Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic sử dụng trong chế biến rau quả lên men

Chúng không những lên men đường có trong nguyên liệu thành axit lactic, làm giảm pH của sản phẩm, mà còn có khả năng sinh ra các hợp chất có tính kháng khuẩn, vì thế làm giảm nguy cơ nhi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CHẾ PHẨM VI KHUẨN LACTIC SỬ DỤNG TRONG CHẾ

BIẾN RAU QUẢ LÊN MEN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

PHẦN I TỔNG QUAN……… 3

1.1 Vi khuẩn Lactic và ứng dụng……… 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Lactic……….……… 3

1.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic……… 4

1.1.3 Đặc điểm của vi khuẩn lactic ……… 5

1.1.3.1.Hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic……… 5

1.1.3.2.Phân loại vi khuẩn lactic……… 6

1.1.3.3.Hoạt động chuyển hoá của vi khuẩn lactic……… 6

1.1.3.4.Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic ……… 10

1.2 Rau quả lên men và ứng dụng chế phẩm VKL trong rau quả muối chua 13

1.2.1 Tổng quan về rau quả lên men……… 13

1.2.2 Quy trình công nghệ sản xuất dưa cải bẹ muối chua truyền thống ở Việt Nam……… 14

1.2.3 Cơ chế của quá trình muối chua rau quả……… 15

1.2.4 Vi khuẩn lactic trong lên men rau quả……… 16

1.2.4.1.Các chủng vi khuẩn lactic khởi đầu cho quá trình lên men rau quả……… 16

1.2.4.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men lactic trong rau quả muối chua……… 17

1.3 Quá trình tạo chế phẩm Lactic……… 18

1.3.1 Quá trình tạo sinh khối ……… 18

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic……… 19

1.3.2.1.Nhu cầu dinh dưỡng……… 19

1.3.2.2.Điều kiện nuôi cấy……… 21

1.3.3 Các phương pháp sấy……… 22

1.3.3.1.Sấy đông khô.……… 22

1.3.3.2.Sấy chân không.……… 23

1.3.3.3.Sấy phun.……… 23

1.4.2 Chất độn cho chế phẩm……… 28

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 30

2.1 Vật liệu.……… 30

2.1.1 Chủng giống.……… 30

2.1.2 Nguyên liệu muối dưa……… 30

2.1.3 Hoá chất và môi trường.……… 30

2.1.3.1.Hoá chất.……… 30

2.1.3.2.Môi trường.……… 30

2.1.4 Thiết bị ……… 32

2.2 Phương pháp nghiên cứu.……… 33

2.2.1 Phương pháp vi sinh.……… 33

2.2.1.1.Hoạt hoá, làm sạch và giữ giống ……… 33

2.2.1.2.Phương pháp đếm khuẩn lạc 34 2.2.1.3.Quá trình nuôi cấy tạo sinh khối……… 35

2.2.2 Phương pháp xác định đặc tính của chủng Lactobacillus plantarum b33… 35

2.2.2.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc ……… 35

2.2.2.2.Quan sát hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram ……… 35

2.2.2.3.Kiểm tra khả năng sinh khí……… 36

2.2.3 Phương pháp hoá học.……… 36

2.2.3.1.Xác đinh hàm lượng đường khử bằng phương pháp Grassianov 36

2.2.3.2.Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp chuẩn độ……… 36

2.2.4 Phương pháp hoá lý……… 37

2.2.4.1.Xác định pH bằng máy đo pH 37

2.2.4.2.Xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn lactic bằng phương pháp đo OD (Optical Density) ……… 37

2.2.4.3.Xác định lượng sinh khối vi khuẩn lactic bằng ly tâm và cân……… 37

2.2.4.4.Phương pháp thu hồi chế phẩm……… 38

2.2.4.5.Xác định độ ẩm của chế phẩm……… 40

2.2.4.6.Xác định tỷ lệ tế bào sống sót……… 40

2.2.5 Kiểm tra khả năng kháng E coli và St aureus của chủng Lactobacillus plantarum b33 ……… 40

2.2.5.1.Phương pháp nuôi đồng thời trong môi trường MRS lỏng……… 40

2.2.5.2.Trong sản phẩm dưa cải bẹ muối chua……… 42

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 44

3.1 Kiểm tra các đặc tính của chủng Lactobacillus plantarum b33……… 44

3.1.1 Đặc diểm hình thái……… 44

3.1.2 Kiểm tra khả năng sinh khí……… 44

3.1.2 Khảo sát khả năng phát triển của chủng ở các nhiệt độ khác nhau………… 45

3.2 Nghiên cứu khả năng sinh trưởng của chủng Lactobacillus plantarum b33……… 46

3.2.1 Xác định khả năng sinh trưởng……… 46

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới khả năng tạo sinh khối ……… 47

3.2.3 Ảnh hưởng của chế độ đảo trộn, thông khí đến khả năng tạo sinh khối của chủng ở nhiệt độ 300C……… 47

3.3 Nghiên cứu chọn chế độ thích hợp cho quá trình sấy phun đối với chủng Lactobacillus plantarum b33……… 49

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào tới đặc tính của chế phẩm……… 49

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chất mang maltodextrin……… 50

3.4 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tỷ lệ tế bào sống trong quá trình tạo chế phẩm Lactobacillus plantarum b33 trên phương pháp sấy phun………… 52

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy……… 52

3.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ tế bào……… 53

3.5 Ứng dụng chế phẩm vi khuẩn Lactobacillus plantarum b33 trong muối chua dưa cải bẹ………. 54

3.5.1 Đánh giá chất lượng chủng Lb.plantarum b33 trong chế phẩm……… 54

3.5.2 Khả năng ức chế một số vi sinh vật gây độc hại của chủng b33……… 56

3.5.2.1.Nghiên cứu trên môi trường MRS lỏng……… 56

3.5.2.2.Nghiên cứu trong dưa cải bẹ muối chua……… 60

3.5.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm dưa cải bẹ……… 64

3.5.3.1.Đánh giá chất lượng cảm quan……… 64

3.5.3.2.So sánh hiệu quả sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic……… 64

3.5.4 Quy trình công nghệ ứng dụng chế phẩm VKL trong quá trình muối chua dưa cải bẹ……… 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 69

TÓM TẮT NỘI DUNG……… 73

Hiện nay có rất nhiều lại sản phẩm thực phẩm trên thế giới nói chung ứng dụng vi khuẩn lactic thành công cho đặc tính riêng (phomat, sữa chua, ) Còn ở Châu Á, đặc biệt Việt Nam đẵ sử dụng vi khuẩn lactic từ thời xa xưa trong rau quả muối chua (cà muối, dưa chuột muối, dưa cải bẹ muối, ) Dưa cải bẹ muối chua là món ăn mang tính truyền thống khá phổ biến, tạo thành do quá trình lên men tự nhiên của hệ vi khuẩn lactic sẵn có trong nguyên liệu Tuy nhiên, cho đến hiện nay, phương pháp muối chua rau cải bẹ vẫn chỉ được thực hiện 1 cách thủ công, nghĩa là quá trình lên men lactic là hoàn toàn tự nhiên Điều này dẫn đến chất lượng sản phẩm không ổn định, và sản phẩm có nguy cơ nhiễm một số vi sinh vật gây bệnh Người ta cũng đã tìm cách đẩy nhanh quá trình lên men trong phương pháp muối chua rau cải bẹ bằng việc bổ sung thêm nước dưa cũ Việc bổ sung này cũng giúp quá trình lên men xảy ra nhanh hơn nhờ hệ vi khuẩn lactic hỗn hợp có trong nước dưa, tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào khẳng định nước dưa cũ làm giảm nguy cơ nhiễm tạp và tăng tính ổn định cho sản phẩm dưa cải muối chua Mặt khác, trong sản phẩm dưa cải bẹ muối chua, hệ vi sinh vật có lợi chiếm ưu thế chính là vi khuẩn lactic Chúng không những lên men đường có trong nguyên liệu thành axit lactic, làm giảm pH của sản phẩm, mà còn có khả năng sinh ra các hợp chất có tính kháng khuẩn, vì thế làm giảm nguy cơ nhiễm các vi sinh vật lạ gây hỏng sản phẩm Tuy nhiên, để nâng cao chất lượng sản phẩm, rút ngắn thời gian lên men, và giảm nguy

cơ nhiễm tạp trong sản phẩm rau cải bẹ muối chua, chúng ta cần bổ sung thêm vào sản phẩm chủng vi khuẩn lactic thuần khiết (chế phẩm vi khuẩn lactic thuần khiết)

và có khả năng kháng khuẩn tốt Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

với tên: “Nghiên cứu và phát triển chế phẩm vi khuẩn lactic sử dụng trong chế biến rau quả lên men”

Thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến các nghiên cứu sau:

- Nghiên cứu điều kiện nhiệt độ nuôi cấy thích hợp để thu hồi nhiều sinh khối

chủng Lb.plantarum b33 khỏe giúp sau sấy được chế phẩm tỷ lệ sống sót cao

- Nghiên cứu chế độ sấy phun thích hợp cho chủng nhằm nâng cao tỷ lệ sống sót cho chế phẩm

- Nghiên cứu nồng độ chất mang maltodextrin và nồng độ vi khuẩn trong 1 g chất mang khô tuyệt đối (CFU/g CM) để nâng cao tỷ lệ thu hồi và tỷ lệ sống sót cũng như số tế bào vi khuẩn sống trong 1 g chế phẩm (CFU/g CF) cho chế phẩm

- Nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh trong chế biến dưa cải bẹ muối chua

- Kéo dài thời gian sử dụng thực phẩm

- An toàn về mặt vi sinh cho thực phẩm

- Tạo ra thực phẩm dễ tiêu hoá với đặc tính riêng

- Phân huỷ các hợp chất độc và không có lợi cho thực phẩm,

Với khả năng chuyển hoá đặc hiệu, vi khuẩn Laclic đã có mặt trong rất nhiều quá trình lên men sữa (có mặt ở sản phẩm sữa chua, bơ, phomat, ), lên men thịt (nem chua,…), lên men các loại ngũ cốc và rau quả (đặc biệt là rau qủa muối chua)

ở nhiều nước trên thế giới, đem lại lợi ích cho người tiêu dùng và người sản xuất Ngày nay, việc nghiên cứu các vi khuẩn có lợi nói chung và vi khuẩn Lactic nói riêng càng được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm ứng dụng vào một số sản phẩm thực phẩm

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Lactic

Năm 1857, Pasteur chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [12] Năm 1873, lần đầu

tiên J.Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên Bacterium lactis (hiện nay gọi là Streptococcus lactic), Năm 1998, Axelsson đã xem xét lại vi khuẩn lactic

Ông cho rằng: Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, hô hấp yếm khí, dạng không bào tử, hình cầu hoặc que, chúng tạo ra axit lactic khi lên men hợp chất cacbonhydrat Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong các quá trình lên men yếm khí thực phẩm, đang dùng lên men bột mì nhão ẩm, bia cỏ, các loại

sữa lên men, tinh bột sắn (để chế biến gari và fufu) và nhiều rau quả lên men (muối

chua, )

Những đặc tính sinh hoá, sinh lý, sinh thái, cách phân loại, ứng dụng của vi

khuẩn lactic đã được nghiên cứu kỹ và viết trên cuốn sách tên: Lactic Acid

Bacteria-Microbiological and Functional Aspects [11]

Cho tới nay, đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng về vi khuẩn lactic Nhờ

khoa học kỹ thuật hiện đại, con người đã miêu tả một cách đầy đủ hơn về hình

dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic Trong đó, công nghệ

di truyền trở thành một công cụ phân loại xác định hàm lượng phần trăm mol C+G

chứa trong DNA hay sử dụng phương pháp điện di để xác định các gen

1.1.2 Ứng dụng của vi khuẩn lactic

Việc sử dụng vi khuẩn lactic trong các sản phẩm thực phẩm lên men ngày càng

trở nên rộng rãi Các dạng sản phẩm lên men quen thuộc có nguồn gốc từ nguyên

liệu ban đầu là sữa, thịt, tinh bột, dưa chuột, bắp cải và cải bẹ,

Bảng 1.1 Một số sản phẩm lên men [12]

chính

Vi sinh vật Vùng địa lý

Bia Lúa mạch Nấm men, VKL Toàn thế giới

Rượu cọ Nhựa cây cọ Nấm men Toàn thế giới

Bánh mì Bột mì Nấm men Toàn thế giới

Gari Bột sắn VKL Nigeria

Kimchi Các loại rau VKL Toàn thế giới

Nước tương, miso Đậu tương Nấm men, VKL Đông nam châu á Tempeh Đậu tương Nấm mốc, VKL Indonesia

Các sản phẩm trên hầu như sử dụng hệ vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu, cho nên, ngoài những ưu điểm nổi trội vẫn có một số các hạn chế như quá trình lên men kéo dài và gây ra sự nhiễm tạp trong quá trình lên men Vì thế nhờ sự tiến bộ của các ngành khoa học kỹ thuật đã nghiên cứu và sản xuất ra các loại chế phẩm bổ sung vào trong các quá trình lên men nhằm rút ngắn thời gian lên men, hạn chế các

sự nhiễm của loài vi sinh vật có hại

Ngày nay, axit lactic là sản phẩm số một được sản xuất nhờ ứng dụng vi khuẩn lactic; axit lactic là nguyên liệu cần thiết cho ngành công nghệ thực phẩm, công nghệ tổng hợp chất dẻo, công nghệ sản xuất thức ăn gia súc, công nghệ thuộc da, dệt [14]

Ngoài ra, vi khuẩn lactic còn tổng hợp ra chất có tác dụng bảo quản thực phẩm (bacteriocins), các loại kháng sinh dùng trong y học [11]

1.1.3 Đặc điểm của vi khuẩn lactic [11]

1.1.3.1.Hình thái, sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic

Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae Chúng không

đồng nhất về mặt hình thái, các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào Tuy nhiên về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất Chúng đều là các vi khuẩn Gram(+), không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết ra axit lactic Chúng không chứa các riboxom và enzym catalaza nên không phân giải trực tiếp peroxit thành nước và oxy

Một đặc điểm quan trọng:là từng loại vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh dưỡng rất phức tạp và khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ Mặc dù đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn, lactic vẫn

đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như phôtphat, lưu huỳnh, vitamin, muối vô cơ, axit amin, lipit, những chất này phải có trong môi trường lên men

1.1.3.2.Phân loại vi khuẩn lactic

Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic Dựa vào những tính chất cơ bản của chúng mà người ta có thể phân loại theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm… Năm 1919, Orla – Jensen là người tiên phong trong việc nghiên cứu, phân loại có hệ thống các vi khuẩn lactic Về hình dáng, Ông phân chúng thành bốn giống:

Lactobacillus; Leuconostocs; Pediococcus; Streptococcus và Lactococcus Ngày nay người ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi

- Lactobacillus: Trực khuẩn, có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ Nhiệt độ

tối ưu là 300C - 450C Lên men được galactoza, glucoza, sacaroza, fructoza

-Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng Lên men đường

dextran, trioza, sản phẩm tạo thành là axit D- lactic, etanol, CO2

-Pediococcus: Cầu khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn Lên

men đường glucoza theo con đường EMP, axit lactic tạo thành có dạng DL, D(-) hay D(+)

-Streptococcus và Lactococus: Dạng cầu khuẩn, xếp đôi hoặc chuỗi Có khả

năng lên men đường hexoza thành axit lactic và các loại đường khác

-Bifidobacterium: Lên men dị hình, có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình

ovan, có lúc lại hình que Có khả năng lên men lactoza sản phẩm tạo thành là axit

lactic và axit axetic Ví dụ như các chủng B.bifidum, B.longgum, B infantis

Ngoài ra, theo nhiệt độ, người ta cũng có thể phân ra 3 loại: ưa lạnh, ấm, ưa nhiệt

1.1.3.3.Hoạt động chuyển hoá của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều nguồn đường, thường có khả năng phân giải protein và lipit yếu, đòi hỏi nguồn axit amin sẵn có để sinh trưởng

a Chuyển hoá đường

* Một số đường như: mantose, galactose, và fructose, được lên men bởi nhiều loài vi khuẩn Các loại đường này sau khi đồng phân hoá hoặc phosphoril hoá, chúng đi theo con đường chuyển hoá chính ở hai dạng glucose-6-phosphate hoặc fructose-6-phosphate

* Đường hexoza (glucoza)

Tất cả các vi khuẩn lactic đều sản sinh ra axit lactic từ hexoza và chúng thiếu chức năng để liên kết với electron vận chuyển của mạch và chu trình Krebs, nên chúng thu năng lượng thông qua cơ chất ở dạng photphoryl hóa Axit lactic được sinh ra có thể ở dạng L (+), ít khi ở dạng D(-), hoặc có thể ở dạng hỗn hợp

Con đường hexoza chuyển hóa đã phân chia vi khuẩn lactic thành 2 nhóm: lên men đồng hình và lên men dị hình Ta thấy các dạng lên men đồng hình như

