Tìm hiểu căn nguyên virut gây viêm phổi cấp tại miền bắc việt nam 2007 2009

Bệnh viêm phổi cấp do căn nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - đó là thời gian mà số mắc trong cộng đồng tăng cao, ví dụ: dịch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa đông tại

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

- NGÔ HƯƠNG GIANG

TÌM HIỂU CĂN NGUYÊN VI RÚT GÂY VIÊM PHỔI CẤP TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM

2007-2009

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin trân trọng cảm ơn:

Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, khoa Công nghệ Sinh học-Công nghệ Thực phẩm-Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Ban Giám đốc, Ban Chủ nhiệm khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

Đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS.Lê Thị Quỳnh Mai, Trưởng khoa Vi rút, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, đã tận tình

giúp đỡ tôi từ những bước đi đầu tiên vào lĩnh vực vi rút học và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện cho tôi nâng cao và mở rộng kiến thức để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các anh chị em, các bạn đồng nghiệp công tác tại Trung tâm Cúm Quốc Gia - Khoa vi rút đã nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ tôi trong

suốt quá trình thực hiện luận văn

Nhân dịp này tôi cũng xin bày tỏ lòng tri ân tới: Ông bà, Bố Mẹ, – những

người có công sinh thành nuôi dưỡng, dạy dỗ, đã hết lòng vì tôi có được thành quả

hôm nay Cám ơn các anh chị em tôi, toàn thể người thân trong gia đình và tất cả bạn bè đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian vừa qua

Tôi cũng xin gửi lời cám ơn tới Chồng tôi – người luôn bên tôi động viên,

chia sẻ những khó khăn và hạnh phúc trong cuộc sống hàng ngày

Với tấm lòng chân thật và biết ơn mãi mãi!

Hà Nội,24 tháng 10 năm 2010 Ngô Hương Giang

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những số liệu và kết quả trong luận văn này

Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi, những số liệu, kết quả trong nghiên cứu, các nhận xét, kết luận trong luận án này là do tôi thực hiện một cách nghiêm túc, khách quan dựa trên những số liệu có thật được thu thập tại Trung tâm Cúm quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Học viên Ngô Hương Giang

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phòng

ngừa và kiểm soát bệnh, Mỹ)

RSV Respiratory Syncytial Virus (Vi rút hợp bào đường hô hấp)

RT-LAMP Reverse transcriptase-Loop-mediated isothermal

amplification-RT-LAMP (Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược)

RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Phản ứng

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các vi rút gây bệnh VĐHHC 12

Bảng 2.1 Số bệnh nhân nghi viêm phổi cấp tại Miễn Bắc Việt Nam, 2007-2009 36

Bảng 2.2 Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền vi rút bằng phương pháp RT- PCR 39

Bảng 2.3 Bảng mô tả trang thiết bị 41

Bảng 2.4 Thành phần cho 1 phản ứng 44

Bảng 2.5 Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT-PCR 45

Bảng 3.1: Bệnh phẩm VĐHHC phân bố theo tháng 48

Bảng 3.2: Bệnh phẩm VĐHHC phân bố ca bệnh theo giới 49

Bảng 3.3: Bệnh phẩm VĐHHC phân bố theo độ tuổi 50

Bảng 3.4: Tỷ lệ dương tính với căn nguyên vi rút gây VĐHHC 52

Bảng 3.5: Kết quả xét nghiệmmẫu bệnh phẩm dương tính phân bố theo họ 53

Bảng 3.6: Tác nhân vi rút gây VĐHHC ( 1/2007 đến 5/2009) 55

Bảng 3.7: Kết quả xét nghiệm theo tháng 56

Bảng 3.8: Sự cảm nhiễm của vi rút cúm theo nhóm tuổi: 57

Bảng 3.9: Sự cảm nhiễm của vi rút RSV theo nhóm tuổi: 58

Bảng 3.10: Sự cảm nhiễm của vi rút picorna theo nhóm tuổi: 59

Bảng 3.11: Số mẫu dương tính do căn nguyên vi rút A/H5N1 61

Bảng 3.12: Số bệnh phẩm thu thập và nhiễm vi rút cúm A/H5N1 theo thời gian 61

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm 13

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của vi rút cúm 15

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae 18

Hình 1.4 Cấu trúc virion của Picornaviridae 20

Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp protein của vi rút polio 21

Hình 2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch họng 37

Hình 2.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch mũi 38

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm sàng lọc vi rút cúm A/B 47

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm phân típ vi rút cúm AH3N2, A/H1N1, A/H5N1 47

Hình 3.3 Kết quả điện di sản xác định vi rút RSV và hMPV 47

Biểu đồ 3.1: Biểu đồ về số mẫu thu thập theo tháng 49

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ các trường hợp VĐHHC theo giới tại các tỉnh Miền Bắc 2007-2009 50 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ các trường hợp mắc VĐHHC phân bố theo độ tuổi 51

Biểu đồ 3.4: Số bệnh phẩm dương tính và số mẫu thu thập theo các năm 52

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ % số bệnh phẩm dương tính với các tác nhân vi rút gây VĐHHC 53 Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ % các họ vi rút gây VĐHHC 54

