Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic trong sản xuất xúc xích lên men

Còn sản phẩm xúc xích lên men trên thế giới đa số được sản xuất công nghiệp hóa và có bổ sung chế phẩm LAB - được tuyển chọn làm chủng khởi động, ngoài mục đích định hướng quá trình lên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS PHAN THANH TÂM

Hà Nội - 2011

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo

TS Phan Thanh Tâm đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình học

tập và nghiên cứu

Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm- Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho việc học tập, nghiên cứu của em tại trường

Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn yêu thương tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành đề tài

Hà Nội, tháng năm 2011

Tác giả

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1 LAB Lactic acid bacteria

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các thành phần dinh dưỡng của các sản phẩm thịt lên men 11

Bảng 1.2 Vai trò, chức năng của VSV có lợi trong chế biến thịt lên men 24

Bảng 2.1 Nguyên liệu phụ tính cho 1kg nguyên liệu 39

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc của chủng vi khuẩn lactic 40

Bảng 3.2 Đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn lactic 40

Bảng 3.3 Khả năng lên men của các chủng ở nhiệt độ khác nhau 41

Bảng 3.4 Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic 44

Bảng 3.5 Độ ẩm, mật độ sống sót và tỷ lệ sống sót của chế phẩm sau sấy 45

Bảng 3.6 Cảm quan các mẫu salami lên men có hàm lượng glucoza khác nhau 46

Bảng 3.7 Cảm quan các mẫu salami lên men có hàm lượng NaCl khác nhau 47

Bảng 3.8 Sự đánh giá cảm quan của các mẫu salami lên men bổ sung lượng chủng khác nhau 49

Bảng 3.9 Đánh giá cảm quan chung của các mẫu XXLM-Sa 51

Bảng 3.10 Các chỉ tiêu lý hóa của sản phẩm sau 96h 53

Bang 3.11 Chỉ tiêu VSV của sản phẩm sau 96h 53

Bảng 3.12 Bảng phân tích ANOVA 58

Bảng 3.13 Chi phí thực nghiệm sản xuất XXLM –Sa có bổ sung chủng 64  

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1.Một số hình ảnh SP thịt lên men trên thế giới và ở Việt Nam 8

Hình 1.2 Một số hình ảnh các sản phẩm thịt lên men trên thế giới 10

Hình 1.3 Qui trình công nghệ sản xuất xúc xích lên men 12

Hình 1.4 Sự biến đổi sinh hóa của các chất trong quá trình lên men 16

Hình 1.5 Hình ảnh một số chủng VSV làm chủng cấy trong thịt lên men 24

Hình 2.1 Đường chuẩn xác định axit amin tự do 35

Hình 2.2 Đường chuẩn xác định axit amin tự do 37

Hình 3.1 Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn lactic 40

Hình 3.2 Ảnh tế bào của các chủng vi khuẩn lactic 41

Hình 3.3 Khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng khi có 2% NaCl và 200ppm NaNO2 42

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng của các chủng khi không có 2%NaCl 42

và 200ppmNaN02 42

Hình 3.5 Khả năng lên men của các chủng vi khuẩn lactic có 2%NaCl 43

và 200ppm NaNO 2 43

Hình 3.6 Khả năng lên men của các chủng vi khuẩn lactic 43

không có 2%NaCl và 200ppm NaNO2 43

Hình 3.7 pH của các mẫu salami lên men có hàm lượng glucoza khác nhau 46

Hình 3.8 pH của các mẫu salami lên men có hàm lượng NaCl khác nhau 47

Hình 3.9 Sự biến đổi pH của các mẫu salami lên men 49

Hình 3.10 Sự biến đổi pH của các mẫu XXLM-Sa 50

Hình 3.11 Hàm lượng Enterobacteriacea của các mẫu salami lên men 51

Hình 3.12 Lượng S.aureus của các mẫu salami lên men 51

Hình 3.13 Lượng vi khuẩn lactic của các mẫu salami lên men 52

Hình 3.14 Sự thay đổi pH trong thời gian bảo quản 55

Hình 3.15 Sự thay đổi hàm ẩm trong thời gian bảo quản 55

Hình 3.16 Sự thay đổi NH3 của các mẫu XXLM trong thời gian bảo quản 55

Hình 3.17 Sự thay đổi S.aureus trong thời gian bảo quản 56

Hình 3.18 Sự thay đổi Enterobacteriace trong thời gian bảo quản 56

Hình 3.19 Điểm cảm quan theo thời gian bảo quản 56

Hình 3.20 Sơ đồ bố trí thị nghiệm điều tra thị hiếu 58

Hình 3.21 Mức độ ưa thích chung 59

Hình 3.22 Mức độ ưa thích về mùi 59

Hình 3.23 Mức độ ưa thích về vị 60

Hình 3.24 Mức độ ưa thích về màu sắc 60

Hình 3.25 Mức độ ưa thích về cấu trúc 61

Hình 3.26 Quy trình sản xuất XXLM 62

MỞ ĐẦU

Xúc xích lên men là sản phẩm xuất hiện từ rất lâu trên thị trường thế giới như Salami (của Ý), Summer (của Mỹ), Pepperoni (Tây Ban Nha), Nham (của Thái Lan), Đó là hỗn hợp thịt được nghiền nhỏ, phối trộn với các gia vị, phụ gia và được lên men tự nhiên hoặc cấy chủng, sau đó được sấy khô, làm chín hoặc hun khói Ở Việt Nam, thịt lên men được biết là sản phẩm nem chua – một sản phẩm thịt lên men truyền thống gần giống như xúc xích lên men

Tuy nhiên, hệ VSV lên men trong sản phẩm nem chua là hệ VSV tự nhiên, không được phân lập, tuyển chọn mà nhờ kinh nghiệm sản xuất nên chất lượng sản phẩm không ổn định và có nguy cơ không đảm bảo VSATTP cho người tiêu dùng Còn sản phẩm xúc xích lên men trên thế giới đa số được sản xuất công nghiệp hóa

và có bổ sung chế phẩm LAB - được tuyển chọn làm chủng khởi động, ngoài mục đích định hướng quá trình lên men, ổn định chất lượng sản phẩm còn cung cấp một lượng lớn vi khuẩn có lợi cho cơ thể

Hiện tại ở Việt Nam sản phẩm này hầu như chưa có trên thị trường do công nghệ sản xuất đòi hỏi khắt khe, đặc biệt là quá trình lên men và làm chín dài ngày Thêm vào đó nguồn nguyên liệu thịt ở Việt Nam hiện đang có rất nhiều nguy cơ mất an toàn, nhiễm các VSV gây bệnh, gây hại do quá trình giết mổ, vận chuyển, bảo quản thủ công Do vậy, công nghệ sản xuất theo quá trình lên men tự nhiên sẽ rất khó khăn trong việc kiểm soát chất lượng Chính vì vậy, công nghệ sản xuất sản phẩm này đòi hỏi việc bổ sung chủng khởi động nhằm định hướng và kiểm soát quá trình lên men và đồng thời đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng Hướng đi phát triển sản phẩm mới trên thị trường Việt Nam - xúc xích lên men dạng Salami bổ sung chủng khởi động LAB (Start cultures) đã phần nào đáp ứng mong muốn phát triển sản phẩm mới nhằm đa dạng hóa sản phẩm từ thịt, nâng cao

chất lượng VSATTP, chính vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng

chế phẩm vi khuẩn lactic trong sản xuất xúc xích lên men.”

Tính mới của đề tài : Sản phẩm xúc xích lên men (dạng Salami) gần như chưa

có mặt ở thị trường Việt Nam Việc nghiên cứu lựa chọn nguồn chủng giống vi khuẩn lactic thích hợp làm chủng khởi động cũng như các yếu tố công nghệ phù hợp sẽ phát triển một dạng sản phẩm thịt cao cấp ở Việt Nam, không chỉ chứa đầy

đủ các chất dinh dưỡng đảm bảo VSATTP mà còn là nguồn thực phẩm chức năng

quý báu bởi sản phẩm này còn cung cấp một hệ VSV có lợi “probiotic” cho người tiêu dùng Rất phù hợp với các hướng nghiên cứu hiện tại trên thế giới đó là muốn cung cấp hệ VSV có lợi probiotic cho cơ thể thông qua các sản phẩm thực phẩm

Khả năng áp dụng của đề tài: Thành công của đề tài sẽ được áp dụng tại cơ sở

sản xuất, chế biến thịt với mục đích phát triển sản phẩm mới tương đối, cung cấp thực phẩm chức năng Việc sản xuất thực phẩm thịt dạng lên men có bổ sung probiotics đang là sự quan tâm của rất nhiều các nhà khoa học trong nước cũng như trên thế giới Thành công của đề tài sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về lĩnh vực này

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Thực phẩm lên men, thịt lên men

1.1.1 Giới thiệu

Thực phẩm lên men là thực phẩm được chế biến, bảo quản bằng sự lên men bởi enzym nội tại của nguyên liệu hay từ VSV được bổ sung Phần lớn thực phẩm lên men được lên men bởi vi khuẩn lactic (LAB-lactic acid bacteria) như sữa chua, kim chi (Hàn Quốc), Nham (Thái Lan), nem chua, dưa chua (Việt Nam),…

Thực phẩm lên men đã được chứng minh là tốt cho sức khỏe vì chứa các thành phần dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe là probiotic và prebiotic, tạo ra trạng thái cân bằng hệ VSV đường ruột từ đó nâng cao khả năng chuyển hóa, tiêu hóa và ngăn ngừa bệnh tật của vật chủ