Pediococus, Streptococus và một số Lactobacillus, sinh axit lactic là thành phẩm

chính và duy nhất của việc lên men glucoza Tuy nhiên đưới điều kiện sinh trưởng thay đổi và khi cơ chất ban đầu là pentoza thì có thể thay đổi Các chủng lên men đồng hình sử dụng con đường Embden-Meyergof-Parnas để sinh ra 2 mol lactate trên 1 mol glucoza và nhận được xấp xỉ gấp 2 lần năng lượng trên một mol glucoza

so với các chủng lên men dị hình Các chủng lên men dị hình như Leuconostocs, nhóm III lactobacilli, oenococci và weissellas thông qua đồ hình 6- phosphogluconate/phosphoketolase (6-PG/PK) sinh ra một lượng cân bằng giữa

lactate, CO2, và etanol từ 1 mol glucoza theo con đường monophotphat hoặc pentoza [11] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Sơ đồ quá trình lên men glucoza của vi khuẩn lactic:

(Hình 1.1A) lên men lactic đồng hình (thuỷ phân gluco, đồ hình Meyerhof-Parnas);

Embden-(Hình 1.1B) lên men lactic dị hình (đồ hình

6-phosphogluconate/phosphoketolase) Các enzym đã dùng được đánh số như sau: 1

Glucokinase; 2 fructose-1,6-diphosphate aldolase; 3 glyceradehyde-3-phosphate dehydrogenase; 4 pyruvate kinase; 5 lactate dehydrogenase; 6 glucose-6-phosphate dehydrogenase; 7 6-phosphogluconate dehydrogenase; 8 phosphoketolase; 9 acetaldehyde dehydrogenase; 10 alcohol dehydrogenase

* Sự chuyển hoá disacarit lactoza là một bước quan trọng đầu tiên đối với các

vi khuẩn lactic sử dụng trong sản xuất sữa lên men Lactoza có thể đi vào bên trong

tế bào nhờ chất mang lactoza, và các lacto-pecmeaza phân cắt lactoza thành glucoza

và galactoza, hoặc theo con đường photphoenolpyruvat photphotransferaza (PTS), lactoza phân cắt thành glucoza và galactoza-6-photphat

* Sự lên men đường saccarose bắt đầu bởi quá trình thuỷ phân saccarose thành đường đơn glucose và fructose Những đường đơn này đi theo con đường

chuyển hoá chính Đối với lactococci, đường saccarose bị chuyển hoá theo con

đường PTS và saccarose-6-phosphate phân tách thành glucose – 6 – phosphate và fructose [21] Đường saccarose cũng có thể đóng vai trò như đường monosaccharide ở dạng exopolysaccharide [22]

b Chuyển hoá xitrat [16 – 20]

Xitrat vận chuyển được vào tế bào vi khuẩn là nhờ chất dễ thấm thành tế bào xitrat và khi bị phân chia bởi enzym xitrat lyase để tạo ra oxaloacetat và acetat Dưới sự xúc tác của enzym oxaloacetat decacbonoxylase, oxaloacetat bị decacboxyl thành pyruvat và CO2 Trong công nghiệp chế biến sữa, một số loài như: Lc.lactic subsp lactis, Ln cremoris hoặc Ln.citrovorum được sử dụng với mục đích tạo ra

diacetyl Nhìn chung, sự hình thành diacetyl hoặc acetoin khi nồng độ đường thấp

và pH thấp

Pyruvat dưới tác dụng của enzym 2 sẽ chuyển thành α – axetolactat, α – axetolactat bị oxi hoá thành diaxetyl (là chất có tác dụng tạo hương và giúp bảo quản thực phẩm) Ngoài ra, pyruvat còn tạo được một số axit hữu cơ khác như axit lactic, acetic, propionic (là những axit có tác dụng kháng khuẩn) [11]

Qua nhiều tranh cãi, các nhà nghiên cứu đã đưa ra đồ hình sau:

Hình 1.2 Các đường hướng chuyển hoá từ pyruvate [11]

Mũi tên biểu thị phản ứng không enzym Các chuyển hoá quan trọng và sản phẩm cuối được để trong khung Các phản ứng dưới xúc tác bởi enzym được đánh số: 1 diacetyl synthase; 2 acetolactate synthase; 3 pyruvate-formate lyase; 4 pyruvate dehydrogenase; 5 pyruvate oxidase; 6 acetate kinase

c Chuyển hoá protein

Vi khuẩn lactic có nhu cầu rất lớn về các loại axit amin để phát triển, chúng không thể tổng hợp các nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ mà phải lấy trực tiếp từ môi trường Hoạt động thuỷ phân protein được nhắc đến khi trong môi trường không đủ axit amin cung cấp cho sự sinh trưởng và phát triển [11]

1.1.3.4.Khả năng kháng khuẩn của vi khuẩn lactic [11]

Cơ chế kháng vi sinh vật của vi khuẩn lactic: Quá trình lên men nhờ vi khuẩn

lactic làm giảm một lượng cacbonhydrat sẵn trong nguyên liệu, và kết quả là sinh ra một dãy các phân tử hữu cơ có khối lượng phân tử nhỏ, có hoạt tính kháng khuẩn, trong đó phổ biến nhất là axit lactic, axit axetic và axit propionic Ngoài những sản phẩm trao đổi chất có tính kìm hãm vi sinh vật này, còn nhiều những cấu tử kháng

vi sinh vật được tạo ra từ những vi khuẩn lactic khác nhau Thông thường các chất

có tính kháng khuẩn tạo ra từ vi khuẩn lactic bao gồm: axit hữu cơ, H2O2, CO2, diaxetyl, các chất kháng vi sinh vật có khối lượng phân tử thấp và bacteriocin

a) Axit hữu cơ

Theo các nghiên cứu thu được, axit yếu có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn axit trung bình ở cùng pH thấp Hai axit sinh ra trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic, axit acetic có hoạt tính kháng khuẩn mạnh hơn và phổ kháng khuẩn rộng hơn, bao gồm cả nấm men, nấm mốc và vi khuẩn; trong khi axit propionic cũng có hoạt tính kháng vi sinh vật mạnh, nhưng chỉ là nấm men, nấm mốc Đó là

do chúng có pKa cao hơn axit lactic (4.87, 4.75 và 3.08) Ví dụ, ở pH= 4 chỉ 11% axit lactic không phân ly, trong khi đó axit axetic là 85%, và axit propionic là 92% Khi có 1 hỗn hợp các axit này, axit lactic góp phần chủ yếu làm giảm pH, trong khi axit axetic và axit propionic chủ yếu không bị phân ly, mới đóng vai trò chính là tác nhân kháng vi sinh vật Thật vậy, hỗn hợp axit lactic và axit axetic làm giảm tỉ lệ

sinh trưởng của Samonella enterica typhimurrium hơn là từng loại axit đứng riêng

rẽ, và đó là hoạt tính hợp lực Tuy nhiên, ngoài việc làm giảm pH, axit lactic còn có chức năng như 1 màng thấm, do đó giúp tăng cường hoạt tính của các chất kháng vi sinh vật khác Người ta cho rằng, những phân tử không hòa tan của 1 axit yếu có tính độc, mặc dù những phân tử hòa tan có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật Người ta giả thiết rằng dạng không hòa tan của axit hữu cơ sẽ khuyếch tán qua màng tế bào bởi vì chúng là những dịch lỏng [27]

b) H 2 O 2

Với sự có mặt của O2, vi khuẩn lactic có thể sinh ra H2O2 thông qua hoạt động của các enzym flavoprotein oxidaza và NADH oxidaza Vi khuẩn lactic không có khả năng sinh enzym catalaza để loại bỏ H2O2 Vì thế, H2O2 ngày càng được tích lũy Tuy nhiên, Fortain và các cộng sự [27] lại kết luận rằng H2O2 không được tích lũy đủ trong tế bào, bởi vì nó bị phá hủy bới các enzym peroxidaza, flavoprotein và pseudocatalaza Người ta dự đoán rằng H2O2 sinh ra có vai trò đặc biệt quan trọng cho sự xâm nhập vào đường tiết niệu của vi khuẩn lactic Trong điều kiện tự nhiên, hiệu ứng kháng vi sinh vật của H2O2 có thể được tăng cường bởi sự có mặt của enzym lactoperoxidaza và thiocyanat SCN- Enzym glycoprotein lactocperoxidaza được tìm thấy trong nước bọt, trà, sữa…: SCN- + H2O2 Î OSCN- + H2O

Sự thay đổi và phá hủy cấu trúc của màng tế bào vi sinh vật là do sự giải phóng ra OSCN-

c) CO 2

Vi khuẩn lactic lên men dị hình từ đường hexoza tạo ra CO2 là sản phẩm chính Và nhiều phương thức trao đổi chất khác giải phóng ra CO2 trong quá trình lên men CO2 có tính kháng vi sinh vật lưỡng tính Cách thức là tạo ra 1 môi trường yếm khí, và tự bản thân CO2 cũng có tính kháng vi sinh vật Cơ chế của hoạt tính kháng khuẩn này chưa tìm ra, nhưng được dự đoán là do sự tích lũy CO2 gây ra sự hoạt động bất thường tính thấm của màng tế bào Bởi tính kháng vi sinh vật này,

CO2 được sử dụng như 1 cấu tử chính trong công nghệ đóng gói với môi trường khí thay đổi

Theo nghiên cứu, vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với CO2 trong môi trường khí thay đổi hơn vi khuẩn Gram dương [9]

d) Diacetyl

Diacetyl được tìm ra bởi Niel và các đồng nghiệp [11] như 1 cấu tử tạo hương

và mùi trong bơ Năm 1927 Lemoige đã tìm ra hoạt tính kháng vi sinh vật Bacillus

sp của nó Diacetyl được sinh ra bởi các loài và chủng thuộc giống Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus cũng như các loài vi sinh vật khác Khi

đường hexoza được chuyển hóa, sự tạo thành diacetyl bị ngăn chặn Tuy nhiên, diacetyl sẽ được sinh ra với 1 lượng rất lớn nếu citrate được chuyển hóa Citrate được chuyển hóa thành pyruvat, rồi thành diacetyl Jay tìm ra rằng lượng diacetyl được tăng lên dần dần khi pH <7 Hoạt tính kháng khuẩn của diacetyl bị phản tác dụng khi có mặt glucoza, acetate và tween 80 Diacetyl thể hiện tính kháng với vi khuẩn gram âm, nấm men, và nấm mốc tốt hơn là với vi khuẩn gram dương; và vi khuẩn lactic là kém nhạy cảm nhất với hoạt tính kháng khuẩn của diacetyl

e) Các chất kháng vi sinh vật có trọng lượng phân tử thấp

Gồm: reuterin, reutericyclin, 2-pyrrolidone-5-carboxylic Acid,…

Vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra các hợp chất kháng vi sinh vật với trọng lượng phân tử thấp Đặc điểm của các hợp chất này: khối lượng phân tử thấp, có các đặc tính hoạt động ở pH thấp, bền nhiệt, phổ kháng rộng, tan trong aceton

k) Bacteriocin [11]

Bacteriocin là một peptid, sinh ra bởi một số vi khuẩn để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác Bacteriocin có thể được coi như những chất kháng sinh, tuy nhiên chúng lại khác với chất kháng sinh ở một vài điểm mấu chốt: Bacteriocin là một riboxom tổng hợp; các tế bào chủ miễn dịch với bacteriocin; cách thức hoạt động của bacteriocin khác với các chất kháng sinh; bacteriocin có phổ kháng khuẩn hẹp, do đó chỉ có thể kháng những chủng có liên quan mật thiết với chủng sinh ra bacteriocin đó

1.2 Rau quả lên men và ứng dụng chế phẩm VKL trong rau quả muối chua

1.2.1 Tổng quan về rau quả lên men

Các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở qui mô gia đình trong điều kiện thủ công Hiện nay một số nước đã đưa việc sản xuất các sản phẩm trên qui mô công nghiệp, đi đầu là Nhật Bản, Hàn Quốc, Philipine và Thái Lan Còn

ở châu Âu, công nghệ lên men lactic được ứng dụng trên nguyên liệu rau quả như

xơ mít,…[7], [1], [3]

1.2.2 Quy trình công nghệ sản xuất dưa cải bẹ muối chua truyền thống ở Việt Nam

* Thuyết minh quy trình :

-Chọn nguyên liệu: Cây dưa cải bẹ với khối lượng trung bình 2 – 3 kg/cây, loại mới chớm ra hoa (vì thời điểm này dưa chứa hàm lượng đường cao)

-Cắt-rửa: Loai bỏ cuống già ở sát gốc và những lá sâu, vàng,… tạp chất , một phần vi sinh vật có trên lá dưa Chú ý tránh dập, nát lá dưa khi rửa

-Muối dưa: Thường thực hiện trong các vải sành, sứ Tỷ lệ muối ăn trắng sạch

6 – 9 % so với khối lượng dưa pha với nước Tỷ lệ nước sự dụng là 20% khối lượng dưa Trước khi muối có thể cho thêm 5% hành tươi để tạo vi cho sản phẩm, có tác dụng ức chế các vi sinh vật có hạơ và bổ xung thêm đường cho dưa

-Lên men: Ở chế độ nhiệt độ thích hợp 20-250C, trong thời gian 15-16 ngày nhằm đạt sản phẩm có hàm lượng axit lactic đạt 2,5 - 3,6 g/l Để qúa trình lên men

ổn định có thể pha thêm nước dưa cũ với nước dưa mới muối

Sản phẩm dưa cải bẹ muối chua được đánh giá là đạt chất lượng khi ăn thấy thơm của hành và cải, vị chua tự nhiên của axit lactic hơi the của cải, màu vàng sáng đặc trưng Trạng thái miếng dưa không được nhũn, khi ăn giòn

Thực tế cho thấy: phần lớn quy trình sản xuất dưa cải bẹ muối chua mang tính thủ công, dựa vào kinh nghiệm sản xuất là chính nên chất lượng sản phẩm không ổn định Hơn nữa, thời gian bảo quản và sử dụng ngắn nên hiện nay chưa có một tiêu chuẩn nhất định để quản lý chất lượng sản phẩm Do đó, cần phải cải tiến các quy trình sản xuất đồng thời bổ sung các hóa chất (gia vị), các chế phẩm vi khuẩn lactic

có khả năng sinh axit tốt và khả năng kháng khuẩn cao vào quá trình lên men ổn định và nâng cao chất lượng sản phẩm dưa cải bẹ muối chua, lại có thể rút ngắn thời gian lên

1.2.3 Cơ chế của quá trình muối chua rau quả

Rau quả muối chua thuộc nhóm sản phẩm lên men lactic Trong quá trình lên men này, chất đường (có sẵn trong nguyên liệu hoặc do đưa vào) được chuyển hoá thành acid lactic nhờ hệ vi sinh vật lactic Acid lactic và các sản phẩm khác tạo thành trong quá trình lên men làm cho sản phẩm có hương vị đặc trưng Bên cạnh

đó, acid lactic còn có tác dụng làm giảm pH sản phẩm, ức chế hoạt động của nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng [11]

Quá trình muối chua rau quả gồm có 3 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: muối ăn tạo áp suất thẩm thấu lớn nên đường và các chất dinh dưỡng khác có trong nguyên liệu khuyếch tán vào nước, tạo môi trường thuận lợi cho các vi sinh vật lactic và một số vi sinh vật khác hoạt động Trên bề mặt nước

muối xuất hiện những bọt khí, đó là do hoạt động của vi khuẩn E.coli và một số vi

sinh vật có khả năng sinh khí khác Chủng vi sinh vật lactic phát triển chủ yếu trong

thời kỳ này là Leuconostoc mesentercroides Đó là loại cầu khuẩn có khả năng sinh

khí và acid lactic pH môi trường nhanh chóng giảm xuống, các vi sinh vật có hại sẽ

bị ức chế Khi CO2 sinh ra làm tăng điều kiện yếm khí, góp phần ức chế vi sinh vật

“lạ”, đồng thời ngăn cản được sự oxi hoá vitamin C và giữ được màu sắc tự nhiên của rau cải Ngoài ra, sự phát triển của chủng này sẽ làm môi trường biến đổi, tạo điều kiện thuận lợi cho các chủng vi sinh vật lên men ở giai đoạn sau phát triển Khi nồng độ acid (chủ yếu là acid lactic) đạt 0,25 – 0,3%, nó sẽ phát triển chậm dần và chết đi, trong khi đó các enzyme mà nó tiết ra vẫn tiếp tục chuyển hoá đường thành acid lactic

- Giai đoạn 2: các vi khuẩn lactic phát triển mạnh mẽ và acid lactic tích tụ được nhiều pH của môi trường giảm tới 3 – 3,5 và ức chế hoạt động của các vi khuẩn gây thối Chủng vi sinh vật lactic phát triển chủ yếu trong thời kỳ này là

Lactobacillus cucumeris, Lactobacillus plantarum, B.brassicae fermentati và một

số chủng khác Đây là thời kỳ quan trọng của quá trình lên men Trong giai đoạn này, sản phẩm sẽ tích tụ được lượng acid lactic cao và có hương vị đặc trưng Khi nồng độ acid đạt 1,5 – 2%, cùng với nồng độ muối cao và nhiệt độ thấp, các chủng này sẽ bị giảm hoạt tính

- Giai đoạn 3: một số chủng vi sinh vật lactic khác (như: L.pentoacetius, ) sẽ

tiếp tục quá trình lên men và đưa nồng độ acid lên 2 – 2,5 % Lượng acid lactic tích luỹ cao quay lại ức chế hoạt động của chính các vi sinh vật này Lúc này, một số nấm men và nấm mốc có khả năng phân huỷ acid lactic sẽ phát triển, làm giảm chất lượng sản phẩm Do vậy, trong thời kỳ này, để ngăn ngừa hiện tượng trên, ta có thể bảo quản sản phẩm ở nhiệt độ thấp (2 - 40C) hoặc bảo quản ở điều kiện yếm khí hay bảo quản bằng acid sorbic, natri benzoat,… [1], [3], [7]

1.2.4 Vi khuẩn lactic trong lên men rau quả [44]

1.2.4.1.Các chủng vi khuẩn lactic khởi đầu cho quá trình lên men rau quả

Các loại rau quả lên men có thể sử dụng rộng rãi bao gồm sauerkraut, dưa chuột và oliu muối chua Thông thường bắp cải, cải bẹ, dưa chuột, và oliu được lên

men bởi Lb plantarum P cerevisiae, P pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides,

or Lb brevis

cũng có thể được dùng Dịch muối NaCl được thêm vào, trong suốt quá trình chuẩn

bị sản phẩm này Hỗn hợp NaCl và axit lactic làm cho rau quả lên men ổn định trong suốt thời gian dài ở nhiệt độ phòng Nồng độ muối cũng hạn chế độ tăng trưởng của vi khuẩn lactic, do đó ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm

1.2.4.2.Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men lactic trong rau quả muối chua Bao gồm: nồng độ muối ăn, hàm lượng đường trong sản phẩm (đường có sẵn trong nguyên liệu và đường bổ sung thêm vào), độ pH của sản phẩm, hệ vi sinh vật trong sản phẩm và nhiệt độ môi trường [11]

Dung dịch muối ăn với nồng độ tương đối cao sẽ ức chế sự phát triển của các

vi sinh vật lạ và cả vi khuẩn lactic Khi tiến hành muối chua rau quả cần tạo điều kiện cho các vi khuẩn lactic phát triển và ức chế các vi sinh vật lạ Do vậy cần sử dụng nồng độ muối không quá cao: thường sử dụng muối ăn với nồng độ 4 - 6% Đường trong quá trình muối chua rau quả là nguồn tạo axit lactic Trong trường hợp đường ở nguyên liệu không đủ thì hàm lượng axit lactic tích tụ trong sản phẩm cũng không đạt mức yêu cầu, khi đó sản phẩm có hương vị kém và dễ bị hư hỏng khi bảo quản Vì vậy: muối chua cần chọn loại nguyên liệu có hàm lượng đường đạt mức yêu cầu và khi cần thì phải bổ sung thêm đường Độ axit trong sản phẩm cũng ảnh hưởng lớn tới quá trình muối chua vì các vi sinh vật rất nhạy cảm đối với pH môi trường (pH tối ưu của vi khuẩn lactic là 5,5- 6,5) Trong quá trình lên men của rau quả muối chua axit lactic tích tụ với hàm lượng 0,5% cũng đã ức chế hoạt động của nhiều vi sinh vật lạ gây ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men Khi tích tụ axit lactic với hàm lượng cao (1 - 2%) thì ngay cả các vi khuẩn lactic cũng bị ức chế và do đó quá trình lên men lactic bị kìm hãm Nồng độ axit lactic giới hạn đạt được trong quá trình lên men lactic phụ thuộc vào lượng đường có sẵn trong nguyên liệu, nồng độ muối, nhiệt độ lên men và loại vi khuẩn lactic Tuy nhiên axit lactic không ức chế hoạt động của một số nấm men, nấm mốc Nhiệt độ lên men ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và tới chất lượng sản phẩm Ở nhiệt độ 0 - 40C thì sự lên men lactic không bị đình chỉ mà chỉ diễn ra chậm Nhiệt độ tối ưu cho nhiều loại vi khuẩn lactic là 35 - 420C, nhưng nhiệt độ này cũng kích thích sự phát triển của

nhiều vi sinh vật lạ Sự lên men lactic cần tiến hành trong điều kiện yếm khí Phần lớn các vi khuẩn lactic hoạt động trong điều kiện yếm khí tùy tiện, tức là phát triển không nhất thiết phải có mặt của oxy không khí [7],[1],[3]

1.3 Quá trình tạo chế phẩm Lactic

1.3.1 Quá trình tạo sinh khối

Trong quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn, người ta chia quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn thành 4 pha chính:

-Pha tiềm phát: được tính từ khi bắt đầu cấy đến khi tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn tăng mạnh Thời gian này vi khuẩn làm quen và thích nghi với môi trường mới

-Pha phát triển logarit: là pha tăng trưởng mạnh nhất Tế bào sinh sản với tốc

độ lớn nhất, sự tạo thành sinh khối được mô tả theo hàm số mũ; lượng cơ chất giảm

rõ rệt và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra Tế bào ở pha này trẻ về sinh lý, có hoạt tính sinh học cao Kích thước tế bào cũng lớn lên Số lượng tế bào tăng theo phương trình: N= No.2n . Trong đó:

-No : Số tế bào ban đầu

-N : Tổng số tế bào

-n : Số lần tế bào phân chia

Tốc độ sinh sản đạt mức cưc đại và không thay đổi trong suốt thời gian của giai đoạn phát triển logarit Việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần

-Pha cân bằng: quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi Kết quả số tế bào và cả sinh khối không tăng cũng không giảm Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất Cho nên, khi giảm nồng độ cơ chất thì tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm

Nguyên nhân tồn tại của pha này là do sự tích luỹ các sản phẩm của quá trình trao đổi chất (các loại rượu, axit hữu cơ, ) và việc cạn dần các chất dinh dưỡng Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng Sản

Thông qua đánh giá các pha sinh trưởng của vi khuẩn, người ta có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Nhìn vào đường cong sinh trưởng, ta có thể thấy rõ thời gian vi khuẩn phát triển ở từng pha và khi nào vi khuẩn phát triển mạnh nhất để thu được lượng sinh khối lớn nhất

Thời gian sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn ở mỗi pha phụ thuộc vào từng loại vi khuẩn, đặc điểm, tính chất, thành phần của môi trường và các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, điều kiện thông khí,

Nếu thu hồi sinh khối ở pha cân bằng, lúc này xuất hiện khá nhiều tế bào già

và chết; vì vậy khả năng chịu đựng của vi khuẩn đối với các phương pháp xử lý sẽ kém (phương pháp sấy,…) Do vậy: Để có được chế phẩm hoạt lực cao, ta cần chọn thời điểm thu hồi sinh khối ra khỏi canh trường nuôi cấy vì nó ảnh hưởng đến số lượng tế bào sống sót trong quá trình sấy và bảo quản sau này Theo một số nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã chứng minh: nếu sinh khối được lấy ra tại thời điểm vi khuẩn phát triển đạt đến đầu pha cân bằng là tốt nhất

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic

1.3.2.1.Nhu cầu dinh dưỡng [11]

a Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza (glucoza, fructoza, manoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysacarit (tinh bột, dextrin) Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho

vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit

malic, pyruvic, fumaric, axetic… Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon,

vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng Khi đó xảy ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2 Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau

b Nhu cầu dinh dưỡng nitơ

Một số lớn các vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu

cơ phức tạp có chứa nitơ Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển, chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ Đôi khi trong một số

trường hợp sự phát triển của một vài loài vi khuẩn lactic, như Lactobacillus helyeticus, có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường

Do vậy, để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân protein từ thịt, lactabumin, casein, peptone, peptit, nấm men thuỷ phân…

c Nhu cầu vitamin

Các vitamin đóng vai trò là coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào Rất ít vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp được vitamin

d Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic

Một số chất hữu cơ ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của axit lactic Các bazơ nitơ: Adenin, Hypoxantin, Guanin, Uraxin, Thimin, Thimidin Axit hữu cơ : axit axetic và nhiều axit hữu cơ không bay hơi khác Axit amin: L-asparagin, L-glutamin.,

Một loại axit hữu cơ quan trọng ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các loài vi khuẩn lactic là axit oleic (có thể thay thế bằng axit linoleic và axit linolenic) Đó chính là nguyên nhân tại sao người ta lại sử dụng Tween 800 - một dẫn xuất của axit oleic (Polyoxyethlene sorbiton monooleate), trong thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy vi khuẩn lactic

e Nhu cầu các muối vô cơ

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều

các hợp chất vô cơ như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan, magie… đặc biệt là mangan Một vài enzym có sự tham gia của các iôn kim loại này trong cấu trúc trung tâm hoạt động, chẳng hạn như trường hợp của photphofructokinaza 1.3.2.2.Điều kiện nuôi cấy

a Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt

độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn

Mỗi loại vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ thích hợp để phát triển Chẳng hạn

: Lactobacillus (Ưa ấm) : 30 - 35oC là nhiệt độ tối ưu và 15 - 45oC là nhiệt độ giới hạn

Lactobacillus (Chịu nhiệt): 40 - 45oC là nhiệt độ tối ưu và 30 - 52oC là nhiệt độ giới hạn ,…

b.Tỷ lệ tiếp giống

Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của vi khuẩn Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp Nếu tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng

c Độ thông khí

Oxy là một trong các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Vi sinh vật sử dụng O2 trong môi trường lỏng Tính chất này có liên quan đến sự phân bố hệ enzym hô hấp trong tế bào chất (nước chiếm trên 80%) Đặc biệt vi khuẩn lactic là vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện Nhưng trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn lactic vẫn cần hô hấp để sinh trưởng và

phát triển Vì thế trong nuôi cấy, ta cần kiểm tra khả năng sử dụng oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp, sao cho tốc độ hòa tan nó bằng tốc độ tiêu thụ của vi sinh vật

d pH

Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của ion H+ và OH- trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Chính vì vậy, trong quá trình lên men lactic khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH<3.8) Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4.0 Các vi khuẩn lactic khác nhau sẽ thích hợp với khoảng pH

khác nhau Ví dụ: Pediocccus : pHmin = 3,5-4,4 ; Lactobacillus : pHmin =3,2 -3,5,

e.Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu

Màng tế bào của vi khuẩn Gram dương là màng bán thấm nên nồng độ muối

có ảnh hường rất lớn đến khả năng phát triển của tế bào Nếu trong môi trường có nồng độ muối lớn, tế bào sẽ bị mất nước, chịu trạng thái khô sinh lí, co nguyên sinh chất và sẽ bị chết nếu kéo dài Ngược lại nếu nồng độ muối trong môi trường thấp, nước sẽ xâm nhập vào trong tế bào làm áp lực tăng lên Vi khuẩn lactic có thể bị ức chế nếu nồng độ muối > 5%, tuy nhiên một số loài có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn Có thể tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic nếu

bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin

1.3.3 Các phương pháp sấy

Vấn đề lựa chọn phương pháp sấy là rất quan trọng vì nó quyết định tỷ lệ tế bào sống sót trong chế phẩm và khả năng bảo quản sau này Các phương pháp sấy hay sử dụng hiện nay : sấy đông khô, chân không và sấy phun [10]

1.3.3.1.Sấy đông khô

Là phương pháp sấy đặc biệt Ẩm chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không qua trạng thái lỏng Vật liệu sấy được sấy trong môi trường chân không với

áp suất nhỏ hơn 456 mmHg, nhiệt độ sấy có thể đạt -80oC

Vật liệu trước sấy được làm lạnh đông sâu nhanh, nhằm chuyển toàn bộ nước

có trong vật liệu sang trạng thái rắn, các cấu tử hoà tan cần cố định để không kết hợp lại với nhau Dưới áp suất rất thấp, nước sẽ bay hơi, hơi ẩm bay sang thiết bị ngưng tụ và ngưng tụ thành nước đá Trong quá trình làm lạnh sâu, có thể vi sinh vật bị chết, nên để khắc phục ta phải sử dụng các chất độn để nhũ hoá keo bảo vệ hỗn dịch

1.3.3.2.Sấy chân không

Phương pháp sấy này dựa trên nguyên tắc: nhiệt độ sôi và áp suất hơi bão hoà

là hai thông số phụ thuộc vào nhau Áp suất giảm thì nhiệt độ sôi giảm và ngược lại

Vì vậy, người ta tiến hành sấy ở áp suất thấp nhằm giảm nhiệt độ sấy để đảm bảo tỷ

lệ sống sót của vi sinh vật sau khi sấy cao

Phương pháp này được áp dụng với điều kiện độ ẩm của chế phẩm không quá cao, như thế thời gian sấy sẽ không quá lâu, nhưng ảnh hưởng tới khả năng sống của tế bào Vì: độ ẩm thấp nên sự phối trộn giữa vi khuẩn và chất độn không đều, khiến chất độn không phát huy được khả năng bảo vệ

1.3.3.3.Sấy phun

*Nguyên lý: sấy phun làm bay hơi nước từ phân tử huyền phù nhờ kết hợp quá

trình phun và tiếp xúc với môi trường sấy khô, không khí Quá trình sấy phun diễn

ra cho đến khi độ ẩm của bột đạt yêu cầu và sản phẩm được tách ra khỏi không khí Hỗn hợp đem sấy phun có thể là dung môi, huyền phù, nhũ tương hay thể tan Sấy phun gồm 4 quá trình [28]:

1) Chuyển dung dịch nguyên liệu sang trạng thái các giọt nhỏ (nguyên tử hoá) : giai đoạn này được thực hiện nhờ cơ cấu phun áp suất

2) Trộn hỗn hợp vật liệu sấy và môi trường sấy (không khí): quá trình trộn lẫn này đặc trưng cho các phương pháp sấy phun khác nhau: dòng cùng hướng, dòng ngược hướng, phương pháp kết hợp và đĩa quay

3) Sấy khô vật liệu (loại ẩm): ngay khi các giọt nhỏ của vật liệu sấy tiếp xúc với không khí sấy, quá trình bay hơi bắt đầu diễn ra, màng hơi được tạo thành một cách nhanh chóng trên bề mặt các giọt vật liệu Do diện tích bề mặt lớn, nhiệt độ

thích hợp và gradient ẩm, sự tăng nhiệt độ mạnh và chuyển khối đã làm cho quá trình sấy khô có hiệu quả Sự hoá hơi làm hạ nhiệt độ của giọt vật liệu và do đó nhiệt độ chỉ không tăng quá cao

4) Tách sản phẩm ra khỏi không khí: về nguyên tắc, có hai giai đoạn phân tách sản phẩm ra khỏi môi trường sấy:

+ Quá trình phân tách đầu tiên ở đáy của buồng sấy

+ Sản phẩm khô được tách hoàn toàn trong thiết bị phân tách (thường dùng nhất là thiết bị cyclon)

*Ứng dụng:

Quá trình sấy phun ứng dụng để sản xuất rộng rãi chế phẩm vi khuẩn lactic dùng trong công nghiệp chế biến các sản phẩm sữa (phomát hay sữa chua), thực phẩm chức năng, sản xuất bacteriocin, và môi trường vi sinh vật probiotic,

Khi so sánh với các kĩ thuật sấy (sấy phun, sấy chân không, sấy đông khô) thì sấy phun được cho là giảm chi phí và tốn ít thời gian hơn Điều đó được báo cáo chi tiết hơn: năng lượng tiêu thụ khi sấy phun thấp hơn nhiều (4000 - 6000 kJ/ kg nước bay hơi ) so với sấy lạnh đông (100.000 kJ cần thiết để bay hơi 1 kg nước),… [29] Trong quá trình sấy phun, vi khuẩn đối mặt đối với nhiều stress như: nhiệt (cả

ẩm ướt lẫn khô), oxy hóa, những stress liên quan đến sự loại nước (thẩm thấu, tích trữ những cơ chất độc, ) tác động đồng thời hay liên tiếp lên vi khuẩn, dẫn tới sự chết tế bào Hơn nữa, như đã đề cập ở trên, việc loại nước liên quan đến tính vững bền của các phân tử sinh học (có thể gây ra nhiều thay đổi không thể đảo ngược trong sự toàn vẹn về mặt cấu trúc và tính năng màng tế bào và các protein) Sự bảo đảm các chức năng, cấu trúc là rất quan trọng cho sự tồn tại và duy trì chức năng của vi khuẩn Cho đến nay, ứng dụng thương mại về phương pháp bảo quản này đối với vi khuẩn lactic vẫn chưa có được thành công ở diện rộng [30 -33]

Khả năng sống được của những tế bào được nuôi cấy trong cùng điều kiện nhưng xử lý bởi sấy phun, lạnh đông và sấy đông khô là khác nhạu (khả năng sống của chế phẩm sau sấy phun nhỏ thua khả năng sống của chế phẩm sấy bằng phương

pháp khác) Ông Fu và Etzel đã nghiên cứu so sánh khả năng sống của Lc lactis

ssp lactis [35]; Johnson và Etzel đối với chủng L helveticu [34] Một vài tính chất

khác của chế phẩm như sự sinh ra bacteriocin, axit được tìm thấy vẫn giữ nguyên

sau quá trình sấy phun [30], [32]

Sấy phun là công nghệ được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp hóa học và

công nghiệp thực phẩm như để sấy các dung dịch chứa nước hoặc hữu cơ, huyền phù, nhũ tương,… Sấy phun có thể dùng để bảo quản hoặc đơn giản là phương pháp sấy nhanh

Là phương pháp sấy dựa trên nguyên tắc bay hơi ẩm nhờ sự chênh lệch nhiệt

độ giữa chế phẩm và tác nhân sấy Tác nhân sấy thường là không khí nóng, nhiệt độ đầu vào là 100 - 160oC, nhiệt độ đầu ra là 60 - 90oC

*Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun tạo chế phẩm vi khuẩn lactic

Quá trình sản xuất chế phẩm khô của vi khuẩn lactic là một quá trình xuyên suốt từ việc nuôi cấy thu sinh khối đến khi bảo quản bột khô Rầt nhiều yếu tố tác động đến khả năng sống sót của vi khuẩn, một vài yếu tố trong đó thích hợp với hầu như tất cả canh trường vi khuẩn lactic trong khi một số khác thì đặc hiệu cho một vài chủng giống được nghiên cứu Các yếu tố quan trọng được tổng kết sau đây

Các thông số của quá trình:

Quá trình sấy phun sản xuất bột khô nhờ việc tạo thành nguyên tử chất lỏng tại vận tốc cao và định hướng những giọt nhỏ vào trong luồng khí nóng, ví dụ 120 -

200 °C Sự nguyên tử hoá tạo ra một diện tích bề mặt lớn dưới dạng hàng triệu những giọt nhỏ cỡ 10 - 200 µm, dẫn đến một thời gian rất ngắn tiếp xúc đối với khí nóng trong buồng sấy Quá trình nguyên tử hóa, chính bản thân nó không gây ra sự

khử hoạt tính tế bào Ví dụ, tế bào L lactis không bị tổn thương từ những lực phân

cắt hay nóng lên trong khi đi qua bộ phận phun [35] Dù tăng nhiệt độ không khí đầu vào giảm bớt khả năng sống được của tế bào [32], nhưng nhiệt độ cao không trực tiếp tương quan với sự khử hoạt tính và nó chỉ có một hiệu ứng nhẹ [33] Điều này có thể vì thực tế phạm vi của sự khử hoạt tính vi khuẩn trong thời gian sấy khô phụ thuộc đặc biệt vào sự kết hợp thời gian-nhiệt độ

Mối tương quan thời gian - nhiệt độ của những hạt nguyên tử này có thể được chia thành hai thời kỳ Khi bắt đầu sấy phun (thời kỳ nhịp độ khô ổn định), nhiệt độ của những phần tử sấy khô và sự khử hoạt tính bằng nhiệt hạn chế bởi nhiệt độ ẩm

do hiệu ứng làm lạnh bằng bay hơi Tại giai đoạn tiếp theo (thời kỳ độ khô giảm mạnh), nhiệt độ của những phần tử sấy tăng nhưng nói chung không đạt đến nhiệt

độ không khí đầu ra Giai đoạn thứ 2 này đóng vai trò quan trọng cho sự khử hoạt tính bằng nhiệt, và bởi vậy thời gian sấy tối ưu là thời gian cho sự loại bỏ ẩm mong muốn mà tăng tối thiểu nhiệt độ của sản phẩm sấy Khi nhiệt độ không khí khô thấp được yêu cầu cho sản phẩm nhạy cảm nhiệt thì thời gian tiếp xúc lại có thể rất dài Điều này có thể dẫn tới những tháp sấy khô có chiều cao lớn hoặc cần không khí đã loại ẩm

So với nhiệt độ không khí đầu vào, nhiệt độ đầu ra hay nhiệt độ mà sản phẩm đạt khi rời khỏi buồng sấy được tin là tham số chính ảnh hưởng đến khả năng sống được của các chế phẩm sấy phun Nhiệt độ không khí đầu ra phụ thuộc vào nhiệt

độ không khí đầu vào, tốc độ dòng chảy không khí, tốc độ cấp liệu sản phẩm, và sự nguyên tử hoá dung dịch sấy Sự thiết lập thích hợp những biến số này khó tính toán trước, và những khó khăn trong sự làm ổn định nhiệt độ không khí đầu ra có thể gây

ra một sự biến đổi lớn trong khả năng sống được chế phẩm sấy khô Nhiều tác giả thông báo rằng khi giảm nhiệt độ đầu ra sẽ nâng cao khả năng sống sót [33], [37], [38]

Bản chất chống chịu của canh trường đối với quá trình sấy phun:

Một số nghiên cứu nhận thấy khả năng sống liên quan đến hình thái tế bào như kích thước và hình dạng của nó Các loài khác nhau của một chi (hoặc thậm chí trong nhiều trường hợp các chủng khác nhau của cùng một loài) có khả năng sống sót khác nhau trong cùng một điều kiện sấy khô hay trong cùng điều kiện bảo quản [39], nguyên nhân cơ bản của mức độ khác nhau đó có thể là do sự thay đổi về kiểu

di truyền Phần lớn các loài có khả năng chịu đựng nhiệt và chịu oxy một cách ôn hoà thì có tỷ lệ sống sót cao hơn (68-82%) các loài có khả năng chống chịu nhiệt kém và khả năng chống oxy biến đổi (19,4-38%) [39]

Các nhân tố đáp ứng stress:

Cũng như các vi khuẩn khác, nhóm vi khuẩn lactic cũng cảm ứng với stress để bảo vệ tế bào trước một số điều kiện khắc nghiệt Sự cảm ứng của các hệ thống phòng vệ này ảnh hưởng đến khả năng chống chịu trước các điều kiện xấu như

stress nhiệt và stress thẩm thấu trong quá trình sấy khô tế bào Khi L.paracasei được

sấy phun ở nhiệt độ outlet thấp hơn (85 - 90o C và 90 - 950C) thì mức độ sống sót cao

Thời điểm thu hồi sinh khối vi khuẩn:

Thời điểm thu hồi sinh khối thích hợp nhất để sản xuất chế phẩm vi khuẩn phụ thuộc vào chủng cụ thể Nhìn chung, vi khuẩn lactic thường được thu hồi ở cuối pha log, đầu pha cân bằng, bên cạnh hiệu suất sinh khối lớn, còn có khuynh hướng nâng cao tỷ lệ sống sau quá trình sấy phun So sánh số tế bào đếm được (trước sấy ( 8,54

và 8,87 log cfu/mL ) của chủng L.delbrueckii ssp bulgaricus thu hồi ở pha log và

pha cân bằng, số tế bào sau sấy phun tương ứng là 5,80 và 7,45 log cfu/mL [16] Trong công trình của Corcoran và cộng sự [40], ba pha phát triển khác nhau của

L.rhammosus ( pha lag, pha log và pha cân bằng ) được nghiên cứu và các kết quả

tương tự được tìm thấy Hơn 50% và 14% sống sót đối với tế bào ở pha cân bằng và pha log, trong khi tế bào ở pha lag nhạy cảm nhất với chỉ 2% sống sót Việc thiếu glucose có thể dẫn tới khả năng đáp ứng đối với nhiều stress, như stress nhiệt và stress thẩm thấu

Mới chỉ có một vài báo cáo khoa học về ảnh hưởng của nồng độ tế bào đối với quá trình sấy vi khuẩn Linders và cộng sự [41] tìm thấy rằng mật độ tế bào ban đầu

liên quan trực tiếp đến hoạt động sinh trưởng bình thường của Lb.plantarum sau khi

sấy

Chất bảo vệ môi trường sấy:

Cho thêm các chất bổ trợ vào các chế phẩm vi sinh vật là cách làm thông dụng

để bảo vệ tế bào trong quá trình sấy và bảo quản Các chất này có thể là các thành phần đơn giản cho thêm trực tiếp vào sinh khối hoặc là hỗn hợp phức tạp, các polymer được sử dụng như môi trường huyền phù hay chất mang (như sữa gầy,

whey, gôm acacia, gelatine, maltodextrin ) Trong nghiên cứu của Lian và cộng sự đối với bifidobacteria sấy phun sử dụng các chất mang khác nhau (10% sữa gầy, gôm arabic, tinh bột tan và gelatine), sữa gầy đem lại tỷ lệ sống cao nhất Mức độ sống sót của bifidobacteria phụ thuộc nhiều vào các chất mang và thay đổi theo

từng chủng Chủng B.infantis sống sót tốt hơn với gôm arabic so với gelatine và tinh bột tan, trong khi chủng B.longum sống tốt hơn với gelatine so với gôm Arabic

và tinh bột tan Việc tăng nồng độ các chất mang từ 10 đến 20% hoặc hơn làm giảm

mức sống sót của bifidobacteria [31], tỷ lệ sống của L.acidophilus sấy phun với

25% sữa tách béo cao hơn so với ở nồng độ chất mang là 40% [20] Trái với những kết quả đó, tăng nồng độ chất mang từ 25% lên 33% làm tăng khả năng sống khi sấy phun với nhiệt độ outlet là 80 và 900C chủng Beijerinckia sp [37]