Biểu đồ 3.7 Tỷ lệ % các căn nguyên vi rút gây VĐHHC 55

Biểu đồ 3.8: Kết quả xét nghiệm theo tháng 56

Biểu đồ 3.9: Sự cảm nhiễm của vi rút cúm theo nhóm tuổi 58

Biểu đồ 3.10: Sự cảm nhiễm của vi rút RSV theo nhóm tuổi 59

Biểu đồ 3.11: Sự cảm nhiễm của vi rút picorna theo nhóm tuổi 60

Biểu đồ 3.12: Số bệnh phẩm thu thập và nhiễm vi rút cúm A/H5N1 theo thời gian 62

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình và biểu đồ

Mục lục

ĐẶT VẤN ĐỀ 10

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 CÁC VI RÚT ĐƯỜNG HÔ HẤP 12

1.1.1Vi rút họ Orthomyxoviridae 12

1.1.2Vi rút họ Paramyxoviridae 16

1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae 19

1.2 SỰ LƯU HÀNH CỦA VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP 21 1.2.1 Trên Thế giới 21

1.2.2 Tại Việt Nam 23

1.3 DỊCH TỄ HỌC BỆNH VĐHHC DO VI RÚT 24

1.3.1 Ổ chứa 24

1.3.2 Phương thức và thời gian lây truyền 24

1.3.3 Tính cảm nhiễm và đáp ứng miễn dịch 25

1.4 SINH BỆNH HỌC 26

1.5 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG 27

1.6 DỰ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ 27

1.6.1 Dự phòng 27

1.6.2 Điều trị 29

1.7 CHẨN ĐOÁN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 30

1.7.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyên 30

1.7.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 33

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36

2.1.1 Định nghĩa ca bệnh 36

2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm thu thập 36

2.2 VẬT LIỆU 37

2.2.1 Mẫu bệnh phẩm 37

2.2.2 Sinh phẩm 39

2.2.3 Các chủng vi rút mẫu chứng: 40

2.2.4 Trang thiết bị và dụng cụ 41

2.3 PHƯƠNG PHÁP 42

2.4 AN TOÀN SINH HỌC 46

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 47

3.1 KẾT QUẢ ĐIỆN DI SẢN PHẨM RT-PCR 47

3.2 TÌNH HÌNH THU THẬP MẪU BỆNH PHẨM, 2007-2009 48

3.2.1 Sự phân bố bệnh phẩm theo tháng 48

3.2.2 Phân bố ca bệnh theo giới 49

3.2.3 Phân bố theo độ tuổi 50

3.3 XÁC ĐỊNH CĂN NGUYÊN 51

3.3.1 Tỷ lệ các căn nguyên vi rút được xác định trong các mẫu bệnh phẩm thu thập từ tháng 1/2007 đến 5/2009 52

3.3.2 Kết quả xét nghiệm phân bố theo họ 53

3.3.3 Kết quả xác định căn nguyên vi rút gây VĐHHC 1/2007 đến 5/2009 54

3.3.4 Phân tích sự lưu hành của các tác nhân vi rút theo tháng 56

3.4 SỰ LIÊN QUAN GIỮA TÁC NHÂN LÂY NHIỄM VÀ CÁC LỨA TUỔI 57

3.4.1 Sự cảm nhiễm của vi rút cúm theo nhóm tuổi 57

3.4.2 Sự cảm nhiễm của vi rút RSV theo nhóm tuổi 58

3.4.3 Sự cảm nhiễm của vi rút picorna theo nhóm tuổi 59

3.5 SỰ LƯU HÀNH CỦA VI RÚT CÚM A/H5N1 TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM 60

3.5.1 Sự lưu hành của vi rút cúm A/H5N1 61

3.5.2 Sự liên quan về thời gian giữa số bệnh phẩm thu thập và nhiễm vi rút cúm A/H5N1 được xác định 61

3.6 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VĐHHC 62

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 64

4.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC HỘI CHỨNG VĐHHC 64

4.1.1 Đặc điểm phân bố theo tháng trong năm 64

4.1.2 Đặc điểm về giới tính 65

4.1.3 Đặc điểm về tuổi 65

4.2 CĂN NGUYÊN CÁC VI RÚT GÂY VĐHHC TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM, 2007-2009 66

4.2.1 Căn nguyên là vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae 67

4.2.2 Căn nguyên là các vi rút đường hô hấp khác 69

KẾT LUẬN 73

KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hội chứng viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC) do căn nguyên là vi rút hoặc

vi khuẩn chủ yếu hay gặp tại các nước có kiểu hình khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều Một số tác nhân có thể gây nên các vụ dịch lẻ tẻ hoặc thành đại dịch (dịch cúm, vi rút hợp bào hô hấp – Respiratory Sycytial Virus…) [5, 28, 48] Tác nhân vi rút gây

bệnh thường gặp là: vi rút thuộc họ Picornaviridae, Paramyxoviridae (RSV, vi rút á cúm…), Orthomyxoviridae (vi rút cúm A, B…) [1, 12, 48] Trong đó, vi rút cúm

được xem là một trong những căn nguyên quan trọng nhất gây bệnh VĐHHC [47,

54, 70] Hiện nay có khoảng hơn 200 loại vi rút có cấu trúc kháng nguyên khác nhau gây bệnh VĐHHC

Trên Thế giới, hội chứng VĐHHC xuất hiện quanh năm ở các vùng ôn đới, nhất là vào thời gian thời tiết lạnh và ẩm Bệnh viêm phổi cấp do căn nguyên vi rút thường mang tính chất “mùa” - đó là thời gian mà số mắc trong cộng đồng tăng cao,

ví dụ: dịch cúm theo mùa, RSV thường tập trung vào mùa đông tại các nước ôn đới thuộc khu vực Bắc bán cầu, á cúm (phân típ 1 và 2) là nguyên nhân chính gây viêm phổi cấp vào mùa thu và đầu đông, trong khi cao điểm của nhiễm vi rút entero lại vào cuối hè… Viêm phổi do vi rút có ảnh hưởng lớn tới sức khỏe đặc biệt đối với trẻ em và người già tại các nước đang phát triển Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO) có khoảng 4.5 triệu trẻ em dưới 5 tuổi tử vong hàng năm do viêm phổi cấp và căn nguyên vi rút chiếm 40% trong tổng số đó

Tại Việt Nam, bệnh VĐHHC xảy ra quanh năm, có tỷ lệ mắc đứng đầu trong 10 bệnh truyền nhiễm cấp tính [11] Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về viêm phổi cấp do căn nguyên vi rút cũng như tác nhân nào là chủ yếu và thường gặp Đặc biệt các nghiên cứu về vi rút học vẫn còn nhiều hạn chế và các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm về bệnh VĐHHC chưa được phổ biến rộng rãi,

đó là lý do chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

“Tìm hiểu căn nguyên vi rút gây viêm phổi cấp tại Miền Bắc Việt Nam, 2007-2009”

Với mục tiêu:

1 Xác định các tác nhân vi rút gây viêm phổi cấp lưu hành tại Miền Bắc

Việt Nam, 2007-2009 bằng phương pháp RT-PCR

2 Hoàn thiện các quy trình chẩn đoán nhiễm vi rút đường hô hấp trên bệnh

phẩm lâm sàng thu thập tại đường hô hấp trên

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Orthomyxoviridae là họ vi rút đa hình thái, có vỏ ngoài, genome là ARN đơn,

âm, phân đoạn Trước đây, các vi rút Orthomyxo và Paramyxo đều được xếp chung vào một họ là Myxoviridae do chúng có cấu trúc và khả năng lây bệnh giống nhau, nhưng về sau được tách thành 2 họ riêng là Orthomyxoviridae và Paramyxoviridae

do phát hiện thấy chúng còn nhiều đặc điểm cơ bản không giống nhau [12, 48]

Vi rút Orthomyxoviridae gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút

cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa [48] Trong đó vi rút cúm A lưu hành phổ biến

trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa… là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ nhưng cũng có thể bộc phát thành dịch vào mùa đông, đặc biệt là ở trẻ em Vi rút cúm C chưa thấy biểu hiện gây bệnh nguy hiểm cho người

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc virion của vi rút cúm [18]

Virion có vỏ đa hình thái, thường có hình cầu với cấu trúc xoắn, đường kính 80-120nm nhưng đôi khi cũng thấy dạng sợi dài đến vài µm Genome của vi rút cúm A và B được chia thành 8 phân đoạn, đơn âm với tổng khối lượng 5x106

Trong virion có chứa enzyme ARN-polymerase phụ thuộc ARN, enzyme này cần cho quá trình phiên mã vì genome là ARN chuỗi âm Protein capsid kết hợp với ARN tạo nucleocapsid đối xứng xoắn Nucleocapsid được bao bọc bởi màng protein nền M1 (M: Matrix) phía ngoài màng lại được bao bọc bởi vỏ ngoài là lớp lipid kép

có nguồn gốc từ màng sinh chất của tế bào chủ Protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, tạo thành các kênh ion, làm cho pH trong endosome thay đổi [12]

Bề mặt vi rút có đính các gai bản chất là glycoprotein, đó là kháng nguyên hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Protein HA gây ngưng kết hồng cầu

và có vai trò gắn vi rút vào tế bào vật chủ, protein NA có vai trò phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào để giải phóng vi rút

1.1.1.2 Cấu trúc phân tử

Vật liệu di truyền của vi rút cúm A, B là 8 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc: NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B

Protein HA gồm 1.742-1.778 nucleotid mã hóa cho 562-566 axit amin, protein

HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, gắn với thụ thể chứa axit sialic trên bề mặt tế bào và giúp vi rút xâm nhập vào tế bào Protein HA tồn tại dưới 2 dạng: dạng tiền thân không phân tách là HAo hoặc dạng phân tách thành HA1 và HA2 liên kết với nhau bởi cầu nối disulfua (S-S) Sự phân tách này là điều kiện quyết định để vi rút có khả năng gây nhiễm và lây truyền của vi rút [64] Ngoài ra, vị trí axit amin trên gen HA có vai trò gắn với thụ thể tế bào chủ cũng đóng vai trò quan trọng trong việc lây truyền vi rút cúm Vi rút cúm người gắn vào thụ cảm thể trên tế bào chủ tại cổng 2.6 (SAα- 2,6 Gal) [42]

Protein NA có 1413 nucleotid mã hóa cho 453 axit amin Protein NA có bản chất là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng vi rút từ tế bào nhiễm và lan trải vi rút trong đường hô hấp Các đột biến tại vị trí axit amin: 275,

295 ở NA của típ N1 hay 292 ở NA của típ N2 liên quan sự kháng hoặc giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút (Osertamivir và Zanamivir) Sự đột biến này được cho

là kết quả của quá trình cạnh tranh sinh học [17, 33, 34, 41, 43]

