trung gian khác [47,14]

1.6.2 Quá trình nitrat hóa

NH3 được sinh ra trong quá trình amon hóa nhanh chóng bị oxy hóa thành nitrit, rồi tiếp đó thành nitrat Quá trình này người ta gọi là quá trình nitrat hóa Nhóm vi khuẩn thực hiện quá trình nitrat hóa gọi là vi khuẩn nitrat hóa Quá trình nitrat gồm có 2 giai đoạn và do 2 nhóm vi sinh vật khác nhau thực hiện Số lượng các vi sinh vật này trong nước thải rất khác nhau, tùy thuộc vào nguồn gốc và thành phần loại nước thải [47,14]

Giai đoạn nitrit hóa

Giai đoạn nitrit hóa do vi khuẩn nitrit hóa thực hiện, gồm 4 giống:

Nitrosomonas, Nitrocystis, Nitrosospira, Nitrosolobus [47] Chúng là những vi

khuẩn Gram âm, hiếu khí, tự dưỡngvô cơ, thích hợp ở pH trung tính đến hơi kiềm Chúng oxy hoá NH4+ bằng oxy không khí tạo ra NO2 và năng lượng Giai đoạn nitrit hóa có thể được trình bày như sau:

NH4+ + 3/2 O2 -> NO2- + H2O +2H+ + Năng lượng

Năng lượng sinh ra sẽ được các vi khuẩn nitrit hóa sử dụng để đồng hoá

CO2 thành cacbon hữu cơ phục vụ cho hoạt động sống của mình [14] Sự có mặt

của các nhóm vi khuẩn nitrit hóa giúp loại bỏ được hàm lượng NH4+ trong nước thải

lò mổ

Giai đoạn nitrat hóa

Giai đoạn nitrat hóa do vi khuẩn nitrat hoá thực hiện, gồm 3 giống vi khuẩn là:

Nitorobacter, Nitrospira, Nittrococcus Chúng sử dụng năng lượng sinh ra trong các

phản ứng nitrat hóa để đồng hóa nguồn CO2 của không khí Chúng là những vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, thích hợp ở pH trung tính đến hơi kiềm [14] Giai đoạn nitrat hóa có thể được trình bày như sau:

NO2- + 1/2 O2 NO3- + Năng lượng Cũng như các vi khuẩn tự dưỡng hoá năng khác, vi khuẩn nitrat dùng năng lượng sinh ra trong các phản ứng này để đồng hoá CO2 của không khí [14]

Bên cạnh quá trình nitrat hoá do vi sinh vật tự dưỡng hoá năng nói trên thực hiện, còn có quá trình nitrat hoá do vi sinh vật dị dưỡng thực hiện Các vi sinh vật này không có khả năng đồng hoá CO2 nhưng cũng khả năng chuyển hoá NH3 thành

nitrit rồi thành nitrat Đó là những loài thuộc giống: Alealigenes, Anthrobacter,

Corynebacterium, Achrombacter, Pseudomonas, Nocardia, Streptomyces [47]

Ngoài ra, chúng còn có thể tiến hành quá trình nitrat hóa đối với nhiều hợp chất hữu

cơ chứa nitơ khác (amit, amin, oxim, hydroxamat ) [14]

Quá trình nitrat hóa không xảy ra khi pH <6, thường diễn ra ở pH = 6,2- 9,0 Quá trình nitrat hóa diễn ra mạnh ở 30 - 35oC và ngừng trệ ở 10o

C [14] Các vi khuẩn nitrat hóa đều là những vi khuẩn hiếu khí Quá trình nitrat hóa chỉ xảy ra khi

có mặt của oxy, nghĩa là trong môi trường thoáng khí còn trong môi trường kỵ khí với sự có mặt của các cacbonhydrat sẽ xảy ra quá trình ngược lại với quá trình nitrat hóa đó là quá trình khử nitrat hóa Quá trình này khử nitrat theo từng bước tạo thành các sản phẩm NO2, NO, N2O, NH2OH, NH3 và N2 Vi khuẩn nitrat hóa phân bố rộng rãi trong nước thải và có ý nghĩa đáng kể trong vòng tuần hoàn nitơ

1.6.3 Quá trình phản nitrat

Quá trình phản nitrat (còn gọi là quá trình khử nitrat) là quá trình chuyển hóa

NO3- thành N2 nhờ vi sinh vật Qúa trình khử NO3- đến N2 diễn ra theo nhiều bước như sau:

NO3- NO2- NO N2O N2Quá trình phản nitrat hoàn toàn thông qua 4 bước liên tiếp như trên Phản ứng khử NO3 đến N2 chỉ xảy ra trong điều kiện kỵ khí NO3- là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp kỵ khí, năng lượng tạo ra được dùng để tổng hợp nên ATP Bên cạnh đó cũng tồn tại con đường phản nitrat hóa không hoàn toàn như: một số chủng sinh ra cả khí N2 và N2O, một số khác chỉ tạo ra N2O [14]

Các vi khuẩn phản nitrat hóa điển hình là: Pseudomonas denitrificans,

P.aeruginosa, P.stutzeri, P.fluorescens, Micrococcus denitrificans, Bacillus licheniformis, Achromobacter severinii Một số loài vi khuẩn tự dưỡng hóa năng

cũng có khả năng thực hiện quá trình phản nitrat hóa như: Thiobacillus

denitrificans, Hdrogenomonas agilis, Sporovibrio ferrooxydans [47] Các vi khuẩn

nitrat hóa có 2 nguồn năng lượng khác nhau Chúng đều có thể oxy hóa chất hữu cơ nhờ oxy không khí (trừ các loại từ dưỡng hóa năng) Khi phân giải nitrat, trong môi trường sẽ tích luỹ một số gốc kiềm (K, Ca, Na) Các gốc kiềm này sẽ sinh ra KOH, Ca(OH)2, NaOH do đó quá trình phản nitrat hóa luôn kiềm hóa môi trường [14]

Vi khuẩn phản nitrat hóa hoạt động mạnh ở pH trung tính đến hơi kiềm và có

hệ thống enzim nitritreductaza và nitratductaza nhưng enzim này chỉ được tổng

hợp trong điều kiện kỵ khí [14]

1.6.4 Quá trình anammox

Quá trình oxi hóa amon kỵ khí (Anaerobic ammonium oxidation - Anammox), tiến hành thông qua hai bước Bước thứ nhất, amon được oxy hóa một phần thành hydroxyamin hoặc nitrit với oxy là chất nhận điện tử (tự dưỡng hiếu khí) Bước thứ hai, hydroxyamin hoặc nitrit với vai trò là chất nhận điện tử sẽ phản ứng với lượng amon còn lại để tạo nên khí nitơ (tự dưỡng kỵ khí) Kết hợp hai quá trình này gọi là quá trình nitrit hóa một phần/anammox [5]

Quá trình Anammox được thực hiện bởi vi khuẩn tự dưỡng thuộc nhóm

Planctomycetales Các vi khuẩn trong quá trình Anammox thuộc vào 5 giống sau: Candidatus brocadia, Ca kuenenia Ca scalindua, Ca anammoxoglobus và Ca jettenia Chúng có hoạt tính cao trong pH khoảng 6,4 - 8,5 và nhiệt độ khoảng 20 -

43oC Vi khuẩn anammox rất nhạy cảm với oxi và nitrit, nồng độ oxi 2μM và nitrit

từ 5 -10mM đã gây ra ức chế hoàn toàn Chúng là vi khuẩn tự dưỡng hoàn toàn Thời gian thế hệ của chúng là 10 - 14 ngày [44]

Thực tế, việc áp dụng quá trình Anammox trong xử lý nước thải rất khó Trở ngại chính là tốc độ sinh trưởng chậm của vi khuẩn Anammox đòi hỏi thời gian khởi động dài Hơn nữa, chúng là vi khuẩn kỵ khí và tự dưỡng hoàn toàn nên khó nuôi cấy

Nước thải lò mổ thường chứa máu, thịt, mỡ, lông, móng nên rất giàu protein và axit amin [27] Khi thải ra môi trường, các hợp chất này nhanh chóng bị vi sinh vật phân giải [14] Phân hủy protein trong nước thải giết mổ thường diễn ra theo các bước sau: protein chuyển hóa thành amon, tiếp đến amon được nitrat hóa, sau đó nitrat sẽ được khử đến sản phẩm cuối cùng là khí nitơ Trên con đường này protein được rất nhiều vi sinh vật sử dụng nên quá trình amon hóa diễn ra nhanh chóng trong khi các quá trình khác diễn ra chậm chạp Vì vậy, việc phân lập và tuyển chọn các vi khuẩn nitrat hóa và phản nitrat hóa nhằm bổ sung vào để xử lý nước thải ngành thực phẩm là yêu cầu thiết yếu

1.7 Tình hình nghiên cứu chế tạo và ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật trong xử lý nước thải ở Việt Nam

Hiện nay, một số chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho xử lý nước đang được lưu hành trên thị trường Việt Nam Một số chế phẩm thương mại đó được liệt kê tại bảng 1.4

Bảng 1.4 Một số chế phẩm thương mại sử dụng cho xử lý nước

AQUA

Bacillus sp., Pediococcus acidilactici, Streptococcus sp., Pichia, Dekkera

NH3 và H2S

Hoa Kỳ

Các chế phẩm vi sinh vật sử dụng cho xử lý nước thương mại có xuất xứ chủ yếu

ở nước ngoài Các chế phẩm này có giá thành cao Do đó, trong những năm gần đây

đã xuất hiện các nghiên cứu chế tạo và ứng dụng vi sinh vật vào xử lý nước tại Việt Nam Bảng 1.5 trình bày một số chế phẩm đã được nghiên cứu chế tạo bởi các nhà khoa học ở Việt Nam

Bảng 1.5 Một số chế phẩm sinh học được chế tạo và ứng dụng cho xử lý nước

Viện sinh học nhiệt đới [19]

Viện sinh học nhiệt đới [19]

6 BIO-YK

Lactobacillus spp 108 CFU/mL,

Bacillus spp 107 CFU/mL, Sacchromyces spp 107CFU/mL,

vi khuẩn quang dưỡng 105

CFU/mL

Xử lý chất thải trong điều kiện kỵ khí, phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải sinh hoạt, công nghiệp

Viện sinh học nhiệt đới [19]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nước thải được tập hợp tại các chợ giết mổ gia cầm trong địa bàn thành phố Việt Trì (Phú Thọ), nước thải được lấy trực tiếp tại các cống chứa nước thải trong chợ Lượng nước thải giết mổ được xả thải hàng ngày, trực tiếp xuống cống

Hình 2.1 Nước thải giết mổ gia cầm

- Hóa chất phân tích NO2-: C6H7NO3S,; CH3COOH; C10H9N;

- Hóa chất phân tích NH4+: NaKC4H4O6; HgI2; KI; NaOH;

- Các hóa chất nhuộm tế bào: dung dịch tím gentians; dung dịch lugol; dung dịch fucshin; C2H5OH 90%

- Các hóa chất sử dụng làm môi trường nuôi cấy: Cao nấm men (Ấn Độ), pepton (Trung Quốc), cao thịt (Trung Quốc), , agar (Việt Nam), (NH4)2SO4;

K2HPO4; MgSO4.7H2O; FeSO4.7H2O; NaCl; CaCO3; NaNO2; NaCl; Na2CO3; MnSO4; Na2MoO4.2H2O; KH2PO4; KNO3; NH4Cl; CH3COONa.3H2O; CaCl2.2H2O; ZnSO4.7H2O; CoCl2.6H2O; CuCl2; H3BO3; NiCl2.H2O, EDTA-Na2; EDTA-NaFe; NaOH (Trung Quốc)

- Các hóa chất phân tích ADN:

+ Makker: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp plus DNA Ladder

+ Tách chiết ADN: NaCl; Lysis buffer; lysozyme; CH3COOK; CHCl3-IAA; (Merck – Đức)

+ Trình tự các mồi xuôi và ngược như sau:

- Máy lắc ổn nhiệt ( Bio Shaker BR – 43FL, Nhật Bản),

- Thiết bị phân tích đa chỉ tiêu môi trường DR 2 00 (Hach, Mỹ),

- Kính hiển vi (Olympus, Nhật),

- Máy ly tâm (Tomy MX – 305, Nhật Bản),

- Máy đo pH (METTLERTOLEDO, Thụy Sỹ),

- Máy phá mẫu DRB 200, (Hach, Mỹ),

- Máy vortex (VELP, Đức),

- Cân điện tử (Farorius, Nhật),

- Nồi hấp thanh trùng (Tomy, Nhật Bản),

- Bộ điện di DNA (Scientific – Anh)

- Thiết bị chu trình nhiệt Mastercycler

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.2 Thuyết minh quy trình

a Nước thải giết mổ được lấy mẫu tại các chợ ở địa bàn thành phố Việt Trì – Phú Thọ

b Phân lập: Tiến hành pha loãng hàng loạt tới 10-6

rồi cấy trang trên đĩa thạch chứa môi trường Winogradsky I, Winogradsky II và DNM Các chủng phân lập được cấy chuyển riêng rẽ và làm sạch

c Đánh giá khả năng chuyển hóa và lựa chọn chủng: Các chủng sau khi đã cấy chuyển làm sạch được đem đi đánh giá khả năng chuyển hóa bằng bằng các phương pháp phân tích và tiến hành lựa chọn chủng có khả năng chuyển hóa cao nhất

d Định tên 16s RNA: Tiến hành tách DNA tổng số và phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA sau đó gửi đi giải trình tự

e Bước đầu ứng dụng xử lý nước thải giết mổ: Các chủng được tuyển chọn

tiến hành bổ sung vào trong nước thải giết mổ để khảo sát hiệu quả xử lý nước thải

10 phút Đo mật độ quang ở bước sóng 450 nm và lập đường chuẩn

- Xác định hàm lượng amon của mẫu nước thải đã tách cặn tương tự Hiệu suất chuyển hóa amon được xác định theo công thức:

m11: hàm lượng N-NH4 ban đầu (mg/L)

m12: hàm lượng N-NH4 còn lại sau thời gian nuôi cấy (mg/L)

b Phương pháp xác định hàm lượng NO 2 - [18]

- Lập đường chuẩn nitrit với chất chuẩn là NaNO2 có nồng độ: 0; 0,05; 0,1; 0,3; 0,4; 0,6; 0,8 và 1 mg/L Lấy lần lượt 50 mL dung dịch chuẩn vào bình tam giác, thêm 1 mL dung dịch Griess A và 1 mL dung dịch Griess B Lắc đều và

để ổn định trong 10 phút Đo mật độ quang tại bước sóng 520 nm Xác định hàm lượng nitrit của mẫu nước thải đã tách cặn tương tự Hiệu suất nitrit hóa được xác định theo công thức:

m21: hàm lượng N-NO2 sinh ra sau thời gian nuôi cấy (mg/L)

c Phương pháp xác định hàm lượng NO 3 - [34]

- Hàm lượng nitrat được xác định theo phương pháp số 8039 sử dụng kit thử

NO3- (Hach) bằng máy phân tích đa chỉ tiêu DR - 2800 Hiệu suất chuyển hóa

nitrat được xác định theo công thức sau:

m22: hàm lượng N-NO2 ban đầu (mg/L)

m31: hàm lượng N-NO3 sinh ra sau thời gian nuôi cấy (mg/L)

d Phương pháp xác định khí N 2 [24, 30]

- Hàm lượng khí N2 được xác định bằng cách xác định thể tích khí sinh ra và thành phần khí Thể tích khí sinh ra được xác định bằng thể tích khí chiếm chỗ trong xi lanh từ bình đẩy v à o Thành phần khí được xác định bằng máy sắc ký khí với detector dẫn nhiệt (GC - 8A, Shimadzu) với t h ể t í c h khí cấp cho máy là

0,5mL Hiệu suất sinh khí nitơ được tính xác định theo công thức sau:

m41: hàm lượng khí nitơ sinh ra (mg/L)

m32: hàm lượng N-NO3 ban đầu (mg/L)

chất lượng nước HACH DR - 2800

h Phương pháp xác định hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng (TSS) [13]

- Lấy một thể tích nhất định mẫu nước thải lọc qua giấy lọc (kích thước lỗ 0,45 µm) đã biết khối lượng Giấy lọc được sấy ở 105oC trong 2 giờ Để nguội trong bình hút ẩm, cân giấylọc

m2 : Khối lượng mẫu sau khi sấy ở 105oC (mg)

m1 : Khối lượng giấy lọc trước khi sấy (mg)

V thể tích mẫu được lọc (mL)

i Phương pháp xác định nitơ tổng [34]

Phân tích TN sử dụng bộ kit đo TN chuẩn của hãng HACH Quy trình đo TN dựa theo quy trình chuẩn số 10072 kèm theo của hãng với máy phân tích chất lượng nước HACH DR-2800 (Hach, 2007)

j Phương pháp nhuộm Gram [9]

- Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính

- Nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 0,5 - 1 phút, rửa nước;

- Nhuộm bằng dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;

- Khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 0 , giữ khoảng 30 giây cho đến khi vừa thấy mất màu, rửa nước;

- Nhuộm bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước và để khô

- Quan sát ở vật kính 100x: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng

2.2.4 Các phương pháp nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy

- Môi trường LB (Luria-Bertani) (g/L): Peptone: 10; Cao nấm men: 5; NaCl: 10; thạch: 20; pH = 7

- Môi trường phân lập vi khuẩn nitrit hóa (Winogradsky I – W1) (g/L):

(NH4)2SO4: 2; K2HPO4: 1; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,001; NaCl: 2; CaCO3: 1, thạch: 20; pH = 7,5

- Môi trường phân lập vi khuẩn nitrat hóa (Winogradsky II – W2) (g/L):

NaNO2: 1; K2HPO4: 1; MgSO4.7H2O: 0,5; FeSO4.7H2O: 0,001; NaCl: 0,3; Na2CO3: 1; MnSO4: 0,002, thạch: 20; pH = 7,5

- Môi trường phân lập vi khuẩn phản nitrat hóa (DNM): MgSO4.7H2O: 0,15 g/L; Na2MoO4.2H2O: 0,1g/L; KH2PO4: 1,5g/L; KNO3: 4,21g/L; NH4Cl: 2,5g/L;

CH3COONa.3H2O: 5,67g/L; CaCl2.2H2O: 7,4mg/L; MnSO4.H2O: 1mg/L; ZnSO4.7H2O: 3,6mg/L; CoCl2.6H2O: 0,4mg/L; CuCl2: 0,45mg/L; H3BO3: 0,01mg/L; NiCl2.H2O: 0,01mg/L, EDTA-Na2: 3,7mg/L; EDTA-NaFe: 12mg/L; thạch: 20 g/L; pH 7,0