Lịch sử bảo quản thịt bằng lên men có từ hàng ngàn năm (lên men tự nhiên) Sự cấy chủng bắt đầu bởi Jensen và Paddock năm 1940 cho xúc xích khô, các chế

phẩm đầu tiên là Pediococcus cerevisae thuần khiết (1955) ở Mỹ bởi Niven Niinivaara (1955) đã ứng dụng Micrococcus M53 ở châu Âu và sau đó Numi (1966)

đã kết hợp Micrococcus với Lactobaccillus spp, Pediococcus acidilactici, P pentosaceus, Staphylococcus xylosus hay S camosus thuần khiết hoặc là hỗn hợp

của chúng cho thịt lên men.[21]

Lịch sử ra đời thịt lên men ở châu Âu hay Trung Quốc đến từ rất lâu (cách đây khoảng 2000 năm) xuất phát từ quá trình bảo quản tự nhiên thịt

Thịt lên men là quá trình “chín sinh hóa” của thịt nhờ vai trò của các enzym có trong thịt và của hệ VSV

Bản chất là quá trình lên men lactic và qúa trình thủy phân protein, lipit thịt tạo

ra sản phẩm có hương vị rất đặc trưng

Xúc xích lên men là sản phẩm đã xuất hiện trên thế giới như Pepperoni (của Tây Ban Nha), Summer (của Mỹ), Salami (của Ý), Nham (của Thái Lan), Ở Việt Nam chúng ta chỉ biết đến nem chua – một sản phẩm lên men truyền thống gần giống như xúc xích lên men Tuy nhiên, nem chua khác với xúc xích sản phẩm được bao gói trong lá chuối chứ không nhồi trong các loại vỏ bao xúc xích Và công nghệ sản xuất sản phẩm này vẫn mang tính thủ công truyền thống, quá trình lên men tự nhiên nên chất lượng sản phẩm không đồng đều và nguy cơ không đảm bảo VSATTP

Nem chua (Việt Nam) Pepperoni (Tây Ban Nha) Salami (Ý)

Hình 1.1.Một số hình ảnh SP thịt lên men trên thế giới và ở Việt Nam

Ở Châu âu, xúc xích lên men tự nhiên có truyền thống lâu đời được bắt nguồn từ các quốc gia Địa Trung Hải trong suốt thời đại La Mã Sau đó các sản phẩm này được lan rộng ra các nước như Đức, Hungary, và một số các quốc gia khác như Mỹ, Argentina, và Úc Hiện nay, Châu Âu vẫn là quốc gia sản xuất và tiêu thụ xúc xích khô lên men lớn nhất

Trên thị trường Châu Âu có rất nhiều loại sản phẩm xúc xích khô lên men được bắt đầu từ sự thay đổi về nguyên liệu ban đầu, công thức phối trộn, và quá trình sản xuất đã tạo nên những thói quen và phong tục cho các vùng miền, quốc gia khác nhau Nhưng từ một quan điểm của thế giới có hai phạm trù có thể được phân biệt như sau:

Các sản phẩm ở Miền Bắc và các vùng Địa Trung Hải có một vài tính chất đặc trưng riêng Các sản phẩm miền bắc tốc độ axit hóa bởi vi khuẩn axit lactic cho một giá trị pH dưới 5 và sự hun khói được đảm bảo là an toàn, cải thiện một phần sức khỏe và đóng góp lớn trong việc đảm bảo chất lượng của sản phẩm

Các sản phẩm ở vùng Địa Trung Hải tốc độ axit hóa đạt được ở giá trị pH cuối cùng trên 5 Sự an toàn và đảm bảo sức khỏe một cách chắc chắn chủ yếu là bởi quá trình sấy và hoạt độ nước thấp

Theo Zeuthen (1995), thịt được bảo quản và lên men dựa trên vi khuẩn lactic tự nhiên trong thịt (Lactic Acid Bacteria - LAB), một lượng nhỏ nitrat và một lượng lớn muối Khi mà nhu cầu về thịt lên men sau chiến tranh thế giới II tăng lên, những nghiên cứu về chủng khởi động nhằm đảm bảo chất lượng cho quá trình lên men được đặt ra

1.1.2 Định nghĩa, phân loại xúc xích lên men (XXLM)

1.1.2.1 Định nghĩa[21]

XXLM là một dạng nhũ tương của thịt đã xay nhuyễn và các phần tử chất béo, muối và các gia vị khác Hỗn hợp được phối trộn sau đó được nhồi trong vỏ bao, tiếp đó được lên men và làm chín

Xúc xích lên men có các tính chất đặc trưng về mùi, vị, cấu trúc, mầu sắc thông qua quá trình lên men dưới tác động điều kiện vật lý, hóa học của hỗn hợp thịt được chứa trong vỏ bao

Bảo quản lạnh, tiêu thụ trong 1 - 2 ngày

(Nem chua Việt Nam xếp vào nhóm này)

™ Nhóm bán khô (semi-dried): có thể thái lát, thời gian sản xuất ngắn (short processed)

Ví dụ: Summer sausage, Salami, Holsteiner, Cervelat (Zervelat), Chorizo (của

Tây Ban Nha), Tuhringer

Đặc điểm:

Thời gian sản xuất 1 - 4 ngày

Sấy khô bằng nhiệt nên đã loại bỏ được 8 - 30% ẩm

9 Mức aw: 0,92 - 0,94

Sản phẩm này bao gói sau khi lên men hoặc gia nhiệt Nhìn chung là thường hun khói trong suốt quá trình lên men

™ Nhóm sấy khô (dried): thời gian chín dài (long ripening)

Ví dụ: Salami khô hoặc cứng (của Ý, Đức, Hungary), saucission (của Pháp), pepperoni ( của Châu âu, Bắc mĩ, Úc)

Sản phẩm này có sử dụng chủng giống thương mại

Ở Mỹ sản phẩm này có nhiệt độ lên men 15 - 35ºC trong thời gian 1 – 5 ngày Sản phẩm không hun khói hoặc hun khói nhẹ Do hoạt động của vi khuẩn, giá trị pH giảm xuống còn 4,7 – 5,3 ( axit lactic 0,5 – 1%; độ chua tổng số 1,3%) nhờ đó, tạo điều kiện cho quá trình sấy khô bởi protein biến tính, kết quả sản phẩm có cấu trúc rắn chắc

Ở Châu Âu, hoạt động của vi khuẩn làm giảm pH xuống còn 5,3 – 5,6 làm cho sản phẩm có hương vị nhẹ hơn so với sản phẩm của Mỹ

Thời gian sản xuất từ 12 – 14 tuần

Sản phẩm này có hương thơm ít hơn sản phẩm bán khô (Semidry)

Mettwurst sausage Summer sausage Salami của hungari

Hình 1.2 Một số hình ảnh các sản phẩm thịt lên men trên thế giới

Bảng 1.1 Các thành phần dinh dưỡng của các sản phẩm thịt lên men [15]

1.2 Công nghệ sản xuất XXLM có sử dụng chủng khởi động

1.2.1 Quy trình công nghệ sản xuất XXLM

1.2.1.1.Sơ đồ quy trình XXLM[15],[20]

Hình 1.3 Qui trình công nghệ sản xuất xúc xích lên men

Nguyên liệu (Thịt lợn, thịt bò, mỡ lợn

Chế phẩm VSV Thái, xay

Nguyên liệu phụ  Phối trộn

Sản phẩm hoàn thiện

1.2.1.2 Thuyết minh quy trình

™ Lựa chọn nguyên liệu

Thịt từ con vật trưởng thành, khoẻ mạnh Thịt bò nên có pH tối thiểu 5,4 – 5,5

Và thịt lợn nên có pH tối thiểu 5,7 – 5,8

Mỡ lợn thường chọn loại mỡ cổ (mỡ gáy) tạo cấu trúc tốt cho sản phẩm

™ Nghiền, xay nhuyễn và phối trộn

Có rất nhiều cách nghiền, xay nhuyễn và phối trộn khác nhau đối với xúc xích

bán khô và xúc xích khô Mức độ xay to nhỏ phụ thuộc vào từng loại xúc xích

Thịt bò thì thường xay trước rồi sau đến thịt lợn và sau cùng là các nguyên liệu phụ Muối được bổ sung cuối cùng trong quá trình xay

™ Nhồi vào vỏ bao

Thịt sau khi được xay nhuyễn, phối trộn thì được đưa đi nhồi vào vỏ bao Nhồi làm sao cho lượng không khí trong thanh xúc xích là ít nhất vì không khí sẽ làm ôi hoá chất béo nên ảnh hưởng xấu đến màu sắc và làm giảm thời gian sử dụng của xúc xích

Vỏ bao bao gói xúc xích thường là ruột động vật đã được xử lý Động vật thường được lấy ruột là lợn và cừu Có thể sử dụng vỏ bao nhân tạo có bản chất gelatin hay

collagen

™ Quá trình lên men

Quá trình lên men có thể được coi là công đoạn quan trọng mà trong đó sự phát triển và sự chuyển hóa đường glucoza thành axit lactic của chủng LAB xảy ra kèm theo sự giảm pH rất nhanh Tuy nhiên, cần phải hiểu rõ rằng những biến đổi quan trọng khác cũng diễn ra trong giai đoạn này, hơn nữa sự phát triển của LAB thường tiếp tục trong quá trình làm khô và hun khói của loại xúc xích bán khô Trong trường hợp của xúc xích khô, quá trình lên men xảy ra cùng lúc với giai đoạn đầu của quá trình làm khô và hoạt tính của enzim VSV vẫn tồn tại thậm chí cả khi các điều kiện không cho phép sự phát triển của VSV