1.1.1.3 Cơ chế nhân lên

Hình 1.2 Chu trình nhân lên của vi rút cúm[48]

- Đầu tiên, vi rút sẽ gắn vào các thụ thể đặc hiệu trên màng sinh chất nhờ gai glycoprotein HA Vi rút xâm nhập vào bên trong tế bào theo cơ chế nhập bào Màng

tế bào bao lấy vi rút, tạo bọng (endosome) nằm bên trong tế bào chất Quá trình dung hợp với màng endosome làm giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất và được vận chuyển vào trong nhân tế bào

- Trong nhân sợi ARN (-) ban đầu được làm khuôn để tổng hợp nên sợi ARN (+) theo cơ chế bổ sung cARN (+) nhờ enzyme ARN - polymerase phụ thuộc ARN của vi rút Chính các cARN (+) này lại được dùng làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN (-) mới là nguyên vật liệu di truyền của vi rút Các sợi ARN (-) được tạo thành này là một sợi hoàn chỉnh về độ dài và một phần được phiên mã tạo ra các mARN (+) ngắn hơn Sau đó, quá trình dịch mã thành các protein chức năng xảy ra ở tế bào chất

- Các protein NS1, M1 và NP được vận chuyển vào nhân kết hợp với sợi ARN (-) mới tổng hợp để hình thành nên nucleocapsid, sau đó được vận chuyển ra tế bào chất Tại đây, nucleocapsid được bao bọc bởi các protein HA, NA, M2 thông qua sự tương tác với bộ máy Golgi Hạt virion mới được tạo thành bằng cách nảy chồi từ

Hấp phụ

Nảy chồi

Đóng gói Sau dịch mã

Dịch mã

Nhân Dung hợp, cởi vỏ

Nhập bào

màng sinh chất, axit sialic ở màng sinh chất sẽ bị phân cắt bởi enzyme NA và giải phóng vi rút ra khỏi tế bào chủ để bắt đầu một chu trình lây nhiễm mới

Như vậy, quá trình sao chép của vi rút cúm xảy ra trong nhân tế bào

1.1.2 Vi rút họ Paramyxoviridae

Paramyxoviridae là họ vi rút có genome ARN (-), không phân đoạn Họ này

gồm các vi rút quan trọng gây bệnh cho người và động vật như sởi, quai bị, á cúm (parainfluenza), hợp bào hô hấp (Respiratory Syncytial Virus-RSV), toi gà Newcastle, sốt chó (canine distemper), sốt trâu bò (rindepest) và một số bệnh đường

hô hấp khác [12] Nhưng các vi rút thường gặp gây VĐHHC là vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV và parainfluenza (á cúm phân típ 1, 2, 3, 4)

1.1.2.1 Hình thái

Virion thuộc loại đa hình thái, thường có hình cầu với đường kính 50-200nm, chứa 5-7 polypeptid và một phân tử ARN đơn (-), dài, khối lượng 5-7x106 Bao quanh nucleocapsid đối xứng xoắn là màng M có cấu tạo từ protein M không được glycosyl hoá Phía ngoài màng M là vỏ ngoài với các gai glycoprotein bề mặt dài khoảng 8nm

Virion bị bất hoạt bởi các dung môi hoà tan lipid, chất tẩy rửa, formaldehyde, các chất oxy hoá…

Đặc điểm đặc trưng là hạt vi rút được bao bọc bởi 2 lớp vỏ lipid với các gai glycoprotein mang tính kháng nguyên [11]

Phần vỏ bao của vi rút Paramyxo bao gồm hai cấu trúc glycoprotein: H-N và

F Chúng tạo nên các gai trên bề mặt của hạt vi rút Các glycoprotein lớn H, N có vai trò của hemagglutinin và neuraminidase là men ngưng kết hồng cầu động vật lông vũ và giúp sự hấp phụ (adsorbtion) của vi rút trên tế bào cảm thụ Cấu trúc protein khác, ký hiệu F, có vai trò kết dính các thành phần của hạt vi rút trong tế bào

và giúp vi rút xâm nhập qua màng tế bào cảm thụ Hoạt động xâm nhập của yếu tố

F là nhờ sự hoạt hoá bởi phần giải protein (proteolytic) làm cho men sớm của tế bào chủ tạo F thành Fo rồi cắt thành F1 và F2 F1, F2 hoạt động để có sự hoà nhập của

vi rút vào màng tế bào do đó ARN vi rút xâm nhập vào được tế bào [11]

1.1.2.2 Cấu trúc phân tử

Paramyxoviridae

vi rút [49] 6 gen đó có chức năng mã hóa protein N gắn ARN của nucleocapsid, phosphoprotein P của nucleocapsid, các enzyme polymerase chính của tiểu phần L, protein màng M không gắn đường, glycoprotein gắn màng G, H hay HN và glycoprotein hòa màng F Ngoài ra, các

thành viên trong họ Paramyxoviridae còn có thêm từ một đến năm loại gen điển

hình mã hoá các protein phi cấu trúc để tăng cường quá trình phát triển của vi rút

Do vỏ lipoprotein của vi rút dễ vỡ nên thông thường hình ảnh của hạt vi rút trên kính hiển vi điện tử méo mó, vỡ và thành phần nucleoprotein thường chảy ra ngoài hạt vi rút Các polypeptid cấu trúc của vỏ bao gồm HN (hemagglutinin - neuraminidase) và F (fusion) protein từ các gai bề mặt và M (matrix) protein 3 protein khác cùng với RNA cấu thành nhân nucleoprotein của hạt vi rút và quá trình phiên mã có thể thực hiện với các vi rút có vật liệu di truyền là RNA đơn âm

Protein F cấu tạo bởi sự phân giải protein của tiền polypeptid, có vai trò rất quan trọng trong quá trình hòa màng của tế bào nhiễm và sau đó hình thành hợp bào (syncytial)

Lớp vỏ bao ngoài (envelope) là màng kép lipid, lớp màng này thu nhận được

từ màng tế bào chủ Lớp màng bao ngoài bao gồm ba loại glycoprotein bề mặt: Protein gắn màng G, protein hòa màng F và protein kỵ nước SH Ngoài ra còn có protein M (matrix protein) là protein nằm ở trong của lớp vỏ envelope

Các glycoprotein được hình thành từ virion - spikes, nó có kích thước rất ngắn khoảng 11 - 20nm, khoảng cách giữa các spikes là từ 6 - 10nm Nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn, đường kính xoắn ốc khoảng 18nm

Pneumovirus không có enzyme neuraminidase Protein G không có hemagglutinin mà nó đảm nhiệm chức năng năng thay cho hemagglutinin để gắn vào thụ thể của tế bào

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc virion của vi rút họ Paramyxoviridae [30]

1.1.2.2 Cơ chế nhân lên

Trong quá trình gây nhiễm trùng, vi rút Paramyxo xâm nhập vào tế bào tạo tế bào khổng lồ Khả năng xâm nhập tế bào này được sử dụng như một đặc điểm quan trọng để chẩn đoán bệnh

Có thể xâm nhiễm vào nhiều loại tế bào nuôi cấy mô Xâm nhập nhờ dung hợp giữa vỏ ngoài vi rút với màng sinh chất của tế bào chủ Quá trình phiên mã và nhân lên đều diễn ra trong tế bào chất Virion trưởng thành chui ra ngoài theo lối nảy chồi Các tế bào nhiễm thường bị tan ra, nhưng cũng xảy ra sự dung hợp tế bào với nhau để tạo ra thể hợp bào, thể vùi

1.1.3 Vi rút họ Picornaviridae

Picorna bắt nguồn từ chữ pico là nhỏ, rna là axit ribonucleic Họ có chứa rất

nhiều vi rút gây bệnh quan trọng cho người và động vật, bao gồm vi rút polio, viêm gan A, vi rút bệnh lở mồm long móng (Foot and mouth disease virus-FMDV), và vi rút rhino [12, 48] Họ này có 5 chi là:

- Vi rút aphtovirus gồm 7 serotyp chủ yếu gây nhiễm ở động vật móng guốc chẻ (bệnh lở mồm long móng)

