Phân lập và nghiên cứu các đặc tính dịch tễ học phân tử của các chủng listeria monocytogenes được phân lập trên địa bàn hà nội

Một đặc tính đặc biệt của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp nên các mặt hàng đông lạnh như thịt, xúc xích, các sản phẩm bơ, sữa …

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

PHAN THỊ HƯƠNG TRÀ

ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH DỊCH TỄ

HỌC PHÂN TỬ CỦA CÁC CHỦNG LISTERIA MONOCYTOGENES

ĐƯỢC PHÂN LẬP TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

HÀ NỘI - 2010

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận nghiên cứu này sẽ không có thể thực hiện được nếu không có sự hỗ trợ của nhiều người Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến TS Lê Quang Hòa – Phòng Hóa sinh và Sinh học phân tử - Viện CNSH & CNTP – Trường ĐHBK Hà Nội, người đã hướng dẫn tận tình trong suốt thời gian làm việc ở phòng thí nghiệm

và luôn sẵn sàng giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng muốn bày tỏ lòng cảm ơn tới các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập Đặc biệt cảm ơn đến tất cả các cán bộ nhân viên phòng thí nghiệm Hóa sinh và Sinh học phân tử, phòng thí nghiệm Công nghệ cao và phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học cùng với các bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh thực tập tại đây đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình tôi, những người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Học viên

Phan Thị Hương Trà

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, những nội dung được trình bày trong luận văn này là do sự tìm tòi, nghiên cứu của chính bản thân Các kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào của các tác giả khác

Tôi xin chịu trách nhiện về những nội dung cam đoan trên

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2010

Tác giả

Phan Thị Hương Trà

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN 0 

LỜI CAM ĐOAN 1 

MỤC LỤC 2 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 5 

MỞ ĐẦU 6 

PHẦN I TỔNG QUAN 8 

I.1 Tổng quan về L monocytogenes 8 

I.1.1 Các đặc tính cơ bản của L monocytogenes 8 

I.1.1.1 Đặc hình thái 9 

I.1.1.2 Đặc tính sinh lý 10 

I.1.1.3 Đặc tính sinh hoá 11 

I.1.1.4 Đặc tính huyết thanh học 12 

I.1.1.5 Đặc điểm về cấu trúc phân tử và con đường xâm nhiễm 14 

I.1.2 Con đường lây nhiễm và bệnh do L monocytogenes gây ra 21 

I.1.2.1 Con đường lây nhiễm L monocytogenes 21 

I.1.2.2 Bệnh do L monocytogenes gây ra 22 

I.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do L monocytogenes gây ra 24 

I.1.3.1 Trên thế giới 24 

I.1.3.2 Ở Việt Nam 28 

I.1.3.3 Quy định kiểm soát L monocytogenes 30 

I.2 Các phương pháp phát hiện L monocytogenes 31 

I.2.1 Các phương pháp truyền thống 31 

I.2.1.1 Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái vi sinh vật học 31 

I.2.1.2 Phương pháp sinh hóa 32 

I.2.1.3 Phương pháp huyết thanh học 35 

I.2.2 Các phương pháp không truyền thống 36 

I.2.2.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) 36 

I.2.2.2 Phương pháp lai phân tử DNA (DNA-Hybridization) 37 

I.2.2.3 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 39 

I.3 Các phương pháp xác định kiểu phụ của L monocytogenes 42 

I.3.1 Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu hình 43 

I.3.1.1 Phương pháp huyết thanh học 43 

I.3.1.2 Phương pháp dựa trên kiểu của thể thực khuẩn 43 

I.3.1.3 Phương pháp MLEE (multilocus enzyme electrophoresis) 44 

I.3.1.4 Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu esterase 44 

I.3.2 Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên kiểu gen 45 

I.3.2.1 Phương pháp PFGE (pulsed-field gel electrophoresis) 45 

I.3.2.2 Phương pháp ribotyping 47 

I.3.2.3 Các phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR 48 

I.3.2.4 Phương pháp xác định kiểu phụ dựa trên trình tự DNA 50 

I.4 Các phương pháp xác định độc tính của L monocytogenes 51 

I.4.1 Thử nghiệm độc tính trên chuột 51 

I.4.2 Thử nghiệm độc tính bằng các dòng tế bào 52 

I.4.3 Xét nghiệm dựa trên các gen và protein liên quan tới độc tính 53 

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55 

II.1 Vật liệu 55 

II.1.1 Nguyên liệu 55 

II.1.2 Chủng vi sinh vật 55 

II.1.3 Hóa chất 56 

II.1.4 Thiết bị 57 

II.2 Phương pháp nghiên cứu 57 

II.2.1 Xây dựng quy trình phân lập L monocytogenes từ thực phẩm 57 

II.2.1.1 Giai đoạn tăng sinh từ mẫu thực phẩm ban đầu 57 

II.2.1.2 Giai đoạn chọn lọc trên môi trường rắn 57 

II.2.1.3 Giai đoạn tăng sinh thuần chủng và bảo quản giống 61 

II.2.1.4 Thí nghiệm xác định chu kỳ phát triển của L monocytogenes 61 

II.2.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được 63 

II.2.2.1 Thu DNA làm khuôn cho phản ứng PCR 63 

II.2.2.2 Thực hiện phản ứng PCR 63 

II.2.2.3 Kiểm tra kết quả PCR bằng điện di trên gel agarose 64 

II.2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen 64 

II.2.2.5 Phương pháp phân tích trình tự gen 66 

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 68 

III.1 Xây dựng quy trình phân lập L monocytogenes từ thực phẩm 68 

III.1.1 Thí nghiệm xác định chu kỳ phát triển của L monocytogenes 68 

III.1.2 Kết quả phân lập L monocytogenes trong môi trường chọn lọc 71 

III.2 Nghiên cứu dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được 74 

III.2.1 Kiểm tra độ nhạy của phản ứng PCR 74 

III.2.2 Khảo sát số chu kỳ cần thiết trong phản ứng PCR 77 

III.2.3 Kết quả tinh sạch DNA 79 

III.2.4 Kết quả giải trình tự gen 81 

II.2.4.1 Tinh sạch trình tự gen 81 

III.2.4.2 Xác định kiểu phụ của các chủng dựa trên trình tự gen đặc trưng 83 

III.2.4.3 Phân tích dịch tễ học phân tử của các chủng phân lập được 87 

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 94 

IV.1 Kết luận 94 

IV.2 Đề nghị 95 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 96 

PHỤ LỤC 104 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

1 aw Water activity (hoạt độ của nước)

2 DNA Axit Deoxyribonucleic

3 bp Base pair (cặp bazơ)

4 dNTP Deoxynucleotide

5 EDTA Ethylen Diamine Tetra acetic Acid

6 EtBr Ethidium Bromide

7 MVLST A multi-virulence-locus sequence typing

8 kDa Kilo Dalton

9 LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA

10 PCR Polymerase Chain Reaction

11 PEG Polyetylen Glycol

12 TAE Tris - Acetate - EDTA

13 TE Tris - EDTA

14 PBS Phosphate Buffered Saline- muối đệm phosphate

15 HFb Half Fraser Broth (Môi trường tiền tăng sinh Lm)

16 Fb Fraser Broth (Môi trường tăng sinh Lm)

17 CFU Colony forming unit (Số đơn vị hình thành khuẩn lạc)

18 CAMP Christie, Atkins, Munch-Petersen

MỞ ĐẦU

Listeria monocytogenes là một trong những vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm trên cả người và động vật Trong tự nhiên, L monocytogenes có phạm vi phân bố khá rộng, có thể được tìm thấy ở nhiều nơi như đất, nước, thực vật, nhiều loại thực

phẩm, thức ăn gia súc và có cả trong phân người hoặc phân động vật Một đặc tính đặc biệt của loài vi khuẩn này là chúng có khả năng tồn tại và phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp nên các mặt hàng đông lạnh như thịt, xúc xích, các sản phẩm bơ, sữa …có nguy cơ cao bị nhiễm loại vi khuẩn này

Bệnh do L monocytogenes gây ra được gọi chung là listeriosis Đối tượng có

nguy cơ bị nhiễm bệnh cao thường là những người có hệ thống miễn dịch hoạt động kém như trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người lớn tuổi hoặc các bệnh nhân mắc hội chứng suy giảm miễn dịch Hậu quả của bệnh gây ra rất lớn Trong giai đoạn đầu tiên khi bị nhiễm bệnh, người bệnh thường biểu hiện các triệu chứng lâm sàng không đặc trưng giống như người bị cảm cúm thông thường (như ớn lạnh, mệt mỏi, đau đầu, mỏi cơ và xương) – chính vì vậy người ta thường không nhận biết được ngay sự lây nhiễm của loại vi khuẩn này Nếu độc tính đủ mạnh chúng sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm cấp tính với triệu chứng nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, viêm dạ dày Tuy nhiên, khi không được điều trị kịp thời bằng thuốc kháng sinh, chúng có thể phát triển gây nhiễm trùng máu, viêm màng não, sẩy thai và có thể gây tử vong