Công đoạn lên men có thể là lên men tự nhiên và lên men có bổ sung chủng

- Quá trình lên men tự nhiên:

Quá trình này phụ thuộc hoàn toàn vào sự có mặt của LAB trong nguyên liệu

thịt tươi

LAB xuất hiện trong thịt là điều bất biến nhưng ban đầu với số lượng thấp, trừ phi thịt được bảo quản một thời gian trong các túi chân không Sự lựa chọn các điều kiện ban đầu ngăn cản quần thể VSV Gram (-) nổi trội trong thịt và các vi khuẩn

sinh hương Gram (+) bao gồm Micrococcus và các loài Staphylococcus coagulase

dương và âm, cũng như các loại LAB Người ta chứng minh rằng quá trình lên men

theo thứ tự bắt đầu là các loài Enterobacteriaceae, tiếp theo là Enterococcus và cuối cùng là Lactobacillus và Pediococcus.[15]

Ở những loại xúc xích có bổ sung nitrat mà không có mặt của nitrit thì các loại vi khuẩn có thể phát triển rộng hơn và điều này làm cải thiện chất lượng của xúc xích lên men khô một cách rõ rệt Với những loại xúc xích được lên men theo đúng công nghệ thì LAB phát triển nhanh và đạt mức 106-108CFU/g sau 2-5 ngày lên men Sự

giảm giá trị pH tương ứng làm cho chủng Pseudomonas và các loại cầu khuẩn gram

âm nhạy cảm với axit khác bị tiêu diệt trong vòng 2-3 ngày, mặc dù có nhiều loài có

thể chống chịu axit hơn như Salmonella, có thể tồn tại trong thời gian dài Số lượng

LAB có xu hướng giảm sau khi đạt được cực đại, mặc dù trong các loại xúc xích được chín bởi nấm mốc thì thời kỳ thứ hai của quá trình sinh trưởng thường diễn ra khoảng sau 15 ngày trùng với sự tăng giá trị pH do sự chuyển hóa lactate Sự trì hoãn quá trình lên men lactic ban đầu và sự giảm chậm giá trị pH tạo thuận lợi cho

sự phát triển của S.aureus và có thể sinh enterotoxin Lượng mùi hương thấp cũng

có thể do sự phát triển của các VSV không mong muốn

Các loài thuộc chủng Lactobacillus là các LAB nổi trội trong quá trình lên men xúc xích tự nhiên Các loài xuất hiện phổ biến nhất là L bavaricus, L curvatus, L farciminis, L plantarum và L sakei có thể là loài đóng vai trò quan trọng nhất, tiếp

đó là L curvatus Các loài không mong muốn như loài L viridescens sinh H2O2,

cũng có thể xuất hiện với số lượng rõ rệt Pediococcus xếp thứ 2 sau chủng Lactobacillus, nó nổi trội hơn về số lượng trong quá trình lên men Các loài Pd damnosus, Pd acidilactici và Pd pentasacceous đều đóng vai trò quan trọng Lactococcus và Leuconostoc thường chỉ xuất hiện với số lượng nhỏ, mặc dù chủng Leuconostoc với số lượng lớn thường đi kèm với các loại xúc xích kém chất lượng

Quá trình lên men kết thúc khi pH ≤ 5,2 -5,3 tạo cho sản phẩm có trạng thái cấu trúc rắn chắc và ức chế VSV có hại phát triển

Nếu pH ≤ 4,8 thì hương vị xúc xích tốt nhưng trạng thái cấu trúc và tính chất của sản phẩm bị giảm đi Tuy nhiên nếu pH thấp thi thời hạn sử dụng kéo dài hơn Lượng đường thêm vào từ 0,3 - 2%

Quá trình lên men truyền thống xuất hiện trước những năm 1940 đa số là quá trình lên men lactic tự nhiên

+ Quá trình lên men có bổ sung chủng khởi động[19]: Xúc xích lên men có thể

sản xuất mà không cần sử dụng chủng giống, nhưng việc sử dụng chủng khởi động cho quá trình sản xuất xúc xích đang tăng lên với mục đích là để đảm bảo tính an toàn và các tính chất tiêu chuẩn hóa của sản phẩm, bao gồm hương vị, mầu sắc phù hợp, và để rút ngắn thời gian chín

Do khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển, nhất là ngành VSV học Người ta đã tìm ra cách bổ sung một số chủng VSV vào sản phẩm xúc xích lên men từ những năm 1940 nhằm nâng cao giá trị cảm quan, tính an toàn và rút ngắn thời gian sản xuất Kỹ thuật sản xuất xúc xích lên men đã được cải tiến bằng cách sử dụng các chủng ban đầu dưới dạng đông khô

Chủng vi khuẩn được bổ sung trong sản phẩm xúc xích lên men thường là vi

khuẩn lên men tạo axit lactic, thường là các chủng VSV Lactobacillus, Pediococcus

và Streptococcus Ví dụ như ở Pháp và ở Mỹ sử dụng chủng lactobacilli, ở Tây Ban Nha sử dụng hỗn hợp các chủng, ở Châu Âu thông dụng chủng Micrococci và Lactobacilli

Thường bổ sung các chủng này vào quá trình phối trộn, thời gian lên men khoảng 24h ở nhiệt độ cao 30 - 41oC

1.2.2 Những biến đổi và sự chuyển hóa xảy ra trong quá trình lên men thịt

Tổng quát những biến đổi sinh hóa được thể hiện qua hình 1.8

Hình 1.4 Sự biến đổi sinh hóa của các chất trong quá trình lên men[22] 1.2.2.1 Sự biến đổi pH và axit hóa trong quá trình lên men thịt

Sự biến đổi pH và sự axit hóa trong sản xuất xúc xích là kết quả của quá trình lên men đường bởi vi khuẩn lactic Quá trình lên men lactic chuyển hóa đường theo hai phương thức: lên men đồng hình (sản phẩm chính là axit lactic chiếm 90-98%) và lên men dị hình (ngoài axit lactic còn có thể tạo ra các axit hữu cơ khác, etanol và

CO2) Quá trình này có một vai trò quan trong trong việc tạo hương vị, mầu sắc, sự phát triển cấu trúc, và kiểm soát được vi khuẩn không mong muốn trong suốt quá trình lên men

Việc bổ sung đường và các yếu tố công nghệ sản xuất (như nhiệt độ, ướp muối, thời gian chín) đều ảnh hưởng đến tỷ lệ axit hóa, giá trị pH cuối cùng, và tính chất cảm quan của xúc xích Mức độ axit hóa cần thiết phụ thuộc vào tính chất cảm quan của sản phẩm Axit lactic là hương vị được mong muốn có trong xúc xích ở phía bắc châu âu, nhưng không điển hình trong các loại thịt lên men ở phía nam châu

Âu

Sự axit hóa thể hiện trong quá trình lên men qua các dấu hiệu:

Gluxit

Enzym thịt, VSV lactíc

Vi khuẩn lactic

Những hợp chất tạo vị

Lipit

Vai trò vi khuẩn lactic, cầu khuẩn,

Những hợp chất tạo hương thơm

Protein

Enzym thịt, VSV lactíc

Các axit hữu cơ Các peptit, aminoaxit Các axit béo tự do

Phụ thuộc vào hệ sinh vật ban đầu, Lactobacilli và Micrococci là những quần thể

chiếm ưu thế ban đầu Sau đó số lượng vi khuẩn lactic tăng từ 106 đến 108,

109CFU/g và ổn định trong suốt quá trình lên men Loại LAB chiếm ưu thế là

Lactobacillus, Pedicoccus, Lactococcus,…

Sự giảm pH làm giảm đáng kể Pseudomonas và các vi khuẩn Gram(-), các vi

khuẩn gây thối, gây bệnh và gây hư hỏng

Nấm men phát triển thường 104 - 106 CFU/g góp phần tạo hương vị cho sản

phẩm Debaryomyces là nấm men chiếm ưu thế trong quá trình lên men thịt

Nấm mốc cũng phát triển tùy thuộc vào công nghệ và loại bao bì, Penicillium

chiếm hơn 95% trong các loại thịt lên men [21]

Nấm men và mốc hầu như không được phát hiện trong nhiều sản phẩm ở cuối giai đoạn chín

Enterococci có ở mức ban đầu là từ 2 - 4 log(CFU/g) Enterococci phát triển hầu

như trong suốt giai đoạn đầu của quá trình lên men và giữ ở mức ổn định từ 4 - 6 log(CFU/g) cho đến khi kết thúc toàn bộ quá trình sản xuất Trong một vài trường hợp số lượng của chúng giảm Theo Chevallier et al(2006) quan sát thấy rằng số

lượng Enterococci phụ thuộc theo mùa

Vi khuẩn LAB

Mặc dù các thành phần cấu tử của thịt giống nhau về giá trị pH cuối cùng và quá trình công nghệ, nhưng nó lại có tác động mạnh mẽ đến VSV Loài LAB hầu như được tìm thấy trong các loại xúc xích lên men khác nhau được sản xuất với các công nghệ khác nhau

Ở Đức, Hungary, Hy lạp, Tây Ban Nha, Ý và Argentina thì đều sử dụng loài

L.sakei và L.curvatus Trong đa số các nghiên cứu, L.sakei là loài chiếm ưu thế hơn

cả trong sản phẩm cuối cùng, trên 55% tổng số LAB

Aymerich et at (2006) cho rằng L.sakei được xác định là có mặt trong tất cả các

loại xúc xích Tây Ban Nha và đại diện chorizo chiếm 89,3%, fuet chiếm 76,3%

L.curvatus là loài thứ hai thường sử dụng sản xuất các loại xúc xích Hy Lạp và Ý

1.2.2.3 Sự biến đổi màu sắc

pH thấp có ảnh hưởng mạnh tới sự mất ổn định ban đầu của myoglobin và sự tăng tốc độ tự oxi hóa thành metmyoglobin Do đó phải bổ sung các chất chống oxy hóa như axit ascorbic, glutamic,…và nên sử dụng nitrit là nguồn trực tiếp

Các chất béo và sự có mặt với lượng lớn H2O2 do vi khuẩn gây ảnh hưởng bất lợi đối với màu sắc, thúc đẩy sự tạo thành metmyoglobin có màu nâu.[21]

1.2.2.4 Sự thủy phân protein trong thịt

Sự thủy phân protein trong quá trình lên men làm tăng khả năng tiêu hóa, khả năng phân giải mạng lưới protein thịt lên men trong 22 ngày tăng từ 73,8% tới 78,8% và khả năng tiêu hóa protein tăng từ 92% lên 94,1%.[21]

Trong khi XXLM chín các peptit và axit amin tạo ra hương vị đặc trưng cho những sản phẩm xử lý sấy và có vai trò như chất tăng hương vị

1.2.2.5 Sự thủy phân lipit

Nhờ tác dụng của các enzym có trong thịt, các triglyxerit và photpholipit bị phân hủy và giải phóng ra các axit béo phân tử lượng lớn Đặc biệt là làm tăng axit béo tự

do lên tới xấp xỉ 5% tổng lượng axit béo

Hoạt tính phân giải lipit của lipaza của LAB yếu hơn rõ rệt so với của

Micrococcus [22]

Sự oxi hóa chất béo chủ yếu liên quan đến các axit béo không no, và tạo thành peroxyt và các hợp chất carbonyl gây nên sự ôi với tính chất cảm quan không mong muốn

1.2.2.6 Sự thay đổi hoạt độ nước

aw được quyết định bởi việc bổ sung hay loại trừ nước bằng các chất hòa tan (đặc biệt là NaCl) và việc bổ sung chất béo

Giai đoạn đầu aw giảm (0,96) tạo thuận lợi cho LAB, Micrococcus và staphylococcus spp phát triển trong giai đoạn khợi động của quá trình lên men Sự

giảm aw của xúc xích lên men trong quá trình làm khô ảnh hưởng rõ rệt đến sự phát triển và sống sót của các VSV có hại, và ảnh hưởng rất mạnh tới độ chắc của xúc xích và hoạt động của các enzym trong quá trình chín [22]

1.2.2.7 Sự tạo thành hydroperoxit

Hydroperoxit (H2O2) là một trong những chất chuyển hóa quan trọng được sản sinh bởi LAB Nó tạo ra các hoạt động đối kháng Sự sản sinh hydroperoxit khác nhau giữa các chủng và phụ thuộc vào sự sẵn có của oxy

Sự tạo thành H2O2 trong các sản phẩm thịt lên men có tác động hai chiều: tác dụng kháng khuẩn; và những thay đổi về màu sắc, mùi vị theo chiều hướng không mong muốn H2O2, một hợp chất gây cản trở các tính chất cảm quan của các sản phẩm thịt, hoạt hóa metmyoglobin hình thành nên các gốc cation porphyrin Các gốc này khời đầu cho quá trình chuyển hóa lipit CHính vì vậy quá trình lên men thịt nên tiến hành ở điều kiện yếm khí thì tốt hơn bởi LAB là các vi khuẩn yếm khí hoặc vi hiếu khí [18]

1.2.2.8 Biến đổi hương vị

Hợp chất thơm tạo ra trong quá trình lên men thịt bởi những con đường sau:

Do tạo ra các chất thơm dễ bay hơi do phân hủy, thủy phân lipit, photpholipit và oxi hóa các axit béo

Các axit hữu cơ do VSV tạo ra; sự biến đổi các axit amin và peptit thành các rượu, andehyt và axit có mùi có mùi thơm; các sản phẩm của qúa trình oxi hóa lipit, như sự este hóa của các nhóm acyl trong phân tử hoặc sự khử các andehyt Các axit hữu cơ sinh ra phụ thuộc vào những điều kiện chín và công thức sản phẩm, hương thơm của xúc xích được tạo ra bởi gia vị, hun khói hoặc làm chín bề mặt với nấm men và nấm mốc [21]

Mặt khác, sự trao đổi chất của protein thịt có một tầm quan trọng lớn trong việc tạo hương đặc trưng của thịt lên men

Trong các sản phẩm, enzym proteaza cùng như các enzyme vi khuẩn đều chịu trách nhiệm về sự thay đổi proteolytic mà nó tồn tại trong suốt quá trình chế biến thịt, dẫn đầu thế hệ các peptit nhỏ và các axit amin tự do, đều được xem xét để trở thành hợp chất tạo hương (Aristory và Toldrá 1995; Sanz và Toldrá năm 1997, sanz 1998)

Fadda (2001) báo cáo việc đóng góp của các điều kiện tác nhân, trong thế hệ của

các peptit ưa nước và các axit amin tự do bởi hoạt động proteolytic của L.curvatus CRL705 Hơn nữa, nó đã chứng minh rằng L.sakei đóng một vai trò quan trọng

trong thế hệ axit amin Sanz và Toldra (2002) đã báo cáo một hoạt động cụ thể

aminopeptitaze của L.sakei đóng vai trò quan trọng trong việc giải phóng axit amin

tự do

1.2.2.9 Sự tạo thành các amin sinh học

Các amin sinh tổng hợp là kết quả của

quá trình decacboxyl hóa axit amin do VSV

Sự có mặt của chúng trong thực phẩm ở

mức độ cao có thể mang lại nguy hiểm cho

sức khỏe của người tiêu dùng (nếu vượt quá

mức 100ppm- FDA, EU) Ví dụ: Histidin

tạo thành histamin, Tryptophan tạo

Tryptamin,… [9]

Các nguồn VSV có khả năng khử CO2 tạo

amin là Enterococci, Carnobacteria,

Pseudomonas, Enterobacteria, Micrococci và một số LAB

Việc lựa chọn những chủng khởi động phù hợp góp phần hạn chế những amin sinh học trong sản phẩm

1.2.2.10 Enzym VSV và vai trò của chúng

Enzym khử nitrat thành nitrit Sự khử nitrat thành nitrit được thấy ở Staph.xylous, Staph.carnosus, Staph.simulas, Staph sciuri và Micrococcus varians (50ppm nitrit

là đủ để có được màu trọn vẹn của xúc xích lên men lượng này phải đạt tới trước khi có sự giảm pH < 5,4)

Enzim catalaza: Enzym này được sinh ra nhờ Micrococci có thể ngăn ngừa được

các nhược điểm về màu sắc và mùi vị trong xúc xích lên men do tác dụng khử hydroperoxyt được sinh ra bởi LAB

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm xúc xích lên men 1.2.3.1.Nguyên liệu chính – thịt

Thịt là thực phẩm giàu dinh dưỡng, pH trung tính, aw= 0,99, sau giết mổ bảo quản 0 - 20C thì pH = 5,6 - 6,2

Để sản xuất XXLM nguyên liệu phải chứa từ 50 – 70% là thịt nạc Thịt có thể được lấy từ nhiều nguồn động vật khác nhau như: Thịt bò, thịt lợn, thịt cừu, trâu, ngựa,…

HC CCH2CH(NH2)COOH

HN N

CHHistidinDecarboxyl hóalo¹iCO2

HC CCH2CH2NH2

HN N

CHHistamin

CÊu tróc hãa häc cña histamin

Chất lượng thịt đánh giá qua: khả năng giữ nước, giá trị pH, màu sắc, và đặc biệt là mức độ ô nhiễm VSV Thịt nguyên liệu yêu cầu có VSV tổng số < 105CFU/g hoặc 1cm2

Thịt lợn được sử dụng có giá trị pH ban đầu khoảng 5,6 - 6,0 tạo điều kiện cho quá trình lên men ban đầu và đảm bảo sự giảm pH một cách thích hợp Loại thịt DFD (Dark – Firm - Dry) có pH > 6,2 có màu sẫm, cứng, khô thì không phù hợp cho sản xuất, nhưng loại thịt PSE (Pase – Soft - Excutive) có pH < 5,6 có màu nhợt nhạt, mềm, rỉ nước có thể được sử dụng sản xuất các loại xúc xích lên men cho phù hợp đến 20% tổng lượng thịt [21]

1.2.3.2 Ảnh hưởng thành phần gia vị, phụ gia

* Đường làm cơ chất quá trình lên men

Thường sử dụng các loại đường đơn như là glucoza, đây là cơ chất để lên men được dễ dàng bởi tất cả các loại vi khuẩn lactic Số lượng đường ảnh hưởng đến tỷ

lệ, cấu trúc và nó cũng đóng góp đáng kể trong việc tạo hương vị, cấu trúc và các tính chất của sản phẩm Hàm lượng đường được thêm vào sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến giá trị pH của sản phẩm cuối cùng và việc thêm đường sẽ không làm giảm giá

trị pH hơn vì chủng vi khuẩn bacteria không phát triển trong axit thừa

Hàm lượng gluxit bổ sung là rất quan trọng vì nó xác định rõ tỉ lệ và mức độ axit lactic tạo thành, sự tạo thành kết cấu cho xúc xích, và hương vị mong muốn