- Vi rút cardio chủ yếu nhiễm vào bọn gậm nhấm, mặc dù vật chủ tự nhiên chính còn chưa rõ, chỉ có một serotyp, thường gây bệnh viêm não, viêm cơ tim (myocarditis) ở bọn gậm nhấm

- Vi rút entero là nhóm lớn, bao gồm các vi rút gây bệnh nghiêm trọng ở người

và động vật Thuộc chi này gồm có vi rút polio (gây bệnh bại liệt), coxsackie (gây viêm màng não, viêm họng rộp…), Echo (gây viêm màng não không đặc hiệu, liên quan đến nhiều bệnh đường hô hấp và tiêu hoá)

- Vi rút hepato-nhóm vi rút viêm gan A

- Vi rút rhino là nhóm vi rút lây nhiễm đường hô hấp trên của động vật có vú

và gây cảm lạnh thường ở người

Gần đây phát hiện thấy có một số vi rút rhino nhưng chưa được xếp vào các chi, bao gồm vi rút rhino gây bệnh cho ngựa (típ 1, 2), vi rút rhino gây bệnh cho côn trùng như gây liệt ở đế, vi rút típ C ở ruồi giấm, vi rút gây liệt ở ong…

1.1.3.1 Hình thái và cấu trúc phân tử

Picorna là vi rút nhỏ hình cầu, đường kính trung bình 22-30nm Các thành viên

của Picornaviridae là vi rút không vỏ với một bộ gen sợi đơn (ssRNA), dương Virion:

Capsid hình khối đa diện 20 mặt tam giác đều, gồm 60 dưới đơn vị, mỗi đơn vị chứa một phân tử gồm 4 polypeptid chính ký hiệu VP1, VP2, VP3 và VP4 Ba polypeptid đầu nằm trên bề mặt virion còn polypeptid sau nằm ở trong lõi gắn với ARN Genome

là một phân tử ARN đơn, (+), dạng thẳng, dài 2,5x106, đầu 3‟ có gắn đuôi poly A, còn đầu 5‟ liên kết cộng hoá trị với một protein do vi rút mã hoá, gọi là VPg

Hình 1.4 Cấu trúc virion của Picornaviridae [40]

Ở vi rút cardio và aptho, gần đầu 5‟ của ARN còn có vùng polyC Đó là cấu trúc thứ cấp mà chiều dài có thể khác nhau tuỳ chủng Ở vi rút Rhino và Entero không có vùng này

1.1.3.2 Quá trình nhân lên

Vi rút nhân lên trong tế bào chất Đầu tiên vi rút gắn vào thụ thể nằm trên màng sinh chất của tế bào chủ, sau đó vào tế bào theo cơ chế nhập bào và tiến hành cởi vỏ trong endosome hoặc lysosome Sau khi đƣợc giải phóng khỏi capsid, ARN lập tức bắt đầu dịch mã ở lại trí gần đầu 5‟ để tạo thành một polyprotein Polyprotein này lúc đầu phân cắt thành 3 protein tiền chất là VP1, VP2 và VP3 Mỗi protein lại tiến hành phân cắt tiếp:

- VP1 cắt ra thành VP1A, VP1B, VP1C và VP1D Đó là protein capsid

- VP2 cắt thành VP2A, VP2B Đó là kháng nguyên của vật chủ và VP2C tham gia vào tổng hợp ARN

- VP3 tiến hành tự cắt thành VP3A, VP3B (VPg), VP3C (protease dùng phân cắt hầu hết các protein) và VP3D (ARN polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi ARN mới tổng hợp trên khuôn ARN) Sợi (-) đƣợc tổng hợp trên khuôn sợi (+) Đầu sợi (+) đƣợc uốn lại thành hình kẹp tóc để làm mỗi cho tổng hợp sợi (-) Kết quả là tạo ra một phân tử “đúp”, có chiều dài gấp đôi genome

VP9 ARN vi rút Poly A

5‟ 3‟

Dịch mã

Polyprotein Phân cắt

VP1 VP2 VP3

VP0 VP1 VP3 Protease, VP9, ARNpolymerase

VP2 VP4

Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp protein của vi rút polio [12]

Để lắp ráp, trước hết cần phân cắt VP1 tạo thành một protome (đơn phân gốc) 5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3 Các protome này sẽ liên kết với một genome ARN để tạo thành tiền virion Trong quá trình hoàn thiện, phần lớn hoặc tất

cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt sẽ tạo thành VP2 và VP4 Sau lắp ráp, virion trưởng thành ra khỏi tế bào nhờ tan bào

1.2 SỰ LƯU HÀNH CỦA VI RÚT GÂY BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP CẤP 1.2.1 Trên Thế giới

Các tác nhân gây bệnh VĐHHC trên Thế giới vừa có tính lưu hành địa phương vừa có thể gây thành dịch, nhất là dịch vi rút cúm A đã lan rộng đến nhiều nước trên Thế giới và trở thành đại dịch Hội chứng này có thể xuất hiện quanh năm ở vùng ôn đới nhưng tần số mắc cao vào mùa thu, mùa đông và mùa xuân, nhất là vào thời gian

mà thời tiết lạnh và ẩm Bệnh VĐHHC phát triển mạnh ở nơi mật độ dân số cao Ở vùng nhiệt đới, bệnh VĐHHC xảy ra nhiều hơn vào lúc thời tiết ẩm ướt và lạnh Trong cộng đồng dân cư rộng lớn, một số bệnh do vi rút đường hô hấp thường xảy ra

không có tính theo mùa và có thể gây ra các vụ dịch lớn như vi rút adeno, vi rút hợp bào Tỷ lệ mắc hàng năm cao, đặc biệt ở trẻ em và lứa tuổi thiếu niên [1, 10]

Trong thế kỷ XX đã ghi nhận nhiều đại dịch cúm với số mắc và số tử vong cao Đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918-1919 do vi rút cúm A phân típ H1N1 gây nên ước tính có khoảng 20 triệu người tử vong [54, 61, 66] Dịch cúm Châu Á năm 1957-

1958 có nguồn gốc Singapore do vi rút cúm A phân típ H2N2 gây nên với khoảng 69.800 trường hợp tử vong, trong đó lứa tuổi từ 5-19 tuổi chiếm hơn 50% [54, 57, 65] Đặc biệt, trong những năm gần đây, năm 1997 xuất hiện cúm A phân típ H5N1 tại Hồng Kông lây từ gia cầm sang người và gây tử vong 6/18 trường hợp mắc Hồng Kông đã phải thiêu hủy hơn 2 triệu con gà, gây một tổn thất kinh tế lớn Cuối tháng

12 năm 2003 và những tháng đầu năm 2004, dịch cúm gia cầm đã gây thiệt hại lớn về kinh tế cho các nước Châu Á, trong đó Việt Nam và Thái Lan là 2 nước có cúm gia cầm lây truyền sang người gây tử vong 26 trường hợp [37]

típ 1-4 gây bệnh đường hô hấp trên, gặp ở mọi lứa tuổi, tuy nhiên chủ yếu ở trẻ em Vi rút này xuất hiện nhiề

1/2

- Típ

Típ 4 thường lưu hành

ở Châu Phi và gây bệnh nhẹ đường hô hấp trên [12]

Vi rút hợp bào đường hô hấp (Respiratory Syncytial Virus-RSV) là một trong những căn nguyên gây bệnh viêm đường hô hấp chủ yếu ở trẻ nhỏ Dịch thường xảy

ra vào mùa đông và mùa xuân RSV phân bố khắp nơi và có những yếu tố dịch tễ riêng, hàng năm có thể bùng phát thành dịch và kéo dài khoảng 5 tháng [28, 29, 47]

Ở Anh, nhiễm RSV thường xảy ra từ tháng giêng đến tháng ba và nó có thể thay đổi

từ năm này qua năm khác Ở Mỹ, RSV xuất hiện vào mùa đông và kéo dài tới mùa xuân [28] Ở Washington DC, số trẻ em nhập viện có triệu chứng giống RSV, viêm đường hô hấp dưới cao hơn 2,7 lần Dịch lớn có thể dao động và thay đổi từng năm