Với tỷ lệ tử vong cao, lên tới gần 30%, L monocytogenes nguy hiểm hơn rất nhiều

so với các tác nhân gây bệnh thông qua thực phẩm phổ biến như Salmonella (với tỷ

lệ tử vong 0,38%), Campylobacter (0,02-0,1%) và Vibrio (0.005-0,01%)

Vi khuẩn L monocytogenes được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào nhóm tác

nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm Các ca

nhiễm bệnh do L monocytogenes đã xảy ra ở các nước Châu Âu, Châu Mỹ, Châu

Phi cũng như các nước trong khu vực Châu Á và có xu hướng ngày càng tăng Trong một vài trường hợp, chúng có thể bùng phát thành dịch bệnh trên diện rộng

Ở Việt Nam, với sự phát triển của nền kinh tế , lối sống công ngiệp hóa và nhu cầu

sử dụng các thực phẩm chế biến sẵn như sữa và các sản phẩm của sữa, trứng và các

sản phẩm của trứng, đặc biệt là thực phẩm đông lạnh ngày càng gia tăng trong bữa

ăn hàng ngày của người dân thì nguy cơ nhiễm bệnh do L monocytogenes ngày

càng cao Tuy ở nước ta chưa có trường hợp nhiễm bệnh nào được báo cáo là liên

quan đến L monocytogenes nhưng đã có một số nghiên cứu phát hiện được sự nhiễm tạp của loại vi khuẩn này trong một số loại thực phẩm chế được biến sẵn Bên cạnh đó, khả năng gây bệnh và dịch của các chủng L monocytogenes có nguồn

gốc từ thực phẩm ở nước ta nói chung và ở Hà Nội nói riêng vẫn còn chưa được xác định

Do vậy, trong khuôn khổ của luận văn cao học này, chúng tôi đã nghiên cứu

“Phân lập và xác định độc tính bằng dịch tễ học phân tử của các chủng Listeria monocytogenes từ các mẫu thực phẩm thu thập được trên địa bàn Hà Nội”

Nghiên cứu này đã giải quyết các vấn đề sau:

¾ Xây dựng quy trình phân lập L monocytogenes từ thực phẩm

¾ Áp dụng quy trình đã xây dựng để phân lập các chủng L monocytogenes từ

các mẫu thực phẩm trên địa bàn Hà Nội

¾ Nghiên cứu dịch tễ học của các chủng đã phân lập dựa trên việc phân tích trình tự của các gen mang độc tính – MVLST (Multi-virulence-locus sequence typing)

PHẦN I TỔNG QUAN

I.1 Tổng quan về L monocytogenes

I.1.1 Các đặc tính cơ bản của L monocytogenes

L monocytogenes là một loại vi khuẩn có thế khiến phụ nữ mang thai bị sẩy

thai, gây ra bệnh viêm màng não ở người già hoặc những người có hệ miễn dịch yếu [51]

L monocytogenes được biết đến lần đầu tiên vào năm 1911 khi Hulpher, nhà

vi sinh vật học Thụy Điển, phân lập được một loài vi khuẩn từ bệnh hoại tử gan thỏ

và ông đặt tên là Bacillus hepatic Các đặc tính của loài vi khuẩn do Hulpher mô tả cho thấy nó rất giống với L monocytogenes Năm 1926, Muray đã đặt tên

monocytogenes cho loài này và các đồng nghiệp của ông cho rằng đây là một loài bacillus mới có khả năng hoạt động sinh monocytosis (hiện tượng tăng lượng bạch cầu quá mức bình thường) ở thỏ và chuột lang Đồng thời vào năm 1927, Pirie trong quá trình nghiên cứu nguyên nhân gây ra bệnh dịch đối với động vật ở Nam Phi đã

phát hiện ra một vi sinh vật mới và đặt tên là Listerella hepatolytica Hai tác giả

Murray và Pirie cùng gửi chủng của họ tới NCTC (National Collection of Type Cultures) ở London Sự giống nhau về các đặc tính của hai chủng này dẫn đến kết

quả Murray và Pirie đã thống nhất gọi vi khuẩn này là Listerella monocytogenes

Năm 1929, Nyfeldt đã lần đầu tiên phân lập loài vi khuẩn này từ người Sau đó,

Pirie đã đề xuất đổi tên từ Listerella monocytogenes thành L monocytogenes [51]

Về phân loại học, chi Listeria được chia làm sáu loài là L monocytogenes, L ivanovii, L innocua, L welshimeri, L seeligeri, và L gray Tuy vậy, chỉ có L monocytogenes và L ivanovii có khả năng gây bệnh [56] Nhiều nghiên cứu cho thấy, L monocytogenes có khả năng gây bệnh cho cả người và động vật trong khi

đó L ivanovii chủ yếu gây bệnh cho động vật và hiếm khi thấy chúng gây bệnh cho

người [43]

Bảng 1 Vị trí phân loại Listeria

Loài vi khuẩn này không hình thành capsul và không sinh bào tử Do có các

lông roi nên L monocytogenes có khả năng di chuyển dễ dàng trong môi trường

Khi nuôi cấy ở 20-250C trong tiêu bản giọt treo, vi khuẩn L monocytogenes di động

xoay tròn thành đợt còn trong môi trường thạch mềm chúng di động tạo thành dạng một chiếc ô cách bề mặt vài mm [51]

Hình 1.Vi khuẩn L monocytogenes

Giới Bacteria Ngành

Lớp

Bộ

Họ Chi

Firmicutes Bacilli Bacilales Listeriaceae Listeria

I.1.1.2 Đặc tính sinh lý

L monocytogenes là vi khuẩn kị khí không bắt buộc, không sinh bào tử

Chúng có khả năng sinh trưởng trong các điều kiện hiếu khí, vi hiếu khí, yếm khí và

thậm chí trong điều kiện chân không Tốc độ sinh trưởng và phát triển của L monocytogenes phụ thuộc vào các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH, nồng độ

muối và các chất dinh dưỡng

Người ta nhận thấy, L monocytogenes có khả năng tồn tại trong điều kiện

nhiệt độ từ -4 tới 500C, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng là 30-370C Về lý thuyết, nhiệt độ càng thấp thì vi khuẩn sinh trưởng

càng chậm Thời gian phát triển trung bình của L monocytogenes ở 40C là 43 giờ, ở

100C là 6,6 giờ và ở 370C là 1,1 giờ Nhiệt độ dưới 00C sẽ gây ức chế sự phát triển

của L monocytogenes [51]

Nhìn chung, pH thích hợp cho sự phát triển của L monocytogenes là 7,0 tuy

nhiên nó có thể phát triển với pH biến động từ 4,5 tới 7 Sự sinh trưởng ở pH thấp còn phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy và loại axit có trong môi trường Ở giá trị pH

thấp dưới 4,2, các tế bào L monocytogenes có thể tồn tại nhưng không sinh trưởng

Một số thí nghiệm cho thấy rằng nếu có khoảng 0,1% axit axetic, axit xitric và axit

lactic trong môi trường lỏng tryptose sẽ gây ức chế sự sinh trưởng của L monocytogenes và sự ức chế sẽ tăng lên khi tỉ lệ thuận với nhiệt độ nuôi cấy Sự

sinh trưởng cũng sẽ bị suy giảm khi có mặt vi khuẩn lactic Nguyên nhân chủ yếu là

do vi khuẩn lactic tạo môi trường pH thấp và trong một số trường hợp tạo ra các chất có tính diệt khuẩn

Hoạt độ nước (aw) thích hợp cho sự sinh trưởng và phát trển của L monocytogenes từ 0,97 trở lên Hoạt độ nước tối thiểu cho sự sinh trưởng của hầu

hết các chủng là 0,93, tuy nhiên, một số chủng có thể sinh trưởng trong điều kiện

aw thấp hơn 0,9 thậm chí một vài chủng có thể tồn tại với một thời gian dài trong tình trạng aw rất thấp

L monocytogenes có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối

khá cao 10-12% Loài vi khuẩn này sinh trưởng mạnh trong môi trường có nồng độ

muối vừa phải (6,5%) Khả năng chịu được nồng độ muối cao của L monocytogenes tăng khi nhiệt độ nuôi cấy càng thấp[51]

Farber và Hartwing đã tổng kết các điều kiện tại đó L monocytogenes không

thể phát triển trong các loại thực phẩm ăn liền là:

pH 5,0-5,5 và aw < 0,95

pH <5,0 với bất kỳ aw nào

aw < 0,95 với bất kỳ pH nào

I.1.1.3 Đặc tính sinh hoá

L monocytogenes là loài vi khuẩn có khả năng lên men nhiều loại đường và

không sinh khí H2S Trong 6 loài Listeria chỉ có L monocytogenes, L ivanovii, và

L seeligeri làm tan huyết trên môi trường thạch máu và cho kết quả thử nghiệm CAMP dương tính L monocytogenes và L seeligeri có phản ứng dương tính trong thử nghiệm CAMP với Staphylococus aureus và âm tính với Rhodococus equi trong khi L ivanovii lại cho phản ứng ngược lại

Hình 2 Kết quả thử nghệm CAMP của L monocytogenes

Bảng 2 Đặc tính sinh hóa của các chủng trong chi Listeria

Thử nghiệm CAMP (S aureus) + - - - + -

Thử nghiệm CAMP (R equi) - + - - - -

Khả năng tạo axit từ:

