Tìm hiểu đặc tính của chủng vi rút dengue típ 1 gây dịch tại hà nội từ năm 2000 đến nay

Bệnh sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm có tốc độ lây lan rất nhanh trên thế giới, cho đến nay vi rút Dengue đã được ghi nhận lưu hành ở trên 100 nước thuộc các k

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những số liệu và kết quả trong luận văn này

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, những số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

HỌC VIÊN

Nguyễn Ngọc Linh

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này tôi xin trân trọng cảm ơn :

 Ban Giám hiệu, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm và

Viện Đào tạo Sau Đại học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

 Ban Giám đốc, Ban chủ nhiệm Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin gửi tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn

Thị Thu Thủy, Trưởng phòng thí nghiệm Arbo, Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ

Trung ương đã tận tình chỉ bảo, dìu dắt và truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu từ những bước đầu tới khi hoàn thành luận văn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nâng cao và mở rộng kiến thức, để tôi có được kết quả như ngày hôm nay Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân

thành nhất đến PSG.TS Khuất Hữu Thanh, Phó giám đốc Trung tâm Nghiên cứu

và Phát triển Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học- Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã hướng dẫn tôi những kiến thức chuyên ngành với lòng nhiệt tình trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các Thầy, Cô giáo Viện Công nghệ

Sinh học- Công nghệ Thực phẩm đã cho tôi những kiến thức bổ trợ, vô cùng có

ích trong những năm học vừa qua

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Lê Thị Quỳnh Mai, Phó Viện trưởng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, TS Hoàng Vũ Mai Phương, TS

Nguyễn Lê Khánh Hằng, lãnh đạo Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

cùng các anh chị và các bạn đồng nghiệp công tác tại Phòng Thí Nghiệm Arbo,

Phòng Thí Nghiệm Dự án NIHE-Nagasaki, Khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và

hoàn thành luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Gia đình, những người thân và bạn bè

đã luôn bên cạnh giúp đỡ, ủng hộ, động viên, và khuyến khích tôi trên con đường sự nghiệp khoa học để tôi đạt được thành quả ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 25 tháng 04 năm 2016

NGUYỄN NGỌC LINH

MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CÁM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1.Bệnh sốt xuất huyết 3

1.1.1 Tổng quan về bệnh sốt xuất huyết trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình bệnh sốt xuất huyết ở Việt Nam 5

1.1.3 Tình hình bệnh sốt xuất huyết tại Hà Nội 7

1.1.4 Sự lưu hành vi rút Dengue tại Hà Nội từ năm 2000-2015 9

1.2.Vi rút Dengue 14

1.2.1 Vị trí phân loại 14

1.2.2 Hình thái 15

1.2.3 Đặc tính các protein của vi rút Dengue 18

1.2.4 Quá trình xâm nhập của vi rút vào tế bào 21

1.3.Dịch tễ học truyền bệnh 22

1.3.1 Vật chủ, vectơ và các chu kì truyền bệnh 22

1.3.2 Tiệu chứng lâm sàng 24

1.4.Biện pháp kiểm soát và phòng chống SD/SXHD 27

1.4.1 Chủ động giám sát bệnh SD/SXHD 27

1.4.2 Kiểm soát vectơ truyền bệnh 27

1.4.3 Vacxin phòng chống SD/SXHD 27

1.5.Chẩn đoán phòng thí nghiệm 28

1.5.1 Phương pháp huyết thanh học 29

1.5.2 Phương pháp phân lập vi rút 31

1.5.3 Phương pháp sinh học phân tử 31

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 37

2.1 Đối tượng và vật liệu 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Vật liệu 37

2.2 Phương pháp 41

2.2.1 Quy trình thực hiện xét nghiệm vi rút Dengue tại phòng thí nghiệm 41

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 42

2.2.3 Phương pháp phân lập vi rút trên tế bào 43

2.2.4 Phương pháp giải trình tự gen 45

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51

3.1 Kết quả lựa chọn dòng tế bào cảm nhiễm thích hợp 51

3.2 Kết quả giải trình tự gen vùng gen E của vi rút Dengue 1 53

3.3 Lựa chọn các chủng vi rút Dengue 1 sử dụng cho phân tích cây phát sinh loài 55

3.4 Kết quả so sánh độ tương đồng giữa các chủng vi rút Dengue típ 1 của Việt Nam 57

3.4.1 Độ tương đồng về Nucleotide giữa các chủng dengue típ 1 của Hà Nội 57

3.4.1 Độ tương đồng về Axit Amin giữa các chủng Dengue típ 1 của Hà Nội 58

3.5 Kết quả tạo cây chủng loại phát sinh Dengue típ 1 61

KẾT LUẬN 67

KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid Deoxy Ribonucleic

CDC Centers for Disease Control and Prevention

(Trung tâm phòng chống và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố ca bệnh theo giới tính 10

Bảng 1.2 Phân bố các típ huyết thanh lưu hành tại Hà Nội theo năm 12

Bàng 1.3 Phân chia cấp độ nặng nhẹ của sốt xuất huyết Dengue 25

Bảng 1.4 Biểu hiện lâm sàng của bệnh SXHD liên quan đến típ huyết thanh 26

Bảng 3.1.Các chủng DENV 1 phân lập tại Hà Nội giai đoạn từ 1998-2015 56

Bảng 3.2 Độ tương đồng về Nucleotide giữa các chủng Dengue típ 1 của Hà Nội 57 Bảng 3.3 So sánh độ tương đồng về Axit Amin của vi rút Dengue típ 1 tại Hà Nội 58

DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ

No table of contents entries found.Hình 3.5: Kết quả so sánh trình tự axit amin

của các chủng Dengue 1 lưu hành tại Hà Nội 59 Hình 3.6: So sánh độ tương đồng về axit amin của Dengue típ 1 tại Hà Nội giữa các năm 1999, 2004, 2008, 2009 60 Hình 3.7: Các kiểu gen của cây phát sinh loài của vi rút Dengue 1 63 Hình 3.8: Cây phát sinh loài của vi rút Dengue 1 66

BIỂU ĐỒ

Biều đồ 1.1: Phân bố bệnh nhân sốt xuất huyết theo năm và tháng 9 Biều đồ 1.2: Tỉ lệ bệnh nhân mắc sốt xuất huyết theo giới tính, 2000-2015 11 Biểu đồ 1.3: Phân bố típ huyết thanh của vi rút Dengue lưu hành tại Hà Nội 13 Biểu đồ 1.4: Tỷ lệ phần trăm phân bố tip huyết thanh của vi rút Dengue lưu hành tại Hà nội từ 2000-2015 13

MỞ ĐẦU

Hội chứng sốt xuất huyết do tác nhân vi rút là một nhóm các bệnh do vi rút như vi rút thuộc họ Flaviridae, Filoviridae, Bunyaviridae Một số loài vi rút gây bệnh thể nhẹ như sốt Nephropathia Scandinavia, Zika, trong khi đó một số khác có thể gây bệnh tương đối nặng, thậm chí có thể gây tử vong, chẳng hạn như sốt Lassa, Marburg, Ebola, Hanta, Crimea-Congo, và phổ biến nhất vẫn là sốt xuất huyết Dengue Bệnh sốt xuất huyết Dengue là một trong những bệnh truyền nhiễm có tốc