Mặc dù mùa mắc RSV có thể tiên đoán được hàng năm nhưng tính khắc nghiệt của

vụ dịch lại thay đổi

RSV gây bệnh ở các nước trên thế giới và có thể gây thành dịch Hàng năm, nó

có thể bùng phát thành đại dịch RSV lây nhiễm khá cao, một nửa trẻ sơ sinh mắc các triệu chứng giống RSV trong vòng một năm đầu tiên và xét nghiệm thấy khoảng 40% nhiễm vi rút này Trẻ em thường mắc vi rút này trong vòng 3 năm đầu của cuộc đời Một nghiên cứu ở Houston, 69% trẻ sơ sinh bị nhiễm vi rút RSV trong năm đầu tiên, 83% nhiễm trong năm thứ hai Thậm chí năm thứ ba và thứ tư, một phần ba đến một nửa số trẻ nhiễm bệnh đường hô hấp dưới Do đó khả năng nhiễm

đi nhiễm lại của trẻ là có thể xảy ra

1.2.2 Tại Việt Nam

Việt Nam là nước đang phát triển, với dân số trên 80 triệu người, phần lớn lại làm nông nghiệp, nên đời sống còn gặp nhiều khó khăn Với điều kiện khí hậu Việt Nam nóng và ẩm, nên dễ mắc bệnh VĐHHC quanh năm, nhưng có xu hướng tăng ở những tháng giao mùa Bệnh VĐHHC thường gọi là bệnh cảm cúm xảy ra trên khắp đất nước với tỷ lệ mắc trung bình 5 năm cuối năm của thập kỷ 90 được ghi nhận là 1.627,2/100.000 dân, xếp thứ nhất trong số 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc cao nhất ở Việt Nam [10] Tuy nhiên, giữa các miền tỷ lệ mắc có khác nhau theo phân vùng địa lý và khí hậu Miền Bắc và Tây Nguyên có nhiều vùng núi cao, khí hậu 4 mùa nên hội chứng VĐHHC phát triển nhiều trong các mùa thu, mùa đông và mùa xuân với tỷ lệ mắc trung bình 5 năm cuối của thập kỷ 90 là 2.298,6/100.000 dân ở miền Bắc và 3.160/100.000 dân ở Tây Nguyên Tỷ lệ này thấp hơn ở miền Trung và miền Nam Đây là hai miền thuộc vùng đồng bằng sông Cửu Long và ven biển miền Trung có khí hậu nhiệt đới với hai mùa khô và mùa mưa trong năm Bệnh VĐHHC thường phát triển vào mùa mưa lũ với thời tiết lạnh và ẩm Có nhiều năm, vi rút cúm B, vi rút á cúm, vi rút adeno… đã gây thành dịch ở nhiều địa phương [9] Nhất

là các đại dịch cúm A trên thế giới đã xâm nhập vào Việt Nam và lan rộng ra hầu hết các tỉnh thuộc miền Bắc Việt Nam trong những năm 1957-1958 với chủng vi rút cúm A phân típ H2N2 và năm 1968-1969 với chủng vi rút cúm A phân típ H3N2

Đặc biệt, đầu năm 2004 vi rút cúm A/H5N1 lây từ gia cầm sang người với 22 trường hợp mắc, trong đó 15 trường hợp tử vong [37]

Trong những năm gần đây, đã có nhiều công trình nghiên cứu về căn nguyên gây VĐHHC ở các vùng miền khác nhau trong cả nước Nghiên cứu của GS TS Huỳnh Phương Liên và cộng sự về các chủng vi rút cúm và các vi rút gây VĐHHC

ở Hà Nội năm 2001 chủ yếu là vi rút cúm B (74%), sau đó là vi rút cúm A/H1N1 (20,78%), các vi rút gây VĐHHC khác như vi rút Picorna (51,28%) và RSV phân típ B là 10,26%[8] Một nghiên cứu khác ở Tây Nguyên năm 2003 đã cho thấy 13,9% là chủng vi rút cúm A/H3N2, xuất hiện gần như quanh năm và cao nhất vào tháng 9 Ngoài ra, các vi rút gây VĐHHC khác như vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV), hMPV và các vi rút đường ruột (Picorna) cũng là căn nguyên gây viêm đường hô hấp ở Tây Nguyên (18,2%) [4] Nhóm nghiên cứu gần đây nhất về vi rút gây bệnh VĐHHC ở trẻ em miền Trung Việt Nam năm 2007 đã cho thấy căn nguyên chính là vi rút rhino (28%), RSV (23%), vi rút cúm (15%), hMPV (4,5%),

vi rút á cúm (5% )[75]

Việt Nam đang trên bước đường hội nhập với quốc tế, ngân sách chi cho chăm sóc sức khỏe ban đầu còn rất hạn hẹp Vì vậy, cùng với tiêu chảy và suy dinh dưỡng, viêm đường hô hấp cấp hiện đang có tỷ lệ mắc và tử vong cao, đứng đầu trong các bệnh nhiễm trùng cấp tính [60, 62]

1.3 DỊCH TỄ HỌC BỆNH VĐHHC DO VI RÚT

1.3.1 Ổ chứa

Ổ chứa trong tự nhiên là người, bao gồm người bệnh và người nhiễm vi rút thể

ẩn Nguồn truyền nhiễm bệnh là bệnh nhân

1.3.2 Phương thức và thời gian lây truyền

Bệnh VĐHHC lây truyền từ người sang người theo hai đường chính:

- Theo đường hô hấp: nước bọt và các dịch tiết của bệnh nhân VĐHHC trong quá trình nói, ho, khạc, hắt hơi… tạo ra các giọt khí (droplet) hay các son khí (aerosol) chứa hạt vi rút và xâm nhập trực tiếp vào niêm mạc đường hô hấp hoặc niêm mạc mắt của những người tiếp xúc

- Theo đường tiếp xúc: dịch tiết đường hô hấp và các chất thải khác có chứa vi rút của bệnh nhân làm ô nhiễm bề mặt phòng bệnh hay gia đình cùng các vật dụng

cá nhân, rồi từ đó qua tay của người tiếp xúc để xâm nhập vào niêm mạc miệng, mũi và mắt của người tiếp xúc

Vi rút cúm A/H5N1 lây truyền từ động vật sang người qua đường tiếp xúc trực tiếp giữa gia cầm nhiễm bệnh và người hoặc qua đường tiêu hóa (ăn thịt gia cầm đã

Ngoài hai đường lây truyền chính trên, cũng có những giả thuyết về khả năng lây truyền vi rút qua dụng cụ y tế Hiện tượng lây truyền qua đường không khí (airborne spreading) và đường nước-thực phẩm (water-foodborne spreading) cũng được đề cập đến

1.3.3 Tính cảm nhiễm và đáp ứng miễn dịch

Mọi cá thể đều có thể nhiễm và mắc bệnh nhưng trẻ em thường bị mắc nhiều hơn Sau khi bị mắc sẽ được miễn dịch bảo vệ nhưng kháng thể chỉ tồn tại trong thời gian ngắn Ở người lớn, khi bị nhiễm vi rút cúm có thể có biểu hiện lâm sang từ nhiễm trùng không triêu chứng tới viêm phổi do vi rút tiên phát tiến triển nhanh dẫn tới tử vong Ở trẻ nhỏ, nhiễm vi rút thường sốt cao và kèm theo co giật Bệnh do vi rút RSV, vi rút Rhino… dễ bị mắc lại nhưng bệnh có nhẹ hơn

Bệnh do vi rút cúm A sau khi khỏi bệnh sẽ được miễn dịch lâu dài Trong khi chưa có phân típ cúm mới ra đời, trẻ em thường bị mắc nhiều hơn người lớn bởi vì

có thể người lớn đã mắc bệnh và được miễn dịch trong thời kỳ lưu hành của các

phân típ cúm A/H1N1, A/H2N2, A/H3N2… Trước đây, tỷ lệ mắc bệnh theo lứa tuổi trong các vụ dịch phản ánh sự tồn tại miễn dịch từ những lần trước với các chủng vi rút liên quan tới phân típ gây dịch lần này Bệnh cúm A thường có diễn biến nặng như viêm phổi và dễ tử vong