Việc lựa chọn chất mang không những ảnh hưởng đến khả năng sống sót mà còn tác động lớn đến hiệu suất thu hồi của quá trình sấy phun Ngoài ra nồng độ chất mang cũng cần được nghiên cứu để chọn ra tỷ lệ thích hợp nhằm thu được chế phẩm có tỷ lệ sống sót cao mà hiệu suất thu hồi bột không hề bị giảm sút

1.4.2 Chất độn cho chế phẩm

Đối với vi khuẩn lactic, việc lựa chọn thành phần chất mang là rất quan trọng nhằm tăng cường khả năng sống sót của tế bào trong quá trình sấy và bảo quản sau này Sự phá hủy hệ thống sinh học của vi khuẩn do quá trình lạnh đông và sấy xuất phát từ hai nguyên nhân ban đầu [36]:

• Sự thay đổi trạng thái vật lý của lipit ở màng tế bào

• Sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm trong tế bào

Các hợp chất có khả năng thẩm thấu khác nhau đối với tế bào, từ đó tác động đến cơ chế bảo vệ tế bào Có thể phân ra thành ba loại chính, được xác định như sau:

• Loại xâm nhập được qua thành tế bào và màng nguyên sinh chất

• Loại thâm nhập được qua thành tế bào nhưng không vượt qua được màng nguyên sinh chất (oligosacarit, aminoaxit, polyme khối lượng phân tử thấp)

• Không có khả năng thâm nhập vào thành tế bào và cũng không trực tiếp tương tác với màng tế bào hay thành tế bào (các polyme khối lượng phân tử cao như protein và polysacarit)

Ngoài ra chọn loại chất mang còn phụ thuộc vào việc ứng dụng của chế phẩm

vi khuẩn lactic vào chế biến sản phẩm gì.Chẳng hạn: việc dùng chất mang là sữa

gầy có nhiều ưu điểm khi sấy chế phẩm vi khuẩn Streptococcus themophillus ứng

dụng trong sản xuất sữa chua, ; dùng chất mang là maltodexrin trong sấy chế phẩm

vi khuẩn Lactobacillus plantarum ứng dụng sản xuất dưa cải bẹ muối chua có nhiều

ưu điểm: giảm thời gian muối, dưa có trạng thái giòn, màu vàng, mùi thơm hấp dẫn,

độ nhớt nước dưa thấp, hơn nữa maltodextrin rẽ hơn rất nhiều so với chất mang khác (inulin, )

ổn định hương vị của các sản phẩm thực phẩm; thay đổi cấu trúc và tăng cảm quan thực phẩm; chất trợ sấy; tăng năng lượng cho thực phẩm ăn kiêng giúp thực phẩm

dễ hòa tan, dễ tiêu hóa, tăng giá trị dinh dưỡng

Mặc dù maltodextrin không kết hợp được lên thành tế bào nhưng chúng lại được hấp thụ lên bề mặt vi khuẩn, hình thành một lớp keo dính bảo vệ tế bào trước những tác động của nhiệt

2.1.2 Nguyên liệu muối dưa

* Các loại nguyên liệu: rau dưa cải bẹ, muối , đường

* Nguồn gốc: Để tiến hành muối dưa, chúng tôi sử dụng các nguyên liệu mua tạị chợ Bách Khoa – trong ngày 1 tháng 11 năm 2009

2.1.3 Hoá chất và môi trường

2.1.3.1.Hoá chất

− Đường Glucoza: Việt Nam

− Cao thịt, cao nấm men: Đức

− Pepton, CH3COONa: Trung Quốc

− K2HPO4: Trung Quốc

− MgSO4.7H2O, MnSO4.4H2O: Trung Quốc

− Tween 80, Amonicitrat : Trung Quốc

− Thạch (agar): Việt Nam

2.1.3.2.Môi trường

a Môi trường MRS (Deman, Rogosa, Sharpe):

* MRS lỏng

- Thành phần trong 1000ml môi trường gồm: 0.04g MnSO4 4H2O, 0.2g MgSO4 7H2O, 5g Amonium citrat, 2g K2HPO4, 2g CH3COONa, 4g Cao nấm men, 10g Pepton, 8g Cao thịt, 20g Glucoza, 1ml Tween 80, 1000ml nước

- Chỉ số pH : 6- 6.2 ± 0,2 ở 200C

- Công dụng: dùng để xác định số tế bào của vi khuẩn lactic

b Môi trường MRS tt (MRS thay thế)

- Thành phần trong 1000ml môi trường gồm: 0.04g MnSO4 4H2O, 0.2g MgSO4 7H2O, 5g Amonium citrat, 2g K2HPO4, 2g CH3COONa, 2g Cao nấm men, 5g Pepton, 4g Cao thịt, 20g Glucoza, 1ml Tween 80, 15 g thạch, 1000ml nước

- Chỉ số pH : 6- 6.2 ± 0,2 ở 200C

- Công dụng: dùng nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối ẩm phục vụ cho quá trình sấy

c Môi trường MPA lỏng

- Thành phần trong 1000ml môi trường gồm: 3g cao thịt, 5g NaCl, 10g pepton

- Công dụng: dùng để hoạt hoá và nuôi E.coli, St.aureus

d Môi trường Endo (Merck): có sẵn với thành phần trong 1000ml là: 10g Peptone,

10 g Lactoza, 2.5 g K2HPO4, 3.3g Na2SO3, 0.3g Fucshin kiềm, 15g Agar (Thạch)

- Chỉ số pH: 7.5 ± 0.2 ở 200C

- Công dụng:dùng để xác định số tế bào của vi khuẩn E coli

e Môi trường Baird-Parker : có sẵn với thành phần trong 1000ml là: 10g Peptone,

1g Cao nấm men, 5g Cao thịt, 10g Pyruvat natri, 12g Glycocol, 50ml dịch nhũ lòng

1 Kính hiển vi Nikon, Japan

2 Máy đo pH cầm tay Thụy Điển

3 Chiết quang kế Japan

4 Máy đo OD China

5 Nồi hấp Sanyo, Japan

6 Máy li tâm Hettich, Germary

7 Máy sấy phun (Buchi 290) Switzerland

8 Lò vi sóng Trung Quốc

9 Tủ nuôi cấy Trung Quốc

Hình 2.1.Cấu tạo máy sấy Phun Buchi B-290

1 Đường khí vào 5 Cyclon tách khí khỏi sản phẩm

2 Nhiệt kế điện 6 Bình chưa sản phẩm

3 Đường khí vào xung quanh vòi phun 7 Thiết bị lọc khí ra

4 Phòng sấy 8 Bơm hút khí ra khỏi hệ thống

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1.Hoạt hoá, làm sạch và giữ giống

*Hoạt hoá: Vi khuẩn lactic ở dạng bảo quản lạnh đông trong hạt nhựa, được hoạt hoá bởi môi trường MRS lỏng với thời gian 24h

*Làm sạch: Vi khuẩn sau khi hoạt hoá được cấy theo phương pháp cạn dần trên môi trường MRS rắn, sau thời gian 48h ta có khuẩn lạc sạch

và nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc hiệu trong khoảng thời gian và ở nhiệt độ thích hợp (mỗi độ pha loãng lặp lại 2 lần) Sau đó quan sát đếm số khuẩn lạc, ta tính được số lượng tế bào (khuẩn lạc) trung bình có trong 1ml hay 1 g mẫu theo công thức:

:Trong đó:

Σ C – Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa;

n1 – Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1 (độ pha loãng thấp nhất);

n2 – Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2;

f1 – Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1;

v – Thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa Petri

a) Xác định số khuẩn lạc vi khuẩn lactic

- Dùng phương pháp Korch và chọn môi trường đặc hiệu MRS rắn để nuôi tế bào ở nhiệt độ thích hợp 30o C trong thời gian 48h, sau đó xác định số khuẩn lạc (công thức trên)

b) Xác định số khuẩn lạc vi khuẩn E Coli

- Dùng phương pháp Korch và chọn môi trường đặc hiệu Endo để nuôi tế bào

ở nhiệt độ thích hợp 44o C ± 10C trong thời gian 48h đến 72h, sau đó xác định số khuẩn lạc (công thức trên)

- Trên mỗi đĩa Petri đã nuôi, chọn các khuẩn lạc nghi ngờ có các đặt tính như

có màu hồng hoặc đỏ cánh sen, tròn, bờ đều và có ánh kim để tiến hành khẳng định

đó là E Coli