β-methyl-D-mannoside + - + + - +

Thủy phân Hippurate + + + + + -

Thủy phân Esculin + + + + + +

Gây bệnh cho chuột + + - - - -

-: 90% số chủng cho phản ứng âm tính

+: 90% số chủng cho phản ứng âm tính

d: 11-89% số chủng cho phản ứng dương tính

I.1.1.4 Đặc tính huyết thanh học

Ngoài các đặc điểm sinh hóa, L monocytogenes còn đặc trưng bởi kiểu huyết

thanh Chi Listeria có các kháng nguyên bề mặt đặc hiệu theo nhóm là kháng

nguyên tế bào (somatic) O và kháng nguyên tiên mao (flagellar) H Nhóm kháng

nguyên O có 15 loại (I-XV) còn kháng nguyên H gồm 4 loại (A-D)

Bảng 3.Sự kết hợp giữa kháng nguyên của soma (O) và flagellar (H) trong các kiểu huyết thanh của Listeria

Dựa trên Seeliger & Jones (1986)[60]

Serotype Kháng nguyên O Kháng nguyên H

6a V, (VI), (VII), (IX), XV A, B, C

6b (V), (VI), (VII), IX, X, XI A, B, C

Kiểu huyết thanh của các chủng thuộc Listeria được xác định dựa trên sự hiện diện của các kháng nguyên O và H Theo đó, L monocytogenes có ít nhất 12 kiểu

huyết thanh là 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4ngày, 4e và 7 [33][60] Theo thống kê, người ta nhận thấy 3 kiểu huyết thanh 4b, 1/2a, 1/2b là nguyên nhân gây

ra khoảng 98% các vụ nhiễm độc ở người còn kiểu huyết thanh 4a và 4c hiếm khi liên quan đến các trường hợp gây bệnh Các chủng có kiểu huyết thanh 4b được

phân lập từ hầu hết các vụ bùng phát listeriosis và các kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b

thường là nguyên nhân của các trường hợp nhiễm bệnh rải rác [28][67] Các nghiên

cứu còn cho thấy, L monocytogenes phân lập từ viêm não cừu thường có kiểu huyết

thanh 1/2b hoặc 4b, và những trường hợp người bị nhiễm trùng huyết hoặc sẩy thai chủ yếu là do chủng có kiểu huyết thanh 1/2a gây ra [43]

I.1.1.5 Đặc điểm về cấu trúc phân tử và con đường xâm nhiễm

qua con đường ăn uống chúng lây nhiễm vào cơ thể vật chủ do các thức ăn bị nhiễm

khuẩn Quá trình xâm nhiễm và gây độc của L monocytogenes gồm các bước: bám

vào tế bào chủ, xâm nhập vào tế bào chủ, phá huỷ không bào, di chuyển trong nội bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác

L monocytogenes có khả năng kháng lại được với enzyme phân hủy protein

của vật chủ, chịu đựng được môi trường axit của dạ dày (pH 2,0), muối mật và khi tấn công vào tế bào vật chủ chúng không gây triệu chứng viêm Điều này có được

dự trên hoạt động của một số gen hưởng ứng gây stress (opuCA, lmo1421 và bsh)

và các protein có liên quan (Sleatoret và cộng sự, 2003) Để sống sót qua giai đoạn

ban đầu này, L monocytogenes tuân thủ và tham gia như là một bộ phận của tế bào

chủ với sự giúp đỡ của một họ các protein bên mặt được gọi là các internalin [22] Các internalin đáng chú ý nhất là InlA và InlB

Bảng 4 Các nhân tố quyết định tính độc của L monocytogenes

Gene Protein

Kích thước ( bp)

Số axit amin

Khối lượng phân

tử a

Khối lượng phân

tử b

Điểm đẳng điện

a: khối lượng phân tử tính toán dựa trên dữ liệu trình tự nucleotit (kDa)

b : khối lượng phân tử tính toán dựa trên SDS- PAGE (kDa)

Hình 3 Quá trình sinh trưởng và xâm nhiễm của L monocytogenes

¾ InlA và InlB

Các protein bề mặt InlA (Internalin A) và InlB (Internalin B) được mã hóa bởi

gen inlA và inlB thuộc một họ gen ngoài nhiễm sắc thể, là những protein có vai trò

trong sự xâm nhập vào các tế bào biểu mô của vi khuẩn này

InlA có 800 axit amin và có chứa hai vùng lặp lại: vùng LRR gồm 22 axit amin lặp đi lặp lại liên tiếp 15 lần và một vùng gồm 70 axit amin lặp lại 2 lần InlA

tương tác với E- cadherin để làm trung gian giúp L monocytogenes xâm nhập vào

các tê bào biểu mô Vùng đầu cacbon linh động của InlA có khả năng liên kết đồng hóa trị với thành tế bào, khi vắng mặt vùng này hoặc vùng này bị loại bỏ, protein InlA bị tách ra hoàn toàn và khả năng xâm nhiễm của một vài chủng bị suy giảm đáng kể

Protein InlB có 630 axit amin giúp nhận biết C1q-R (hoặc Met) tạo điều kiện

cho L monocytogenes xâm nhập vào nhiều loại tế bào khác nhau bao gồm cả tế bào

gan, nguyên bào sợi và một vài tế bào biểu mô (Vero, HeLa, HEp-2, CHO và tế bào L2) InlB có các vùng lặp lại tương tự InlA và đầu cacbon của protein này bám với

bề mặt tế bào tạo thành 3 vùng lặp lại của các module GW (lặp lại bắt đầu bằng dipeptide GW) Vùng tương tự LRR có mặt ở protein InlB cũng hoạt hóa phosphoinositide kinase (PI), một lipid kinase cần cho sự xâm nhiễm gián tiếp của

InlB đối với các tế bào chủ Sự xâm nhập vào tế bào chủ của L monocytogenes

không bị các hoạt động của hệ miễn dịch phát hiện [61]

trò chính trong việc xâm nhập vào bên trong nguyên bào sợi và gen iap mã hóa cho protein này cũng được coi như một gen đặc trưng cho L monocytogenes

¾ InlC

InlC (Internalin C) kích thước 30 kDa, có 12 vùng gắn LRR gấp thành một cấu

trúc giống như móng ngựa, trên bề mặt L monocytogenes và tế bào vật chủ; được điều hòa bởi PrfA Từ lâu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng L monocytogenes

lây lan từ tế bào này sang tế bào khác trong cơ thể con người Vi khuẩn lớn lên trong một tế bào và di chuyển nhanh chóng tạo thành một cấu trúc theo hình ngón tay nhô ra từ tế bào và đẩy sang tế bào liền kề Khi đó vi khuẩn sẽ tiếp tục gây bệnh cho tế bào liền kề đó

Hình 4 Hình ảnh quá trình xâm nhiễm của L.monocytogenes

InlC đóng vai trò quan trọng trong quá trình thứ hai hỗ trợ việc lây lan của vi khuẩn sang những tế bào khỏe mạnh Thông thường, màng tế bào hay lớp ngoài cùng của những tế bào khỏe mạnh căng ra Tình trạng căng đó được kỳ vọng là có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn Listeria không lây lan sang những tế bào chưa nhiễm

bệnh liền kề Tuy nhiên, với sự có mặt của InIC làm giảm đi độ căng của màng tế

bào ở những tế bào nhiễm bệnh, điều này sẽ làm cho việc di chuyển của vi khuẩn để xuyên thủng màng tế bào và sau đó lây lan sang các tế bào khỏe manh liền kề dễ dàng hơn

LLO là một độc tố thuộc nhóm có độc tố chứa nhóm thiol (-SH) Nhóm độc tố

này gồm có steptolysin O của Streptococus pyogenes, pneumolysin của Streptococus pneumoniae và perfringolyssin của Clostridium perfringens Các độc

tố này chỉ hoạt động trên các màng có cholesterol, tại đó cholesterol hoạt động như một cơ quan thụ cảm của màng Người ta cho rằng, sau khi LLO liên kết với bề mặt của màng tế bào thứ hai để chuẩn bị lan truyền sang, protein này sẽ tạo thành các oligomer dẫn đến tạo thành dạng lỗ thủng trên màng Hoạt lực của các độc tố này thường được xác định bằng hoạt lực phân giải của chúng đối với các tế bào hồng cầu, vì thế chúng thường được gọi là các chất tan huyết (hemolysin) Khả năng làm

tan huyết là một đặc điểm quan trọng để phân biệt L monocytogenes với các chủng

vi khuẩn khác theo phương pháp hóa sinh truyền thống

LLO là một protein 58-kDa được mã hóa bởi gen hlyA, định vị trên nhóm gen độc của L monocytogenes HlyA là một gen đặc trưng cho L monocytogenes mà nhiều nhà nghiên cứu đã dựa vào hlyA để phát hiện và phân biệt L monocytogenes

với các vi sinh vật khác LLO là thành viên duy nhất thuộc nhóm các độc tố chứa nhóm (-SH) được sinh ra trong nội bào của vi khuẩn Nó có hoạt lực mạnh nhất ở

pH 5,5 là pH trong không bào Ở pH trung tính của tế bào chất chúng hoạt đông

kém hơn, do đó các tác động có hại của LLO đối với màng tế bào khi vi khuẩn L monocytogenes tồn tai tự do trong tế bào chất bị hạn chế LLO có một vai trò quan trọng giúp L monocytogenes thoát khỏi không bào của tế bào chủ

phosphatidylinositol-B cereus, S aureus, C perfringens và Pseudomonas aeruginosa Các enzym này

phân cắt phospholipids thành glycerol và một nhóm phosphate và thường dẫn đến làm thay đổi cấu trúc và thành phần của màng tế bào PI-PLC có khả năng hoạt