Đối tượng có nguy cơ mắc bệnh cao là người già trên 65 tuổi, trẻ em, phụ nữ

có thai, người đang mắc bệnh mạn tính như: bệnh tim, bệnh phổi, bệnh thận… sẽ có nguy cơ bị bệnh nặng và tử vong, nhất là bệnh do vi rút cúm A

1.4 SINH BỆNH HỌC

Nhiễm khuẩn đường hô hấp có liên quan tương hỗ giữa vật chủ và các tác nhân gây bệnh như vi rút, vi khuẩn và các yếu tố môi trường xung quanh Tỷ lệ mắc bệnh, mức độ nặng nhẹ của nhiễm khuẩn cấp tính đường hô hấp liên quan tới 4 yếu

tố bệnh lý gồm:

- Sức đề kháng của vật chủ chống lại sự xâm nhập của vi rút gây bệnh

- Các phản ứng viêm do tác nhân gây bệnh gây ra, mức độ tắc nghẽn đường hô hấp dưới và tổn thương tổ chức phổi

- Tình trạng phục hồi của các tổ chức bị tổn thương

- Khả năng của vật chủ để duy trì đầy đủ chức năng hô hấp

Khi sức đề kháng của vật chủ chống vi rút gây bệnh bị giảm sút thì vi rút sẽ lan truyền nhanh hơn và nhân lên nhiều hơn Nhiễm trùng gây ra bởi vi rút cúm đầu tiên là viêm đường hô hấp trên Vi rút phát triển trên tế bào biểu mô đường hô hấp

và phá hủy nhung mao, nơi được coi là hàng rào bảo vệ đầu tiên, quan trọng của cơ thể trong hệ thống hô hấp Vi rút gây nhiễm khuẩn hô hấp sẽ làm phá vỡ tế bào biểu

mô của đường hô hấp Phản ứng viêm sẽ làm tăng xuất huyết, sung huyết và co thắt

cơ trơn, do đó gây tắc nghẽn đường hô hấp, dẫn đến khó thở, suy hô hấp và có nguy

cơ tử vong nếu không được điều trị kịp thời

Đi cùng với sự nhân lên của vi rút, các đáp ứng miễn dịch của cơ thể bắt đầu được kích hoạt, một số cytokine như interferon típ 1(IFN-1) được sản xuất từ tế bào lưới (DCs) bắt đầu tác dụng trực tiếp lên vi rút Các phân típ khác: IFN-III hoạt động thông qua các phức hợp thụ cảm thể (IL-28Rα hoặc IL-10Rβ ) cũng tác động

vào vi rút Tiếp theo hàng loạt các phản ứng của hệ miễn dịch với tác nhân vi rút xuất hiện, kết quả của các phản ứng này là vi rút bị trung hòa, bị chết, hoặc bị ức chế… Tuy nhiên nếu các phản ứng này ồ ạt, không kiểm soát dễ dẫn đến tác dụng phụ cho

cơ thể có khả năng làm suy giảm chức năng các cơ quan khác như gan, thận…

Ngoài ra, đặc điểm sinh học, độc lực của vi rút cũng là một yếu tố quan trọng liên quan đến các biểu hiện lâm sàng, tiến triển của bệnh Vi rút cúm gia cầm A/H5N1 độc lực cao (HPAI) thường nhân lên trên tế bào biểu mô đường hô hấp dưới gây viêm phổi nặng, tỷ lệ tử vong cao Hoặc vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV) thường gây viêm tiểu phế quản tại trẻ em…

1.5 ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG

Tùy theo vị trí của hô hấp bị tổn thương mà có các hội chứng lâm sàng khác nhau

- Hội chứng viêm đường hô hấp trên: có các biểu hiện sốt, ho, sổ mũi và đau họng…

- Hội chứng viêm đường hô hấp giữa: Viêm thanh quản, viêm thanh khí-phế quản: sốt, ho khan, giọng khàn, phổi có thể có ra ngáy nhẹ khi thăm khám lâm sàng

- Hội chứng viêm nhiễm đường hô hấp dưới: viêm phổi, viêm các tiểu phế quản… Biểu hiện lâm sàng: sốt, ho, khó thở Cận lâm sàng: XQ có biểu hiện viêm phổi kẽ, viêm phế quản, viêm phôi lan tỏa, bạch cầu giảm…

a, Vắc xin cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 và B)

- Gây miễn dịch được coi là biện pháp hữu hiệu để phòng cả vi rút cúm A và

B Tuy nhiên do vi rút cúm thay đổi liên tục và hiệu lực của vắc xin phụ thuộc vào

sự tương đồng giữa chủng sản xuất vắc xin và chủng vi rút cúm đang lưu hành

- Việc tiêm vắc xin được ưu tiên cho ba nhóm đối tượng:

+ Nhóm đối tượng có nguy cơ cao: người già, người tàn tật, người mắc bệnh mãn tính về tim, phổi, thận

+ Nhóm tiếp xúc với các tác nhân gây nhiễm: nhân viên phòng thí nghiệm… + Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: cảnh sát…

- Vắc xin cúm hiện tại có nhiều loại khác nhau bao gồm vắc xin bất hoạt (inactivated vaccine), vắc xin sống giảm độc lực (live attenuated influenza virus-LAIV) và vắc xin sống bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (reassortment vaccine)

- Hiện tại, vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin sống bất hoạt, đa giá (thành phần vắc xin bao gồm vi rút cúm A/H1N1, A/H3N2 và B) [19]

b, Vắc xin cúm A/H5N1

Hiện nay, vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1 cho người vẫn đang được một số nước trên thế giới và Việt Nam nghiên cứu, sản xuất thử ở quy mô phòng thí nghiệm và chưa được thử nghiệm lâm sàng [13] Đây là vắc xin sống bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược

1.6.1.2 Vi rút á cúm:

Dự phòng vi rút á cúm là vắc xin vi rút chết có khả năng hình thành kháng thể trung hòa nhưng không bảo vệ được chống nhiễm bệnh, điều này dễ giải thích vì vắc xin á cúm đòi hỏi phải tạo được kháng thể lớp IgA, hiện nay chưa thực hiện được Do vậy, việc cách ly bệnh nhân và xử lý chất thải của bệnh nhân cần được quan tâm hơn

1.6.1.3 Vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV)

Dự phòng bệnh do RSV bằng vắc xin là rất cần thiết và có hiệu quả tốt hơn Tuy nhiên cho đến nay một số loại vắc xin đang được nghiên cứu và thử nghiệm Vắc xin đầu tiên được sử dụng là vắc xin bất hoạt bằng formalin, tuy nhiên vắc xin này đã không tạo ra được đáp ứng miễn dịch Sau đó một loại vắc xin khác được sản xuất bằng tách thành phần F/G glycoprotein của vi rút Vắc xin tái tổ hợp adeno

- RSV được sản xuất tạo ra được kháng thể kháng F/G glycoprotein và kháng thể trung hòa trên động vật thử nghiệm là chó, có khả năng bảo vệ chống lại nhiễm RSV ở đường hô hấp dưới Một loại vắc xin tái tổ hợp khác là Vaccina - RSV cũng

đã thành công trong việc bảo vệ khỏi mắc bệnh Các loại vắc xin trên cho đến nay chưa được thử nghiệm lâm sàng trên người

Do việc lây lan bệnh bởi RSV theo đường dịch tiết hô hấp nên tỷ lệ nhiễm ở trẻ nhỏ trong thời gian có dịch là rất cao Để giảm thiểu việc lây nhiễm thì công tác

vệ sinh trong quần thể dân cư, đặc biệt là tại những nơi tập trung đông trẻ nhỏ như bệnh viện, nhà trẻ là hết sức quan trọng Với những người làm công tác chăm sóc sức khỏe như các y tá, bác sỹ, hộ lý thì vấn đề tự bảo vệ cũng như tránh làm lây lan dịch bệnh là hết sức cần thiết