Thường bổ sung 0,3 - 2% đường vào lên men thịt

* NaCl là phụ gia chính: Chất tạo vị trong các sản phẩm thịt lên men

NaCl làm tăng độ bền gel ổn định cho sản phẩm Có tác dụng chống lại sự phát triển của VSV Nó được thêm vào ở mức từ 1 - 4%, (tối thiểu là 1%; với 3% không làm chậm quá trình lên men), sẽ cho phép axit lactic phát triển và ức chế được các VSV không mong muốn khác

NaCl làm giảm aw ban đầu tới xấp xỉ 0,96 Sự kết hợp cùng với NaNO2 nồng độ lên tới 150mg/kg và với giá trị pH thấp tạo nên hệ thống ức chế mạnh mẽ[12]

* NaNO2, NaNO3

Nitrit có vai trò: bảo quản, tạo mầu và chống oxy hóa, làm chậm sự ôi chất béo,

ổn định màu sắc, cấu trúc và hương vị đặc trưng cho sản phẩm Nitrat không có vai

trò trực tiếp mà khử thành nitrit nhờ VSV (Micorococcus và staphylococcus)

Nitrat và nitrit thường được sử dụng kết hợp, nhưng nitrat thường không hay được sử dụng ngoại trừ nó như một nguồn dự trữ cho nitrit, mà nó có thể có lợi trong quá trình chế biến lâu dài Nitrit như một hàng rào, nó ức chế sự phát triển của

vi khuẩn Quá trình lên men có thể được sản xuất với chỉ có muối, nhưng sẽ có một lượng lớn VSV nguy hiểm nếu không được sử dụng nitrit

Theo FDA (Cục quản lý dược và thực phẩm Mỹ) khuyến cáo việc sử dụng các chất bảo quản này ở một giới hạn cho phép, chẳng hạn như nếu sử dụng nitrit hay nitrat hoặc hỗn hợp cả hai loại thì sản phẩm cuối cùng phải có lượng nitrit không được lớn hơn 200ppm trong sản phẩm cuối cùng[18] Theo TCVN 7050-2002 [6] thì hàm lượng nitrit trong các sản phẩm thịt không qua xử lý nhiệt là không vượt quá 134mg/kg SP

Lượng nitrit được sử dụng trong xúc xích lên men không ức chế sự phát triển

của salmonella spp, Clostridium botulinum và staphylococcus aureus mà phải kết

hợp với pH, aW Tiêu chuẩn EU yêu cầu NO2 ≤ 150ppm

*Các gia vị khác như tiêu đen, đỏ và trắng, thảo quả, mù tạt, nhục đậu khấu,

gừng, quế, tỏi, và các thành phần khác Thường có trong công thức lên men thịt Các loại gia vị được sử dụng để tạo hương vị, chống oxy hóa và kích thích sự tăng trưởng của vi khuẩn lactic Sodium ascorbate được dùng để cải thiện, làm ổn định mầu sắc và làm chậm quá trình oxy hóa

1.2.3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

* Nhiệt độ

Sự phát triển của vi khuẩn thường quan sát thấy ở nhiệt độ trên 200C và dưới

400C Sự lên men xúc xích thường diễn ra ở 22-240C Nhiệt độ lên men trên 250C,

nguy cơ sự phát triển Staphylococcus aureus tăng [12]

Chia xúc xích làm 3 nhóm phụ thuộc lên men:

- Lên men ở nhiệt độ cao: 400C và thời gian lên men 15 - 20 giờ

- Lên men ở nhiệt độ truyền thống ở châu Âu: từ 20 - 240C, làm chín ở nhiệt độ 15-180C

- Lên men ở nhiệt độ thấp: 10-150C với nguồn chủng cấy thích hợp nhiệt độ này[21]

* Độ ẩm

Quá trình lên men ngắn ở nhiệt độ cao được tiến hành ở độ ẩm tương ứng là 98%, nhưng ở nhiệt độ thấp hơn có một quy tắc chung là độ ẩm tưông ứng trong bể lên men nên thấp hơn 5-10% so với xúc xích (tức là khoảng 80%).[12]

* Hoạt độ nước

Khối thịt ban đầu có aw= 0,96(với NaCl 2-3% và hàm lượng chất béo khoảng 30%) Các vi khuẩn Gram (-) khó có thể phát triển khi hoạt độ nước trên 0,97 còn ở

aw= 0,96 thúc đẩy LAB và Staphylococcus khởi động (staphylococcus aureus có thể

chiếm ưu thế khi aw < 0,95) Trong quá trình chín hoạt độ nước giảm xuống cùng với pH thấp sẽ ức chế các vi khuẩn gây bệnh khác [21]

1.2.3.4 Sự cấy chủng VSV khởi động trong quá trình lên men thịt

Việc sử dụng chủng khởi động chủ yếu phổ biến trong quá trình sản xuất xúc xích lên men bán khô và được nhân rộng trong quá trình sản xuất xúc xích lên men khô ở các nước như Đức Ở các khu vực khác, chủng khởi động được sử dụng ít phổ biến hơn mặc dù giá trị của chúng đang ngày càng được thừa nhận Chủng khởi động chủ yếu là LAB và chúng được bổ sung để cải thiện độ chắc của sản phẩm và

để kiểm soát quá trình lên men Ở những sản phẩm mà KNO3 được bổ sung mà không có NaNO2 thì thường được bổ sung chủng có khả năng phân giải nitrat như

Micrococcus hay Staphylococcus làm chủng khởi động Staphylococcus cũng có thể

được sử dụng mà không có sự có mặt của LAB

Một số chủng VSV được sử dụng làm chủng khởi động trong XXLM

Vi khuẩn:

Các chủng LAB được dùng phổ biến [21]:

- Lactobacillus: L.plantarum, L.alimentarius, L.sakei, L.parpaplantarum L.pentosus, L.paracasei, pediococcus spp, Lactococcus lactic,Lactococcus garviae, Leuconostoccitreum, Leuconostoccitreum mesenteroides

- Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Enterococcus durans, và pseudoavium Enterococcus

- Micrococcaceae (Micrococcus varians)

- Staphylococcin (Staphylococcus carnosus, S xylosus)

Nấm men: Debaryomyces hansenii, Candida famata

Nấm mốc: Thường là Penicillium nalgiovense, P chrysogenum, P camemberi

Lactobacillus plantarum Lactobacillus sakei Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus bulgaricus Micrococus varians Debaryomyces hansenii

Hình 1.5 Hình ảnh một số chủng VSV làm chủng cấy trong thịt lên men

+ Các tính chất chức năng của chủng khởi động đối với sự lên men thịt

Một trong những tính chất cơ bản của chủng khởi động là khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn bản thể có sẵn trong thịt, để tồn tại trong môi trường này, và để thống trị được cộng đồng vi khuẩn của các sản phẩm thịt lên men Sự thành công của các sản phẩm thịt bằng các chủng khởi động là một điều kiện tiên quyết cho sự đóng góp của chúng đối với chất lượng của sản phẩm cuối cùng

Bảng 1.2 Vai trò, chức năng của VSV có lợi trong chế biến thịt lên men [21]

Nhóm

VSV Loài ( Species)

Hoạt động chuyển hóa hữu ích

Tác dụng tích cực đối với sản phẩm

Kìm hãm VSV gây bệnh và gây thối, thúc đẩy quá trình làm khô và tạo màu

Tạo và cố định màu, ngăn chặn sự

ôi thiu, tạo hương

vị và điều hòa lượng nitrit

Nhóm

VSV Loài ( Species)

Hoạt động chuyển hóa hữu ích

Tác dụng tích cực đối với sản phẩm

Nấm

Thủy phân lipit, ngăn chặn sự oxi hóa

Tạo hương vị và làm giảm sự ôi thiu

Nấm

Thủy phân lipit, protein, phá hủy peroxúc xích it, làm giảm sự oxi hóa

Tạo màu, tạo hương vị và ức chế sự ôi thiu

* Giới thiệu các chủng giống thương mại đang có trên thế giới hiện nay

Theo truyền thống, các sản phẩm lên men thường phụ thuộc vào chủng hoang dã,

mà không phù hợp với bất kỳ loài cụ thể nào nhưng chúng thường có mối liên quan

tới Lactobacilli plantarum

Hiện nay, các loài khác như L.sakei và L.leichmanii, cũng như nhiều loài khác

đều đã được phân lập từ các sản phẩm thịt lên men truyền thống (Anon 1978)

Ở Mỹ, L.plantarum, Pediococcus pentosaceus hay P acidtilactici thường được

sử dụng làm chủng khởi động

Ở Châu Âu, các chủng khởi động được sử dụng nhiều nhất: L sakei, L.plantarum Pediococcus pentosaceus, staphylococcus xylosus, S.carnosus và đến một phạm vi thấp hơn Micrococcus spp

Việc sử dụng các loài VSV trong tự nhiên không đảm bảo được chất lượng của sản phẩm Ưu điểm của chủng khởi động đó là cùng một loài VSV có thể sử dụng được nhiều lần mà được cắt giảm trên các biến thể của sản phẩm được hoàn tất và một số lượng lớn các VSV có thể được thêm vào

Hiện nay, việc kết hợp các chủng khởi động có sẵn trong một số VSV sản xuất

axit lactic (ví dụ như Lactobacilli) và cải thiện được một hương vị mong muốn (Micrococcaceae, L brevis, L.buchner) Đây là một sự kết hợp rất là tốt Tuy nhiên,

có rất ít các sản phẩm được sản xuất bởi vì hầu hết các chủng khởi động là một sự kết hợp của một số loại VSV, chúng không tạo ra được sự cân bằng một hương vị, thỉnh thoảng có thể chứa nhiều loài trong đó

1.2.4 Sử dụng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacterioxin

Thịt rất nhạy cảm với các hư hỏng mà vi sinh vật gây ra, đó là do chính các đặc điểm sinh thái của thịt (aw, pH và các dưỡng chất) Trong thịt, LAB là trong số các

vi sinh vật dễ phát triển sau khi thịt được chế biến thành xúc xích lên men, bảo quản cực lạnh hoặc đóng gói chân không hoặc trong môi trường có biến đổi thành phần không khí Vai trò quan trọng của nhóm vi khuẩn lactic và cầu khuẩn catalaza trong quá trình lên men thịt Trong đó ngoài các vai trò chính lên men tạo axit lactic để hình thành cấu trúc và hương vị cho sản phẩm thì vai trò kháng khuẩn của LAB trong thịt lên men nhằm nâng cao tính an toàn và kéo dài thời hạn sử dụng là một trong những tính chất không kém phần quan trọng Cơ chế kháng khuẩn hay cạnh tranh môi trường của LAB là do gây ra sự nhiễu vi sinh vật đối với các vi khuẩn gây hỏng và gây bệnh thông qua một số cơ chế như cạnh tranh oxi và dưỡng chất, cạnh tranh vị trí tấn công/bám dính và sản sinh ra một loạt các chất ức chế: axit lactic, axetic, acetaldehit, diacetyl, hydroperoxit, reuterin,…và bacterioxin Trong đó bacterioxin một thành phần kháng khuẩn có bản chất protein chỉ được sinh ra bởi một số loài Nhiều loại bacterioxin có phổ kháng khuẩn khá rộng đặc biệt là có khả năng kháng được các vi sinh vật gây bệnh, sinh độc tố Do có bản chất là protein nên rất dễ bị phân huỷ bởi proteaza trong hệ thống tiêu hóa, do vậy hiện nay trên thế giới nó được quan tâm đặc biệt nhằm ứng dụng trong chế biến và bảo quản thực phẩm

Chính vì vậy đối với nhóm sản phẩm thịt lên men khi mà trong môi trường sản phẩm vẫn có nguy cơ tồn tại một số loài vi sinh vật gây nguy hại thì việc nghiên cứu tìm ra các giải pháp mới như ứng dụng chủng cấy có khả năng sinh tổng hợp bacterioxin nhằm nâng cao tính bền vững và an toàn cho sản phẩm là việc làm hết sức cần thiết[15]

1.2.4.1 Vai trò sinh tổng hợp hợp chất kháng khuẩn bacterioxin và giải pháp ứng dụng trong công nghệ chế biến thịt lên men

Bacterioxin là các polipeptit có tính kháng khuẩn được sản sinh trên ribosome hoặc các protein có tác dụng kháng khuẩn khi ở dạng thành thục, chống lại một phổ hẹp các loài vi khuẩn họ hàng gần gũi (Jack và cộng sự, 1995) Tuỳ thuộc vào bản chất protein của mình mà bacteriocin có thể bị vô hoạt bởi các proteaza trong đường ruột Phần lớn các bacterioxin đã biết cho đến nay là các phân tử cation có tới 60 phần tử axit amin và bền nhiệt

Bacterioxin do vi khuẩn lactic sinh ra là các phân tử protein hay peptit mang điện tích dương, kích thước nhỏ (gồm 30-60 axit amin), có điểm đẳng điện cao và có khả

năng ức chế các vi khuẩn có quan hệ gần với vi khuẩn sinh ra bacterioxin đó Nhiều

chủng vi khuẩn lactic sản sinh bacterioxin là: Latococcus sub lactic (nisin), L acidophilus (lactacin B, F), L brevis, L casei, L carnis, L delbrueckii, L fermenti,

L gasseri, L helveticus, L plantarum…[15]

Cũng như các quá trình sản xuất các loại thực phẩm lên men khác như: phomát,

sữa lên men, thì là muối, dưa cải bắp, thì LAB đóng vai trò then chốt Pediococcus, các loài lên men dị hình của chủng Lactobacillus và với phạm vi nhỏ hơn nhiều Lactococcus là những loài đóng vai trò quan trọng trước tiên LAB lên men dị hình

là những loài không mong muốn do chúng tạo khí và các hợp chất hương không đặc

trưng, và trong một số loài thuộc chủng Leuconostoc thì có sinh nhầy nhớt Theo

thực tế, mặc dù LAB lên men dị hình phổ biến trong một số kiểu xúc xích lên men

nhưng chúng chỉ xuất hiện với số lượng nhỏ tương ứng Một số chủng Lb sake lên

men đồng hình cũng sinh nhầy nhớt Trong khi loại này biểu hiện là không có tác động đặc trưng đối với chất lượng của xúc xích với mức 107CFU/g, và nó được coi

là loài không mong muốn

Vai trò chủ yếu của LAB là tổng hợp axit hữu cơ, trước tiên là axit lactíc từ các hợp chất carbohydrate, theo đường hướng Embden-Meyerhof Quá trình làm giảm

PH và góp phần ức chế các vi sinh vật không mong muốn Sự giảm giá trị PH cũng

là nhân tố quan trọng làm giảm khả năng giữ nước của protein và do đó đảm bảo quá trình làm khô được chính xác

Trong những năm gần đây, quá trình tổng hợp các chất ức chế (bên cạnh các axit hữu cơ) bởi LAB trong quá trình lên men xúc xích khá được quan tâm Trong một

số trường hợp, sự ức chế có liên quan một cách tương ứng với các quá trình không

rõ ràng như: sự tạo thành hydrogen peroxide, sự giảm khả năng oxihoa-khử và sự cạnh tranh dinh dưỡng, đặc biệt là axit amin và các loại vitamin niacin và biotin Nhiều loại LAB cũng sinh bacteriocin – là những chất có hoạt tính khá đặc biệt Vai trò chủ yếu là khả năng ức chế của bacteriocin đối với các vi sinh vật gây hư hỏng

như Listeria monocytogens Bacteriocin được sinh từ chủng Pediococcus có khả năng chống lại L monocytogene trước khi sự giảm PH một cách rõ rệt diễn ra, mặc

dù hoạt tính đó được tăng cường ở giá trị PH thấp

Các loài thuộc chủng Micrococcus và Staphylococcus coagulase(-) đóng vai trò

quan trọng trong một số loại xúc xích lên men trong quá trình phân giải nitrate

thành nitrite Nhiều loại vi khuẩn có mặt trong thịt tươi như Pseudomonas cũng có

khả năng phân giải nitrate nhưng chúng không có khả năng phát triển trong quá trinh lên men Nitrite là một trong những thành phần quan trọng trong hệ thống các chất ức chế của xúc xích lên men và nó cũng đóng vai trò quan trọng trong qúa trình tạo màu sắc đặc trưng của sản phẩm Quá trình tổng hợp catalase bởi vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn cản sự mất màu do các chủng LAB sinh peroxide và làm giảm quá trình oxihoa chất béo Một số loài thuộc chủng

Lactobacillus có khả năng sinh catalasa rõ rệt Micrococcus và Staphylococcus là

nguồn sinh enzim thủy phân lipid và protein quan trọng trong quá trình chín

Vai trò của enzim trong quá trình tạo hương do enzim vi sinh vật hay do enzim

bản thể trong thịt là vấn đề còn đang tranh cãi nhưng loài Staphylococcus carnosus

góp phần đáng kể vào sự tạo hương trong xúc xích lên men Sự phát triển của các loài vi sinh vật bản thể trong quần thể vi sinh vật trong thịt trước quá trình tổng hợp axit lactíc trong quá trình lên men cũng góp phần cải thiện chất lượng của loại xúc

xích khô

1.2.4.2 Ứng dụng của bacterioxin và chủng sinh bacterioxin trong công nghệ thịt và thịt lên men

* Ứng dụng của các bacterioxin trong công nghệ thịt và thịt lên men

Theo Hugas [17] đã công bố kết quả và đưa ra các liệu pháp sử dụng bacterioxin

và các chùng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin trong các sản phẩm thịt như sau:

- Bổ sung chủng LAB thuần khiết, có sản sinh bacterioxin và có thể phát triển được vào trong thực phẩm Biện pháp này là cách trực tiếp để phối hợp đồng đều bacterioxin vào trong sản phẩm thực phẩm Sự thành công của nó phụ thuộc vào khả năng phát triển và sản xuất bacterioxin của chủng bổ sung trong các điều kiện

kỹ thuật và môi trường (nhiệt độ, pH, chất phụ gia, ) của thực phẩm Vì thịt không thể thanh trùng paster trước khi bổ sung chủng LAB để ngăn ngừa sinh học hoặc để lên men thịt phải có khẩ năng cạnh tranh với VSV tự nhiên

- Bổ sung các chế phẩm bacterioxin thô, dịch lên men hoặc dịch cô đặc như thu nhận được từ quá trình nuôi LAB sản sinh bacterioxin trong các chất nền phức tạp

- Bổ sung các chất đối kháng đã tinh chế hoặc bán tinh chế Theo cách này liều lượng bacterioxinphải chính xác Tuy nhiên ứng dụng của nó còn hạn chế tùy theo tạp quán sử dụng của từng nước

* Phương pháp ứng dụng bacterioxin và chủng sinh bacterioxin trong các sản phẩm thịt:

Bổ sung chủng LAB thuần khiết, có sản sinh bacterioxin và có thể phát triển được vào trong thực phẩm Biện pháp này là cách trực tiếp để phối hợp đồng đều bacterioxin vào trong các sản phẩm thực phẩm Sự thành công của nó phụ thuộc vào khả năng phát triển và sản xuất bacterioxin của chủng bổ sung trong các điều kiện

kỹ thuật và môi trường (nhiệt độ, pH, chất phụ gia, …) của thực phẩm Vì thịt không thể thanh trùng paster trước khi bổ sung chủng LAB nên các chủng LAB để ngăn ngừa sinh học hoặc để lên men thịt phải có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên

Bổ sung các chế phẩm bacteriocin thô, dịch lên men hoặc dịch cô đặc thu nhận được từ quá trình nuôi LAB sản sinh bacteriocin trong các chất nền phức tạp Cách này tránh được việc sử dụng các hợp chất tinh chế

Bổ sung các chất đối kháng đã tinh chế hoặc bán tinh chế Theo cách này, liều lượng bacteriocin phải chính xác hơn và do đó phải được ước lượng trước Tuy nhiên, ứng dụng của nó còn hạn chế, tuỳ theo tập quán sử dụng phụ gia của từng nước

Bổ sung LAB ưa nhiệt ôn hoà như là yếu tố bảo quản ‘an toàn dự phòng’ để chống lại sự lạm dụng nhiệt độ Trong trường hợp này, các chủng bảo vệ sinh học

sẽ giữ ở mật độ như ban đầu trong các điều kiện kiện giá lạnh còn trong điều kiện lạm dụng nhiệt độ, chúng sẽ phát triển cạnh tranh vượt trước các vi khuẩn gây bệnh

Vì vậy tránh được những nguy hại cho sức khoẻ

* Những hạn chế của bacterioxin và biện pháp tăng phạm vi ứng dụng

Một cản trở trong việc ứng dụng các bacteriocin làm chất bảo quản sinh học cho thịt là do chúng có khu vực vật chủ hẹp, chỉ ảnh hưởng tới các vi khuẩn họ hàng gần gũi Tuy nhiên các chủng sản sinh bacteriocin có thể có tác động dương tính đối với các vi khuẩn Gram (-) theo cách gián tiếp như là tạo ra một hệ vi sinh vật chiếm ưu thế và loại trừ các vi sinh vật Gram (-) ưa lạnh

Trái lại với vi khuẩn G (+), vi khuẩn G(-) , như Escherichia coli O157 :H7, có

thêm vào màng trong một màng ngoài mà những kháng khuẩn kỵ nước không thể xuyên qua Lớp trong của màng ngoài thì được tạo thành bởi glyserophospholipid, trong khi lớp ngoài thì được tạo ra bởi lipopolysaccharide Lipopolysaccharide bao

gồm một phần chất béo kỵ nước bên trong và một phần heteropolysaccharide ưa nước bên ngoài, mà được ổn định bởi cation hoá trị II (như Mg 2+) Màng nguyên vẹn bên ngoài có thể bị phá hỏng bởi sự thấm qua , như là EDTA, a xit citric hoặc a xit lactic, mà kháng khuẩn kỵ nước có thể xuyên vào tế bào G (-) Tác động của LAB trong tế bào có thể một phần dựa trên việc tạo ra nồng độ tương ứng của a xit lactic trong môi trường vi sinh, mà kết hợp với chất tẩy trong ruột như muối mật để kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn gây độc G (-)

Các biện pháp xử lý khác nhau đã được thử nghiệm làm cho vi khuẩn Gram (-) nhạy cảm với bacterioxin, đặc biệt là nisin Việc sử dụng nisin cùng với tác nhân có càng kẹp (EDTA, Tween, Triton-X 100) đã mở rộng phổ kháng kháng khuẩn của nisin tới cả các vi khuẩn Gram (-) Sự gây sốc về tính thẩm thấu (hàm lượng muối cao) cũng đã được thử nghiệm như là phương tiện để vi khuẩn Gram (-) nhạy cảm hoá với nisin

1.2.4.3 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic sinh bacterioxin làm chủng cấy trong sản xuất thịt lên men

Trong những năm gần đây, đã có sự tăng lên đáng kể những nghiên cứu về những hợp chất kháng vi sinh vật tự nhiên trong thực phẩm được tạo ra bởi LAB Ngoài việc tạo ra a xit lactic kháng vi sinh vật, LAB còn góp phần tạo ra sự an toàn

và kéo dài thời gian bảo quản của sản phẩm thực phẩm bởi việc tạo ra kháng sinh từ

vi khuẩn (phân tử lượng > 1000 Da) và/hoặc những hợp chất phân tử lượng thấp (khối lượng phân tử < 1000 Da) Những giống bảo vệ sinh học này có thể hoạt động như những chủng khởi đầu trong quá trình lên men thực phẩm hoặc chúng có thể bảo vệ thực phẩm mà không có bất kỳ thay đổi bất lợi nào

Nhà khoa học Arihara và đồng sự đã cho thấy rằng tiềm năng chủng kháng sinh

Lactobacillus gasseri JCM1131 là có khả năng ứng dụng cho quá trình lên men thịt

làm tăng tính an toàn của sản phẩm Sameshima và đồng sự (1998) đã chứng minh

tính hữu dụng của việc sử dụng những chất kháng sinh tiềm năng từ L rhamnosus FERMP-15120 và L paracasei FERMP-15120 trong quá trình lên men thịt

Andersen(1998) lên men xúc xích khô đã thành công trong việc sử dụng hỗn hợp

chủng chủng cấy T-SPX (Chr Hansen) và chủng kháng khuẩn tiềm năng L casei LC-01 hoặc hỗn hợp với chủng kháng khuẩn Bifidobacterium lactis Bb-12

Mặc dù nhóm sản phẩm XXLM rất phổ biến trên thế giới và công nghệ sản xuất

đã mang tính công nghiệp hóa cao với chất lượng đồng đều và đảm bảo ATVSTP Nhưng ở Việt Nam sản phẩm này gần như chưa có nhiều trên thị trường, mới chỉ được nhập khẩu với giá thành cao do công nghệ sản xuất khắt khe và nguồn nguyên liệu thịt có nguy cơ ô nhiễm cao ở Việt Nam

Với mong muốn phát triển sản phẩm có nhiều giá trị dinh dưỡng từ thịt ở Việt

Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic trong sản xuất xúc xích lên men” với các nội dung sau chính như sau:

+ Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic ứng dụng trong sản xuất XXLM + Nghiên cứu công nghệ sản xuất XXLM-Sa có sử dụng chủng khởi động

+ Nghiên cứu quá trình làm chín và bảo quản XXLM-Sa

+ Điều tra thịt hiếu người tiêu dùng với các mẫu XXLM-Sa

+ Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất sản phẩm XXLM- Sa có sử dụng chủng khởi động ở Việt Nam

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu để sản xuất XXLM-Sa hỗn hợp thịt bò, thịt lợn nạc mông hoặc nạc thăn, mỡ phần (mỡ lưng) mua ở chợ và các phụ gia khác như muối, đường, tiêu, tỏi,…

2.1.2 Chủng VSV nghiên cứu

™ Gồm 3 chủng:

+ Chủng Lactobacillus plantarum (chủng H1.40) bộ sưu tập Bộ môn

CNTP-CNSTH - chủng được phân lập từ nem chua, có khả năng sinh tổng hợp bacterioxin,

có hoạt lực cao và nhiều đặc tính tốt

+ Chủng Lactobacillus sakei (chủng DSM 6333), phân lập từ xúc xích lên men

tự nhiên, có khả năng sinh bacterioxin có hoạt lực kháng khuẩn cao và nhiều đặc tính tốt (Bộ sưu tập trường Đại học Torino, Italia)

2.1.3.2 Môi trường

* Môi trường Staphylococcus 110 của FDA

Thành phần môi trường:

Tryptone: 10g; Cao nấm men: 2,5g; Gelatin:30g; Lactose: 2g; D-Mannitol:

10g ; NaCl: 75g; Dipotassium Phosphate: 5g; Thạch:15g; Nước 1lit

Hấp ở 121oC trong 15 phút

* Môi trường VRB agar

Thành phần môi trường:

Cao nấm men:3g; Peptone7g; NaCl:5g; Muối mật No3: 1,5g; Glucoza:10g; Đỏ trung tính : 3mg; Tím violet: 2mg; Thạch:12g; Nước:1lit; pH từ 7,2-7,6 ở 250C Hấp ở 121oC trong 15 phút

* Môi trường MRS đặc

Thành phần môi trường:

Cao thịt (10g), cao nấm men (5g), pepton (15g), glucoza (20g), natri axetat (5g), Tween (1ml), citrat amon (2g), magie sunphat (0.1g), mangan sunphat (0.05g), kalihyđro photphat (2g), nước cất (1lít), aga (môi trường đặc 20g, môi trường xốp 7g)

- Máy đo pH 320pH Metter METTLER POLEDO

- Máy đo quang Model80- 2088- Anh

- Thiết bị sấy chân không Heraeus vacutherm- Đức

- Các thiết bị khác: tủ lạnh, lò vi sóng,…

-Máy ly tâm lạnh

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp hóa lý

2.2.1.1.Xác định pH bằng máy đo điện cực Metter METTLER POLEDO

2.2.1.2 Phương pháp xác định độ ẩm của sản phẩm bằng phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi

2.2.1.3 Phương pháp xác định hàm lượng NH3 theo TCVN 3706-90

2.2.1.4 Phương pháp xác định hàm lượng axit amin tự do bằng phương pháp đo màu trực tiếp với Ninhidrin (theo A.A KOHOHOBA: BectИk A.Г.Y.N0,16, 165 (1962)

Nguyên tắc: Bản chất của phương pháp là dùng ninhydrin tác dụng với α – axit

amin nói chung và tạo phức chất màu tím rồi đem so màu trực tiếp và có thêm pyridin làm chất ổn định màu

Cách tiến hành:

Cân chính xác 15g mẫu phân tích, dùng nước cất hòa tan mẫu, chuyển toàn bộ

vào bình định mức 250ml, thêm nước cất đến vạch định mức lắc đều và lọc thu dịch

trong suốt

Lấy chính xác 2ml dịch lọc, chuyển vào định mức 25ml

Lấy chính xác 2ml dịch đã pha loãng cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml

ninhydrin 2%; 1 ml pyridin 20% rồi đậy kín ống nghiệm Đồng thời làm mẫu kiễm

chứng sử dụng 2ml nước cất thay cho mẫu phân tích thao tác và hóa chất tương tự

Ngâm các ống nghiệm ở các cốc có nhiệt độ 70 – 750C trong 7 – 10 phút Sau

đó để nguội ở nhiệt độ phòng để ổn định sau 30 phút Đem đo màu dung dịch bằng

máy so màu quang điện ở bước sóng 570nm, cuvet dày 1cm Đo mẫu kiễm chứng

và chuẩn máy về 0,000 sau đó đo mẫu Ghi lại kết quả

Xây dựng đường chuẩn

Để xác định hàm lượng axit amin của dịch màu bằng phương pháp so màu,

cần phải xây dựng đường chuẩn axit amin với các nồng độ khác nhau đã biết trước

Axit amin chuẩn sử dụng là L-Tyrozin Cân 0,1 g L-tyrozin cho vào định mức

100ml (1mg/1ml) đem lọc 3 lần thu được dịch lọc, tiếp tục lấy 10ml định mức

100ml ta được nồng độ 0,1mg/ml Tiến hành pha axit amin chuẩn thành các dung

dịch có nồng độ chính xác là 0.02; 0.04; 0.06 và 0.08 mg/ml

Lấy chính xác 0.1ml dung dịch axit amin chuẩn vào các ống nghiệm, thêm vào

mỗi ống nghiệm 1ml ninhydrin 2% và 1 ml pyridin 20% rồi đậy kín ống nghiệm

Tiến hành song song làm mẫu kiễm chứng (nước cất) Ngâm các ống nghiệm ở các

cốc có nhiệt độ 70 – 750C trong 7 – 10 phút Sau đó để nguôi ở nhiệt độ phòng để

ổn định sau 30 phút Đem đo màu dung dịch bằng máy so màu quang điện ở bước

sóng 570nm, cuvet dày 1cm Đo mẫu kiễm chứng và chuẩn máy về 0,000 sau đó đo

các mẫu axit amin chuẩn và ghi lại kết quả thu được

Nồng độ Thể tích

0.02 mg/ml

0.04 mg/ml

0.06 mg/ml

0.08 mg/ml

Từ kết quả thu được khi đo các mẫu axit amin chuẩn dựng đường thẳng biểu thị quan hệ giữa nồng độ dung dịch với giá trị OD đo được

Hình 2.1 Đường chuẩn xác định axit amin tự do

Tính kết quả

Mật độ quan A đo được dóng trên đường chuẩn để suy ra hàm lượng axit amin

có trong mẫu (giả sử là X)

Hàm lượng axit amin tự do được tính theo công thức

% Axit amin = x x x

x

X 25 250 100

2 mTrong đó:

X: hàm lượng axit amin tự do đo được, mg (1mg = 103µg)

25: thể tích dịch pha loãng, ml

250: thể tích dịch pha loãng, ml

2: thể tích dịch pha loãng đem đi xác định, ml

m: khối lượng mẫu thử, g

100: hệ số tính ra phần trăm

2.2.1.5 Xác định hàm lượng lipit bằng phương pháp soxhlet

2.2.1.6 Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

2.2.2 Phương pháp vi sinh

2.2.2.1 Phương pháp xác định Staphylococcus aureus bằng phương pháp phân lập trên môi trường chọn lọc S Aureus 110 (FDA)

2.2.2.2 Tổng số VSV đường ruột Enterobacteriacea bằng phương pháp phân lập trên môi trường VRB agar ( theo National standard method of Health

Protection Agency - UK )

2.2.2.3 Kiểm tra tổng số vi khuẩn lactic bằng phương pháp phân lập trên môi trường MRS (Man Rogosa Sharpe)

2.2.2.4 Phương pháp quan sát đặc điểm, hình thái tế bào

Phương pháp nhuộm Gram:

Nuôi vi khuẩn lactic cần nghiên cứu trong môi trường MRS lỏng 24 giờ Dùng que cấy tròn lấy một giọt canh trường dàn đều lên phiến kính sạch Cố định vết bôi bằng rượu etylic 96% hoặc hơ lên phần không khí nóng của ngọn lửa đèn cồn Đặt lên vết bôi một miếng giấy lọc nhỏ rồi nhuộm thuốc tím gential lên trên, giữ 1 - 2 phút Sau đó bỏ miếng giấy ra, đổ thuốc nhuộm thừa, không rửa nước Nhỏ dịch lugol lên chỗ vết bôi, giữ một phút rồi đổ đi Nhúng bản mẫu vào rượu etylic 95% trong 0,5 - 1 phút, rửa bằng dòng nước chảy nhẹ Tiếp đó nhỏ thuốc nhuộm Fuchsin lên chỗ vết bôi, giữ 1 - 2 phút Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ Đợi cho khô, sau đó quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần Vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu hồng

2.2.2.5 Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi sinh vật

Nuôi vi sinh vật cần nghiên cứu trong môi trường lỏng Sau các khoảng thời gian 0, 3, 6, 9, 12,15, 18,21, 24,27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48 giờ nuôi cấy tiến hành

đo OD của dịch nuôi bằng máy đo quang tại bước sóng λ= 600 nm

2.2.2.6 Phương pháp xác định sự thay đổi pH của môi trường nuôi cấy

Nuôi vi sinh vật cần nghiên cứu trong môi trường lỏng ở nhiệt độ, pH thích hợp Sau các khoảng thời gian 0, 3, 6, 9, 12,15, 18,21, 24,27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48 giờ nuôi cấy tiến hành đo pH dịch nuôi bằng máy đo pH

2.2.2.7 Phương pháp xác định hoạt lực kháng khuẩn bởi bacterioxin bằng phương pháp khuếch tán thạch

Nuôi lỏng các chủng cần nghiên cứu trong môi trường thích hợp, sau 24h ở nhiệt

độ 300C, đem ly tâm canh trường vi khuẩn ở tốc độ 6000 v/p trong 20 phút Sau đó, thu lấy dịch đã ly tâm và chuẩn đến pH = 6 ÷ 6,5 nhằm loại bỏ khả năng kháng khuẩn bởi các hợp chất không phải là bacterioxin và cho qua màng lọc vô khuẩn có

Ølỗ = 0.22µm

Chuẩn đĩa thạch đục lỗ : bổ sung vi sinh vật chỉ thị vào môi trường thạch xốp MPA (ở nhiệt độ 45-500C), với tỉ lệ 150µl dịch chủng chỉ thị trong 30 ml môi trường MPA xốp, lắc đều và đổ vào đĩa pertri Đổ môi trường có chủng chỉ thị lên đĩa thạch với chiều dày 5 mm Đặt đĩa thạch vào tủ lạnh 40C khoảng 1h, sau đó dùng đầu côn có đường kính 9mm khoan các lỗ trên đĩa thạch, số lỗ này tuỳ theo chủng cần thử hoạt tính Dùng micropipet nhỏ vào mỗi lỗ 80 µl dịch đã ly tâm, sau

đó đặt các đĩa đã nhỏ dịch vào tủ lạnh 40C, để trong vòng 8h chờ khuếch tán dịch Tiếp theo chuyển đĩa vào tủ nuôi 300C, đọc kết quả sau 24h Khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị được xác định dựa vào hiệu số (D-d) mm với: D: đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

2.2.2.8 Phương pháp xác định mật độ tế bào (MĐTB) có trong chế phẩm

Cân 1g chế phẩm hoà vào 9ml nước cất vô trùng Tiến hành pha loãng kế tiếp dung dịch đến nồng độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4… Ứng với mỗi độ pha loãng tiến hành cấy trên 3 đĩa thạch MRS, nuôi ở 30oC, thời gian 48-72h Xác định số khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch Chỉ lấy kết quả đếm khuẩn lạc khi đạt được 30-330 khuẩn lạc/đĩa

Xác định mật độ tế bào của chế phẩm dựa trên số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/g như sau: CFU/g= (A.D)/(v.m)

Trong đó:

A: số khuẩn lạc trung bình từ các đĩa cấy cùng độ pha loãng

D: độ pha loãng của dịch

v: thể tich dịch pha loãng cấy trên 1 đĩa thạch (100µl)

m: khối lượng chế phẩm đem đi cân đê xác định mật độ tế bào (g)

2.2.2.9 Phương pháp xác định tỷ lệ tế bào sống sót (TLTBSS) của chế phẩm

TLTBSS = ( )

2

2 1 1

100

100

x W m

x W m

−

−

Trong đó:

x1: mật độ tế bào của chế phẩm trước khi sấy (tb/g chế phẩm ẩm)

x2: mật độ tế bào của chế phẩm sau khi sấy (tb/g chế phẩm khô)

m1 : khối lượng của chế phẩm trước khi sấy (g)

m2 : khối lượng của chế phẩm sau khi sấy (g)

W1 : độ ẩm của chế phẩm trước khi sấy (%)

W2 : độ ẩm của chế phẩm sau khi sấy (%)