động phối hợp với PC-PLC hỗ trợ LLO trong quá trình dung giải không bào sơ cấp

Do đó, cả hai loại PLC có vai trò trong việc giải phóng L monocytogenes thoát khỏi

không bào và lan truyền từ tế bào này sang tế bào khác [11]

¾ ActA

Sau khi đã thoát ra khỏi không bào, L monocytogenes đi vào tế bào chất, ở

đây chúng trải qua quá trình phát triển và tăng sinh trong tế bào Để biến đổi và

phân chia bên trong tế bào, L monocytogenes cần một protein bề mặt khác là ActA ActA không đặc trưng cho L monocytogenes mà là một protein cấu thành sợi lông

có 639 axit amin, khối lượng 67-kDa được tìm thấy ở tất cả các tế bào nhân thật

Gen actA mã hóa protein bề mặt ActA, là một nhân tố duy nhất cần thiết cho khả

năng di chuyển của vi khuẩn

Khi các đầu sợi actin đẩy vi khuẩn tới màng sinh chất tế bào chủ của chúng, màng sẽ trở nên căng phồng và tạo thành vị trí nhô ra bên trong khoảng trống nội bào Khi vị trí màng có bám vi khuẩn của một tế nào đã nhô sang một tế bào bên cạnh thì quá trình lan truyền sẽ diễn ra Tuy nhiên, ở vị trí này tế bào vi khuẩn bị bao quanh bởi một không bào màng kép, trong đó một màng là của tế bào cho và màng còn lại của tế bào nhận vi khuẩn Sự phá hủy màng kép này đòi hỏi phải có sự

tham gia của LLO, PI-PLC, PC-PLC và một metalloprotease mã hóa bởi gen mpl

Sau khi phân giải màng kép này một vòng mới gồm di chuyển trong nội bào và lan truyền của vi khuẩn lại được bắt đầu

trong số tám gen trên có một gen là prfA mã hóa protein PrfA 27 kDa lại có vai trò

điều hòa các gen còn lại

Sự hoạt động của các gen độc được bắt đầu bằng sự liên kết của chúng với một trình tự đối xứng (palindromic) 14 bp bảo thủ (gọi là hộp PrfA) trên các vùng

promoter của PrfA Người ta cũng cho rằng sự oligomer hóa của prfA cũng đóng vai

trò đối với sự hoạt động của các gen độc và nồng độ của prfA có thể quyết đinh khả

năng hoạt động của cac gen độc khác Như vậy, sự biểu hiện của các gen độc tố

được điều khiển khá cao bởi prfA Do đó, một số nhà nghiên cứu đã sử dụng prfA như một gen đặc trưng cho L monocytogenes

¾ InlJ

InlJ là một trong những protein bề mặt của L monocytogenes, một internalin

mới được xác định liên quan tới tính độc của vi khuẩn L monocytogenes, không có

mặt tại các loài listeria khác InlJ hỗ trợ khả năng bám dính lên tế bào vật chủ

Nói tóm lại, L monocytogenes là một mầm bệnh vi khuẩn có khả năng gây

bênh cho người và động vật Khả năng xâm nhiễm và gây bệnh của chúng phụ

thuộc vào một số gen như hly, plcA, plcB, mpl, actA, prfA, inlA và inlB Trong số

đó, sáu gen: hly, plcA, plcB, mpl, actA và prfA được tập hợp tại cùng một operon trên nhiễm sắc thể, hai gen còn lại là inlA và inlB thuộc một họ đa gen và nằm tại một operon khác Ngoài ra, gen iap mã hoá protein p60 cũng tham gia trong quá trình xâm nhiễm của L monocytogenes

I.1.2 Con đường lây nhiễm và bệnh do L monocytogenes gây ra

I.1.2.1 Con đường lây nhiễm L monocytogenes

L monocytogenes là một loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho cả người và

động vật Chúng là một trong số ít các loài có phạm vi phân bố rộng Có thể tìm thấy loài này ở nhiều nơi như: đất, thức ăn gia súc, nước, thực vật, nhiều loại thực

phẩm và trong phân người và phân động vật Những thực phẩm thường bị nhiễm L monocytogenes là: xà lách trộn, sữa thanh trùng, tiệt trùng, pho mát mềm, patê, thịt

lợn đóng gói và xúc xích Do thời gian ủ bệnh lâu dài nên việc xác định nguồn

thực phẩm gây dịch bệnh listeriosis thường rất khó khăn Người ta cho rằng một số chủng L monocytogenes phân lập được ở trẻ sơ sinh bắt nguồn từ bệnh viện do sử

dụng những dụng cụ bị nhiễm khuẩn Những người trồng rau và tiếp xúc gần gũi với động vật bị nhiễm khuẩn cũng dễ mắc bệnh Hình dưới đây mô tả các con

đường lây nhiễm của L monocytogenes trong thực phẩm

Hình 5 Sơ đồ phân bố L monocytogenes trong chuỗi thực phẩm từ môi

trường tự nhiên I.1.2.2 Bệnh do L monocytogenes gây ra

L monocytogenes là nguyên nhân gây ra một loại bệnh nguy hiểm lây nhiễm thực phẩm mang tên listeriosis Thuật ngữ listeriosis bao gồm một phổ rộng các

triệu chứng bệnh tương tự nhau của người và động vật Viêm não là dạng phổ biến nhất trong các loại bệnh do vi khuẩn này gây nên trên động vật nhai lại Nhiễm trùng máu hoặc viêm tạng cũng thường xảy ra ở các con vật còn non Nhiễm trùng

cổ tử cung của các bào thai thông qua nhau thai cũng thường dẫn đến xảy thai ở cừu

và gia súc Một số nghiên cứu cho thấy 20-30% bệnh nhân mắc bệnh tử vong hoặc

chết chu sinh Các trường hợp mắc bệnh do L monocytogenes thường xảy ra riêng

lẻ, nhưng cũng đã có một vài trận dịch bùng phát do nguồn thực phẩm bị nhiễm L monocytogenes

Người ta nhận thấy có hai thể bệnh listeriosis là listeriosis khu trú ở ruột và

listeriosis xâm nhập và lan tỏa Listeriosis khu trú ở ruột gây ảnh hưởng trực tiết tới

hệ thống tiêu hóa Người bệnh sẽ trải qua các triệu chứng nhẹ giống như bị cúm

thường như sốt và đau mỏi cơ cũng như có hiện tượng tiêu chảy Listeriosis thể xâm

nhập và lan tỏa là sự nhiễm bệnh không chỉ tập trung tại đường tiêu hóa mà còn

xâm nhập vào máu gây tình trạng nhiễm trùng máu hoặc lan sang cả hệ thần kinh trung ương và não bộ gây viêm màng não Cả hai tổn thương do nhiễm khuẩn này

đều có thể dẫn đến chết người Listeriosis lan tỏa là một bệnh lý khá nguy hiểm, đòi

hỏi phải nhập viện ngay lập tức để được điều trị tích cực bằng các loại thuốc kháng sinh

Nhìn chung, listeriosis chủ yếu xảy ra đối với phụ nữ mang thai, trẻ sơ sinh và

những người trưởng thành có hệ miễn dịch bị tổn thương nhưng cũng có thể xảy ra đối với những người bình thường Thống kê ở Pháp năm 2008 cho thấy tần suất

mắc bệnh listeriosis là 4,8 ca/1.000.000 dân và có xu hướng ngày càng gia tăng [8] Listeriosis xảy ra dễ dàng hơn gấp 300 lần ở người mắc hội chứng suy giảm miễn dịch (AIDS) so với những người bình thường Phụ nữ mang thai dễ bị nhiễm L monocytogenes có lẽ là do sự thay đổi về miễn dịch tại chỗ và toàn thân trong thai

kỳ

Ở phụ nữ mang thai, hầu hết các trường hợp nhiễm khuẩn đều xảy ra vào 3

tháng cuối của thai kỳ Đa số phụ nữ mang thai bị nhiễm L monocytogenes có dấu

hiệu sốt, mệt mỏi và đau lưng, có khi thấy tiêu chảy, đau bụng, buồn nôn hoặc nôn trong suốt thời kỳ nhiễm khuẩn Vi khuẩn có thể lây truyền qua rau thai dẫn đến nhiễm khuẩn tử cung, viêm màng đệm và màng ối, sinh non, hoặc bệnh khởi phát ở giai đoạn sớm ở những trẻ mới sinh Phụ nữ nhiễm bệnh dễ bị sảy thai tự nhiên Trẻ

sơ sinh tuần lễ đầu tiên khởi phát bệnh với những dấu hiệu nhiễm khuẩn, khó thở những tổn thương ở da, hội chứng u hạt nhiễm khuẩn đặc trưng bởi những ổ áp-xe rải rác ở gan, lách, tuyến thượng thận, phổi và những cơ quan khác Một số trẻ sơ sinh phát bệnh ở giai đoạn muộn thường bị viêm màng não nhiều hơn so với trẻ khởi phát ở giai đoạn sớm Nếu nhiễm khuẩn bào thai ở giai đoạn sớm thường đi kèm với những biến chứng sản khoa như sinh non và viêm màng đệm và màng ối [1]

Nhiễm khuẩn L monocytogenes còn xảy ra ở những người suy giảm miễn

dịch, nhất là những người điều trị lâu dài bằng glucocorticoid, có khối u ác tính hoặc bệnh lý máu ác tính, đái tháo đường, bệnh thận, bệnh gan và AIDS Nhiễm khuẩn huyết là biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất ở những người bị tổn thương hệ

miễn dịch, và nhiễm khuẩn hệ thần kinh trung ương đứng hàng thứ nhì Triệu chứng

nhiễm khuẩn huyết do L monocytogenes không thể phân biệt với nhiễm khuẩn

huyết do những vi khuẩn khác gây ra Bệnh nhân thường bị sốt, mỏi cơ, buồn nôn, nôn và tiêu chảy

Viêm màng não cấp tính hoặc bán cấp gồm các triệu chứng: sốt, đau đầu, suy giảm trí tuệ; xét nghiệm dịch não tủy có thể cho thấy tăng tế bào bạch huyết, tăng nồng độ protein, nồng độ glucose bình thường, hiếm khi tăng bạch cầu đơn nhân; viêm não, màng não, áp-xe trong não, tủy sống và nội sọ; liệt dây thần kinh nội sọ không đối xứng, suy giảm trí tuệ, các dấu hiệu tiểu não, mất cảm giác và vận động; sốt, mất điều vận, động kinh, thay đổi nhân cách, hôn mê, cứng gáy Viêm màng trong tim xảy ra trên các van tim đã có tổn thương từ trước, hay gây tình trạng nghẽn mạch hệ thống Nhiễm khuẩn khác có thể gặp là: nhiễm khuẩn mắt, viêm phúc mạc, viêm xương tủy xương, áp-xe nội tạng, viêm phổi - màng phổi, viêm túi mật, viêm da ở người trồng rau, người chế biến thịt gia cầm Viêm dạ dày ruột cấp tính gây tiêu chảy ở những người bị suy giảm miễn dịch [51]

I.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm do L monocytogenes gây ra

I.1.3.1 Trên thế giới

Ngày 25/1/2000, Tổ chức Y tế Thế giới đã tổ chức họp báo để công bố sự gia tǎng của các bệnh do thực phẩm Theo Tiến sĩ Gro Harlem Brundtland, Tổng Giám đốc TCYTTG thì hàng nǎm có tới 30% dân số ở các nước phát triển có thể bị bệnh

do thực phẩm Con số này ở các nước đang phát triển còn cao hơn nhiều Ngoài những tổn thất về nhân mạng thì thiệt hại về kinh tế, xã hội bởi các bệnh do thực phẩm là cực kỳ to lớn

Trong số các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm đã được các nước trên thế giới

xác định, L monocytogenes là loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm có khả năng

tồn tại trong cơ thể khá lâu và khi có điều kiện thuận lợi chúng sẽ xâm nhiễm vào các mô sâu hơn và gây bệnh Chúng đã gây ra rất nhiều vụ ngộ độc hàng loạt ở các quốc gia trên thế giới

Triệu chứng ngộ độc L monocytogenes đầu tiên thường xảy ra là tác động đối

với hệ thống đường ruột gây ra buồn nôn, nôn và tiêu chảy Thời gian phát bệnh

thường là hơn 12 giờ sau khi nhiễm L monocytogenes Bệnh có thể kéo dài từ ba

ngày đến ba tuần

Vụ ngộ độc thực phẩm do L monocytogenes được xác nhận đầu tiên vào năm

1981 tại Maritime Province - Nova Scotia thuộc Canada Vụ ngộ độc làm 41 người

phải nhập viện và nguyên nhân là do xà lách trộn bị nhiễm L monocytogenes Các

phân tích dịch tễ đã chỉ ra rằng loại rau cải được sử dụng trong món này đã nhiễm

L monocytogenes từ khi trồng[51]

Sau vụ ngộ độc ở Canada, tại Mỹ cũng xảy ra một loạt các vụ ngộ độc do L monocytogenes Vụ ngộ độc ở Boston, Masssachusett năm 1983, có 49 bệnh nhân

bị nhiễm trùng máu hoặc viêm màng não, làm tử vong 14 người (chiếm 29%)

Nguyên nhân do tiêu thụ sữa thanh trùng bị nhiễm L monocytogenes và các thùng

đựng loại sữa này đã bị nhiễm khuẩn Vụ ngộ độc ở Los Angeles và xung quanh vùng Orange tháng 6 năm 1985 là do sử dụng phomat kiểu Mexican nhãn hiệu

Jalisco có 142 trường hợp bị nhiễm L monocytogenes Ngoài ra, còn xảy ra 160

trường hợp ngộ độc thực phẩm ở các vùng của California như Orange, San Diego

và Fresno và một vài bang khác như Colorado, Texas, Oregon và Connecticut Trong suốt thời gian diễn ra ngộ độc đã phát hiện được 93 trường hợp (65%) nhiễm

L monocytogenes là phụ nữ mang thai hoặc con cái của họ và 49 trường hợp

(34.5%) là người trưởng thành, 48 trường hợp tử vong chiếm tỷ lệ là 33.8%

Hình6 Thực phẩm bị thu hồi trên thị trường do nhiễm VSV tại Mỹ, 1999

(Food Safety and Inspection Service United States Deparment of Agriculture

Washington) [20]

Bảng 5 Báo cáo về các trận dịch bùng phát do L monocytogenes gây nên ở Châu Âu từ năm 1999 tới năm 2006 [31]

Số ca nhiễm bệnh ghi nhận được Quốc gia

Một số vụ ngộ độc L monocytogenes xảy ra ở Mỹ cũng như ở Châu Âu có

nguyên nhân chính là từ thịt và các sản phẩm về sữa Các sản phẩm này bao gồm các thực phẩm ăn sẵn được bảo quản trong tủ lạnh với thời gian dài, tạo điều kiện

để L monocytogenes sinh trưởng và lây nhiễm thực phẩm với mật độ lớn hơn 100 CFU/g hoặc ml Phomat mềm nhiễm L monocytogenes là nguyên nhân chính gây ra

vụ ngộ độc cho 122 trường hợp ở Thụy Sỹ và patê bị nhiễm là phương tiện gây ra

vụ ngộ độc với 300 trường hợp ở Mỹ vào năm 1989 đến 1990 Gần đây hơn ở Pháp, lưỡi lợn bị nhiễm trong món thịt đông là nguyên nhân chính của 279 trường hợp bị

bệnh listeriosis trong năm 1992, thịt lợn nói chung gây ra 39 trường hợp ngộ độc

vào năm 1993 và phomát mềm là nguyên nhân gây ra 33 trường hợp vào năm 1995

Giữa tháng 12-1998 và tháng 1-1999, một vụ ngộ độc L monocytogenes xảy ra ở

Phần Lan, trên tổng số 25 người bị ngộ độc, 6 bệnh nhân đã tử vong Nguyên nhân

là do bệnh viện dùng bơ để 3 ngày để chăm sóc các bệnh nhân Trong khoảng tháng

5 đến tháng 11 năm 2000, tình hình ngộ độc do L monocytogenes đã được xác định

ở Mỹ trong 10 bang L monocytogenes được phân lập từ những trường hợp đó đều

có kiểu huyết thanh 1/2a Trong thời gian này đã có 4 người chết, 3 người xảy thai hoặc sinh non Các điều tra cho thấy thịt gà tây bán trong các cửa hàng trên phố là

nguyên nhân gây nhiễm chính Năm 2002, đợt bùng phát dịch bệnh listeriosis ở

nhiều bang, đã xác nhận có 46 ca nhiễm bệnh, 7 ca tử vong và 3 ca xảy thai

Ngày 19 tháng 3 năm 2007, Cơ quan quản lý thực phẩm Anh Quốc có lệnh thu hồi toàn bộ các loại bánh mì kẹp thịt (sandwich) của công ty Anchor cung cấp trong

hệ thống bệnh viện và trường học tại Luân Đôn, do sản phẩm này bị nhiễm vi khuẩn

L monocytogenes

Tháng 10 năm 2008, ở Canada 20 người tử vong do nhiễm L monocytogenes

từ thức ăn nhanh Theo thống kê của cơ quan trên, cả nước Canada hiện có 52 trường hợp nhiễm bệnh do vi khuẩn này với các triệu chứng sốt, đau đầu, buồn nôn, đau bụng và tiêu chảy Ngoài ra còn có 9 trường hợp khác cũng bị nghi nhiễm vi khuẩn nguy hiểm nói trên vì có triệu chứng tương tự Đợt dịch bệnh do ăn phải thức

ăn nhanh nhiễm khuẩn bùng phát tại Canada hồi đầu tháng 8-2008 và ngay lập tức làm 15 người thiệt mạng Ngày 19-8, Cơ quan Thanh tra thực phẩm Canada đã ra

lệnh thu hồi các mặt hàng của Tập đoàn thực phẩm Maple Leaf Foods như thịt gà

tây, các loại xúc xích, giăm bông hun khói bị nghi nhiễm vi khuẩn L monocytogenes Maple Leaf Foods đã đóng cửa nhà máy ở Toronto, nơi vi khuẩn L monocytogenes được tìm thấy trong hai loại sản phẩm thịt được chế biến tại nhà

máy Đến nay, số loại sản phẩm mà tập đoàn này phải thu hồi đã lên tới con số 220, bao gồm cả bánh sandwich có nhân thịt nhiễm khuẩn, với tổng giá trị ước tính khoảng 20 triệu USD (14 triệu euro)

Ngày 23 tháng 8 năm 2010, Bộ Kiểm dịch Nông nghiệp và An toàn thực phẩm

Mỹ (FSIS) đã cho thu hồi 380.000 tấn sản phẩm thịt đông lạnh của công ty Zemco

do bị nhiễm L monocytogenes

Qua những thống kê trên, ta có thể thấy ngộ độc do L monocytogenes xảy ra ở

khắp nơi trên thế giới, xảy ra thường xuyên với tỷ lệ gây chết cao Với đặc điểm

dịch tễ học phức tạp, loài vi khuẩn L monocytogenes được Tổ chức y tế thế giới

xếp vào nhóm tác nhân sinh học có nguy cơ cao trong lĩnh vực an toàn vệ sinh thực phẩm

I.1.3.2 Ở Việt Nam

Theo số liệu mới nhất của Tổng cục Thống kê, trong 6 tháng đầu năm 2007, cả nước xảy ra 4300 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó 37 người đã tử vong Trong đó, các nguyên nhân do vi sinh vật chiếm 55,8%; hóa chất chiếm 13,1%, thực phẩm chứa chất độc tự nhiên chiếm 22,76%, còn lại không rõ nguyên nhân Đáng báo động là những vụ ngộ độc thực phẩm tại các bếp ăn tập thể có xu hướng ngày càng gia tăng Đặc biệt có những vụ ngộ độc tập thể lên tới hàng trăm người Những con

số trên đây chỉ là những số liệu ghi nhận được tại các cơ quan chức năng, trong thực

tế số trường hợp bị ngộ độc thực phẩm còn cao hơn tới hàng trăm lần

Tình hình ngộ độc do L monocytogenes ở Việt Nam vẫn chưa được báo cáo

tại các cơ quan chức năng Nguyên nhân một phần là do hầu hết các báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta thường chỉ được báo cáo dưới hình thức chung (nguyên nhân do vi sinh vật nói chung hoặc hoá chất độc…), các báo cáo về nguyên nhân cụ thể gây nên ngộ độc do loài vi sinh vật này là rất ít Ngoài ra, mặc dù là một trong những vi khuẩn nguy hiểm hàng đầu trong thực phẩm và đã được nhiều

nước quan tâm nhưng các chỉ tiêu kiểm nghiệm về L monocytogenes vẫn chưa

được phổ biến tại các cơ quan có chức năng kiểm tra thực phẩm ở nước ta

Năm 1996, trong số 215 mẫu thực phẩm các loại gồm sữa chua, hải sản đông

lạnh, thịt tươi sống, rau xanh và thực phẩm chế biến dùng ngay, Viện Pasteur TP

HCM đã phân lập được 2 chủng L monocytogenes, chiếm tỷ lệ 0,93% Đến năm

1999, Viện Vệ sinh Y tế Công cộng cũng phân lập được 2 chủng L monocytogenes

từ 20 mẫu thực phẩm, chiếm tỷ lệ 10%

Năm 2006, theo tổng kết của Phòng Kiểm nghiệm Hóa lý- Vi Sinh thực phẩm

Viện Pasteur TP.HCM, các mẫu hải sản đông lạnh có tỷ lệ nhiễm L monocytogenes

là 23/138, chiếm 23,9% tổng số mẫu kiểm tra Như vậy tỷ lệ phát hiện của chủng vi

khuẩn này ngày càng cao ở nước ta và thường được tìm thấy trong các mẫu thực

phẩm đông lạnh Đây là điều phù hợp với đặc điểm sinh lý của L monocytogenes vì

vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong môi trường 0-4oC, là môi trường thường

được dùng để bảo quản thực phẩm [7]

Bảng 6 Thực phẩm nhiễm L monocytogenes ở Việt Nam

(Nguồn: Phòng Kiểm Nghiệm Hóa Lý-Vi Sinh, Viện Pasteur TP.HCM)

Trong tháng 4 năm 2010, số lượng mẫu cá tra đông lạnh xuất khẩu của Việt

Nam bị phát hiện nhiễm L monocytogenes ngày càng gia tăng Bộ, Cục Quản lý

Chất lượng Nông Lâm sản và Thủy sản (NAFIQAD) đã tiến hành thực hiện đề tài

khoa học cấp cơ sở “Xác định nguyên nhân lây nhiễm và đề xuất giải pháp kiểm

soát mối nguy L monocytogenes trong sản xuất sản phẩm cá tra đông lạnh” Theo

số liệu các kết quả phân tích của đề tài cho thấy 162/485 mẫu, (bao gồm 29/120

mẫu nguyên liệu được lấy tại cửa nhà máy chế biến, 79/186 mẫu vệ sinh công

nghiệp trong quá trình sản xuất và 22/95 mẫu vệ sinh công nghiệp sau khi vệ sinh,

STT Năm Mẫu Số mẫu Số mẫu nhiễm Tỉ lệ

1 1996 Thịt và sản phẩm thịt 215 2 0.93%

2 1999 Thực phẩm chế biến 20 2 10%

3 2006 Hải sản đông lạnh 138 23 23.9%

8/28 mẫu tay công nhân, 24/36 mẫu bán thành phẩm) bị phát hiện nhiễm L monocytogenes Như vậy nguyên nhân lây nhiễm L monocytogenes trong sản

phẩm cá tra chủ yếu là do nguyên liệu trong quá trình nuôi, vận chuyển về nhà máy, nhiễm chéo tại các khâu chế biến hoặc do quá trình làm vệ sinh khử trùng tại nhà máy chưa hiệu quả (vệ sinh tay công nhân trước khi vào nhà máy, vệ sinh máy móc, thiết bị, các bề mặt tiếp xúc… chưa đạt yêu cầu) [4]

Thực phẩm bị nhiễm L monocytogenes không chỉ là nguy cơ gây ngộ độc thực

phẩm mà nó còn ảnh hưởng rất lớn tới sự phát triển của kinh tế xã hội nhất là trong các ngành thực phẩm xuất khẩu kinh tế mũi nhọn của nước ta Do đó đòi hỏi phải

có một biện pháp hữu hiệu để quản lý và các giải pháp nhằm giảm thiểu mối nguy này

I.1.3.3 Quy định kiểm soát L monocytogenes

Tiêu chuẩn về L monocytogenes trong thực phẩm cho các nước Châu Âu, Mỹ

là 0 CFU/25g (ml)

Ở Việt Nam, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm (7/2006), tiêu chuẩn về L monocytogenes được bao gồm trong chỉ tiêu “không có vi sinh vật gây bệnh” là 0 CFU/25g L monocytogenes được kiểm soát trong tiêu chuẩn ngành thủy sản đối

với thủy hải xuất khẩu sang châu Âu và Mỹ Tháng 10 năm 2007, Bộ Khoa học và Công nghệ đã công bố hai Tiêu chuẩn Quốc Gia là TCVN 7700-1:2007 (ISO 11290-1:1996) và TCVN 7700-2:2007 (ISO 11290-2:1998) để phát hiện và định

lượng L monocytogenes [2]

I.2 Các phương pháp phát hiện L monocytogenes

Do L monocytogenes có các đặc điểm hình thái và thường gây ra các triệu

chứng lâm sàng không đặc trưng do đó cần thiết phải thực hiện các thử nghiệm sinh

hóa để phân biệt L monocytogenes với các loài Listeria khác hoặc để chẩn đoán các bệnh do L monocytogenes gây ra Nếu trong xét nghiệm phát hiện thấy sự có mặt của các loài Listeria nhưng không phải L monocytogenes thì không cần thiêt sử

dụng thuốc kháng sinh để điều trị bệnh trừ trường hợp bệnh nhân mắc triệu chứng

suy giảm miễn dịch Các phương pháp chẩn đoán L monocytogenes trước đây phần lớn dựa trên kiểu hình, và đặc trưng sản phẩm kiểu gen của L monocytogenes thông

qua các phương pháp sinh hóa, miễn dịch và đặc tính của thể thực khuẩn Do vậy, kết quả của các phân tích này có thể không ổn địnhtùy thuộc vào điều kiện môi trường, giai đoạn tăng trưởng và các đột biến gen tự nhiên Điều này đồng nghĩa với việc sử dụng xét nghiệm kiểu hình có thể dẫn đến kết quả không chính xác Gần đây cùng với những tiến bộ của kỹ thuật di truyền , phương pháp phát hiện gen mục

tiêu đã được sử dụng dựa trên các đặc điểm khác nhau về bộ gen của L monocytogenes với các loài Listeria khác Phương pháp này chính xác hơn và ít bị

ảnh hưởng bởi các biến đổi của điều kiện tự nhiên hơn so với phương pháp kiểu hình

I.2.1 Các phương pháp truyền thống

Để phát hiện L monocytogenes trong các sản phẩm thực phẩm hoặc sản phẩm

sữa theo phương pháp truyền thống người ta phải tiến hành các thử nghiệm dựa trên đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của chúng Nguyên lý của phương pháp này

là tiến hành cấy đếm L monocytogenes trên môi trường nuôi cấy chuyên biệt sau

khi ủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 48 giờ Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ và xác định L

monocytogenes bằng các thử nghiệm sinh hóa

I.2.1.1 Phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái vi sinh vật học

Bước đầu tiên trong quá trình phát hiện và phân lập L monocytogenes trong

các sản phẩm thực phẩm là tăng sinh trong môi trường thích hợp Môi trường tăng

sinh là các môi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của L monocytogenes, có thể bổ sung các chất chọn lọc và các chất chỉ thị Ví dụ như

trong môi trường tăng sinh chọn lọc MFB (Modified Fraser Broth), sau 24-26 giờ ở

350C, nếu có L monocytogenes môi trường sẽ bị sẫm màu, có thể là mầu đen, nâu

đen hoặc xanh đen

Sau quá trình tăng sinh cần tiến hành phân lập L monocytogenes trên môi

trường đặc hiệu Dùng que cấy ria đều để dung dịch mẫu được phân bố khắp các mặt thạch sau cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều, lưu ý môi trường thạch nuôi cấy phải được hong khô trước khi dùng Tùy thuộc vào môi trường chọn lọc mà ta có hình thái khuẩn lạc tương ứng

• Trên môi trường Lithium Chloride-Phenylethanol-Moxalactam (LPM), khuẩn lạc có dạng cụm nhăn nheo hơi trắng, đôi khi có ánh màu xanh xám

• Trên môi trường Oxford Agar (OXA) và Modifided Oxford Agar (MOX), khuẩn lạc màu đen, đường kính 1mm được bao quanh bới một vòng đen sau 24 giờ nuôi cấy Sau 48 giờ, khuẩn lạc có đường kính 2-3 mm, mẫu đen với vòng đen bao quanh và lõm sâu ở giữa Khuẩn lạc cũng có thể xuất hiện với mầu nâu đen hoặc xanh đen

• Trên môi trường PALCAM agar, khuẩn lạc có mầu xanh xám với một vùng lõm sâu ở giữa mầu đen và một vòng đen bao quanh trên nền đỏ của môi trường [6] Khi tách riêng được các khuẩn lạc và dựa trên đặc điểm hình thái ta có các

khuẩn lạc nghi ngờ là L monocytogenes Tiếp theo ta tiến hành kiểm tra đặc điểm

hình thái của chúng Để quan sát qua kính hiển vi người ta tiến hành lấy một khuẩn lạc cho vào môi trường lỏng thích hợp, có thể là nước muối sinh lý hoặc môi trường

tăng sinh, sau đó soi trên lam kính Hình thái đặc trưng của L monocytogenes là tế

bào hình que ngắn, mảnh, di động kiểu xoay tròn nhẹ hoặc nhào lộn Di động kiểu

bơi không phải là đặc trưng của L monocytogenes Còn nếu trên môi trường thạch SIM, L monocytogenes di động tạo hình cái ô ở 250C (lưu ý, để đảm bảo tính di động tao được hình cái ô, môi trường đổ phải cao 10 ml ống 16×125 mm) [6]

I.2.1.2 Phương pháp sinh hóa

Listeria là loài vi khuẩn có nhiều đặc điểm hình thái và sinh hóa tương tự với các loài vi khuẩn gần gũi khác Ngoài việc có phản ứng catalase dưng tính, phản ứng âm tính với indole (thuốc thử) và oxidase, các loài Listeria có thể thủy phân

aesculin, nhưng không thủy phân được urê Những phương pháp sinh hóa thông thường này thường xuyên được khai thác để phân biệt loài Listeria với các loài vi khuẩn khác Mặt khác, mỗi loài Listeria cũng có những tính chất sinh hóa đặc trưng, chúng có thể hữu ích để phân biệt các loài cụ thể Ví dụ, các loài Listeria khác nhau cho các phản ứng khác nhau về khả năng làm tan máu (haemolyse), tan các tế bào hồng cầu của ngựa hay cừu, và chúng cũng có thể có khả năng sản xuất axit từ L-rhamnose, D-xylose và α-methyl-D-mannoside [56]

Do đó, về mặt sinh hóa L Ivanovii khác biệt với L monocytogenes và các loài

Listeria khác bởi nó có phản ứng: làm tan thạch máu của cừu hoặc ngựa trên một diện rộng, rõ ràng và có miền rộng gấp đôi, cho phản ứng Christie-Atkins-Munch-Petersen (CAMP) dương tính, và chúng có khả năng lên men đường D-xylose

nhưng không lên men được đường L-rhamnose [59] Ngoài ra, L ivanovii có thể phân biệt với L monocytogen bởi nó có phản ứng lecithinase cao ngay cả khi trong môi trường có hay không có than, nhưng với L monocytogen, trong các phản ứng lecithinase cần có than trong môi trường phản ứng [13] Tương tự như vậy, L innocua được phân biệt với L monocytogenes trên cơ sở chúng cho phản ứng

CAMP âm tính và không có khả năng gây ra hiện tượng tan máu hay cho thấy hoạt

động của PI-PLC trên môi trường chromogenic L welshimeri thì khác biệt với các

loài Listeria cho phản ứng âm tính β-haemolysis và phản ứng CAMP, và chúng có thể tạo ra acid từ D-xylose and α-methyl-D-mannoside [56]

¾ Nhuộm gram

L monocytogenes là trực khuẩn có khả năng cho phản ứng Gram dương tính

Nhuộm Gram sau 16-24h nuôi cấy thấy trực khuẩn ngắn bắt mầu thuốc nhuộm Gram, đường kính 0,4-0,5mm và dài 0,5-2 mm Lưu ý, khô10ng nên nhuộm Gram

sau 24 giờ vì hình thể của L monocytogenes có thể thay đổi (cầu trực khuẩn) [6]

¾ Thử khả năng tan huyết

Chọn khuẩn lạc điển hình trên môi trường thạch chọn lọc, cấy chấm điểm sang môi trường thạch máu, ủ ở 350C sau 24 giờ kiểm tra kết quả Kết quả cho thấy trên

môi trường thạch máu, khuẩn lạc L monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan

huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng β [6]

¾ Thử khả năng sử dụng cacbohydate

Nuôi cấy vi khuẩn với môi trường có bổ sung các nguồn cacbohydrate khác nhau như esculin, dextrose, maltose, manitol, rhamnose và xylose trong 7 ngày ở

350C Kết quả cho thấy L monocytogenes có khả năng thủy giải esculin, sinh axit từ

dextrose, maltose, lên men đường rhamnose nhưng không lên men đường manitol, xylose, không sinh khí

¾ Thử nghiệm catalase

Chuyển một khuẩn lạc lên một phiến kính sạch và nhỏ một giọt hydrogen peroxide (H2O2) 3% lên khuẩn lạc L monocytogenes cho kết quả dương tính với

phản ứng nếu quan sát thấy sự sủi bọt

¾ Thử nghiệm đỏ Metyl và Voget proxkaue (MR-VP)

Tiến hành cấy khuẩn lạc trong canh thang Clark-Lubs, ủ ấm 350C trong 48 giờ Lấy 1ml canh trường cho vào ống vô trùng và nhỏ thuốc thử 0,2 ml KOH 40% và 0,6 ml a Napton Để trong 1 giờ, nếu kết quả dương tính sẽ cho màu đỏ Tiếp tục ủ

ấm canh thang còn lại thêm 2 ngày, nhỏ Metyl 0,5% trong cồn 600, nếu dương tính cho kết quả màu đỏ

¾ Thử nghiệm CAMP

Thử nghiệm được tiến hành trên đĩa môi trường thạch máu Cấy vạch thành hai

đường cấy mỏng tương ứng với hai chủng thuần Staphylococus aureus và Ridococus equi tạo thành hai đường cấy song song cách nhau khoảng 4 cm Cấy

chủng nghi ngờ ở vùng giữa vuông góc và không chạm vào hai đường cấy song

song của S aureus và R Equi Cấy chủng đối chứng (+) L monocytogenes và L innocua ở phía trên và dưới các đường cấy song song của chủng nghi ngờ Phản

ứng (+) khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh giới giữa chủng thử

nghiệm với S aureus hoặc với R Equi Với S aureus phản ứng (+) sẽ tao vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn Trong khi với R Equi phản ứng (+) lại

cho vùng tan huyết rộng (5-10mm) có dạng hình đầu mũi tên [6]

L monocytogenes cho phản ứng CAMP (+) với S aureus và (-) với R Equi còn L innocua thì cho phản ứng (-) với cả hai loài

Tóm lại, việc xác định L momocytogenes bằng phương pháp sinh hóa rất mất

nhiều thời gian (cần đến 6 ngày để đưa ra được kết quả), bao gồm bước đầu là quá trình phân lập với việc chọn lọc và làm giàu trong môi trường, sao đó là kiểm tra phản ứng Gram và các thí nghiệm sinh hóa khác Trong quá trình phân lập, các tế

bào L momocytogenes có thể bị tổn thương do đó việc tiền làm giàu trong đệm

phosphate có chứa chất ức chế là thực sự cần thiết Cần có một quá trình tập hợp tất

cả các kết quả kiểm tra sinh hóa riêng lẻ khác nhau để đưa ra một kết luận cuối cùng

về L monocytogenes [11][59] Tuy vậy, thử nghiệm sinh hóa dựa trên đặc điểm

kiểu hình đặc trưng của vi khuẩn Listeria, do đó những biểu hiện này có thể bị ảnh hưởng bởi yếu tố bên ngoài như giai đoạn phát triển vi khuẩn và cơ chế trao đổi chất

I.2.1.3 Phương pháp huyết thanh học

Như trên đã trình bày, L monocytogenes có hai kiểu huyết thanh đặc trưng (H

và O) do đó có thể dựa trên khả năng ngưng kết với các kháng huyết thanh để phân

biệt L monocytogenes với các loài Listeria khác Bên cạnh đó, phương pháp huyết thanh học cũng là một công cụ đắc lực để xác định phân nhóm và các dòng của L monocytogenes Trong khi L monocytogenes có 12 kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e và 7 thì L Seeligeri có 7 kiểu huyết thanh là 1/2a, 1/2b, 3b, 4a, 4b, 4c và 6b, kiểu huyết thanh 5 có trong L ivanovii và một vài kiểu huyết thanh khác (1/2b, 6a và 6b) được tìm thấy trong L innocua, L welshimeri và

L Grayi

Tuy nhiên, do có chi phí cao nên các phương pháp huyết thanh học không

thường xuyên được thực hiện trong phòng thí nghiệm lâm sàng Với L monocytogenes và L seeligeri đều chứa kiểu huyết thanh 1/2a, 1/2b, 3b, 4a, 4b, 4c

nên gây khó khăn trong việc sử dụng phương pháp huyết thanh học để so sánh sự khác biệt giữa chúng Hơn nữa, có sự tương đồng về kháng nguyên giữa các kiểu

huyết thanh khác nhau của L monocytogenes, kháng nguyên H của kiểu huyết

thanh 1/2a và 3a đều là A và B; kháng nguyên H của 1/2b, 3b, 4a-e và 7 đều có kiểu

A, B, C; kháng nguyên H của 1/2c và 3c đều có loại B và D; và với một số lượng

lớn kháng nguyên O có mặt phổ biến ở các kiểu huyết thanh khác nhau, khó có thể

kết luận chính xác về kiểu huyết thanh của một số chủng L monocytogenes [40]

Tương tự như phương pháp hóa sinh, phương pháp huyết thanh học đôi khi cũng cho các kết quả chênh lệch nhau vì chúng phụ thuộc vào các đặc tính kiểu hình của vi khuẩn Vì những lý do này, phương pháp kháng huyết thanh phần lớn được thay thế bằng phương pháp phân tử do có tính đặc trưng hơn và nhạy hơn trong việc xác định, so sánh sự khác nhau giữa các loài Listeria và gần đây với sự phát triển đáng kể của phương pháp ELISA đã cải thiện hiệu quả đáng kể quá trình kiểm tra [48]

I.2.2 Các phương pháp không truyền thống

Phương pháp truyền thống để phát hiện L monocytogenes phải trải qua nhiều

công đoạn làm cho quá trình tốn nhiều thời gian và mất nhiều công sức Khác với các phương pháp truyền thống, các phương pháp không truyền thống có thể khắc phục được những vấn đề trên đem lại kết quả nhanh và chính xác Các phương pháp

không truyền thống dùng để phát hiện L monocytogenes chủ yếu là những phương

pháp dựa trên cơ sở phân tích nucleic acid như lai phân tử, PCR và dựa trên cơ sở phân tích miễn dịch ELISA

I.2.2.1 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Trong các phương pháp phân tích miễn dịch, phương pháp ELISA là một phương pháp được ứng dụng nhiều hơn cả trong nhiều phòng thí nghiệm Đây là một phương pháp khá nhạy và đơn giản dùng để phát hiện hoặc định lượng nhiều tác nhân gây bệnh như: các loại độc tố, nhiều loại vi khuẩn, virus, thuốc trừ sâu

Độ nhạy của phương pháp này có thể được phát hiện được khoản 106 CFU/ml (thậm chí 104 CFU/ml)

Nguyên tắc chung của kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể phủ lên những đĩa vi giếng (microplate) với mục đích giữ những kháng nguyên mục tiêu trong mẫu phân tích Nếu có mặt kháng nguyên mục tiêu trong mẫu, kháng nguyên này sẽ được giữ lại trên bề mặt giếng Các kháng nguyên này sẽ được phát hiện bằng cách

sử dụng kháng thể thứ hai đã gắn enzym Các enzym thường được dùng là peroxidase, phosphatase kiềm và một số loại khác Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của

enzym vào giếng, enzym sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu làm thay đổi màu của dung dịch Tốc độ thủy phân của enzym tỷ lệ thuận với lượng kháng thể đã gắn enzym cũng có nghĩa là tỷ lệ thuận với lượng kháng nguyên mục tiêu Sự thay đổi màu có thể nhìn thấy bằng mắt thường hoặc đo được bằng máy đo quang

Cho đến nay phương pháp ELISA đã được sử dụng khá phổ biến để phát hiện các mầm bệnh có trong thực phẩm Phương pháp này đã được thương mại hóa dưới dạng các bộ kit thử nhanh, thậm chí một số nhà nghiên cứu đã thành công trong việc cải tiến để tự động hóa nhằm đạt được sự đơn giản nhât cho người sử dụng phương pháp này Tuy nhiên do tỷ lệ dương tính giả còn cao, ELISA thường chỉ được làm phương pháp sàng lọc

I.2.2.2 Phương pháp lai phân tử DNA (DNA-Hybridization)

Phương pháp lai phân tử còn được gọi là phương pháp sử dụng mẫu dò là một phương pháp để phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm rất nhanh và hiệu quả Phương pháp này cho phép xác định một đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật nhờ sử dụng một mẫu dò đặc hiệu Một gen đầu dò là một đoạn acid nucleic đặc trưng có gắn với enzyme, phóng xạ hoặc biotin hóa, với chất phát huỳnh quang cho phép phát hiện các trình tự đích là RNA hoặc DNA Công nghệ sử dụng gen đầu dò để

phát hiện L monocytogenes cho kết quả chính xác và tương đối đơn giản

Người ta đã chia phương pháp lai phân tử ra thành ba dạng phụ thuộc vào vị trí

cố định của DNA mục tiêu Nếu DNA mục tiêu được cố định lên một màng bằng nitrocellulo hoặc nylon để có thể làm sạch các phân tử mẫu dò không được gắn vào được gọi là lai trên pha rắn Nếu DNA mục tiêu nằm trong môi trường lỏng được gọi là lai trên pha lỏng Khi DNA mục tiêu nằm ngay trong tế bào hay trong mô được gọi là lai tại chỗ

Trong quá trình lai phân tử, sự tách rời hai mạch đôi của chuỗi xoắn kép được xảy ra khi nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn Sau đó nhiệt độ được từ từ hạ xuống trở lại nhiệt độ bình thường, lúc này sự tái bắt cặp giữa các đoạn DNA có

trình tự nucleotid bổ sung sẽ xảy ra Các trình tự bổ sung có thể là DNA hoặc RNA, dẫn đến các phân tử lai có thể là DNA-DNA, RNA-RNA hoặc DNA-RNA

Hình 7 Phương pháp lai phân tử

Trong phương pháp sử dụng gen đầu dò để phát hiện L monocytogenes, DNA của L monocytogenes được đặt lên một chất mang (ví dụ như nitrocellulose hoặc màng nylon), với các đầu dò là các gen đặc trưng của L monocytogenes đã được

gắn kết với enzyme hoặc phóng xạ và sau đó có thể phát hiện ra chúng bằng một cơ chất phù hợp (đối với enzym) hoặc bằng phương pháp phóng xạ tự ghi [36][37]

Theo phương pháp này ta phân biệt được L monocytogenes ở cấp độ di truyền (dựa

trên kiểu gen), chúng cụ thể và chính xác hơn so với phương pháp hóa sinh và phương pháp huyết thanh học dựa trên kiểu hình

Tuy nhiên, kỹ thuật này không có sự khuếch đại acid nucleic nên chúng có hạn chế về độ nhạy; cần ít nhất là 104 bản sao của các gen mục tiêu trên mỗi microlitre