1.6.2 Điều trị

Các thuốc kháng vi rút được coi là phương pháp đặc hiệu cho điều trị nhiễm vi rút tuy nhiên hiện tại các sản phẩm này rất hạn chế, chỉ tập trung vào một số tác nhân nhất định :

Các thuốc kháng vi rút cúm

Ngày nay đã có thuốc trị bệnh cúm do vi rút gây ra, được chia làm 2 nhóm chính: ức chế sự xâm nhập vi rút Amantadine và Rimantadine (Flumadine) và ức chế

sự giải phóng vi rút Oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza)

- Amantadine và Rimantadine: ngăn cản sự xâm nhập của vi rút bằng cách ức chế hoạt động của kênh ion M2, do đó ngăn cản sự “cởi áo” của vi rút [37]

- Oseltamivir và Zanamivir: ngăn cản sự giải phóng vi rút khỏi tế bào nhiễm nhờ

ức chế hoạt động của enzyme neuraminidase (NA), là cơ chế hiệu quả nhất tác động vào vi rút [65] Quá trình giải phóng của vi rút cúm phải có sự tham gia trực tiếp của enzyme neuraminidase có tác dụng tách axit sialic từ màng glycoprotein của vi rút do

đó vi rút được giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm Nếu không có enzyme này vi rút sẽ bị giữ lại bên trong tế bào và không có cơ hội tấn công sang các tế bào khác

Các thuốc kháng vi rút hợp bào đường hô hấp (RSV):

- Ribavirin là một chế phẩm tổng hợp tương tự guanosin được cấp phép sử dụng năm 1972 tại Mỹ Cơ chế tác dụng của Ribavirin phức tạp và có thể tác động vào nhiều yếu tố: ức chế enzyme polymerase trong quá trình sao chép mRNA, ức chế inosine-5‟ monophosphate dehydrogenase làm suy yếu các quá trình tổng hợp các nucleotid trong tế bào [46]

Vi rút á cúm:

- Chưa có thuốc chữa đặc trị và chưa có vắc xin hữu hiệu Do vậy, biện pháp tốt nhất là nghỉ ngơi và điều trị triệu chứng như dùng thuốc giảm sốt hay giảm đau (ví dụ: actaminophen) Nếu bị ho có thể dùng thuốc ho (dextromethophan)

1.7 CHẨN ĐOÁN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

1.7.1 Phương pháp phát hiện kháng nguyên

1.7.1.1 Thử nghiệm chẩn đoán cúm nhanh (Quicktest)

- Đây là một thử nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên của vi rút cúm bằng kháng thể đơn dòng có trong que thử kết hợp với kháng nguyên nucleoprotein

hoặc neuraminidase của vi rút cúm

- Ưu điểm của thử nghiệm này là nhanh (cho kết quả trong vòng 30 phút), đơn giản, là một thử nghiệm khách quan có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng hoặc hỗn dịch nuôi cấy vi rút Tuy nhiên, nhược điểm của thử nghiệm này độ nhạy và độ đặc hiệu kém, một số bộ sinh phẩm không phân biệt được típ huyết thanh A hoặc B, không xác định được phân típ (A/H1N1, A/H3N2 ) và có giá thành cao, trong đó

độ nhạy trung bình 70 -75%, độ đặc hiệu trung bình 90- 99%, độ nhạy phát hiện vi rút cúm A cao hơn vi rút cúm B [19, 20]

Thử nghiệm này có hiệu quả trong sàng lọc tại vùng dịch nhưng không có giá trị nhiều trong chẩn đoán phòng thí nghiệm

1.7.1.2 Phân lập vi rút

- Phân lập vi rút trên tế bào: vi rút được gây nhiễm trên các dòng tế bào cảm thụ: MDCK (vi rút cúm), Hep-2 (RSV, á cúm), Hela (RSV), Vero E6 (RSV, á cúm, hMPV), LL-MK2 (picorna, hMPV, Rhino)… [56, 72] Các mẫu có sự hủy hoại tế bào được giữ lại để định loại vi rút

- Phân lập vi rút được coi là „„tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [19] Chủng

vi rút phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng nguyên để có thể dự báo được sự lan truyền của một chủng vi rút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm

- Phân lập trên trứng: Theo TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt

tiêu chuẩn 10-11 ngày tuổi Sau khi cấy vi rút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng được ủ 33oC/48h Dịch niệu hoặc dịch ối thu được sau khi gặt trứng được kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu ngựa 1%

- Định típ vi rút: vi rút sau khi phân lập được định típ (xác định đặc tính kháng

nguyên) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI)

1.7.1.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescent assay-IFA)

- Phương pháp này cho phép phát hiện trực tiếp các kháng nguyên của vi rút xâm nhiễm vào các tế bào biểu mô đường hô hấp Tế bào được cố định trên lam kính, phát hiện bằng kháng thể nhuộm huỳnh quang (nhuộm trực tiếp) hoặc phát hiện bằng kháng thể đánh dấu huỳnh quang (nhuộm gián tiếp) Phản ứng được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, tế bào nhiễm vi rút sẽ được phân biệt bằng độ đậm màu và hình thái các vùng bắt màu huỳnh quang Nhuộm miễn dịch huỳnh quang cho phép phát hiện nhanh khi số lượng tế bào biểu mô trong bệnh phẩm đủ

để phát hiện Kết quả tương đối dao động vỡ việc đánh giá kết quả chủ quan, độ chính xác thực phụ thuộc vào kinh nghiệm người thực hiện

Phương pháp này được áp dụng cho hầu hết tác nhân vi rút gây viêm đường hô hấp trên như: cúm, á cúm, hợp bào đường hô hấp, adeno…

1.7.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền

1.7.2.1 Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR)

Phản ứng sao chép ngược chuỗi polymerase RT-PCR (Reverse transcriptase Polymerase chain reaction) đã được áp dụng và phát triển cho phần lớn các vi rút có vật liệu di truyền là ARN Phương pháp này có khả năng xác định nhanh sự nhiễm

vi rút thông qua xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng Đây là phương pháp nhanh, nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác khi được kiểm soát tốt

Tuy nhiên, phản ứng này cũng có những hạn chế nhất định trong việc chẩn đoán sớm các trường hợp mắc bệnh do việc lựa chọn loại mẫu bệnh phẩm cũng như thời gian phù hợp để lấy mẫu Phản ứng RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao, khả năng dễ bị tạp nhiễm bởi các tác nhân ngoại lai

Cho tới nay, RT-PCR vẫn được coi là phương pháp tối ưu để phát hiện vi rút cúm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đoán phòng thí nghiệm để khẳng định các trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 theo quy định của TCYTTG

1.7.2.2 Phản ứng real time RT-PCR

Phản ứng real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular beacon, hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [27] Phản ứng Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút gây bệnh như vi rút cúm, RSV [23, 24]

Phản ứng real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một hệ thống “đóng” Ưu điểm của phương pháp này là nhanh, nhạy, có độ chính xác và đặc hiệu cao, giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm [36] Tuy nhiên, phản ứng real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm với giá thành tương đối cao

1.7.2.3 Phản ứng khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược

C trong 2 phút trong hệ thống máy Loopamp-real time LA-200 (Kyoto Nhật Bản) Vì vậy, thời gian tiến hành sẽ được rút ngắn [55, 58]

Trong một phản ứng đã sử dụng 6 loại mồi bao gồm 2 mồi trong, 2 mồi ngoài

và 2 mồi dạng vòng đã làm tăng độ nhạy của phản ứng Phản ứng này có thể phát hiện vi rút cúm trong giai đoạn sớm của bệnh [51] Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng này cần được đánh giá thông qua một số lượng mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm Hiện nay, phản ứng này cũng đang được phát triển để chẩn đoán nhanh một số bệnh truyền nhiễm khác do vi rút cúm SARS-CoV, vi rút viêm gan B, vi rút viêm não Nhật Bản [67]