độ lây lan rất nhanh trên thế giới, cho đến nay vi rút Dengue đã được ghi nhận lưu hành ở trên 100 nước thuộc các khu vực có khí hậu nhiệt đới và á nhiệt đới, vùng Đông Nam Á, Tây Thái Bình Dương, Châu Mỹ, và Châu Phi [1] Việt Nam là quốc gia có tỉ lệ bệnh nhân sốt xuất huyết cao trong khu vực Đông Nam Á Theo số liệu thống kê của Bộ Y tế Việt Nam, trong 20 năm gần đây số mắc và chết do bệnh ngày càng gia tăng Từ năm 1998 trở lại đây tình hình bệnh sốt xuất huyết có diễn biến phức tạp, trong đó, miền Nam được ghi nhận là khu vực nóng nhất trong cả nước về

số ca mắc ,và chết Tuy nhiên, việc giám sát bệnh tại những khu vực khác như miền Bắc, miền Trung, và Tây Nguyên cũng là một vấn đề y tế cần quan tâm [2]

Trong hơn 20 năm trở lại đây, Việt Nam ghi nhận rất nhiều vụ dịch sốt xuất huyết lớn, như vào năm 1998 với 324.866 ca mắc và 384 trường hợp tử vong, căn nguyên của vụ dịch đó được xác định là vi rút Dengue típ 3 Ngoài ra không thể không nhắc đến vụ dịch lớn vào năm 2009,cả nước ghi nhận có 105,370 trường hợp mắc và 87 ca tử vong Riêng tại Hà Nội, số trường hợp mắc sốt xuất huyết ghi nhận 15.444 ca chiếm 87% số trường hợp mắc trong khu vực phía Bắc, số tử vong là 4 chiếm 100% so với toàn miền Bắc và nguyên nhân chính đó là vi rút Dengue 1 Năm 2015, khu vực miền Bắc, Việt Nam ghi nhận 16.047 ca mắc sốt xuất huyết, trong đó 90% các ca bệnh chủ yếu tập trung tại Hà Nội (14.560 ca bệnh) [4] Vi rút Dengue 1 và Dengue 2 là nguyên nhân gây ra vụ dịch này Chính do những nguyên nhân trên, chúng tôi muốn tiến hành nghiên cứu tìm hiểu về vi rút Dengue típ 1 gây

định, cũng như xác định sự tiến hóa về mặt di truyền của vi rút Dengue típ 1 lưu hành tại Hà Nội từ năm 2000- nay

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu:

"Tìm hiểu đặc tính của chủng vi rút Dengue típ 1 gây dịch tại Hà Nội, từ năm 2000 đến nay"

Với mục tiêu:

1 Xác định dòng tế bào cảm nhiễm thích hợp đối với chủng vi rút Dengue 1

2 Xác định độ tương đồng các trình tự nucleotide, axit amin, so sánh, lập sơ đồ cây phát sinh loại của vi rút Dengue típ 1 tại Hà Nội với các vi rút Dengue típ 1 phân lập tại các vùng khác ở Việt nam và trên thế giới, từ đó xác định

kiểu gen lưu hành, nguồn gốc giả định

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Bệnh sốt xuất huyết

1.1.1 Tổng quan về bệnh sốt xuất huyết trên thế giới

Bệnh sốt xuất huyết là bệnh truyền nhiễm cấp tính chủ yếu do vi rút Dengue (DENV) gây nên Bệnh lây truyền từ người sang người qua vật chủ trung gian truyền bệnh là muỗi vằn Bệnh có thể gây thành dịch và tỷ lệ tử vong tương đối cao,

cụ thể theo Tổ chức Y tế thế giới, mỗi năm có khoảng 100 triệu trường hợp mắc, tỷ

lệ tử vong trung bình do sốt xuất huyết khoảng 2,5-5% Bệnh lưu hành tại trên 100 quốc gia thuộc các khu vực có khí hậu nhiệt đới và á nhiệt đới như vùng Đông Nam

Á và Tây Thái Bình Dương, châu Mỹ, châu Phi với khoảng 2,5 tỷ người sống trong vùng nguy cơ [1,35] Sự lây lan nhanh chóng của vi rút Dengue và bệnh sốt xuất huyết là do sự kết hợp của các yếu tố: sự gia tăng đô thị hoá, tăng trưởng dân số, sự

di cư và sự giao lưu di chuyển trên thế giới, bên cạnh đó là những khó khăn trong việc kiểm soát có hiệu quả vector truyền bệnh Sự biến đổi khí hậu cũng phần nào là một yếu tố ảnh hưởng đến sự lây lan của sốt xuất huyết trên toàn thế giới [9]

Bệnh sốt xuất huyết đã được ghi nhận ở hầu hết các châu lục, trừ Nam Cực

Từ xa xưa, các bệnh có triệu chứng tương tự sốt xuất huyết đã được mô tả trong tài liệu ở Trung Quốc (992) và Tây Ấn (thế kỉ XVII) Những ghi nhận đầu tiên về bệnh sốt Dengue/ sốt xuât huyết Dengue (SD/SXHD) trên thế giới vào năm 1779 tại Jakarta (Indonesia) và Cairo (Ai Câp), 1780 tại Philadenphia (Mỹ) Tại khu vực châu Á có những tài liệu ghi chú về lịch sử bệnh SD/SXHD xảy ra từ những năm 1927-1928 tại Athens (Hy lap) làm khoảng 1250 người chết, 1953-1954 tại Philippine và trong vòng 20 năm sau đó bệnh SD/SXHD đã trải rộng khắp vùng Đông Nam châu Á tới Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc, Nam và Tây Thái Bình Dương, Châu Phi, châu Mỹ và vùng biển Caribean Tháng 5 năm 1945, lần đầu tiên tác nhân gây bệnh được phân lập bởi Alber Sabin từ những binh lính bị ốm tại Calcuta (Ấn Độ), NewGuinea và Hawaii Những chủng vi rút Dengue mà Sabin

nguyên giống nhau ngoài ra còn 3 chủng khác tại New Guinea, Sabin nhận thấy có

sự khác biệt về tính kháng nguyên với các chủng trên Hai chủng vi rút này được gọi là dengue típ 1 và dengue típ 2 Hai chủng vi rút dengue tiếp theo là dengue 3 và dengue 4 đã được William Mcd Hammon và cộng sự phân lập được từ những trẻ

em bị bệnh sốt xuất huyết tại vụ dịch ở Manila năm 1956 Tiếp theo sau đó rất nhiều chủng vi rút dengue được phân lập từ các vùng khác nhau trên thế giới nhưng tính kháng nguyên của chúng đều được định dạng trong 4 típ huyết thanh trên [16, 34]

Các nhà nghiên cứu về vi rút dengue đã sớm cho rằng bệnh SD/SXHD được lây truyền bởi muỗi nhưng mãi đến tận năm 1903, H Graham mới chứng minh

được điều này Năm 1906, T.L Brabcroft đã chỉ ra rằng muỗi Aedes aegypti chính

là vectơ chính truyền bệnh SD/SXHD.Những nghiên cứu sâu hơn về sau cho thấy

muỗi A Albopictus và A Polynesiensis cũng tham gia vào việc truyền bệnh này Tới năm 1997 vi rút dengue và muỗi A aegypti đã phát triển rộng trên toàn thế giới

Theo những nhà nghiên cứu hiện nay trên thế giới có hơn 2.5 tỷ người sống trong vùng nguy cơ dịch, mỗi năm có khoảng 100 triệu trường hợp mắc bệnh SD/SXHD trở thành vấn đề lớn ảnh hưởng tới sức khoẻ cộng đồng trên toàn cầu [12, 34, 36]

Hình 1.1 Tình hình mắc bệnh sốt xuất huyết trên thế giới năm 2015

Hình 1.2 Các nước có số ca mắc sốt xuất huyết trung bình/ năm cao trên thế giới

trong giai đoạn 2004-2010

1.1.2 Tình hình bệnh sốt xuất huyết ở Việt Nam

Việt Nam được xác định là một trong những nước đứng đầu khu vực Đông Nam châu Á và thế giới về tỷ lệ mắc và chết do bệnh SD/SXHD (hình 1.2).Ở Việt Nam, năm 1913 Gaide đã thông báo về bệnh sốt Dengue ở miền Bắc và miền Trung.Năm 1929, Boye đã mô tả về một vụ dịch Dengue ở miền Nam xảy ra năm 1927.Năm 1960 vụ dịch SXHD lớn được mô tả với 60 trường hợp tử vong [1,5] Những năm có dịch lớn xảy ra trên từng khu vực hay trên toàn lãnh thổ là: 1963,

trường hợp và số tử vong là 66 trường hợp Tuy nhiên từ năm 2004 đến năm 2009

số mắc và tử vong do sốt xuất huyết ngày càng có xu hướng gia tăng Trong đó phải

kể đến vụ dịch lớn vào năm 2009,cả nước ghi nhận có 105,370 trường hợp mắc và

87 ca tử vong Riêng tại Hà Nội, số trường hợp mắc sốt xuất huyết ghi nhận 16,090

ca chiếm 87% số trường hợp mắc trong khu vực phía Bắc, và căn nguyên chính của

vụ dịch này là DENV 1 [3]

Hình 1.3: Phân bố sốt xuất huyết Dengue tại Việt Nam năm 2013

Gần đây, số trường hợp mắc giảm từ 128.710 trường hợp năm 2010 xuống còn 69.854 trường hợp năm 2011, trước khi tăng lên 84.303 trường hợp năm 2012, với số ca tử vong lần lượt là 109, 61 và 77 ca Năm 2013 dịch sốt xuất huyết không

có sự gia tăng đột biến ở khu vực miền Bắc và Nam, nhưng lại tăng cao và bùng

83% tổng số trường hợp mắc của cả nước Năm 2014, tình hình dịch sốt xuất huyết

có chiều hướng giảm chỉ ghi nhận 37.149 trường hợp mắc, và 20 ca tử vong [4]

Năm 2015, dịch sốt xuất huyết bùng phát ở khu vực miền Bắc với 16.047 trường

hợp tăng gấp 4 lần so với số mắc trung bình khu vực miền Bắc giai đoạn 2010

-2014 (hình 1.4)

Hình 1.4.Số trường hợp mắc sốt xuất huyết tại Miền Bắc theo tháng, năm

2014, 2015, và trung bình giai đoạn 2010-2014

1.1.3 Tình hình bệnh sốt xuất huyết tại Hà Nội

Hà Nội là địa phương lưu hành dịch SXHD, dịch có khả năng diễn biến phức

tạp do sự ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ như: đô thị hóa diễn ra mạnh mẽ, di

biến động dân cư lớn, một số khu vực dân cư thiếu nước sạch, vệ sinh môi trường

kém, nhất là nơi học sinh, sinh viên, người ngoại tỉnh thuê trọ, các làng nghề buôn

bán phế liệu, phế thải, các công trình xây dựng nhiều tạo điều kiện cho muỗi sinh

sản Bên cạnh đó thời tiết phức tạp thuận lợi cho sự phát sinh, phát triển của véc tơ

truyền bệnh SXHD làm tăng nguy cơ bùng phát dịch [9]

Từ năm 2006-2011, Hà Nội ghi nhận 30.665 trường hợp mắc và 4 ca tử vong, số ca mắc trung bình/năm là 5.110 và tỷ lệ chết trên mắc là 0,013% Số mắc tập trung yếu ở khu vực nội thành chiếm 77,2% tổng số ca mắc Số mắc ghi nhận ở tất cả các tháng và đạt đỉnh vào tháng 9, 10 và 11 Các ca bệnh chủ yếu trên 15 tuổi chiếm 88,05% và phân bố đều ở cả hai giới Thể lâm sàng nhẹ chiếm 78,7%, thể lâm sàng nặng có sốc chiếm tỷ lệ rất ít Ghi nhận sự lưu hành của cả 4 típ vi rút, tuy nhiên DENV 1 và 2 có xu hướng trội hơn

Năm 2009 Hà Nội có 16.090 ca SXHD, số mắc tăng 6,7 lần so với năm

2008, tử vong 04 ca Bệnh nhân phân bố ở 29/29 quận huyện với 521/577 xã phường (90,3%), số quận huyện và xã phường có bệnh nhân đều tăng so với cùng

kỳ năm 2008 Dịch tản phát trên toàn thành phố chủ yếu là ổ dịch nhỏ

Năm 2010 Hà Nội có 3.122 ca mắc SXHD, không có ca tử vong, số mắc giảm 80,1% so với cùng kỳ năm 2009 (16.090 ca) Các ca bệnh phân bố ở 29/29 quận huyện Tỷ lệ xã phường có bệnh nhân giảm 24,3% so với cùng kỳ năm 2009

Hình 1.5 : Tỉ lệ mắc SXHD /100.000 dân tại Hà Nội năm 2013, 2014

Những năm gần đây, số mắc vẫn tập trung chủ yếu ở khu vực nội thành (chiếm 76%) như Đống Đa, Hoàng Mai, Hai Bà Trưng, Hoàn Kiếm, Thanh Xuân…

và các huyện ngoại thành nơi đô thị hóa cao như Từ Liêm, Thanh Trì 60% bệnh nhân

là đối tượng học sinh, sinh viên, người lao động tự do và người ngoại tỉnh (hình 1.5)

1.1.4 Sự lưu hành vi rút Dengue tại Hà Nội từ năm 2000- 2015

Theo báo cáo của Trung tâm Y tế Dự phòng Hà Nội, từ năm 2000-2015 có tổng số 51.163 trường hợp mắc sốt xuất huyết tại Hà Nội:

1.1.4.1 Phân bố ca bệnh theo các tháng tại Hà Nội từ năm 2000- 2015

Biều đồ 1.1: Phân bố bệnh nhân sốt xuất huyết theo năm và tháng

Tháng 12

Nino, cho nên các ca mắc sốt xuất huyết năm nay có xu hướng gia tăng muộn hơn

và kéo dài hơn so với mọi năm (từ tháng 7 – tháng 12)

1.1.4.2 Phân bố ca bệnh theo độ tuổi và giới tính

Bảng 1.1 Phân bố ca bệnh theo giới tính

Biều đồ 1.2: Tỉ lệ bệnh nhân mắc sốt xuất huyết theo giới tính, 2000-2015

So sánh với tỷ lệ mắc sốt xuất huyết ở các khu vực khác của Việt Nam, thì biểu đồ trên cũng cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ở nam và nữ là tương đối giống nhau, lần lượt là 50,66% và 49,34%

Tỷ lệ bệnh nhân mắc sốt xuất huyết là trẻ em dưới 15 tuổi chiếm tỷ lệ thấpkhoảng 10%, trong khi đó lại tập trung chủ yếu ở độ tuổi lao động chiếm tới 90% tổng số bệnh nhân toàn thành phố Kết quả này tương đồng với đặc điểm dịch

tễ học SXHD ở các tỉnh miền Bắc Tuy nhiên, kết quả này không tương đồng với các số liệu thu thập được ở miền nam Việt Nam về các trường hợp mắc SXHD với

tỉ lệ mắc SXHD ở trẻ em dưới 15 tuổi luôn chiếm tỉ lệ lớn hơn các nhóm tuổi khác

Cụ thể, theo kết quả nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học SXHD tại Bạc Liêu giai đoạn 2006-2012 của Phạm Thị Nhã Trúc cho biết nhóm tuổi mắc SXHD nhiều nhất là từ

6 - 15 tuổi chiếm 50,2% Độ tuổi mắc đang có chiều hướng tăng dần trong nhóm 16 -25 tuổi chiếm 27% và giảm dần từ 31 tuổi trở lên [5] Trong khu vực Đông Nam Á,

sự khác biệt về lứa tuổi hay mắc SXHD cũng rất rõ ràng, trong khi Thái Lan, Indonesia là những nước có tỉ lệ cao ca bệnh SXHD là trẻ em thì tại Malaysia, Philippin những người trên 15 tuổi mắc SXHD lại chiếm đa số [24] Trên thực tế tại

Hà Nội, lứa tuổi mắc bệnh trên 15 tuổi là một điều kiện thuận lợi cho công tác truyền thông phòng chống bệnh SXHD, tập trung truyền thông vào đối tượng từ vị thành niên trở lên - đối tượng có khả năng nhận thức cao và tự chăm sóc bản thân sẽ

50.66%

49.34%

Nam

Nữ

1.1.4.3 Sự phân bố các típ vi rút Dengue lưu hành tại Hà Nội

Trong giai đoạn 2000- 2015, tổng số 1.227 mẫu huyết thanh sớm của bệnh nhân nghi mắc sốt xuất huyết tại Hà Nội được xét nghiệm tại viện VSDTTU số mẫu dương tính là 419 mẫu chiếm 34.15%.Ghi nhận cả 4 típ vi rút dengue nhưng vi rút dengue 1 và dengue 2 vẫn chiếm tỷ lệ lớn 36.28 % và 44.87 % so với dengue 3 và dengue 4 là 11.69 % và 7.16 %, theo thứ tự (bảng 3.2) Sự xuất hiện của dengue 1 với tỷ lệ cao trong giai đoạn này tương đồng với những báo cáo của các nước láng giềng như Thái lan, Philippine, Trung Quốc, Lào và Campuchia Vì vậy việc tìm hiểu mối liên quan về dịch tễ học phân tử của vi rút dengue 1 lưu hành tại Hà Nội là cần thiết và đó cũng là mục tiêu chính của đề tài trên

Nhìn biểu đồ 1.4, chúng ta có thể thấy sự lưu hành xuyên suốt chủ đạo, cũng như vai trò gây bệnh của DENV 1 trong giai đoạn này là chủ yếu., với số mẫu bệnh phẩm phân lập dương tính với DENV 1 là 152 mẫu chiếm 36,28%

Bảng 1.2 Phân bố các típ huyết thanh lưu hành tại Hà Nội theo năm

Biểu đồ 1.3: Phân bố típ huyết thanh của vi rút Dengue lưu hành tại Hà Nội

Biểu đồ 1.4: Tỷ lệ phần trăm phân bố tip huyết thanh của vi rút Dengue lưu hành

Họ Flaviviridae bao gồm các vi rút có hệ gen là ARN mạch thẳng, sợi đơn

dương, có kích thước từ 9,6 đến 12,3kb, mã hóa cho 3 loại protein cấu trúc và 7 protein phi cấu trúc [12, 20] Đầu 5’ của genome có mũ là nucleotide được metyl hóa, chứa vùng gắn với ribosome.Vi rút có vỏ ngoài hình cầu, đường kính từ 40 đến

60 nm Bên cạnh chi Flavivirus, họ Flaviviridae còn bao gồm chi Hepacivirus, điển hình là vi rút viêm gan C và viêm gan G, và chi Pestivirus, chi này gồm các loài vi

rút gây bệnh cho các loài động vật như trâu, bò, cừu, dê…

Chi Flavivirus có khoảng 63 loài, bao gồm vi rút Dengue và một số loại vi

rút khác cũng có có vật chủ trung gian là động vật chân khớp, gây bệnh ở các mức

độ nghiêm trọng khác nhau, bao gồm vi rút gây bệnh sốt vàng, vi rút viêm não Nhật Bản B, vi rút gây bệnh sốt Tây Nile (West Nile) vi rút gây bệnh viêm não do ve

Các loại vi rút thuộc chi Flavivirus có đặc điểm giống nhau về cấu tạo, hình thái,

cấu trúc gen và phương thức sao chép vật chất di truyền [21] Bên cạnh đó, các

thành viên của chi Flavivirus có chung các quyết định kháng nguyên, điều này đem

lại những khó khăn nhất định trong việc xác định các thành viên riêng biệt của chi bằng phương pháp huyết thanh học Người ta cũng chỉ ra rằng các cá thể đã có miễn dịch với vi rút sốt vàng nếu bị tái nhiễm vi rút Dengue hoặc chủng ngừa với kháng nguyên Dengue có các phản ứng miễn dịch thứ phát

Vi rút Dengue có 4 típ huyết thanh, đó là vi rút Dengue típ 1, típ 2, típ 3 và típ 4, kí hiệu lần lượt là DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4

Hình 1.6 Vị trí phân loại của vi rút Dengue (theo hệ thống phân loại của

kép, chứa glycoprotein và protein có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào Vỏ

Group IV- ss (+) RNA virus

Flaviviridae

DENV Yellow fever virus WNV

Phân loại

Vi rút Dengue

capsit bao quanh axit nucleic tạo thành nucleocapsit có đường kính 30nm, chứa 32 capsome Vỏ hạt vi rút có những gai trên bề mặt gắn vào vỏ và các protein cấu trúc màng Nucleocapsid của vi rút bao gồm protein capsid và hệ gen ARN, chứa xấp xỉ khoảng 6% ARN, 66% protein, 17% lipit và 9% carbonhydrat [6, 9]

Hình 1.8 Cấu trúc bề mặt vỏ ngoài của DENV Các phần màu xanh chỉ các phân tử protein E dạng dimer nằm xen lẫn trên lớp

vỏ lipid

Hệ gen của nhóm Flavi là một phân tử ARN mạch dương với chiều dài xấp

xỉ 11Kb Hệ gen của DENV là một phân tử ARN sợi đơn, mạch dương, có chiều dài khoảng 10,700 nucleotide [12] Đầu 5’ của sợi ARN có mũ m7GpppAmp, đầu 3’ không được polyadenyl hoá Bên cạnh việc mã hoá cho protein của vi rút, genome của DENV còn chứa các cấu trúc ARN điều hoà các quá trình khác nhau của nó Sau khi nhiễm vào tế bào chủ, genome của DENV thực hiện chức năng như là một mARN để tiến hành dịch mã, và sau đó là làm khuôn tổng hợp ARN Các phân tử ARN mới được tổng hợp có thể tiếp tục được sử dụng để dịch mã hoặc được đóng gói trong protein capsid Các quá trình vừa nói ở trên được điều hoà bởi các yếu tố ARN có mặt trong các vùng mã hoá và không mã hoá của genome của vi rút, các vùng này hoạt động như là các promoter, enhancer và repressor Bên cạnh đó, trong quá trình nhiễm vào tế bào ARN của vi rút tham gia giúp vi rút tránh khỏi đáp ứng chống lại của tế bào vật chủ

Vùng khung đọc mở của ARN chứa khoảng 10,200 nucleotide, mã hoá cho

10 loại protein gồm 3 protein cấu trúc (C-prM-E) và 7 loại protein phi cấu trúc (NS1- NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)

Đầu 5’ UTR của DENV có chiều dài từ 95 đến 101 nucleotide, được chia làm 2 domain với chức năng khác nhau, chủ yếu liên quan đến quá trình khởi đầu tái bản ARN vi rút Đầu 3’UTR của DENV cũng đóng vai trò thiết yếu trong quá trình này.Vùng này có khoảng 450 nucleotide, chia thành 3 domain.Domain I nằm ngay phía sau bộ ba kết thúc, là vùng có mức độ biết đổi cao nhất giữa các týp huyết

thanh của DENV Domain II chứa các trình tự có mặt ở tất cả các Flavivirus có vật

chủ trung gian là muỗi Các trình tự của vùng ARN thuộc domain I và II đóng vai trò như là enhancer đối với quá trình tổng hợp ARN của vi rút Domain III là vùng

có cấu trúc bảo thủ nhất, chứa trình tự cần thiết cho quá trình tương tác ARN-ARN [12, 17]

Hình 1.9: Mô hình cấu trúc hạt vi rút Dengue

M

E Lipids từ vật chủ

Vùng cấu

trúc

Vùng không cấu trúc

CAP 5’

N.C.R

SợiARN đơn chứa khoảng 11,000 bazơ

650

Hình 1.10.Sơ đồ cấu trúc các vùng mã hoá và không mã hoá trên genome của

DENV

(CS: cyclization sequence UAR – upstream AUG region)

Hình 1.11 Các protein được mã hoá trong genome của vi rút DENV

1.2.3 Đặc tính các protein của vi rút Dengue

Protein Capsid (C)

Protein C có trọng lượng từ 9-12kDa, chứa 112 -127 axit amin và tích điện dương cao do có lượng lớn các axit amin Lys và Arg Tỷ lệ các axit amin cơ bản cao trong protein C sẽ trung hoà phân tử ARN vi rút tích điện âm với phân tử có liên quan Mức độ tương đồng của axit amin ban đầu trong protein C là thấp ở nhóm

flavivirus Tuy nhiên, vùng kỵ nước được bảo tồn Vùng kỵ nước này có thể dùng

để biệt hoá sự lắp ráp nucleocapsid tại vị trí màng và hoạt động như một trình tự nhận biết đối với prM

Protein màng (M)

Hai dạng protein M được đặc trưng bởi: prM có mặt ở các hạt vi rút chưa trưởng thành trong tế bào, và protein M có ở các hạt vi rút trưởng thành ngoài tế bào prM là một glycoprotein có trọng lượng 18.1- 19.1kDa là tiền thân của protein cấu trúc M có trọng lượng 7-9kDa chứa 75 axit amin Vị trí glycosyl hoá liên kết

đầu N của nhóm flavivius nằm trong phần protein của tiền thân M Sự phân tách

prM dẫn đến sự tái sắp xếp các cấu trúc oligo trên bề mặt của các hạt vi rút, nhằm thúc đẩy hoạt động gây nhiễm của các hạt vi rút trưởng thành Protein tiền màng (prM) có vẻ là cần thiết cho sự biểu hiện của cấu trúc kháng nguyên gốc

Các hạt vi rút có chứa protein prM có độ kháng axit gấp 400 lần so với các vi rút có chứa M trưởng thành Bằng chứng này cho thấy prM có thể hoạt động như một protein độc lập, bảo vệ protein E không bị sai lệch trong quá trình nảy chồi ra khỏi tế bào [17]

Protein vỏ (E)

Protein vỏ có trọng lượng phân tử 55-60kDa gồm 494- 501 axit amin là thành phần protein chính của bề mặt hạt vi rút và được glycosyl hoá ở hầu hết chứ

không phải ở tất cả các flavivirus Hai vị trí glycosyl hoá có khả năng liên kết đầu

N, axit amin Asn -67 và 153 có mặt trong protein E của 4 chủng vi rút Dengue

Protein bề mặt E-glycoprotein hạt vi rút chính là kháng nguyên quan trọng nhất liên quan đến chức năng sinh học của vi rút dengue và miễn dịch dịch thể Protein này có vai trò trong sự gắn kết vi rút với các tế bào dễ bị tổn thương dẫn đến

sự tăng trưởng các vi rút Kháng nguyên này cũng trung hoà dung hợp màng đặc hiệu vi rút, có khả năng cho phép các vi rút lây nhiễm mới thoát khỏi túi nội bào và khởi đầu chu kỳ sao chép trong tế bào Do các đặc tính sinh học, protein này kích thích cơ thể bệnh nhân tạo ra kháng thể trung hoà vi rút, kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu, kháng thể kháng dung hợp và kháng thể tăng cường vi rút Tầm quan trọng của protein này trong đáp ứng miễn dịchtrung gian tế bào cũng được xác

nhận Các thử nghiệm để xác định các vacxin flavivirus mới tạo điều kiện tìm hiểu

thêm mối liên quan giữa glycoprotein E và các protein bề mặt vi rút khác [17, 34]

Protein NS1

Protein NS1 có trọng lượng 42-50kDa chứa 353-354 axit amin Tất cả các

flavivirus có ít nhất một vị trí glycosyl hoá liên kết N bảo tồn tại vị trí 208-209 của

NS1 Chúng cũng chứa 12 phần cytine bảo tồn Dựa trên các nghiên cứu về vi rút

YF và JE, glycosyl hoá liên kết N của NS1 được cho là có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý và bài tiết Protein này tồn tại ở các dạng khác nhau khi được tìm thấy trên bề mặt tế bào hay khi được bài tiết vào môi trường ngoài tế bào Dạng đôi của NS1 được tìm thấy ở cả dịch nội và ngoại bào từ môi trường tế bào bị nhiễm Người ta gợi ý rằng NS1 đóng vai trò trong sự trưởng thành của hạt vi rút vì NS1 liên kết với protein E chưa trưởng thành trong lumen ER

Protein NS1 đã được xác định như là kháng nguyên gắn bổ thể hoà tan Dạng hoà tan được tiết ra có thể tạo nên các kháng thể có các hoạt động gắn bổ thể Vì được biểu hiện trên bề mặt của các tế bào lây nhiễm, NS1 có thể hoạt động như một mục tiêu cho đáp ứng miễn dịch

Các đoạn protein nhỏ không cấu trúc

NS2A, 2B, NS3, 4A là những protein nhỏ không cấu trúc Tất cả các đoạn protein này là vùng ít được bảo tồn trong chuỗi nhưng biểu hiện các vùng kỵ nước

được bảo tồn ở các flavivirus, cho thấy chúng là các protein liên kết màng Hầu hết

các chức năng của chúng vẫn chưa xác định được NS2A có vẻ là cần thiết đối với quá trình tạo ra đầu cuối C của NS1 NS2B (trọng lượng từ 13-15kDa của 130-132 axit amin) có liên quan đến chức năng protease của phức hệ NS2B – NS3 [11]

Các chức năng sinh vật học đặc biệt của NS4A (có trọng lượng phân tử từ 16.0 đến 16.4kDa của 149 đến 150 axit amin và NS4B (có trọng lượng phân tử từ 27-28kDa của 248-256 axit amin) vẫn chưa được xác định Chúng có thể liên quan

đến vị trí màng của các phức hệ sao chép NS3-NS5 thông qua tương tác protein với protein, do phức hệ NS3-NS5 là liên kết yếu với màng bất chấp các đặc tính ưa nước

1.2.4 Quá trình xâm nhập của vi rút vào tế bào

Nhóm flavivirus sao chép ở nhiều tế bào nuôi cấy có nguồn gốc từ động vật

và côn trùng chân khớp Trong tế bào động vật, các vi rút được sinh ra đi vào tế bào khác chủ yếu bởi thụ quan- nội bào trung gian Trong tế bào muỗi vi rút dengue 2 nhân lên có thể xâm nhập vào các tế bào muỗi khác hoặc đơn bào máu ngoại vi nhờ

sự dung hợp trực tiếp với màng bào tương Quá trình xâm nhập và cởi áo xảy ra bởi enzym phân giải nội bào với sự tạo thành thể túi Ngay khi vi rút ở bên trong tế bào, nucleocapsid loại bỏ được thực hiện nhờ sự dung hợp phụ thuộc axit của vi rút và màng hạt nội bào Quá trình sao chép bắt đầu với sự dịch mã trực tiếp trên hệ gen trần của vi rút Polyprotein dịch mã được xử lý và các protein vi rút, bao gồm các thành phần NS3 và NS5 được coi là sao chép, hình thành ARN hệ gen 44S, dạng sao chép mạch đôi và sao chép trung gian RF và RI là trung gian trong sao chép

ARN của hệ gen flavivirus RF có chức năng như là khuôn tái chế cho ARN vi rút -

phụ thuộc ARN polymerase trong quá trình sao chép vi rút [6, 9, 15,17]

Hình 1.12: Quá trình sao chép ARN của vi rút Dengue trong tế bào

dạng sao

chép

Bộ máyG olgi nhân

Endoplasmic reticulum

Plasma membrane

N C

R

Hạt vi rút

1.3 Dịch tễ học truyền bệnh

1.3.1 Vật chủ, vectơ và các chu kì truyền bệnh

Vi rút Dengue có vật chủ trung gian truyền bệnh là Aedes aegypti va Aedes albopictus [34] Ngoài vật chủ là người, nhiều chi động vật linh trưởng cũng nhạy cảm với vi rút Dengue Các loài thuộc chi Macacus, Pongidae, Certhopicicus, Cercocebus, Papio, Hylobates và Pancó thể nhiễm vi rút thông qua vết đốt của các

con muỗi mang vi rút Sự nhiễm vi rút ở các loài này thường không biểu hiện triệu chứng, nhưng xảy ra nhiễm trùng máu ở các mức độ đủ để tiếp tục lây nhiễm qua muỗi Các nghiên cứu ở Malaysia đã chỉ ra chu kỳ truyền bệnh trong rừng, liên

quan đến các loài khỉ và Aedesniveus – một loài muỗi hút máu cả khỉ và người Ngoài các vật chủ trung gian đặc trưng cho thành thị như Aedes aegyptivaAedes albopictus, một số loài khác cũng thuộc chi Aedes như Ae leutocephalus và Ae furcifer cũng là tác nhân gây bệnh [16]

Ở chu kì thành thị, vi rút được lây truyền bởi các loài muỗi kiếm ăn ở trong

và xung quanh các khu dân cư Vi rút lây truyền theo các con đường và các phương tiện giao thông

Aedes aegypti (muỗi vằn) là loài muỗi có kích thước trung bình, thân màu đen bóng, có nhiều vảy trắng bạc tập trung thành cụm hay đường trên thân Muỗi phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và ôn đới của các châu lục, là nơi có khí hậu nóng

ẩm, mưa nhiều, phù hợp với sự phát triển của nó tập trung ở thành phố, sau đó đến các đồng bằng ven biển và các làng mạc gần đường giao thông – là những nơi có dân cư đông đúc, nhiều dụng cụ chứa nước và các phương tiện giao thông thường xuyên qua lại Muỗi trưởng thành sống ở trong nhà, gần người, thường trú đậu nơi

có ánh sáng yếu, có độ cao khoảng 2 mét trở xuống, thường hoạt động vào ban ngày, cao điểm vào lúc sáng sớm và buổi chiều Muỗi cái thường hút máu một vài người trong một “bữa ăn” của chúng, do vậy có thể lây truyền vi rút cho nhiều người trong một lần hoạt động

Aedes albopictus (hay còn gọi là muỗi hổ Châu Á) là một loài muỗi nhỏ con,

có sọc trắng chạy dài từ đầu dọc theo lưng và ra tận phía sau chân, thân muỗi có khoang trắng Đây là một loài muỗi rất hiếu chiến, năng động, thường hoạt động đốt người vào giữa ban ngày và đặc biệt là vào lúc rạng đông hoặc khi trời về chiều, vừa chợp tối Muỗi đẻ trứng trên những diện tích ẩm ướt, ngay trên thành hoặc gần sát với mặt nước, trong những dụng cụ chứa nước tạm thời, nhưng nó vẫn ưa đẻ trứng tự nhiên trong rừng, trong vườn tại các hốc cây, kẽ lá, vũng nước dưới đất, vỏ dừa Hơn nữa, trứng muỗi có tính chống chịu cao, có thể tồn tại được qua mùa khô, phát triển thành nhộng và con trưởng thành vào mùa mưa tiếp sau đó [1, 8, 16]

1.3.2 Tiệu chứng lâm sàng

Các triệu chứng, hội chứng bệnh trong giai đoạn đầu thường giống các biểu hiện của nhiễm các vi rút bất kỳ nào như cúm, sởi, rubella…Theo TCYTTG năm

2009 hình thái lâm sàng của SXHD có các triệu chứng như sau :

 Sốt cao đột ngột, liên tục kéo dài từ 2 đến 7 ngày

 Nhức đầu, mệt mỏi, chán ăn, đau cơ khớp, nhức hai hố mắt

 Da sung huyết, phát ban Có biểu hiện xuất huyết như chấm xuất huyết ở dưới da hoặc chảy máu cam

 Đối với bệnh nhân mắc sốt xuất huyết Dengue, từ ngày thứ 2,3 trở đi, xuất hiện triệu chứng xuất huyết dưới nhiều hình thái:

 Dấu hiệu dây thắt dương tính

 Xuất huyết tự nhiên ở da, niêm mạc, vết bầm tím ở quanh nơi tiêm chích Chấm xuất huyết thường xuất hiện ở mặt trước hai cẳng chân, mặt trong hai cánh tay, bụng, đùi, mạng sườn hoặc mảng bầm tím Bệnh nhân có thể bị chảy máu mũi, lợi, đôi khi xuất huyết ở kết mạc, đi tiểu ra máu Kinh nguyệt kéo dài hoặc xuất hiện kinh sớm hơn kì hạn Trường hợp bệnh nhân bị bệnh nặng có thể bị xuất huyết tiêu hoá

 Ngoài ra, bệnh nhân có các biểu hiện: tăng dung tích hồng cầu ≥ 20%, tràn dịch màng bụng, màng phổi và hạ protein máu do huyết tương bị thoát ra ngoài thành mạch; có thể có dấu hiệu giảm tiểu cầu và bạch cầu Trong trường hợp biến chứng nặng, bệnh nhân sốt xuất huyết có thể bị suy tuần hoàn cấp, biểu hiện bởi các triệu chứng: li bì, lạnh đầu chi, da lạnh ẩm, mạch nhanh nhỏ, huyết áp hạ hoặc huyết áp kẹt (hiệu số giữa huyết áp tối đa và huyết áp tối thiểu ≤ 20mmHg) [1, 7, 16, 17, 39]

Hình 1.15 Sơ đồ phân loại các ca nhiễm vi rút Dengue theo TCYTTG [39]

Theo Tổ chức Y tế thế giới, bệnh nhân có đủ 4 triệu chứng sau là đủ tiêu chuẩn để chẩn đoán là SXHD: sốt 2-7 ngày, có biểu hiện xuất huyết, giảm tiểu cầu

và có dấu hiệu bị thoát huyết tương (cô đặc máu hoặc bị tràn dịch màng phổi, ứ huyết tương trong ổ bụng) là đủ cơ sở để chẩn đoán là bệnh nhân mắc bệnh sốt xuất huyết Dengue [7, 39] Tuỳ theo mức độ nặng nhẹ, người ta chia các ca mắc sốt xuất huyết ra làm 4 cấp độ (Bảng 1.2 )

Bảng1.3 Phân chia cấp độ nặng nhẹ của sốt xuất huyết Dengue

I Sốt đột ngột cùng với các triệu chứng không đặc hiệu Có dấu hiệu

dây thắt dương tính (đặc điểm thể hiện sốt xuất huyết duy nhất)

II Tương tự như cấp độ I, trừ việc có xuất huyết tự nhiên

III Có dấu hiệu suy tuần hoàn với các biểu hiện: mạch nhanh, yếu,

huyết áp kẹt (hiệu số < 20mmHg) hoặc tụt huyết áp

IV Sốc sâu, không bắt được mạch, không đo được huyết áp

Sốt xuất huyết Dengue (hiện

tượng thoát huyết tương)

Không xuất huyết

Sốt Dengue

Không

Hình 1.16 Sơ đồ tóm tắt các triệu chứng và thời gian xuất hiện của chúng khi mắc

sốt Dengue, sốt xuất huyết và sốc Dengue [1] Bảng 1.4 Biểu hiện lâm sàng của bệnh SXHD liên quan đến típ huyết thanh [46]

sánh với DENV-2 và DENV-4

DENV-2

DENV-3

Nhiễm thứ phát có biểu hiện lâm sàng rất nặng Nhiễm tiên phát thường có biểu hiện lâm sàng nặng hơn khi so sánh với DENV-2 và DENV-4 Nhiễm thứ phát cũng có biểu hiện khá nặng

Nhiễm trùng máu Đau đầu, đau cơ thể

Sốt Phát ban

Xuất huyết Giảm tiểu cầu

1.4 Biện pháp kiểm soát và phòng chống SD/SXHD

1.4.1 Chủ động giám sát bệnh SD/SXHD

Những thông tin sớm về nguy cơ bùng nổ dịch hoặc khả năng lan truyền của dịch có khả năng giúp cho hoạt động ngăn chặn và dập dịch được tiến hành một cách chủ động, do đó thiệt hại do dịch gây ra được giảm bớt Với mục đích dự báo dịch, các chuyên gia phải kiểm soát được sự lan truyền của vi rút dengue trong cộng đồng và có khả năng dự báo được khu vực nào đang có dịch SD/SXHD lưu hành, típ huyết thanh nào gây nên vụ dịch đó Theo Gubler (CDC, Mỹ) việc thiết lập hệ thống giám sát chủ động bệnh SD/SXHD tốt nhất nên chia làm ba nhóm đặt dưới sự kiểm soát của phòng thí nghiệm chức năng và có quan hệ chặt chẽ :

Mạng lưới giám sát lâm sàng tại cộng đồng

Hệ thống báo dịch

Hệ thống giám sát bệnh viện [1, 17]

1.4.2 Kiểm soát vectơ truyền bệnh

Do vectơ chính là muỗi A aegypti thường có tập quán sống trong nhà, hoá

chất diệt côn trùng nhằm diệt muỗi thường có ảnh hưởng nhất định Biện pháp kiểm soát vectơ chính hiện nay là giảm số lượng bọ gậy bằng phương pháp sinh học sử dụng Mesocyclop, đây là phương pháp dễ thực hiện, hiệu quả cao

1.4.3 Vacxin phòng chống SD/SXHD

Vacxin dengue được đề cập tới ngay sau khi phân lập được vi rút Dengue tại Nhật và Mỹ, hiệu quả phòng chống bệnh của loại vacxin này chưa được nhắc đến Hiện nay theo TCYTTG dự định phát triển một loại vacxin có khả năng chống bệnh SD/SXHD với cả 4 típ huyết thanh, bởi vì qua các vụ dịch đã xảy ra cho thấy kháng thể của các típ vi rút dengue khác nhau không tương đồng vì vậy không thể trung hoà vi rút chéo [34]

Trong 40 năm qua, cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau đã được sử dụng trong các phòng thí nghiệm để phát triển ra nhiều loại vắc xin trong đó có vắc xin sốt xuất huyết.Đầu những năm 2000, các nhà khoa học, Công ty Acambis (nay Sanofi Pasteur) thiết kế một thế hệ mới của vắc xin flavivirus, sử dụng công nghệ ADN tái tổ hợp Vi rút tái

tổ hợp (CYD1, CYD2, CYD3 và CYD4) được tạo ra bằng cách loại bỏ các gen mã hóa các premembrane (prM) và vỏ (E) protein từ vi rút sốt vàng YFV17D và chèn các gen tương ứng từ virus sốt xuất huyết Sử dụng công nghệ này, Sanofi Pasteur

đã phát triển thành công vaccine 4 thành phần vào một vacxin duy nhất.Vắc xin sốt xuất huyết là vắc xin mới sản xuất trên tế bào Vero theo công nghệ nuôi cấy hiện đại sử dụng các giá thể nuôi cấy tế bào là các hạt microcarrier với môi trường không huyết thanh

Tại Việt Nam, Sanofi Pasteur đã phối hợp cùng Viện Pasteur, thành phố Hồ Chí Minh triển khai tiến hành thử nghiệm tại thành phố Long Xuyên, tỉnh An Giang, và Mỹ Tho, Tiền Giang, với 2.336 trẻ trong độ tuổi từ 2-14 tuổi Kết quả nghiên cứu đã đánh dấu mốc quan trọng trong lịch sử phòng chống sốt xuất huyết Dengue trên thế giới, khi loại vắc xin này giúp ngừa được 56,5% ca sốt xuất huyết

có triệu chứng, giảm được 88,5% ca sốt xuất huyết thể nặng và làm giảm 67% nguy

cơ nhập viện do sốt xuất huyết Tuy nhiên tính an toàn của vắc xin trong nghiên cứu

sẽ tiếp tục được theo dõi đến năm 2017

1.5 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Để xác định một cách chắc chắn bệnh nhân có bị nhiễm vi rút dengue hay không chỉ có thể thực hiện tại các phòng thí nghiệm Tùy vào loại mẫu hay thời gian lấy mẫu (số ngày sau khi nhiễm vi rút) mà chúng ta có thể lựa chọn phương pháp xét nghiệm phù hợp để phát hiện kháng nguyên, vật liệu di truyền hay kháng thể của vi rút trong huyết thanh bệnh nhân [4, 7, 8]

Hình 1.17 Thời gian tồn tại của kháng nguyên, kháng thể trong huyết thanh bệnh

nhân

Trong phòng thí nghiệm, một số phương pháp sau thường được sử dụng để chẩn đoán sự có mặt của vi rút Dengue:

1.5.1 Phương pháp huyết thanh học

Các phương pháp huyết thanh học được sử dụng trong phòng thí nghiệm để phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue như:

 Phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu

HI là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi, thường xuyên vì nó có độ nhạy cao, dễ thực hiện Kháng thể HI tồn tại lâu (có thể tới 48 năm) vì vậy HI còn là phương pháp lý tưởng để giám sát dịch tễ huyết thanh học Phương pháp này chỉ có thể xác định được nhiễm vi rút Dengue nói chung, không thể xác định được týp của vi rút

Dengue đã nhiễm.Phản ứng HI chỉ có giá trị trong chẩn đoán khi có mẫu huyết thanh

Mẫu huyết thanh đơn không có giá trị trong chẩn đoán Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng

 Phản ứng trung hoà (NT)

Trung hòa là hiện tượng vi rút bị bất hoạt khi có mặt của kháng thể đặc hiệu Hỗn hợp vi rút và kháng thể được trộn lẫn trong điều kiện thích hợp và sau đó gây nhiễm vào tế bào, trứng hay động vật Sự hiện diện của các vi rút không bị bất hoạt

có thể được phát hiện bởi các hiện tượng tạo đám hoại tử, ngưng kết hồng cầu hay gây bệnh cho động vật… Phản ứng trung hòa là một phản ứng nhạy và rất đặc hiệu,

có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian thực hiện phản ứng kéo dài (3 ngày) và phải làm việc trực tiếp với kháng nguyên là các vi rút sống, đặc biệt là các tác nhận nguy hiểm nên các bước thực hiện thí nghiệm phải tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3

 Phản ứng miễn dịch hấp phụ liên kết men (ELISA) : MAC- ELISA và

GAC-ELISA

Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gắn enzyme được Engval và Perlmann phát triển vào năm 1970 và được ứng dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm trên thế giới cho đến nay Thử nghiệm ELISA phát hiện kháng thể IgG, IgM được xem như một phương pháp huyết thanh học đặc hiệu để chẩn đoán nhiễm bệnh do vi rút Kháng thể có trong mẫu huyết thanh cần xét nghiệm sau khi gắn với kháng nguyên đã gắn trên giá rắn sẽ được phát hiện bằng kháng thể khác Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp ELISA phụ thuộc vào thời gian tồn tại của kháng thể IgM, IgG trong huyết thanh bệnh nhân (hình 1.17) Thử nghiệm ELISA nhìn chung đã thay thế các

kỹ thuật khác nhằm phát hiện các kháng thể vì đơn giản, độ nhạy cao, nhanh và dễ dàng thực hiện với số lượng mẫu lớn ở thực địa

1.5.2 Phương pháp phân lập vi rút

Có thể sử dụng các hệ thống sau để phân lập vi rút Dengue :

 Cấy truyền trên não chuột ổ (1-3 ngày tuổi)

 Cấy truyền trên các dòng tế bào

 Cấy truyền trên muỗi trưởng thành

Trong đó, phương pháp phân lập trên các dòng tế bào là phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi nhất vì có độ nhạy tương đối cao và có khả năng giải quyết được một số lượng mẫu lớn dễ dàng trong thời gian ngắn Sau khi khuếch đại

vi rút trên các dòng tế bào, người ta xác định týp huyết thanh của vi rút bằng các phương pháp sinh học phân tử như PCR, Realtime PCR, bên cạnh đó kĩ thuật miễn dịch huỳnh quang (IFA), sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các týp huyết thanh kết hợp với kháng thể kháng IgG chuột gắn huỳnh quang cũng có thể sử dụng

từ máu hoặc huyết thanh bệnh nhân

Phản ứng RT-PCR là phản ứng khuếch đại một đoạn khuôn mẫu ARN theo

- Giai đoạn thứ nhất Phiên mã ngược khuôn mẫu ARN thành sợi ADN bổ

sung (cADN)

- Giai đoạn thứ hai: giai đoạn thực hiện phản ứng PCR

ARN được cấu tạo nhờ bốn loại nucleotide (adenine, guanine, cytosine và uracil) liên kết với nhau tạo thành một chuỗi đơn Khi chuỗi nucleotide này được biến đổi thành ADN thì uracil (U) được thay thế bằng thymine (T) Phản ứng biến đổi ARN hệ gen thành sợi ADN bổ sung phải nhờ đến một enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) do vậy giai đoạn này được gọi là phiên mã ngược (RT), sau đó quá trình tổng hợp sợi đôi ADN lại nhờ một enzyme khác là ADN polymerase I Khi đã có ADN sợi đôi từ khuôn mẫu ARN thì phản ứng tiếp theo sẽ

là khuếch đại gen nhờ kỹ thuật PCR được thực hiện với ba mức nhiệt độ phù hợp ở mỗi chu kỳ Toàn bộ phản ứng khuếch đại một đoạn ADN từ khuôn mẫu ARN trải qua hai giai đoạn nói trên được gọi là RT-PCR

Đối với việc phát hiện và xác định týp huyết thanh của vi rút Dengue có trong huyết thanh bệnh nhân, người ta thường sử dụng các cặp mồi để nhân lên các trình tự xác định trong vùng mã hoá gen C-prM của vi rút Giai đoạn 2 của phản ứng PCR có sự tham gia của các mồi đặc hiệu của 4 típ vi rút, sau khoảng 30 chu kì nhiệt sản phẩm ADN đặc hiệu cho 4 típ vi rút sẽ được nhìn thấy sau khi điện di, đó

là các băng dương tính với độ dài khác nhau Mẫu bệnh phẩm sử dụng trong phương pháp này thường là huyết thanh bệnh nhân nghi SXH, nhưng hiện nay rất nhiều công trình khoa học đã công bố những nghiên cứu về phát hiện vật liệu di truyền của vi rút Dengue trong nước bọt, nước tiểu, hay gan của bệnh nhân tử vong [13, 27, 30]

Ngày nay, người ta đã cải tiến phương pháp RT-PCR qua 2 giai đoạn này thành chỉ còn một lần chạy PCR duy nhất Phương pháp này được gọi là phương pháp Multiplex RT-PCR, nó không những giữ nguyên các ưu điểm của phương pháp RT-PCR truyền thống như nhanh, đặc hiệu, nhạy và cho kết quả chính xác, mà còn giúp giảm giá thành khi thực hiện phản ứng, đơn giản hoá các bước kỹ thuật,

nhờ đó có thế áp dụng rộng rãi hơn trong việc chẩn đoán và nghiên cứu sốt xuất huyết trong phòng thí nghiệm [25,31]

Phản ứng real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một hệ thống “đóng” Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, có độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm.Tuy nhiên, phản ứng real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao [25, 31, 41]

 Giải trình tự nucleotide

Vào giữa thập niên 80, việc giải trình tự trực tiếp của các vùng gen đặc hiệu

đã được áp dụng cho việc nghiên cứu nhiều loại vi rút khác nhau Các phân tích đầu tiên của sự đa dạng vi rút dengue đã sử dụng trình tự nucleotide khá ngắn để so sánh hoặc sử dụng rất ít các chủng vi rút khác nhau Cùng với sự phát triển của khoa học

kỹ thuật đặc biệt là cách mạng sinh học phân tử, các nghiên cứu về sự tiến hoá của

vi rút dengue và độc tính của nó cũng được quan tâm Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc làm thế nào để hiểu các thông tin di truyền nhiều hơn các nghiên cứu

về tiềm năng gây bệnh của vi rút dengue Việc phân loại các vi rút thành các nhóm

di truyền (các kiểu gen) trong các típ huyết thanh đã liên tục thay đổi do các phương pháp phân tích chuỗi trình tự và tiến hoá được cải tiến, và nguồn dữ liệu có sẵn mở rộng [10, 17, 24]