Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic để xử lý phế liệu tôm nhằm thu nhân chitin

Chitin và dẫn xuất của nó – chitosan có hoạt tính sinh học cao như tính kháng nấm, tính kháng khuẩn và khả năng tự phân hủy sinh học nên chúng được ứng dụng rất nhiều trong y, dược, công

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGÔ THỊ BÍCH NGỌC

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ

XỬ LÝ PHẾ LIỆU TÔM NHẰM THU NHẬN CHITIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI -2011

MỤC LỤC 1 

LỜI CAM ĐOAN 1 

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2 

DANH MỤC CÁC BẢNG 3 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 4 

LỜI MỞ ĐẦU 5 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 

1.1 TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ CHẾ BIẾN THỦY SẢN TẠI VIỆT NAM 7 

1.2 PHỤ PHẨM CỦA CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN TÔM 7 

1.3 CẤU TẠO VỎ TÔM VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 8 

1.3.1 Cấu tạo vỏ tôm [2] 8 

1.3.1.1 Lớp biểu bì (epicuticle) 9 

1.3.1.2 Lớp màu 9 

1.3.1.3 Lớp canxi hóa 9 

1.3.1.4 Lớp không bị canxi hóa 9 

1.3.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm [2] 9 

1.4 KHÁI QUÁT VỀ CHITIN - CHITOSAN 11 

1.4.1 Tính chất lý hóa 11 

1.4.1.1 Chitin 11 

1.4.1.2 Chitosan 13 

1.4.2 Ứng dụng của chitin, chitosan hiện nay 14 

1.4.2.1 Trong xử lý môi trường [51, 63, 58, 62] 14 

1.4.2.2 Trong công nghệ thực phẩm [55, 26, 64, 20] 16 

1.4.2.3 Trong y dược [1, 16, 38, 10] 17 

1.4.2.6 Trong công nghiệp mỹ phẩm [47] 18 

1.4.3 Một số phương pháp thu nhận chitin - chitosan hiện nay 19 

1.4.3.1 Phương pháp cơ học 19 

1.4.3.2 Phương pháp hóa lý 19 

1.4.3.3 Phương pháp hóa học 19 

1.4.3.4 Phương pháp sinh học 23 

1.5 VI KHUẨN LACTIC 25 

1.5.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic 25 

1.5.2 Đặc điểm của vi khuẩn lactic 26 

1.5.2.1 Hình thái, sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn lactic [39] .26 

1.5.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic 26 

1.5.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic .28 

1.5.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng 28 

1.5.2.3.2 Điều kiện nuôi cấy 30 

1.5.3 Quá trình lên men lactic của vi khuẩn lactic 31 

1.5.3.1 Lên men lactic đồng hình 31 

1.5.3.2 Lên men lactic dị hình 32 

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHTIN-CHITOSAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 33 

1.6.1 Trên thế giới 33 

1.6.2 Ở Việt Nam 33 

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 

2.1 Vật liệu nghiên cứu 35 

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 35 

2.1.2 Thiết bị dùng cho thí nghiệm 35 

2.1.3 Hóa chất 35 

2.2 Môi trường dùng cho nghiên cứu 36 

2.2.3 Môi trường thạch + sữa gầy 37 

2.3 Các phương pháp nghiên cứu 37 

2.3.1 Phương pháp xác định định tính khả năng sinh axit của vi khuẩn lactic .37 

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng axit lactic 37 

2.3.3 Phương pháp xác định định tính hoạt tính protease 38 

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu động học sinh trưởng và khả năng tích tụ axit lactic 38 

2.3.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 38 

2.3.6 Phương pháp xác định hàm ẩm của nguyên liệu 38 

2.3.7 Phương pháp phân tích thành phần rỉ đường 39 

2.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng tro 40 

2.3.9 Phương pháp xác định hàm lượng Protein (Phương pháp Biuret) 41 

2.3.10 Phương pháp lên men bằng vi khuẩn lactic 42 

2.3.11 Phương pháp xác định hiệu suất khử khoáng và khử protein 42 

2.3.12 Phương pháp xác định đơn vị khuẩn lạc (CFU) 43 

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 

3.1 Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic 44 

3.1.1 Đặc điểm hình thái 44 

3.1.2 Khả năng sinh axit lactic 45 

3.1.3 Đặc điểm hoạt tính phân giải protein (hoạt tính protease) 46 

3.2 Nghiên cứu động học sinh trưởng của hai chủng NCDN4 và BNC1 47 

3.3 Phân tích thành phần ban đầu của PLT và rỉ đường 49 

3.3.1 Thành phần hóa học ban đầu của phế liệu tôm 49 

3.3.2 Phân tích thành phần rỉ đường 49 

3.4 Nghiên cứu tối ưu các điều kiện của quá trình lên men PLT bởi Lactobacillus plantarum NCDN4 50 

3.4.3 Ảnh hưởng của pH ban đầu tới hiệu suất khử khoáng 52 

3.4.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống tới hiệu suất khử khoáng 53 

3.4.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ NaCl tới hiệu suất khử khoáng 54 

3.4.6 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất khử khoáng 55 

3.5 Nghiên cứu kết hợp enzym neutrase trong quá trình lên men 56 

3.6 So sánh quá trình lên men PLT có thanh trùng và không thanh trùng 57 

3.7 Thu hồi dịch sau lên men 58 

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN 62 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 

I Tài liệu Tiếng Việt 63 

II Tài liệu Tiếng Anh 64 

PHỤ LỤC 1 70 

PHỤ LỤC 2 72 

PHỤ LỤC 3 73 

PHỤ LỤC 4 75 

PHỤ LỤC 5 76 

PHỤ LỤC 6 77 

PHỤ LỤC 7 78 

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Ngô Thị Bích Ngọc xin cam đoan nội dung trong quyển luận văn này với đề

tài “Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic để xử lý phế liệu tôm nhằm thu nhận

chitin ”là công trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn

của TS Lê Thanh Hà - Bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT Ký hiệu Tên đầy đủ

      1 PLT Phế liệu tôm

      2 DD Độ deaxetyl hóa

3 IR      Infrared Radiation

4 XRD X- ray diffractometer

5 B subtilis Bacillus subtilis

6 L plantarum Lactobacillus plantarum

DANH MỤC CÁC BẢNG

6 Bảng 3.3- Thành phần hóa học có trong PLT ban đầu 49

7 Bảng 3.4- Thành phần rỉ đường 49

thức lên men

57

thanh trùng và không thanh trùng

58

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

plantarum

44, 45

khoáng

55

LỜI MỞ ĐẦU

đó, tôm đông lạnh là sản phẩm chính với sản lượng ước tính đạt hơn 600.000 tấn/ năm Tuy nhiên, cùng với việc tăng sản lượng tôm thì khối lượng chất thải ra trong quá trình sản xuất, chế biến cũng tăng lên Điều này cũng đặt ra cho ngành chế biến thủy sản yêu cầu tận dụng nguồn phế liệu này nhằm nâng cao giá trị kinh tế về nguồn lợi thủy sản

Phế liệu của nhà máy tôm đông lạnh chủ yếu là đầu và vỏ tôm, chứa một lượng lớn protein, chất màu, chitin… Trong đó, chitin là thành phần chủ yếu của vỏ tôm Chitin là một polyme sinh học có cấu trúc mạch thẳng, gồm các đơn vị N-axetyl-β-D-glucosamin nối với nhau bằng liên kết β-(1,4)-glucozit Chitin và dẫn xuất của nó – chitosan có hoạt tính sinh học cao như tính kháng nấm, tính kháng khuẩn và khả năng

tự phân hủy sinh học nên chúng được ứng dụng rất nhiều trong y, dược, công nghệ mỹ phẩm, nông nghiệp, xử lý môi trường, công nghệ thực phẩm…

Từ trước đến nay, ở Việt Nam, đã có nhiều đề tài nghiên cứu chiết xuất chitosan, những polyme sinh học được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp từ phế liệu tôm Tuy nhiên, hiện nay các quy trình sản xuất chitin-chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình hóa học Việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lượng chitin-chitosan thu được có chất lượng thấp, các hóa chất và chất hữu cơ chưa được tận thu thải ra gây ô nhiễm môi trường

Công nghệ sinh học đã và đang mở ra một lựa chọn khác để tách chitin Điều này

có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin-chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu thủy sản

Xuất phát từ những yêu cầu và mục đích trên chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề

tài " Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic để xử lý phế liệu tôm nhằm thu nhận

chitin"

Đề tài bao gồm các nội dung chính sau:

¾ Tuyển chọn chủng lactic có khả năng sinh nhiều axit lactic và có hoạt tính protease cao

môi trường đến quá trình khử khoáng của chủng được lựa chọn

tăng khả năng khử khoáng và khử protein vỏ tôm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ CHẾ BIẾN THỦY SẢN TẠI VIỆT NAM Ngành chế biến thủy sản ở nước ta đóng vai trò hết sức quan trọng cả về ý nghĩa

kinh tế và xã hội, là một trong ba ngành đóng góp vào thu nhập quốc dân lớn nhất cả nước.

lực không ngừng ngành thủy sản vẫn trụ vững và đạt được những bước tiến đáng ghi nhận Theo thống kê mới nhất của Tổng cục thống kê, tổng sản lượng thuỷ sản 5 tháng đầu năm 2009 ước tính đạt 1736,6 nghìn tấn, tăng 4,4% so với cùng kỳ năm trước Trong đó, cá đạt 1334,3 nghìn tấn, tăng 4%; tôm 149,6 nghìn tấn, tăng 3,8% Sản lượng thủy sản nuôi trồng 5 tháng đầu năm 2009 ước tính đạt 748,2 nghìn tấn, giảm

nghìn tấn, tăng 5,3% so với năm 2008, trong đó cá đạt 3654,1 nghìn tấn, tăng 5,3%;

tra cả nước đạt 2,359 tỷ con, diện tích nuôi đạt 5.400 ha, sản lượng cá thu hoạch đạt 1.140.390 tấn, xuất khẩu đạt 538,2 nghìn tấn, đạt giá trị 1,15 tỷ USD, tăng 6,6% về khối lượng và 2,4% về giá trị Nuôi tôm nước lợ đạt 469.893 tấn, trong đó tôm sú đạt 333.174 tấn trên diện tích 613.718 ha, tôm chân trắng đạt 136.719 tấn trên diện tích 25.397 ha [19]

1.2 PHỤ PHẨM CỦA CÔNG NGHIỆP CHẾ BIẾN TÔM

Năm 1998, sản lượng tôm đông lạnh là 75.000 tấn, tương đương đạt giá trị 449 triệu USD Các nhà máy chế biến đông lạnh thải ra khoảng 50.000 tấn phế liệu, tương đương khoảng 40% nguyên liệu Trong đó, đầu và vỏ tôm là thành phần chủ yếu [ 21] Theo kết quả phân tích của Meyers, 1985 [45] tính theo % chất khô tuyệt đối, những thành phần chủ yếu có trong phế liệu đầu và vỏ tôm như sau:

Bảng 1.1- Thành phần phế liệu vỏ và đầu tôm

Thành phần hóa học (%) Đầu tôm Vỏ tôm

Theo Hong K và cộng sự 1989 [33] thành phần hóa học của thịt tôm và vỏ tôm là:

Bảng 1.2- Thành phần hóa học của thịt tôm và vỏ tôm

Thành phần hóa học Tôm thịt Vỏ tôm

1.3 CẤU TẠO VỎ TÔM VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

1.3.1 Cấu tạo vỏ tôm [2]

Vỏ tôm chia thành 4 lớp chính

● Lớp biểu bì

● Lớp màu

● Lớp bị canxi hóa

● Lớp không bị canxi hóa

Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi hóa cứng do sự lắng đọng của canxi Lớp màu, lớp canxi hóa, lớp không bị canxi hóa chứa nhiều chitin nhưng lớp biểu bì thì không Ta gọi các lớp chứa chitin là endocuicle

1.3.1.1 Lớp biểu bì (epicuticle)

Những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ bởi fucxin, có pH

=5,1, không chứa chitin Nó khác với các lớp vỏ còn lại, bắt màu với anilin xanh Lớp epicuticle có lipit vì thế nó cản trở tác động của axit ở nhiệt độ thường trong công đoạn khử khoáng bằng axit hơn là các lớp bên trong Màu của lớp này thường vàng rất nhạt có chứa polyphenoloxidase và bị hóa cứng bởi puinone-tanin Lớp epicuticle liên kết với một số màng mỏng bên ngoài cản trở hòa tan ngay cả trong môi trường axit đậm đặc do nó có chứa các mắt xích paratin mạch thẳng

1.3.1.2 Lớp màu

Tính chất của lớp này do sự có mặt của những thể hình hạt của vật chất mang màu giống dạng melanin Chúng gồm những túi khí hoặc những không bào Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh là con đường cho canxi thẩm thấu vào

1.3.1.3 Lớp canxi hóa

Lớp này chiếm phần lớn vỏ, thường có màu xanh trải đều khắp, chitin ở trạng thái tạo phức với canxi

1.3.1.4 Lớp không bị canxi hóa

Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo thành bởi một phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dài bao gồm các phức chitin-protein bền vững không có canxi và quinone

1.3.2 Thành phần hóa học của phế liệu tôm [2]

♦ Protein: Thành phần protein trong phế liệu tôm thường tồn tại ở hai dạng:

- Dạng tự do: Dạng này là phần thịt tôm từ một số tôm bị biến đổi được vứt lẫn vào phế liệu hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng của đầu tôm Nếu công

nhân vặt đầu tôm không đúng kĩ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều làm tăng định mức tiêu hao nguyên liệu, mặt khác phế liệu khó xử lý hơn

- Dạng phức tạp: Ở dạng này protein không hòa tan và thường liên kết với chitin, canxi cacbonat, với lipit tạo lipoprotein, với sắc tố tạo proteincarotenoit như một phần thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm

♦ Chitin: Tồn tại dưới dạng liên kết bởi những liên kết đồng hóa trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin-protein, liên kết với các hợp chất khoáng và các hợp chất hữu cơ khác gây khó khăn cho việc tách và chiết chúng

♦ Canxi: Trong vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ yếu là muối

Ngoài các thành phần chủ yếu kể trên, trong vỏ đầu tôm còn chứa các thành phần khác như: nước, lipit, photpho

Sau đây là kết quả phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của phế liệu tôm (% chất khô)

Bảng 1.3- Một số chỉ tiêu sinh hóa của phế liệu tôm (% chất khô)[21]

Như vậy, phế liệu tôm có giá trị dinh dưỡng cao so với một số động vật khác Hàm lượng protein trung bình đạt 34,8% Tỷ lệ chất khô, photpho, canxi không có sự sai khác nhiều giữa ba loài

1.4 KHÁI QUÁT VỀ CHITIN - CHITOSAN

1.4.1 Tính chất lý hóa

1.4.1.1 Chitin

nguyên liệu, là một chuỗi dài polyme của N- axetylglucosamin, là thành phần chính của một số động vật giáp xác như: tôm, cua, sam…[14,6] thành phần của mai mực… Chitin được chế biến thành chitosan và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: y dược, nông nghiệp, bảo quản thực phẩm, môi trường…[12,13]

Chitin có cấu trúc là một polysaccarit không phân nhánh, cấu trúc hóa học của

Hình 1.1- Công thức cấu tạo chitin

Khối lượng phân tử chitin trong tự nhiên lớn hơn 1 triệu dalton Trong tự nhiên, chúng không tồn tại ở dạng tinh khiết mà thường kết hợp với các polysacarit khác, với protein và với cả muối khoáng

Như vậy, chitin là một polyme sinh học được cấu tạo từ các gốc D-glucosamin và được xem như là một bazơ hữu cơ Do trên nguyên tử nitơ của mạng

chưa bị chia trên nguyên tử nitơ của mạng chitin làm cho mật độ điện tử của nó giảm nên tính bazơ của chitin yếu Bằng các phương pháp hóa lý khác nhau (IR, X-ray…), người ta đã xác định chitin tồn tại dưới 3 loại cấu hình: α-chitin, β-chitin, γ-chitin

Các cấu hình chitin khác nhau là do sự phân bố không gian khác nhau của các vòng D-glucosamin trong mạng chitin [22,15] Trong 3 cấu hình của chitin, α-chitin

có cấu hình ổn định và bền vững nhất Với một số điều kiện nhất định, β-chitin và γ–chitin chuyển thành α–chitin bền vững hơn (β-chitin chuyển thành α–chitin khi ngâm

cầu liên kết hydro giữa các nhóm chức của mạng polyme này với các nhóm chức của mạng của polyme khác, β-chitin chỉ có cầu liên kết hydro giữa các nhóm chức trong cùng một mạng polyme [14,15] β-chitin có khả năng trương nở trong nước, khả năng hoạt động về mặt hóa học của β–chitin lớn hơn α–chitin, α–chitin có trong vỏ tôm, cua, sam…[12,15], β-chitin có trong mai mực…[14,12,15,11], γ-chitin có trong dạ dày của mực nang, mực ống [11]

Chitin có màu trắng hoặc ngà, vô định hình Chitin ở thể rắn xốp, nhẹ, không màu, không mùi, không vị

Chitin không tan trong nước, trong môi trường kiềm, axit loãng và các chất dung môi hữu cơ như ete, rượu… nhưng nó lại hòa tan trong dung dịch đặc nóng của

chất oxy hóa trên để khử màu cho chitin

Kết tinh ở dạng tinh thể vô định hình, chitin khó hòa tan trong dung dịch ammoniac, không hòa tan trong thuốc thử Schweizei-sapranora

Chitin là polysaccharit nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao, có tính hòa hợp và tự phân hủy trên da

Chitin bị men lyzozym – một loại men chỉ có trên cơ thể người phân giả thành monomer N-axetyl-Dglucosamin Khi đun nóng chitin trong HCl đậm đặc tạo thành Glucoamin chlohydrat Khi đun nóng chitin trong NaOH đậm đặc tạo thành chitosan (C6H11O4N)n [12,13]

1.4.1.2 Chitosan

Chitosan là dẫn xuất đề axetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế

liên kết với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicozit Do vậy, chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly β-(1-4)-D- glucozamin Công thức phân tử: [C6H11O4N]n, Mchitosan = (161.07)n

Hình 1.3- Công thức cấu tạo chitosan

Chitosan ở dạng bột có màu trắng ngà, còn ở dạng vẩy có màu trắng hay hơi vàng, xốp nhẹ, hình vảy, không mùi, không vị, trọng lượng phân tử trung bình từ 10.000- 500.000 dalton tùy loại Chitosan có tính kiềm nhẹ, không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc, cồn, axeton và các dung môi hữu cơ khác nhưng tan trong axit loãng (pH=6) điển hình như tan trong axit axetic loãng tạo thành dung dịch keo Độ nhớt của dung dịch chitosan trong dung dịch keo phụ thuộc và khối lượng

phân tử của chitosan, nguồn gốc và phương pháp điều chế Dung dịch chitosan trong axit có độ nhớt phụ thuộc vào độ deaxetyl hóa chitosan (DD%) Độ nhớt của chitosan

lại Bằng phương pháp phổ X-ray, 1H-NMH, chuẩn điện thế, hồng ngoại người ta xác định được DD của chitin Tuy nhiên, để xác định DD của chitin một cách nhanh chóng người ta phải sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại (IR) [13] Theo quy ước,

DD ≥ 50% được gọi là chitosan và DD ≤ 50% được gọi là chitin [13]

có nhiều mao quản nên khả năng hấp thụ nước rất cao

Chitosan là polyme mạch thẳng nên có khả năng bám dính tốt vào bề mặt tích điện âm và có khả năng hấp phụ nhiều ion kim loại

Phản ứng với axit đậm đặc tạo thành muối khó tan, chitosan tác dụng với iot

Hàm lượng nitơ trong chitin thay đổi từ 5-8% Hàm lượng này phụ thuộc vào hiệu suất của quá trình deaxetyl hóa Trong khi đó, hàm lượng nitơ trong chitosan hầu hết chứa trong amin thơm Do vậy, những phản ứng điển hình của nhóm amin, N- axetyl và phản ứng bazo-chiff là những tính chất quan trọng nhất của chitosan [13] Chitosan tan trong dung dịch axit loãng như axit axetic, axit fomic Chitosan có khả năng tạo keo trong N-methyl-pholine, N-oxyd Sự thủy phân chitosan bằng axit đậm đặc sẽ tạo ra D-glucosamin tương đối tinh khiết

1.4.2 Ứng dụng của chitin, chitosan hiện nay

1.4.2.1 Trong xử lý môi trường [51, 63, 58, 62]

hay các hợp chất và các hạt khỏi dung dịch Trong những năm gần đây, phương pháp này được đánh giá là một trong những phương pháp hiệu quả về cả kinh tế và kỹ thuật

để loại bỏ các kim loại gây nhiễm bẩn nguồn nước mặt và nhiều loại nước thải công nghiệp Olin và Bailey đã đưa ra 12 loại chất hấp phụ có khả năng tách kim loại khỏi các dòng thải với chi phí thấp Trong số 12 loại này, chitosan có dung lượng hấp phụ cao nhất đối với kim loại [51]

Chitosan có khả năng hấp phụ tốt các kim loại nặng Do đặc tính của nhóm amino tự do trong cấu trúc chitosan được tạo thành khi deaxetyl hóa chitin, các phức chelat của nó làm cho khả năng hấp phụ kim loại tăng gấp 5 đến 6 lần so với chitin Khi ghép một số nhóm chức vào khung cấu trúc của chitosan sẽ làm tăng khả năng hấp phụ kim loại của chitosan lên nhiều lần Để tạo điều kiện tốt cho quá trình chuyển khối, đồng thời tăng dung lượng hấp phụ kim loại của chitosan,biến tính chitosan hấp phụ kim loại nặng trên mạng lưới liên kết mạch thẳng và chéo nhau Kết quả là đã tạo

ra được nhiều loại chitosan biến tính có dung lượng hấp phụ kim loại cao

Volesky, Holan, Wase và Foster cũng đã nghiên cứu một số chất hấp phụ sinh học và khả năng giữ các nguyên tố phóng xạ như urani, thori Họ đã nhận thấy khả năng ứng dụng rộng lớn của các loại chất hấp phụ sinh học trên cơ sở chitosan biến tính vì vậy chúng đã được tập trung nghiên cứu, phát triển và thương mại hóa Các chất hấp phụ sinh học ở dạng tự nhiên thường mềm, trong dung dịch nước có xu hướng kết tụ hoặc tạo gel Hơn nữa, ở dạng tự nhiên mạng lưới của chúng thực tế không có khả năng hấp phụ Sự di chuyển của kim loại nhiễm bẩn vào mạng lưới giam giữ đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình chế tạo vật liệu hấp phụ sinh học Cần thiết phải cung cấp sự hỗ trợ vật lý và tăng cường sự thâm nhập của mạng giam giữ kim loại của chất hấp phụ sinh học trên các loại giá thể khi chuẩn bị vật liệu hấp phụ sinh học Nhiều vật liệu hấp phụ sinh học với các loại màng chitosan biến tính trên các giá thể khác nhau đã được nghiên cứu cho mục đích này [58, 62]

Một nhóm tác giả thuộc Phòng nghiên cứu kỹ thuật công trình của quân đội

Mỹ kết hợp cùng Trung tâm nghiên cứu & Quản lý chất thải của ủy ban Quản lý Tài nguyên Thiên nhiên và Trường đại học Tổng hợp Illinois đã kết hợp nghiên cứu một loại vật liệu hấp phụ sinh học với màng chitosan trên nhôm oxit Vật liệu màng chitosan đã biến tính trên giá thể composit sứ - nhôm oxit đạt 153,8 mg Cr6+/g (với nồng độ ban đầu của Cr6+ đều ở 1000mg/l) Ảnh hưởng của cấu trúc lỗ, độ phân bố kích thước lỗ xốp và giá trị pH tới dung lượng hấp phụ rất rõ rệt Nói chung, vật liệu

có bề mặt riêng 80 - 105 m2/g với kích thước hạt 100 - 150 micron là thích hợp Ở giá trị pH thấp, dung lượng hấp phụ tăng Sự có mặt ở nồng độ cao của ion sunfat và

clorua sẽ làm giảm khả năng hấp phụ kim loại

Wu và các cộng sự khảo sát tình hình này của chitosan bằng việc loại bỏ protein trong nước Họ đã nhận ra rằng tác dụng ngưng tụ các chất rắn lơ lửng và các protein của chitosan tỉ lệ nghịch với khối lượng phân tử Nồng độ của các dung dịch thử nghiệm của chitosan nằm trong khoảng 10 - 15mg/l Kết quả cho thấy các mẫu sử dụng thí nghiệm trên có thể loại bỏ được đến 90% độ đục [63]

Chitosan được ứng dụng trong kĩ thuật xử lý nước như một phần của quá trình lọc nước Chitosan tạo ra các hạt cặn tốt để kết khối chúng lại với nhau và sau này được loại bỏ cùng với cặn bẩn bằng phương pháp lọc cát Chitosan cũng loại bỏ photpho, những khoáng vật nặng và các loại dầu trong nước

1.4.2.2 Trong công nghệ thực phẩm [55, 26, 64, 20]

Từ trước đến nay, việc bảo quản các loại thực phẩm tươi sống giàu đạm, dễ hư hỏng như thịt, cá trong điều kiện khí hậu nóng ẩm của nước ta là một trong những vấn đề đã và đang được các nhà sản xuất, chế biến và các nhà khoa học quan tâm, nên sau khi vỏ bọc chitosan từ vỏ tôm được hoàn thành, các nhà nghiên cứu đã nghĩ ngay

Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả đã chỉ ra rằng: màng bao chitosan, trong

quá trình bảo quản, ảnh hưởng tích cực đến chất lượng ủa trứng gà tươi Theo Su Hyun Kim [55], Cenzig Caner [26], trứng được bảo quản bằng màng bao chitosan hạn chế được đáng kể sự hao hụt khối lượng, tăng chỉ tiêu chất lượng lòng trắng, lòng đỏ trứng Nghiên cứu của Xian De Liu và cộng sự [64] cho thấy sử dụng màng bao chitosan kết hợp với chiếu xạ giúp cải thiện chất lượng trứng gà tươi trong thời gian bảo quản Ở nước ta, tác giả Trần Thị Luyến, Lê Thanh Long [20] cũng đã nghiên cứu

ứng dụng màng bao chitosan kết hợp với phụ gia để bảo quản trứng gà tươi

Chitosan có khả năng kết hợp với bentonit, gelatin, silicagen, keo thạch hay

những chất khác để làm trong rượu nho, rượu mật ong và bia Chitosan tạo sự kết dính

tiên của rượu vang đỏ) sẽ không kết hợp với chitosan nữa

Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng khuẩn, như ức chế sự

hoạt động của một số loại vi khuẩn E coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà

rốt, và có tác dụng tốt với các loại thực phẩm tươi sống, đông lạnh khi bao gói chúng bằng các màng mỏng chitosan dễ phân hủy

Màng chitosan có tác dụng làm chậm lại quá trình bị thâm của hoa quả Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dễ bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị, nhờ bao gói bằng màng chitosan mà giữ cho rau quả tươi lâu hơn

Ngoài ra chitosan còn được sử dụng để thay thế cho hàn the trong sản xuất bánh cuốn, giò chả

1.4.2.3 Trong y dược [1, 16, 38, 10]

Trong lĩnh vực y khoa, nhờ vào tính ưu việt của chitosan, cộng với đặc tính không độc, hợp với cơ thể, tự tiêu huỷ được nên chitosan đã được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm, làm thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, bảo vệ niêm mạc và chống đựợc cả bệnh ung thư Theo một số nhà khoa học thì chitosan có khả năng khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư

Qua thí ngiệm thực hiện trên 60 bệnh nhân tuổi từ 35-76 của nhóm các bác sĩ Bệnh viện K Hà Nội vào năm 2003 đã chứng minh, chitosan có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư Chitosan còn có khả năng chống viêm cấp trên mô lành

Một nghiên cứu của tiến sĩ Shadat Hosain- Khoa sinh hóa và sinh học phân tử thuộc đại học Jahangirnagar (Bangladet) đưa ra kết luận là chitosan có thể giúp hạn chế tăng cân và giảm lượng cholesterol trong máu Quan trọng hơn, khi được dùng như là nguồn bổ sung cho khẩu phần ăn kiêng thì chitosan còn làm giảm lượng cholesterol có lợi hơn là có hại

Những thuộc tính của chitosan cho phép nhanh chóng đóng cục máu và mới đây đã được Mỹ thừa nhận để sử dụng làm băng y tế So với các loại băng thường, tốc

độ cầm máu, tính sát khuẩn và thời gian lành mô khi sử dụng loại băng này có hiệu quả hơn gấp nhiều lần Một số chuyên gia ở Trung tâm Huyết học thuộc Viện hàn lâm

Y học Nga cũng đã phát hiện chitosan có thể ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ

Trong công nghệ bào chế thực phẩm, chitosan có thể dùng làm các chất phụ gia như làm tá dược độn, tá dược dính, chế tạo màng viêm nang, chất mang sinh học

dẫn thuốc… Viện hóa học thực phẩm trung TW2 đã tiến hành nghiên cứu thực nghiệm ứng dung chitosan làm tá dược dính trong một số công thức thuốc viêm có được chất

dễ bị tác động bởi các ion kim loại nặng

Chitosan được sử dụng làm phụ gia để dập viên thuốc, sản xuất màng bọc viên thuốc, màng da nhân tạo, chỉ khâu nhân tạo…

1.4.2.4 Trong nông nghiệp [4]

Công dụng đầu tiên của chitosan là chất kích thích tăng trưởng cho cây trồng

và là chất thúc đẩy khả năng của cây kháng lại một số loại nấm

Dung dịch muối chitosan trong nước đá được sử dụng để ngâm thóc giống, phun lên đồng ruộng lúa khi cây lúa chuẩn bị đẻ nhánh và chuẩn bị trổ đòng Năng suất lúa có thể tăng được 7 tấn/ha

Chitosan có tác dụng kích thích nảy mầm nhanh, tỉ lệ hạt nảy mầm cao với thóc, ngô, đậu tương Có tác dụng kích thích sinh trưởng cả khi xử lý hạt và phun trên

lá Chitosan diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu

Chitosan được sử dụng để bọc nang các hạt giống nhằm ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố định thuốc trừ sâu, phân bón, tăng cường khả năng nẩy mầm của hạt Hiện nay, chế phẩm Olygoglucosamin và Olygochitin đang được nghiên cứu tại Đại học Nha Trang

1.4.2.5 Trong công nghiệp sản xuất giấy [55]

Chitosan được ứng dụng rất sớm trong công nghiệp sản xuất giấy Các ứng dụng này bao gồm xử lý bề mặt giấy với dung dịch chitosan 1% để tăng sức cản gẫy

và sức bền gấp nếp mà không làm giảm độ sáng của giấy Phủ một lớp chitosan trên giấy để làm mất tác dụng do hiện tượng dẫn điện gây ra, mà tác dụng này có thể gây ra

sự giảm chất lượng màu

1.4.2.6 Trong công nghiệp mỹ phẩm [47]

Các ứng dụng của chitosan và các dẫn xuất trong mỹ phẩm đã được báo cáo tổng quát bởi Muzzerelli Ông chỉ ra rằng sử dụng chitosan có thể loại bỏ được phần tinh bột còn lại trong nước gội đầu Việc sử dụng nó còn làm cho tóc mềm, mượt thêm nhờ các tương tác giữa các polysaccarit và protein của tóc

Gần đây có nhiều báo cáo về việc sử dụng chitosan và dẫn xuất của nó trong

mỹ phẩm Với tính chất làm tăng độ bám dính các loại kem, làm mềm da, mịn da nên các hãng mỹ phẩm trên thế giới đã ứng dụng thành phần chitosan vào hàng loạt các sản phẩm của mình

1.4.3 Một số phương pháp thu nhận chitin - chitosan hiện nay

Hiệu quả thu hồi protein của phương pháp này không cao Tuy nhiên, quá trình này

đã loại bỏ một phần protein tự do trong đầu tôm vì vậy giảm thiểu được hóa chất sử dụng cho các công đoạn tiếp theo

1.4.3.2 Phương pháp hóa lý

Áp dụng phương pháp này nhằm thu hồi protein từ dịch thủy phân của công nghệ

sản xuất chitin- chitosan theo phương pháp hóa học và phương pháp sinh học Nguyên

lý dựa trên việc kết tủa protein bằng cách dùng axit để điều chỉnh pH dung dịch chứa protein về điểm đẳng điện của protein, sau đó dùng các phương pháp lắng, lọc để thu hồi protein

Phương pháp có ưu điểm dễ làm, đơn giản, có thể thu hồi với hiệu suất cao, cho phép thu hồi được hầu hết các protein hòa tan, do đó có thể ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của nhà máy chế biến thực phẩm, chế biến thủy sản. 

1.4.3.3 Phương pháp hóa học

Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc sử dụng HCl ở nhiệt độ phòng với

cơ chế như sau:

CaCO3 +2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O

Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4

Chitin có thể được sản xuất bằng phương pháp hóa học theo quy trình như sau

Phế liệu tôm tươi

↓

Khử protein

↓ Kiểm tra hàm lượng protein

↓ Khử khoáng

↓ Kiểm tra hàm lượng khoáng

↓ Chitin ● Ưu điểm: Thời gian xử lý vỏ tôm thu được chitin nhanh

● Nhược điểm:

Chitin thu được phụ thuộc nhiều vào qui trình xử lý với axit và kiềm mạnh để khử khoáng và protein Quá trình này tiêu tốn năng lượng, sản ra một lượng lớn nước thải chứa kiềm và axit gây ăn mòn và ô nhiễm mạnh, đồng thời rất khó tách các sản phẩm còn giá trị như: chất màu, protein…Nhưng điều quan trọng là tính ổn định của quá trình, mà từ đó dẫn đến sự thay đổi độ deaxetyl hóa và trọng lượng phân tử của chitin Tất cả các yếu tố trên dẫn đến giá thành của sản phẩm chitin và chitosan cao, nên sẽ bất lợi trong vấn đề thương mại

Dưới đây là một số các qui trình thu nhận chitin-chitosan bằng phương pháp hóa học

¾ Quy trình sản xuất chitin của Xí nghiệp Thủy sản Hà Nội

Phế liệu tôm ↓ Tách khoáng lần I

(HCl 4%, tỷ lệ w/w =1/2, t=24 giờ)

↓Rửa trung tính ↓

Tách protein lần I

↓Rửa trung tính

↓Tách khoáng lần II (HCl 4%, tỷ lệ w/w =1/2, t/gian=24 giờ)

↓Rửa trung tính

↓Tách protein lần II

↓Rửa trung tính

↓Tách khoáng lần III (HCl 4%, tỷ lệ w/w =1/2, t/gian=24 giờ)

↓Rửa trung tính

↓Sấy khô

↓ChitinChitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu.Tuy nhiên, lại có nhược điểm là thời gian sản xuất kéo dài, tiêu tốn nhân công, nồng độ hoá chất

sử dụng cao kết hợp với thời gian xử lý kéo dài ở công đoạn khử khoáng làm cắt mạch polyme trong môi trường axit dẫn đến độ nhớt giảm

¾ Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm Sú bằng phương pháp hóa học với một công đoạn xử lý kiềm (Trần Thị Luyến, 2003 )

Vỏ tôm tươi hoặc khô

↓Ngâm HCl

(HCl 10%, tỷ lệ w/v = 1/10,t0 phòng, τ = 5h)

↓ Khử protein và lipit (NaOH 40%, tỷ lệ w/v = 1/10,t0 = 80±2 0C, τ= 5h)

↓Rửa trung tính ↓

Ngâm HCl

↓ Chitosan Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có chất lượng không thua kém so với các quy trình thông thường với 2 giai đoạn xử lý kiềm Tổng thời gian cần thiết giảm rất nhiều và như vậy nếu so về mặt kinh tế thì đây là phương pháp tốt hơn hẳn Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là dung dịch NaOH đậm đặc sau khi deaxetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng

¾ Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm hùm của Pháp

Phế liệu tôm

↓ Khử protein

↓ Khử khoáng

↓ Loại màu (Chiết axeton: 10 phút, sấy khô, tẩy mầu, NaOCl 0,315%, t = 5 phút, tỷ lệ

w/v=1/10)

↓ Deaxetyl

rõ rệt Mặt khác, axeton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao Chưa kể đến các yếu tố an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất của nước ta hiện nay

1.4.3.4 Phương pháp sinh học

Trong phương pháp sinh học tại công đoạn khử protein và khử khoáng không sử dụng hóa chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men hoặc các enzym để loại bỏ protein và khoáng một cách triệt để Sản phẩm chitin thu được có chất lượng cao do không bị ảnh hưởng nhiều bởi hóa chất

Để loại bỏ protein người ta sử dụng vi khuẩn sinh protease [28, 65, 41, 56, 36, 54] hay chế phẩm protease [51, 29, 24, 40, 34] để loại protein, vi khuẩn lactic [61, 60, 48]

hay Bacillus [56, 54] để loại khoáng

♦ Sử dụng vi khuẩn sinh protease hay chế phẩm protease để loại bỏ protein ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm

Theo nghiên cứu của Jo, chủng Serratia marcescans FS-3 có thể khử tới 84% protein sau 7 ngày lên men Trong nghiên cứu khác của Oh [65], chủng Pseudomonas aeruginosa K-187 có thể loại được 78% protein cũng sau 7 ngày lên men Nghiên cứu của Sini chỉ ra rằng chủng Bacillus subtilis không những có thể loại được 84% protein

mà còn loại được tới 72% khoáng sau 12 ngày lên men Phương pháp dùng vi sinh vật

có ưu điểm là rẻ tiền do chỉ cần thêm nguồn cacbon là glucose, dextrose hay rỉ đường nhưng lại có nhược điểm là thời gian thường kéo dài

Một phương pháp sinh học khác loại protein cũng khá hiệu quả là phương pháp dùng chế phẩm protease Các chế phẩm enzym sử dụng khá đa dạng như trypsin, papain, pepsin [51], chymotrysin, pancreatin [29] nhưng có hiệu quả và hay sử dụng hơn cả là Alcalase [29, 24, 40, 34 ] Phương pháp enzym có ưu điểm là thời gian ngắn (trong vài giờ) và có thể thu hồi protein và asthaxatin có chất lượng cao làm thức ăn gia súc Tuy nhiên, phương pháp enzym có giá thành cao hơn so với phương pháp vi sinh

Nhược điểm chính của phương pháp sinh học là loại protein không triệt để Lượng protein dư còn lại trong vỏ tôm khi xử lí bằng phương pháp enzym thường >3% [29] trong khi bằng phương pháp hóa học có thể giảm đến <1%

♦ Sử dụng vi khuẩn lactic để loại khoáng ra khỏi phần vỏ của phế liệu tôm

Việc sử dụng vi khuẩn lactic để loại khoáng ra khỏi phế liệu tôm là một xu hướng

mà hiện nay nhiều nhà nghiên cứu quan tâm Trong quá trình lên men lactic, ở giai đoạn đầu vi khuẩn lactic và vi khuẩn khác hoạt động, số lượng vi khuẩn lactic chiếm

đa số Đồng thời với số lượng vượt trội vi khuẩn lactic sẽ hấp thu cơ chất, sinh trưởng phát triển và sinh ra axit lactic Axit lactic sẽ làm hạ pH và ức chế hoạt động của vi khuẩn gây thối rữa Thành phần canxi cacbonat trong vỏ tôm sẽ tác dụng với axit lactic để tạo ra lactat canxi ở dạng không hòa tan Phản ứng này tương tự như quá trình khử khoáng bởi HCl trong phương pháp hóa học Sơ đồ của phản ứng như sau:

Đồng thời trong quá trình này protein sẽ bị hóa lỏng do hệ enzyme proteolytic có sẵn trong nguyên liệu và do vi khuẩn lactic gây ra

Hall và De Silva (1994) đã đề xuất phương pháp khử khoáng đơn giản bằng việc lên men lactic như một phương pháp bảo quản phế liệu Phương pháp này là dạng ủ chua ban đầu được phát triển cho bảo quản phế liệu tôm panda trước quá trình chế biến ở khí hậu nhiệt đới Ủ chua là một quá trình đơn giản của việc bảo quản nguyên liệu tránh vi sinh vật gây thối và đã được ứng dụng cho bảo quản cá trong nhiều năm (Hall và De Silva, 1994) So với loại protein, phương pháp sinh học loại khoáng dùng

vi khuẩn lactic đạt hiệu quả khá cao, thường loại >90% khoáng [61] thậm chí có thể loại được đến 99.7% khoáng chỉ trong thời gian 2-3 ngày [66] So với loại khoáng bằng phương pháp hóa học, phương pháp lên men lactic ngoài việc cho chitin có chất lượng cao, thân thiện môi trường còn cho phép tận thu dịch lên men dùng làm thức ăn cho gia súc có giá trị Tuy vậy, nhược điểm của phương pháp là thời gian lên men kéo dài

Trong đa số các nghiên cứu, quá trình sinh học thường chỉ áp dụng cho 1 trong 2 quá trình khử protein hay khử khoáng Tuy vậy, một số các tác giả đã tìm cách dùng phương pháp sinh học hoàn toàn để lên men đồng thời vi khuẩn sinh protease và vi khuẩn tạo axit lactic để loại protein và khoáng đồng thời và đã cho hiệu quả khá cao

[59, 66] Tuy phương pháp này cho chitin chất lượng cao lại có nhược điểm là thời gian kéo dài và tốn công sức lao động và không loại được protein hoàn toàn Để khắc phục nhược điểm này, các nghiên cứu kết hợp phương pháp hóa học với sinh học đã được thực hiện

Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp nhiều khó khăn như giá thành sản phẩm có thể sẽ cao tùy thuộc vào loại enzym sử dụng, việc loại bỏ hoàn toàn protein

có thể đạt được bằng phương pháp hóa học nhưng không thể đạt được bằng phương pháp sinh học Tuy nhiên, bằng phương pháp sinh học, thể tích chất thải ra không lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzym có thể được thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipit, các sắc tố cũng được thu hồi Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lý môi trường

1.5 VI KHUẨN LACTIC

1.5.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic

Năm 1875, Pasteur chứng minh rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic [42] Năm 1873, lần đầu tiên

J.Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên Bacterium lactics (hiện nay gọi là Streptococcus lactic)

Năm 1998, Axelsson đã xem xét lại vi khuẩn lactic Ông cho rằng: "Vi khuẩn lactic là vi khuẩn gram dương, hô hấp yếm khí, dạng không bào tử, hình cầu hoặc hình que, chúng tạo ra axit lactic khi lên men hợp chất cacbonhydrat" Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn quan trọng nhất trong các quá trình lên men yếm khí thực phẩm, đang dùng lên men bột mì nhão ẩm, bia cỏ, các loại sữa lên men, tinh bột sắn và nhiều rau quả lên men (muối, chua ) Người ta cũng tìm thấy vi khuẩn lactic trong đất, trên bề mặt thực vật (chủ yếu là rau quả và các loại hạt) chúng sống từ các chất sinh trưởng tiết ra từ mô cây, trên da, trong tuyến nước bọt, ở niêm mạc và hệ tiêu hóa (nhất là ở đoạn ruột chuối) của người và một số gia súc, gia cầm

Các nghiên cứu về bacteriocin cho thấy, hầu hết các loài được phân lập từ đường ruột và các nguồn thịt có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn Đây là một đặc tính quý báu của vi khuẩn lactic hiện đang được đẩy mạnh, khai thác và đã ứng dụng có hiệu quả [37] Cho tới nay, đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng về vi

khuẩn lactic Nhờ khoa học kĩ thuật hiện đại, con người đã miêu tả một cách đầy đủ hơn về hình dáng cấu tạo, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn lactic

1.5.2 Đặc điểm của vi khuẩn lactic

1.5.2.1 Hình thái, sinh lí, sinh hóa của vi khuẩn lactic [39]

Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae Chúng không đồng

nhất về mặt hình thái, các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau Ngoài ra, hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào Tuy nhiên, về mặt sinh lí chúng tương đối đồng nhất Chúng đều là các vi khuẩn gram (+), không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết ra axit lactic Chúng không chứa các riboxom và enzym catalaza nên không phân giải trực tiếp peroxit thành nước và oxy

Hình 1.4- Vi khuẩn lactic [23]

      Một đặc điểm quan trọng là từng loại vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh

dưỡng rất phức tạp và khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ Mặc dù đường cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho sự chuyển hóa vi khuẩn lactic vẫn đòi hỏi các nhân tố phát triển khác như photphat, lưu huỳnh, vitamin, muối vô cơ, axit amin, lipit những chất này phải có trong môi trường lên men

1.5.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic

Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng bao gồm nhiều giống khác nhau Dưới họ, có một

số cách phân loại khác nhau dựa vào các đặc tính lên men, nhiệt độ phát triển, hình

thái và cách sắp xếp tế bào Tùy thuộc vào hình dạng tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành dạng hình cầu và hình que Kích thước chúng thay đổi tùy từng loài

● Giống Streptococcus có dạng hình tròn hoặc hình ovan, đường kính tế bào

0,5-1µm Sau khi phân chia theo một phương chúng thường xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc chuỗi ngắn

● Giống Leuconostoc có hình dạng hơi dài hoặc hình ovan, đường kính từ

0,5-0,8µm và chiều dài khoảng 1,6µm Trong một số điều kiện chúng cũng có dạng hình hơi tròn, chiều dài khoảng 1-3µm Sau khi phân chia chúng thường sắp xếp thành chuỗi, không tạo thành đám tập trung

● Giống Lactobacillus có hình dạng que Tùy vào điều kiện của môi trường sống

mà hình dạng của chúng thay đổi từ hình que ngắn đến dài Sắp xếp thành chuỗi hay đứng riêng lẻ

● Giống Pedicoccus là những hình tứ cầu khuẩn hoặc song cầu khuẩn Có hoạt tính

thủy phân protein rất yếu

● Giống Bifidobacterium là những trực khuẩn, khi mới phân lập có thể phân nhánh

dạng chữ Y, V và tập hợp thành khối Sau nhiều lần cấy truyền chúng trở thành dạng trực khuẩn dạng thẳng hoặc hơi uốn cong [5]

Dựa vào sản phẩm sinh ra trong quá trình lên men, người ta chia vi khuẩn lactic thành hai nhóm: nhóm vi khuẩn lên men lactic điển hình (đồng hình) và nhóm vi khuẩn lên men lactic không điển hình (dị hình)

● Vi khuẩn lên men lactic đồng hình sản sinh 85- 90% axit lactic Do thiếu hụt porphyrin và cytocrom, không có chuỗi vận chuyển electron nên chúng thu năng lượng bằng con đường lên men bắt buộc

● Vi khuẩn lên men lactic dị hình sản sinh 50% lactic, 25% etylic, 25% axit

Do tạo nhiều axit lactic trong quá trình lên men nên chỉ có nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp

1.5.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic

1.5.2.3.1 Nhu cầu dinh dưỡng

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất dinh dưỡng rất phức tạp, không một đại diện nào của chúng có thể phát triển trên môi trường muối khoáng thuần khiết chứa glucoza và

nicotinic, axit folic, biotin ) và các axit amin trong quá trình sinh trưởng và phát triển [8] Vì vậy, môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic thường chứa một lượng lớn các chất cung cấp axit amin và vitamin như: cao nấm men, peptone Ngoài ra, để tăng cường khả năng sinh trưởng phát triển của vi khuẩn lactic, người ta còn bổ sung các muối khoáng (Mn2+, Mg2+, Fe3+ )

● Nhu cầu dinh dưỡng cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza ( glucoza, fructoza, manoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin) Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit malic, pyruvic, fumaric, axetic Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng các các axitamin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn

khuẩn khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau

● Nhu cầu dinh dưỡng Nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic không thể tự sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ Vì vậy, để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô vơ

Chính vì vậy, nguồn dinh dưỡng là các axit amin, trong môi trường nuôi cấy người

ta còn bổ sung các hợp chất chứa nitơ như: pepton, cao thịt, cao nấm men [50] Nhưng nếu trong môi trường chứa quá nhiều các axitamin và protein thì nó sẽ ức chế quá trình trao đổi chất của vi khuẩn lactic, do các hợp chất này tạo thành hệ keo bám

lên bề mặt tế bào, làm giảm bề mặt trao đổi chất của tế bào với môi trường dinh dưỡng [37]

● Nhu cầu vitamin

Vitamin đóng vai trò là các coenzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào nên rất cần thiết cho hoạt động sống Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin Vì vậy, cần bổ sung vào môi trường các loại vitamin Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết khoai tây, ngô, cà rốt hay dịch

tự phân nấm men [50] Nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic cũng có thể thay đổi, nó phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy Các yếu tố có tác động mạnh đến nhu

trường [52]

● Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác

Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ như: adenin, hypoxantin, guanin, uraxin, thimin, thimidin và các axit hữu cơ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit xitric, axit oleic [31] Nên hiện nay người ta sử dụng các muối xitrat, dẫn xuất của axit oleic, làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic Vì vậy, người ta bổ sung Tween 80 một dẫn xuất của axit oleic vào môi trường nuôi cấy

Axit axetic cũng có những tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào Nên người ta thường sử dụng axit axetic dưới dạng các muối axetat đế làm chất đệm cho môi trường khi nuôi cấy vi khuẩn lactic

● Nhu cầu các muối vô cơ khác

Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các muối

vô cơ Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, magie đặc biệt là mangan

Mangan không chỉ có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của tế bào mà còn kích thích khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic [43] Mangan và magie tham gia vào cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của một số enzym, giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy, ổn định cấu trúc tế bào Mangan tham gia vào việc

ổn định riboxom và kéo dài pha tĩnh của vi khuẩn lactic Magie kích thích vi khuẩn lactic lên men các loại đường

1.5.2.3.2 Điều kiện nuôi cấy

● Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến các phản ứng enzym của tế bào vi sinh vật Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng Một số loài có thể phát

● Ảnh hưởng của oxi [57]

Oxy là một trong các yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi

sự phân bố hệ enzym hô hấp trong tế bào chất (nước chiếm trên 80%) Đặc biệt vi khuẩn lactic là vi khuẩn yếm khí tùy tiện Nhưng trong quá trình nuôi cấy với mục đích thu hồi sinh khối, vi khuẩn lactic vẫn cần hô hấp để sinh trưởng và phát triển Vì thế, trong nuôi cấy ta cần kiểm tra khả năng sử dụng oxy để từ đó cung cấp oxy cho phù hợp sao cho tốc độ hòa tan nó bằng tốc độ tiêu thụ của vi sinh vật

● Ảnh hưởng của pH

hoặc gián tiếp đến sự trao đổi chất và phát triển của vi khuẩn Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn lactic có thể bị ức chế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Chính vì vậy, trong quá trình lên men lactic khi axit lactic tích lũy đủ lớn thì ức chế luôn cả hoạt động của vi khuẩn lactic (pH< 3.8) Nói chung quá trình lên men sẽ dừng lại khi pH đạt giá trị 4,0 Các vi khuẩn lactic khác nhau sẽ thích hợp với khoảng pH khác nhau

● Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu [27]

Áp suất thẩm thấu của môi trường tỷ lệ với nồng độ chất khô hòa tan trong môi trường Màng tế bào của vi khuẩn Gram (+) là màng bán thấm nên nồng độ muối có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phát triển của tế bào Nếu trong môi trường có nồng

độ muối lớn, tế bào sẽ bị mất nước, chịu trạng thái khô sinh, co nguyên sinh chất và sẽ

bị chết nếu kéo dài Ngược lại, nếu nồng độ muối trong môi trường thấp, nước sẽ xâm nhập vào trong tế bào làm áp lực tăng lên Vi khuẩn lactic có thể bị ức chế nếu nồng

độ muối > 5% Tuy nhiên, một số loài có khả năng chịu được nồng độ muối cao hơn

Có thể tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của vi khuẩn lactic nếu bổ sung ion K+, gluxit hoặc axit amin

1.5.3 Quá trình lên men lactic của vi khuẩn lactic

Để thực hiện việc trao đổi chất và năng lượng, vi khuẩn lactic buộc phải tiến hành quá trình lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hóa kị khí đường thành axit lactic Tùy từng loại, từng nhóm vi khuẩn lactic khác nhau mà quá trình lên men lactic xảy ra theo phương thức lên men đồng hình hay lên men dị hình hoặc kết hợp cả hai phương thức trên

Trong lên men đồng hình thực tế chỉ xuất hiện axit lactic, còn trong lên men dị hình

lên men đồng hình là có ý nghĩa về mặt công nghiệp

1.5.3.1 Lên men lactic đồng hình

Các vi khuẩn lên men lactic đồng hình phân giải đường theo con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas path way), chúng chứa các enzym cần thiết cho sự phân giải này, kể cả enzym aldolaza Hidro xuất hiện trong phản ứng loại hidro của triphotphat sẽ được chuyển cho piruvat

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + Q

Tùy thuộc vào tính chuyển hóa không gian của enzym xúc tác cho phản ứng này, lactatdehidrogenaza, và tùy thuộc vào sự tồn tại của một enzym lactat-raxemara mà có thể xuất hiện các dạng axit dạng D(-), L(+) hay DL Chỉ có một phần nhỏ pyruvat

axeton Mức độ tạo thành các sản phẩm phụ này rõ ràng là phụ thuộc vào sự có mặt của oxy

1.5.3.2 Lên men lactic dị hình

Các vi khuẩn lactic dị hình thiếu các enzym chủ yếu của con đường EMP, đó là aldolaza và trioxophotphatizomeraza Vì thế, giai đoạn đầu của sự phân giải glucose xảy ra theo con đường PP tức là qua glucose-6-photphat, 6-photphatgluconat và rubuloza-6-photphat Chất này nhờ một enzym epimeraza được chuyển thành xiluloza-

5 photphat và sau đó trong một phản ứng phụ thuộc tiaminpirophotphat và axetylphoyphat Sự oxy hóa trioaza thành axit lactic xảy ra giống như trong sự lên men đồng hình, còn axetyl photphat có thể được chuyển hóa thành etanol hoặc axetic [7]

1.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHTIN-CHITOSAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.6.1 Trên thế giới

Từ những năm 30 của thế kỷ XX, việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính

chất hoá lý và ứng dụng của chitin, chitosan đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, cả lĩnh vực sinh học và đạt hiệu quả cao

Hãng Kyowa Oid và Fat của Nhật Bản (1972) lần đầu tiên đưa vào công nghệ sản xuất chitin Viện kỹ thuật Masachusetts của Mỹ (1977), khi tiến hành xác định giá trị của chitin và protein trong vỏ tôm, cua, đã cho thấy việc thu hồi các chất này rất có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần chitin thu được được dùng để sản xuất ra các dẫn xuất khác

Năm 1986, những công ty của Nhật Bản đã sản xuất được 1270 tấn chitin Trong đó

1170 tấn dùng trong sản xuất chitosan, 60 tấn phục vụ sản xuất D-glucosamin và oligosaccharit và 40 tấn là chitin Tiêu thụ 700 tấn trong đó 500 tấn dùng trong xử lý nước thải, 10 tấn dùng trong mỹ phẩm, sản xuất thức ăn và thực phẩm và 100 tấn dùng trong các mục đích khác

Năm 1990, sản lượng chitosan trên thế giới vào khoảng 1200 tấn Hiện nay, đi đầu trong lĩnh vực sản xuất chitin-chitosan là Nhật Bản, đã sản xuất 600 tấn/năm, Mỹ 400 tấn/ năm Ngoài ra, còn có các nước như Trung Quốc, Pháp, Ấn Độ cũng đã sản xuất

và ứng dụng chitin, chitosan

Hiện nay, có khoảng 10 công ty lớn sản xuất chitin-chitosan trên thế giới, hầu hết các công ty này đều ở Nhật Công ty Protan, Biopolymer, một trong những công ty lớn trên thế giới sản xuất chitin-chitosan đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc chitosan sử dụng thích hợp để xử lý nước, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và nhiều

ứng dụng khác trong nông nghiệp

1.6.2 Ở Việt Nam

Việc nghiên cứu sản xuất chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất, phục

vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới ở nước ta Năm 1978, trường Đại học Thủy sản bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin-chitosan của Đỗ Minh Phụng

Trước yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản đang ngày càng cấp bách, trước những thông tin khoa học, kỹ thuật mới về chitosan, cũng như tiềm năng thị trường của chúng, đã thúc đẩy các nhà khoa học nước ta bắt tay nghiên cứu và hoàn thiện quy trình sản xuất chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng trong các lĩnh vực khác nhau

Gần đây, khi chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có giá trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu như: Trường Đại học Thủy sản, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Đại học Tổng hợp Thành Phố Hồ Chí Minh…đã tập trung vào nghiên cứu và ứng dụng công nghệ này Tuy nhiên, chất lượng sản xuất và ứng dụng của nó chưa được đánh giá đầy đủ

Ở phía Bắc, Viện khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy Đặc Sản Hà Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình và có hiệu quả bước đầu

Ở phía Nam, Trung tâm công nghệ sinh học Thủy Sản phối hợp với một số cơ quan khác: Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh, Phân viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học Nông nghiệp Miền Nam đã và đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin-chitosan trong các lĩnh vực: nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm

Ở Trung Bộ, Trường Ðại học Thủy sản Nha Trang đã nghiên cứu mở rộng đối tượng sản xuất chitosan trên vỏ tôm, vỏ cua, mai mực, hoàn thiện công nghệ sản xuất chitosan

Các sản phẩm này đã được thử nghiệm đạt chất lượng tốt Trường Ðại học Thủy sản Nha Trang đã bước đầu nghiên cứu sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Vỏ và đầu tôm thẻ được thu nhận từ vùng biển Nam Định Phế liệu tôm đã được rửa

sạch loại bỏ tạp chất ( rác, phần protein thối rữa )

- Sử dụng 6 chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum NCDN4, BNC1, LTM1,

MT1,G3 và BC51 được cung cấp bởi Phòng vi sinh- Viện Công nghiệp Thực phẩm

- Enzym Protease : Neutrase 0,8 L được chiết suất từ Bacillus amyloliquefaciens (của

hãng Novozym, Đan Mạch)

- Rỉ đường

2.1.2 Thiết bị dùng cho thí nghiệm

▪ Bình ổn nhiệt ( Baths- Trung Quốc)

▪ Máy li tâm ( EBA 20- Hettich Zentrifugen- Đức)

▪ Cân điện tử ( Max = 600g ; d=0,01g Denver Instrumen -Đức)

▪ Máy khuấy từ ( Velp Scientifica )

▪ Vortex ( Stuart Biocote - Đức)

▪ Máy đo quang ( Genesys 20 Thermo Spectronic - Mỹ)

▪ Máy xay ( Philips)

▪ Máy đo pH ( Hanna Instruments pH 211 Microprocessor)

▪ Nổi thanh trùng ( Nga)

▪ Tủ nuôi tĩnh ( Boxun- Trung Quốc)

▪ Máy đốt tro ( Barntead 48000)