1.7.3 Phương pháp phát hiện kháng thể

Đây là phương pháp phát hiện kháng thể kháng vi rút huyết thanh bệnh nhân

Có 3 phương pháp cơ bản được sử dụng là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ liên kết enzyme (ELISA) và phản ứng trung hòa vi lượng (MN) Kết quả được xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI) Chẩn đoán huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trường hợp lâm sàng Tuy nhiên, nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu như việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của vi rút không đạt kết quả do chất lượng bệnh phẩm hoặc một lý do nào khác

1.7.3.1 Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test-HI)

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được Hirst GK phát hiện năm 1942 [38] Nguyên lý của phương pháp là phát hiện kháng thể kháng HA đặc hiệu vi rút cúm (antihemagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1, B…) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu Hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc hồng cầu gà 0,5% được sử dụng trong phản ứng HI để phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm mùa, hồng cầu ngựa 1% được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng vi rút cúm A/H5N1 [19, 20]

- Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể áp dụng để phát hiện sự lưu hành của kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm với một số lượng mẫu lớn Phần lớn kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phương pháp HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân típ đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm Tuy nhiên, phản ứng HI chỉ

có giá trị trong chẩn đoán cúm khi có mẫu huyết thanh kép để xác định được sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh Mẫu huyết thanh đơn không

có giá trị trong chẩn đoán Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng [68]

1.7.3.2 Phản ứng trung hòa vi lượng (Microneutralization test – MN)

Phản ứng trung hòa vi lượng-ELISA được Hormon và cs phát triển năm 1988 [32, 68] Nguyên lý của phản ứng là sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu nucloprotein (NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào nhiễm

vi rút cúm Sử dụng phương pháp Reed và Muench để tính giá trị liều gây nghiễm 50% trên tế bào (TCID50)

Phản ứng trung hòa vi lượng là một phản ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân típ vi rút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát hiện được [68] Phản ứng này dễ tiến hành vì không cần kháng nguyên tinh khiết Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dài (2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với vi rút sống, đặc biệt là vi

rút cúm A/H5N1, nên thí nghiệm phải tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3

1.7.3.3 Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme immusorbent assay-ELISA)

linked-Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) được Murphy và cs phát triển năm 1980 để đánh giá đáp ứng kháng thể của những người tình nguyện tiêm vắc xin cúm A[53] Đây là thử nghiệm được sử dụng để phát hiện kháng thể IgG và IgM kháng vi rút cúm Kháng thể có trong huyết thanh bệnh nhân sau khi gắn với kháng nguyên đã gắn trên giá rắn sẽ được phát hiện bằng kháng thể khác Ở phương pháp trực tiếp, kháng thể phát hiện được cộng hợp trực tiếp với enzyme Còn trong phương pháp gián tiếp, kháng thể không được đánh dấu mà được phát hiện bằng kháng thể kháng IgG và IgM đặc hiệu loài cộng hợp với enzyme

Tuy nhiên, chẩn đoán huyết thanh học ít sử dụng trong chẩn đoán bệnh VĐHHC, thường được sử dụng để nghiên cứu hồi cứu hoặc giám sát huyết thanh học

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Định nghĩa ca bệnh

Tất cả các bệnh nhân viêm phổi cấp nghi nhiễm vi rút có triệu chứng như sau:

- Sốt cao đột ngột trên 38oC (xác định bằng cách đo nhiệt độ hoặc qua khai thác bệnh sử)

- Khó thở (dựa vào cảm giác của bệnh nhân hoặc các dấu hiệu thở nhanh nông, thở gắng sức hoặc đo khí máu) và đó có chỉ định áp dụng hô hấp hỗ trợ (thở oxy qua xông, qua mask hoặc thở máy)

- Hình ảnh X-quang có tổn thương đặc hiệu do viêm phổi do vi rút

- Có kết quả hội chẩn chuyên khoa (ghi trong bệnh án) không hướng đến các loại căn nguyên khác ngoài vi rút, đặc biệt là viêm phổi vi khuẩn, lao…

2.1.2 Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm thu thập

Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân có các triệu chứng như trên được thu thập từ tháng 01 năm 2007 đến tháng 5 năm 2009 tại Hà Nội và các tỉnh Miền Bắc Việt Nam (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Số bệnh nhân nghi viêm phổi cấp tại Miễn Bắc Việt Nam, 2007-2009

2.2 VẬT LIỆU

2.2.1 Mẫu bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được lấy từ những bệnh nhân viêm đường hô hấp cấp nghi nhiễm vi rút từ 1-5 ngày kể từ khi khởi bệnh, bảo quản 2-8oC trong khi vận chuyển tới phòng thí nghiệm

Bệnh phẩm để xác định vi rút: Dịch ngoáy họng, dịch mũi, dịch nội khí quản được bảo quản trong môi trường vận chuyển vi rút

- Dịch ngoáy họng: Đưa tăm bông vào vùng hầu họng, để cho thấm ướt toàn

bộ đầu tăm bông, sau đó miết mạnh và quay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan và thành sau họng 3 đến 4 lần và rút ra theo chuyển động xoay tròn (để lấy được dịch,

tế bào vùng họng) Đưa ngay tăm bụng vào ống nhựa đó có sẵn 2-3 ml môi trường bảo quản vi rút

Hình 2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch họng

- Dịch mũi: Đưa tăm bông dọc theo sàn tới khoang mũi hầu để ở đó vài giây

và rút ra theo chuyển động xoay tròn Đưa ngay tăm bông vào ống nhựa đó có sẵn 2-3 ml môi trường bảo quản vi rút

Hình 2.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm dịch mũi

- Dịch nội khí quản: Bênh nhân khi đang thở máy, đó được đặt nội khí quản

Dùng 1 ống hút dịch, đặt theo đường nội khí quản và dùng bơm tiêm hút dịch nội

khí quản theo đường ống đặt Cho dịch nội khí quản vào ống nhựa chứa 2-3 ml môi

trường bảo quản vi rút

Cúm A M30F2/08 ATG AGY CTT YTA ACC GAG GTC GAA ACG 232

M264R3/08 TGG ACA AAN CGT CTA CGC TGC AG

1

H1 H1 HA F AGG CAA ATG GAA ATC TAA TAG CGC 164

H1 HA R CCA TTG GTG CAT TTG AGG TGA TG

1

H3 H3 HA F AAG CAT TCC YAA TGA CAA ACC 120

H3 HA R ATT GCR CCR AAT ATG CCT CTA GT

5

H5-3 CTC CCC TGC TCA TTG CTA TG

1

B Flu B F TCC TCA ACT CAC TCT TCGAGC G 120

Flu B R CGG TGC TCT TGA CCA AAT TGG

RSV RSV-AB-F1-FAM AAC AGT TTA ACA TTA CCA AGT GA 368

RSV-AB-R1 TCA TTG ACT TGA GAT ATT GAT GC

1

hMPV hMPVF-F1-FAM GAG CAA ATT GAA AAT CCC AGA CA 347

hMPFV-R1 GAA AAC TGC CGC ACA ACA TTT AG

2

HIPV1 PIV1- forward CCG GTA ATT TCT CAT ACC TAT G 317

PIV1- reverse CCT TGG AGC GGA GTT GTT AAG

2

HIPV2 PIV2- forward CCA TTT ACC TAA GTG ATG GAA T 203

PIV2- reverse GCC CTG TTG TAT TTG GAA GAG T

2

HIPV3 PIV3- forward ACT CCC AAA GTT GAT GAA AGA T 102

PIV3- reverse TTA ATC TTG TTG TTG AGA TTG A

2

HIPV4 PIV4- forward GGA TGC ATT CGA ATT CC 204

PIV4- reverse ACA ACT CTT TCG ATT CC

Picorna PICO-F3-FAM GGC CCC TGA ATG (CT)G GCT AA 115

PICO-R3 GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA

4

OL 68-1 GGT AAY TTC CAC CAC CAN CC

Nguồn gốc của các mồi: