Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật lên men dịch thủy phân từ sinh khối thực vật

Trong số những nguồn nguyên liệu sinh học có thể sử dụng cho sản xuất ethanol thì nguồn sinh khối thực vật giàu lignocellulose còn ít được khai thác.. Sản phẩm thu được của quá trình thu

KHỐI THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

MỞ ĐẦU

Hiện nay vấn đề nhiên liệu sinh học trở thành mối quan tâm hàng đầu của các quốc gia Một trong số các nguồn nhiên liệu sinh học được đề cập đến có tính ứng dụng cao là ethanol Ethanol là nguồn nhiên liệu sinh học (còn gọi là bio-ethanol) được sử dụng thay thế một phần nhiên liệu truyền thống Ethanol nhiên liệu là cồn tuyệt đối (hay còn gọi là cồn khan, có độ cồn 99,7 – 100 %)

Nhiên liệu hóa thạch là nguồn năng lượng chính cho nền kinh tế thế giới, tuy nhiên theo thời gian nguồn nhiên liệu này sớm muộn sẽ cạn kiệt Ngoài ra việc sử dụng nhiên liệu hóa thạch đã thải vào không khí một lượng rất lớn khí nhà kính (chủ yếu là CO2), việc này làm nhiệt độ không khí trái đất tăng lên, mực nước biển dâng cao Nếu không tích cực hành động có thể dẫn tới thiên tai, lũ lụt, hạn hán Chính vì những điều đó mà nhiều quốc gia, nhiều tập đoàn năng lượng trên thế giới đã có chiến lược kết hợp sử dụng tiết kiệm hiệu quả dầu mỏ, đồng thời đầu tư cho nghiên cứu sử dụng các dạng nhiên liệu sạch thay thế một phần xăng dầu, trong đó có nhiên liệu sinh học

Ở nước ta cồn được sản xuất chủ yếu từ nguồn nguyên liệu tinh bột và rỉ đường Sản lượng cồn hiện nay còn thấp và gặp nhiều khó khăn về nguồn nguyên liệu Trên thế giới, việc nghiên cứu sử dụng ethanol để pha với xăng dầu đã được tiến hành trong nhiều năm qua Ethanol nhiên liệu được đặc biệt chú ý ở các nước có nền nông nghiệp phát triển và là mục tiêu hướng đến của đa số quốc gia có nhu cầu tiêu thụ năng lượng lớn (World ethanol production, 2008-2012)

Theo (Prasad et al., 2006) các loại vật liệu thô chứa đường hoặc vật liệu có thể chuyển hoá thành đường đều được sử dụng làm cơ chất lên men sinh ethanol Vật liệu thô bao gồm: Nguyên liệu chứa tinh bột, nguyên liệu chứa cellulose, phế thải nông nghiệp và nguyên liệu chứa đường

Sinh khối thực vật là nguồn năng lượng to lớn đối với toàn bộ sự sống trên hành tinh của chúng ta Phần lớn sinh khối thực vật thải ra từ hoạt động nông - lâm nghiệp, công nghiệp gỗ, chế biến bột giấy đều bị xem như là “chất thải” và gây ra ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, nguồn vật liệu này có thể chuyển hoá thành các sản

phẩm mang giá trị kinh tế cao, có thể ứng dụng cho nhiều ngành công nghiệp như: hoá chất, nhiên liệu, thức ăn gia súc và dinh dưỡng cho con người

Trong số những nguồn nguyên liệu sinh học có thể sử dụng cho sản xuất ethanol thì nguồn sinh khối thực vật giàu lignocellulose còn ít được khai thác Để có thể sản xuất ethanol thì sinh khối thực vật cần được thủy phân thành đường đơn và sau đó hỗn hợp đường hexose (chủ yếu là glucose) và pentose (chủ yếu là xylose) sẽ được lên men thành ethanol Việc sử dụng nguồn sinh khối thực vật như: bã mía, rơm rạ, phế thải công nghiệp (mùn cưa, mật rỉ) cho sản xuất ethanol không ảnh hưởng tới an ninh lương thực

Sản phẩm thu được của quá trình thuỷ phân sinh khối thực vật là hỗn hợp các loại đường khác nhau (chủ yếu là glucose và xylose trong đó xylose chiếm 20 – 30% lượng đường tạo ra) dùng làm nguyên liệu lên men ethanol Bản thân việc lên men đường xylose cũng gặp nhiều khó khăn bởi có rất ít các chủng vi sinh vật có khả năng thực hiện công đoạn này một cách hiệu quả (Võ Hồng Nhân và cộng sự., 1993)

Nhìn chung ethanol có thể được tạo ra từ sự lên men các loại đường bởi các vi sinh vật: Vi khuẩn và nấm men (Hahn- Hagerdal B et al., 2006) Vì vậy việc tìm các chủng vi sinh vật có khả năng lên men ethanol từ 2 nguồn đường glucose, xylose là

có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tiễn

Với mục đích hướng tới sản xuất cồn nhiên liệu từ sinh khối thực vật chúng

tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tuyển chọn và nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật lên men dịch thủy phân từ sinh khối thực vật” Với

các nội dung chính như sau:

¾ Tuyển chọn các chủng có khả năng lên men đường pentoza (xyloza)

¾ Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn tuyển chọn

¾ Phân loại định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên đặc điểm sinh lý, sinh hóa và trình tự gen 16S rARN

¾ Đánh giá khả năng lên men ethanol các nguồn đường

¾ Nghiên cứu động học quá trình lên men của chủng vi khuẩn

¾ Nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng và khả năng lên men sinh ethanol của chủng vi khuẩn

¾ Đánh giá bước đầu khả năng lên men dịch thuỷ phân từ sinh khối thực vật (dịch thuỷ phân từ gỗ) của chủng tuyển chọn

Đề tài được thực hiện tại Phòng Công nghệ vật liệu sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam, với sự hỗ trợ kinh phí từ

đề tài: “Nghiên cứu áp dụng công nghệ hiện đại để sản xuất ethanol nhiên liệu

từ gỗ phế liệu nguyên liệu giấy”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sinh khối thực vật

Sinh khối thực vật hay còn gọi là biomass bao gồm: các loại sản phẩm cây

trồng như gỗ, phế phụ phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp giấy…Các nguyên liệu này chứa thành phần chủ yếu là cellulose, hemicelluloses và lignin Quá trình sản xuất ethanol có thể thực hiện trên nhiều loại cơ chất khác nhau,

có thể phân loại các nguyên liệu lên men thành 3 dạng chính: nguyên liệu chứa tinh bột, nguyên liệu chứa đường và sinh khối thực vật Về mặt bản chất các loại nguyên liệu này đều chứa hydratcacbon, cơ chất chủ yếu cho lên men ethanol (Prasad et al., 2006), (Cardona và Sanchez, 2007)

- Nguyên liệu chứa tinh bột

Nguyên liệu chứa tinh bột bao gồm: các loại ngũ cốc như ngô, gạo, đại mạch,

khoai tây, khoai lang, sắn…Những nguyên liệu này đã được ứng dụng rộng rãi trong lên men cồn công nghiệp Một số nước điển hình như Mỹ sản xuất cồn chủ yếu từ ngô, Thái Lan sản xuất từ sắn và ở nước ta nấu rượu cổ truyền chủ yếu từ nguyên liệu sắn, gạo, ngô…Ngày nay, việc sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột gặp phải nhiều trở ngại, do đây là nguồn lương thực chủ yếu phục vụ đời sống con người Vì vậy, việc mở rộng sản xuất cồn nhiên liệu sẽ có tác động tiêu cực đến an ninh lương thực trên toàn thế giới

- Nguyên liệu chứa đường

Nguyên liệu chứa đường bao gồm: mía đường, củ cải đường và rỉ mật Rỉ mật

là một phụ phẩm của ngành sản xuất đường Khoảng 75% tổng rỉ mật của thế giới

được sản xuất từ mía (Saccharum officinarum) và đa phần còn lại có từ củ cải đường

(Beta vulgaris) Mía được trồng ở các nước nhiệt đới (Châu Á và Nam Mỹ), còn củ

cải đường có nguồn gốc ở các vùng ôn đới (Châu Âu và Bắc Mỹ) Thành phần chính của rỉ mật là đường sucrose và lượng nhỏ đường glucose, fructose Nói chung, sản lượng rỉ mật bằng khoảng 1/3 sản lượng đường sản xuất Cứ khoảng 100 tấn cây mía đem ép thì có 3 - 4 tấn rỉ mật được sản xuất Brazil, Cu ba, Ấn Độ sản xuất ethanol

chủ yếu từ mía đường Trong khi đó ở Pháp lại chủ yếu sử dụng nguyên liệu củ cải đường

- Sinh khối thực vật

Trong số những nguồn nguyên liệu sinh học có thể sử dụng cho sản xuất ethanol, nguyên liệu cellulose thực sự dồi dào và ít được khai thác Sản lượng sinh khối thực vật toàn cầu hàng năm vào khoảng 200 tỷ tấn, và 90% trong số đó là lignocellulose Có khoảng 8 - 20 tỷ tấn trên thực tế có thể sử dụng để sản xuất ethanol Mặc dù đã có nhiều cố gắng việc sản xuất ethanol từ nguồn tài nguyên tái sinh này trên quy mô công nghiệp còn gặp nhiều khó khăn

Sinh khối thực vật giàu lignocellulose là nguyên liệu phức tạp hơn nhiều so với tinh bột Thành phần chủ chốt của chúng bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin gắn kết chặt chẽ với nhau bởi những liên kết hydro và liên kết đồng hóa trị Để

có thể sản xuất ethanol, các polysaccarit này cần được thủy phân thành đường đơn và sau đó hỗn hợp đường hexose (chủ yếu là glucose) và pentose (chủ yếu là xylose) sẽ được lên men thành ethanol Việc thủy phân lignocellulose theo con đường hóa học

và enzyme đều không đơn giản Ngoài ra, trong quá trình thủy phân sử dụng axit (một công đoạn không thể thiếu trong các công nghệ hiện có) còn phân hủy một lượng đáng kể các đường tạo thành những chất độc hại như furfuran (tới 60% tùy theo chế độ thủy phân) đối với vi sinh vật trong công đoạn lên men tiếp theo Bản thân việc lên men đường xylose (chiếm 20 - 30% lượng đường tạo ra) thành ethanol cũng gặp nhiều khó khăn bởi có rất ít các chủng vi sinh vật có khả năng thực hiện công đoạn này một cách hiệu quả

So sánh khả năng sản xuất cồn từ các nguồn nghuyên liệu khác nhau (bảng 1.1) cho thấy, sinh khối thực vật cho sản lượng ethanol tương đối cao chỉ xếp sau ngô, gạo, đại mạch và lúa mì Đây là điều thực sự đáng mừng, nhằm giải quyết một lượng lớn phế thải từ các hoạt động nông, lâm nghiệp nhằm bảo vệ môi trường Theo (Bohlamann, 2006) Sinh khối thực vật có thể sản xuất trên 442 tỷ lít ethanol mỗi năm

Bảng 1.1 Năng suất cồn từ các nguyên liệu (Linoj Kumar N.V et al., 2006)

ethanol (l/tấn)

Củ cải đường 110 Khoai tây đường 125

Sắn 180 Ngô 360 Gạo 430 Đại mạch 250

Cao lương 60

Bã mía và sinh khối thực vật 280

1.2 Các qui trình thuỷ phân sinh khối thực vật

1.2.1 Thủy phân bằng axit

1.2.1.1 Tiền xử lý nguyên liệu bằng axit đặc

Công nghệ này dựa trên việc sử dụng axit đặc để phá hủy cấu trúc tinh thể của cellulose sau đó thủy phân bằng axit loãng Các khâu tách axit khỏi đường, thu hồi

và cô đặc axit là những công đoạn mấu chốt của quy trình Trong công nghệ này, axit đặc sẽ phá hủy các liên kết hydro giữa các mạch cellulose sẽ hình thành trạng thái dạng gelatin với axit trở nên rất mẫn cảm với phản ứng tự thủy phân Sau khi pha loãng với nước và dưới tác động của nhiệt cellulose sẽ nhanh chóng bị thủy phân thành glucose

Năm 1937 người Đức đã xây dựng và đưa vào hoạt động một số nhà máy sản xuất cồn theo công nghệ thủy phân bằng axit đặc sử dụng axit clohydric Vào năm

1948 người Nhật đã phát triển công nghệ sử dụng axit sulfuric đặc và sản xuất ở quy

mô thương mại Họ đã đưa vào một công nghệ lọc màng mới khi đó cho phép phân tách axit khỏi dung dịch đường với khả năng thu hồi 80% lượng axit sử dụng Công nghệ thủy phân bằng axit đặc được tiếp tục phát triển dưới sự tài trợ của Bộ Nông

nghiệp Hoa Kỳ trong những năm của thập niên 1940 và 1980

Trong quy trình xử lý nguyên liệu này sinh khối thực vật có hàm ẩm 10% được xử lý bằng axit sulfuric nồng độ 70 - 77% Lượng axit sử dụng so với sinh khối

là 1,25:1 và nhiệt độ được giữ ở mức dưới 500C Sau đó nước được bổ sung để pha loãng axit tới nồng độ 20% - 30% và gia nhiệt tới 100oC và giữ trong 1h để quá trình thủy phân có thể diễn ra Dịch dạng gel được lấy ra khỏi bể phản ứng và lọc ép để lấy dịch đường và axit Phần chất rắn còn lại sẽ được tái thủy phân lần 2 Dịch đường

và axit sẽ được phân tách sử dụng cột sắc ký Công đoạn lên men tiếp theo có thể chuyển hóa được đường thành ethanol với hiệu suất 85% với xylose và 92% với glucose Arkenol tuyên bố rằng có thể thu hồi được 97% axit trong quy trình sản xuất của mình (Võ Hồng Nhân và cộng sự., 1993)

1.2.1.2 Tiền xử lý nguyên liệu bằng axit loãng

Quá trình thủy phân được thực hiện thông qua 2 giai đoạn Giai đoạn đầu được thực hiện ở chế độ tương đối ôn hòa cho việc thủy phân hemicellulose trong khi đó giai đoạn sau sẽ được thích ứng để thủy phân dạng polysacarit bền vững hơn nhiều đó là cellulose Dịch thủy phân từ mỗi quá trình được thu hồi, trung hòa và lên men tạo ethanol Công nghệ sản xuất ethanol dựa trên công nghệ thủy phân dùng axit loãng được người Đức phát triển từ trước Đại chiến thế giới Lần thứ I Công nghệ này đã được thương mại hóa ở Mỹ thông qua một quy trình cải biến với một bước thủy phân Hiệu suất của công nghệ này chỉ đạt 125 lít cồn/tấn nguyên liệu, tuy nhiên với thời gian thủy phân ngắn hơn rất nhiều Tất cả các nhà máy sản xuất cồn từ gỗ kể trên đã đóng cửa sau Đại chiến I do khả năng cạnh tranh thấp và nhu cầu không còn Năm 1932, người Đức phát triển công nghệ thủy phân theo nguyên lý “dòng chảy”

sử dụng axit sulfuric loãng Trong công nghệ này axit loãng được bơm qua lớp nguyên liệu và được gọi là công nghệ Scholler Mặc dù hiệu suất thu hồi đường glucose cao (khoảng 70%) phương pháp vẫn có nhược điểm là nồng độ đường trong dịch thủy phân thấp

Trong giai đoạn thủy phân nguyên liệu được xử lý bằng dung dịch axit sulfuric 0,7% ở nhiệt độ 190oC với thời gian lưu là 3 phút Công đoạn tiếp theo được thực hiện ở 215oC với nồng độ axit là 0,4% và thời gian lưu 3 phút Dịch thủy phân

từ mỗi quá trình được thu hồi, trung hòa và lên men tạo ethanol Cellulose và lignin còn lại ở dạng rắn được sử dụng làm nhiên liệu cho hoặc sản xuất hơi và điện

(Neureiter M et al., 2002), (Sun Y Cheng J., 2005), (Võ Hồng Nhân và cộng sự., 1993)

1.2.2 Thủy phân bằng enzim

Cellulase là những enzyme thủy phân cellulose, các enzyme này được tạo ra ở rất nhiều sinh vật khác nhau như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, thực vật, côn trùng… Cellulase có thể tồn tại dưới dạng enzyme đơn hay phức hệ enzyme còn được gọi là cellulosome Dựa vào cơ chế xúc tác, cellulase được chia làm 3 loại chính: 1) endoglucanase hay 1,4-β-D-Glucan-4-Glucanohydrolase; 2) exoglucanase và 3) β-Glucosidase Trong sản xuất ethanol từ biomass, khả năng ứng dụng enzyme cụ thể nhất là thay thế công đoạn thủy phân dùng axit bằng thủy phân dùng enzyme Với việc phân chia rõ ràng giai đoạn thủy phân và lên men hiện nay thường được gọi tắt

là SHF (Separate Hydrolysis and Fermentation)

Một trong những cải biến quan trọng trong ứng dụng enzyme là công nghệ kết hợp cả hai quá trình đường hóa và lên men trong cùng một công đoạn, hay còn gọi tắt là SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) Trong quy trình SSF, enzyme cellulase và vi sinh vật lên men cồn được sử dụng đồng thời Lượng đường tạo ra bởi enzyme tức thời được chuyển hóa thành ethanol So với SHF, SSF có thể làm tăng hiệu suất chuyển hóa cellulose thành ethanol lên 40% Một trong những khó khăn là sự khác nhau trong nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cellulase (45 - 55oC) và nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật lên men ethanol (28 - 35oC) Ngoài

ra, một số thành phần của dịch thủy phân cũng như ethanol tạo ra cũng có tác động

ức chế lên enzyme cellulase (Farrell AE et al., 2006), (Ghosh P Ghose TK., 2003), (Jones AM et al., 1994), (Lee J., 1997), (Rausch KD Belyea RL., 2006), (Lin Y

Tanaka S., 2006) (Jones AM et al., 1994), (Võ Hồng Nhân và cộng sự., 1993)

1.2.3 Dịch thuỷ phân từ sinh khối thực vật

Nguyên liệu chứa cellulose hay còn gọi là biomass bao gồm: các loại sản phẩm cây trồng như gỗ, phế phụ phẩm nông nghiệp, sản phẩm phụ của công nghiệp giấy… Sản xuất ethanol từ phế phụ phẩm nông nghiệp bao gồm các giai đoạn chính như: xử lý và thủy phân nguyên liệu thành đường đơn, lên men nhờ vi sinh vật, lọc

dịch lên men và tiến hành cất cồn (Gomez LD et al., 2008), (Moon HC et al., 2009) Trong đó, công đoạn chủ chốt và quyết định hiệu quả sản xuất cồn nhiên liệu từ biomass là thủy phân nguyên liệu thành đường Hiện nay có nhiều hướng tiếp cận vấn đề này là thủy phân nguyên liệu thông qua tiền xử lý axit và kiềm, nổ hơi phá vỡ cấu trúc, xử lý bằng nước nóng, sử dụng các hóa chất như CO2 và chuyển hóa sinh học nhờ các enzyme thủy phân (Sanchez OJ Cardona CA., 2008) Phương pháp sử dụng axit và kiềm loãng kết hợp quá trình gia nhiệt được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi nhất Axit có vai trò loại bỏ các hemicellulose và tạo ra sản phẩm như xylose, arabinose, glucose, furfural và một phần lignin hòa tan…(Lavarack BPet al., 2002) Một số axit được sử dụng như axit hydrocloric, axit peractic, nitric, phosphoric (Balat M., 2008), (Sassner P et al., 2008), (Wei., bioethanol production),

và phổ biến nhất là axit sulfuric (Lloyd TA Wyman CE., 2005) (Sassner P et al.,2008), (Wei., bioethanol production) Vai trò của kiềm là loại bỏ lignin khỏi cấu trúc lignocellulose tạo điều kiện thuận lợi cho enzyme cellulase tương tác với cellulose (Pandey A et al.,2000) Ngoài ra, tiền xử lý bã mía dưới tác động của kiềm

sẽ phá vỡ cấu trúc thành tế bào thông qua các hoạt động như: hòa tan hemicellulose, lignin và silic; thủy phân uronic và ester acetic; làm trương nở cellulose và cuối cùng

là dẫn đến phá vỡ cấu trúc tinh thể cellulose

1.2.4 Thành phần dịch thuỷ phân

Sản phẩm thu được của quá trình thuỷ phân sinh khối thực vật là hỗn hợp các loại đường khác nhau (chủ yếu là glucose và xylose trong đó xylose chiếm 20 – 30% lượng đường tạo ra) dùng làm nguyên liệu lên men ethanol

Trong quá trình tiền xử lý, bên cạnh các sản phẩm chính, một số sản phẩm phụ cũng được hình thành như: aliphatic acids (acetic, formic and levulinic acid), các đồng phân của furan, các hợp chất của axit phenolic, furfural Đây là những sản phẩm phụ ảnh hưởng đến hoạt động sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào nấm mem, làm giảm đáng kể hiệu suất và thậm chí có thể gây ức chế hoàn toàn quá trình lên men, làm giảm đáng kể hiệu suất và thậm chí có thể gây ức chế hoàn toàn quá trình lên men Theo một số nghiên cứu, các chất này gia tăng khi quá trình tiền xử lý

hóa học được kết hợp với nhiệt độ cao Pattra và cộng sự đã nghiên cứu và chỉ ra Furfural được hình thành từ quá trình thủy phân đường pentose và hàm lượng Furfural tạo thành tỉ lệ thuận với nồng độ axit sulfuaric sử dụng (Pattra S et al., 2008) Một sản phẩm phụ là axit acetic cũng gây hiệu ứng ức chế lên men khi nồng

độ trong khoảng 4-10 g/l, axit này được tạo thành trong quá trình thủy phân các gốc acetyl của hemicelluloses (Rodriguez-Chong A et al., 2004)

Tùy vào loại axit và nồng độ sử dụng trong tiền xử lý nguyên liệu, hiệu quả thủy phân hemicelluloses trong lignocelluloses có thể đạt 60 - 90% Khi nồng độ axit

> 1,5%, bên cạnh vai trò loại bỏ hemicelluloses, axit sẽ có tác động lên cả thành phần cellulose và làm gia tăng các độc tố trong dịch thủy phân

1.2.5 Qui trình sản xuất E từ sinh khối thực vật

Theo (Balat et al., 2008), quá trình chuyển đổi cellulose và hemicellulose có trong sinh khối thực vật thành các loại đường đơn là một quá trình phức tạp

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ chuyển hoá từ sinh khối thực vật đến ethanol

1.2.6 Các tính chất của ethanol nhiên liệu

Ethanol là một loại nhiên liệu thay thế có triển vọng bởi nó là nguồn tài

nguyên sinh học có thể hồi sinh, nó bão hoà oxy, bởi vậy việc sản xuất E làm nguyên

liệu thay thế làm giảm sức nén đánh lửa của động cơ (Hansen et al., 2005) Ethanol

có chỉ số octane cao hơn, khả năng bắt lửa tốt, tốc độ cháy nhanh hơn và tốc độ bốc

hơi nhanh hơn so với dầu xăng Từ những tính chất này cho phép E có mức độ nén

cao hơn, thời gian đốt ngắn hơn vì vậy nó dẫn đầu về lý thuyết có khả năng vượt trội

xăng dầu trong việc đốt cháy động cỏ (Balat et al., 2008), tuy nhiên E nhiên liệu

cũng có những điểm bất lợi như: Tỷ trọng thấp hơn xăng dầu, tính ăn mòn thấp, tốc

độ cháy sáng thấp, tốc độ bay hơi thấp, tan được trong nước và gây độc đến hệ sinh

thái (Maclean và Lave,2003)

Bảng 1.2 Một số tính chất của E so với xăng dầu (Properties of Fuels, 2010)

1.3 Chủng vi sinh vật lên men cồn từ dịch thủy phân sinh khối thực vật

Trong tự nhiên, rất nhiều vi sinh vật có thể sử dụng đường 5 và đường 6

carbon làm nguồn dinh dưỡng, do đó nó có thể lên men chuyển hóa các đường này

thành ethanol Một số vi sinh vật lên men ethanol phổ biến như Saccharomyces

cerevisiae; Zymmomonas mobilis; E coli… Để sàng lọc và lựa chọn chủng vi sinh

vật có thể sử dụng trong sản xuất công nghiệp, các vi sinh vật phải đáp ứng một số

tiêu chí nhất định: Có thể sử dụng dải cơ chất rộng; Có khả năng phát triển và lên

men với hiệu suất cao; Sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men tối thiểu; Có

khả năng chịu độ cồn cao, pH thấp và nhiệt độ cao, khả năng sinh trưởng trên môi

trường rẻ tiền… (Đỗ Huy Định., 2003)

Trong công nghiệp, nấm men Saccharomyces cerevisiae được sử dụng phổ

biến nhất, vì nó có nhiều đặc điểm đáp ứng được các tiêu chí trên Ngày nay, bằng phương pháp công nghệ gen, người ta đã tạo ra rất nhiều chủng có khả năng lên men

đồng thời nhiều loại đường khác nhau như Saccharomyces cerevisiae tái tổ hợp

nhằm tạo ra chủng có khả năng lên men pentose (Tatirungkij M et al., 1993), (Amore

R et al., 1989), (Kotter P Ciriacy M , 1993), (Sarthy AV et al., 1987), (Deng XX et al., 1990)

1.3.1 Nấm men

Nấm men là đối tượng được quan tâm trước hết trong lên men ethanol, đặc

biệt là nấm men S cerevisiae Chúng là dạng nấm men đơn bào mang nhiều đặc

điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển, tế bào dạng hình cầu, bầu dục, elip, hoặc hơi dài, với kích thước 3 - 7 x 4 - 12 cm, khuẩn lạc nhẵn bóng, tròn, màu kem

Nấm men S cerevisiae có đặc điểm sinh trưởng kị khí không bắt buộc, chúng vừa có khả năng hô hấp và lên men ethanol Sinh trưởng kị khí nghiêm ngặt ở S cerevisiae

chỉ xảy ra qua một vài thế hệ, vì sự tổng hợp sterol cần cho cấu trúc màng tế bào đòi hỏi phải có khí O2

Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp tới sự sinh sản, phát triển nấm men, tốc độ lên men và chất lượng ethanol Nấm men có thể chịu được nhiệt độ từ 4 - 45oC, nhưng nhiệt độ phù hợp cho sự sinh sản và phát triển của nấm men là 24 - 30oC Ngoài ra, nhiệt đố quá thấp hoặc quá cao đều làm cho quá trình lên men bị dừng trong khi hàm lượng đường trong dung dịch lên men còn cao Nhiệt độ phù hợp cho quá trình lên men rượu truyền thống từ gạo là 24 - 28oC và việc duy trì nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình lên men là rất cần thiết (Nguyễn Thành Đạt., 1999)

Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong môi trường có pH từ 2,5 - 7,5, nhưng pH phù hợp nhất với sinh sản và phát triển của nấm men là 4,0 - 6,0 Vì vậy,

để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển của nhiều loại vi khuẩn, phù hợp với sinh trưởng của nấm men, trong nhân giống và sản xuất pH luôn được duy trì ở mức 5,0 - 6,0

Nấm men S cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose,

galactose, đường đôi như sucrose hoặc đường ba như raffinose Nấm men đạt tốc độ sinh trưởng nhanh nhất khi hàm lượng đường trong dịch lên men là 1 - 2% Hàm lượng đường phù hợp cho quá trình lên men rượu là 16 - 20%, hàm lượng đường 28% sẽ ức chế quá trình lên men Tỷ lệ các loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng không nhỏ tới tốc độ và hiệu suất lên men (Anna Kokova – Kratochvilova.,1990) Ngoài ra nấm men này có khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao, ở 38% đường tế bào nấm men không bị phá vỡ

Nồng độ oxy hòa tan là điều kiện quan trọng cho giai đoạn sinh sản và phát triển của nấm men, quyết định đến hiệu suất và chất lượng rượu Hàm lượng oxy hòa tan phù hợp cho sinh sản và phát triển của nấm men thường là: 0,65 - 0,70 mg/l Khi môi trường có đầy đủ oxy nấm men sẽ sử dụng đường làm nguồn năng lượng tăng sinh khối Ngược lại khi môi trường thiếu oxy, nấm men lên men và chuyển hóa đường thành rượu Vì vậy khi lên men rượu để có được hiệu suất lên men cao nhất, đồng thời hạn chế quá trình tạo aldehyl, rượu bậc cao, axeton… có trong rượu thành phẩm, cần phải hạn chế tối đa sự có mặt của oxy có trong dịch lên men (Anna Kokova – Kratochvilova.,1990)

Mỗi chủng nấm men có khả năng chịu được nồng độ cồn khác nhau, một số

chủng chỉ chịu được cồn ở nồng độ thấp như: Hansenula, Alanama… Nhưng nấm men S cerevisiae lại có khả năng chịu cồn tới 18 - 20% Trong quá trình lên men

rượu, nồng độ cồn tăng dần sẽ ức chế không chỉ các hoạt động của nấm men mà còn kìm hãm hoạt động của nhiều loại enzyme chuyển hóa đường thành rượu (Anna Kokova – Kratochvilova.,1990) Các chủng này thường lên men ethanol với độ cồn đạt được từ 10 - 15% ở pH 3,5 - 4,0 trong dải nhiệt độ từ 32 - 38oC Với năng lực lên

men cao và là đối tượng được tìm hiểu kỹ nhất, nấm S cerevisiae là ứng cử viên tiềm

năng nhất cho công đoạn chuyển hóa glucose thành ethanol trong sản xuất cồn nhiên liệu từ sinh khối

1.3.2 Vi khuẩn

Một loại vi khuẩn gram âm khá đặc biệt cũng nhận được nhiều sự quan tâm là

Zymomonas mobilis Loại vi khuẩn này có khả năng lên men đồng hình sinh ethanol

và chịu được độ nồng độ cồn tới 120 g/l Vi khuẩn Zymomonas là loại vi sinh vật duy

nhất sử dụng glucose trong điều kiện yếm khí theo con đường Entner-Doudoroff (ED) trong khi đa số vi sinh vật khác sử dụng con đường Embden-Meyerhof (EM) Con đường ED tạo ra lượng ATP chỉ bằng một nửa so với EM trên cùng một lượng

glucose và do vậy, Zymomonas tạo ra ít sinh khối hơn và lượng glucose chuyển trực tiếp thành ethanol cũng cao hơn Hiệu suất sinh ethanol của Zymomonas khoảng 5 -

10% cao hơn so với S cerevisiae trên cùng một lượng glucose lên men Vi khuẩn Z mobilis là loại vi sinh vật không gây độc hại cho con người và không đòi hỏi những

điều kiện nuôi cấy ngặt nghèo như nhiều vi khuẩn khác Trong những năm

1970-1980 một số nhà khoa học còn cho rằng Z mobilis ưu việt hơn so với S cerevisiae trong sản xuất cồn Tuy nhiên, trong thực tế sản xuất S cerevisiae vẫn là vi sinh vật

được lựa chọn (Lawford HG Rousseau JD., 2003)

Một trong những khó khăn khi lên men dịch thủy phân sinh khối thực vật là rất ít vì sinh vật có khả năng lên men xylose (chiếm 20 - 30% lượng đường tạo ra)

Nấm men S cerevisiae không có khả năng lên men xylose ở các mức độ khác nhau Hiện nay nấm men Pachysolen tannophilus đang được sử dụng trong lên men dịch

thủy phân hemicellulose (sản phẩm chủ yếu là xylose) để tạo ethanol Tuy nhiên nấm

men P tannophilus không tích lũy được quá 2% ethanol trong canh trường và điều

này là hạn chế rất lớn trong sản xuất Chính vì những lý do đó hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện đặc tính chủng giống theo hướng

chuyển các gen cần thiết cho khả năng lên men xylose vào S cerevisiase

Đã có một số thành tựu nhất định đạt được trong lĩnh vực này, tuy nhiên để tiếp cận được với sản xuất công nghiệp những chủng giống này còn phải có được cải thiện nhiều hơn nữa Một trong những hướng nghiên cứu cũng được thực hiện khá

tích cực là tạo những chủng E coli tái tổ hợp có khả năng lên men đồng thời nhiều loại đường và phát triển được trên những môi trường có thành phần đơn giản hơn

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Carbon là thành phần cơ bản xây dựng nên tế bào nấm men Carbon có trong

tế bào chất, trong thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Vì vậy, các hợp chất chứa cacbon chiếm vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sống của nấm men, chúng đáp ứng được ba nhu cầu chính sau đây: i) Sản sinh năng lượng; ii) Tạo thành các tiền chất; iii) Thực hiện các quá trình oxy hóa khử để biến những tiền chất thành những sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm cuối để xây dựng tế báo hoặc tích tụ trong môi trường

1.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Trong quá trình sống, nấm men cũng như tất cả các cơ thể sống kháng ddeeni cần nitơ để xây dựng tế bào Hầu hết các thành phần của tế bào đều chứa nitơ (protein, nucleotide, enzyme…) Các thành phần này được tạo thành nhờ quá trình trao đổi cacbon và nitơ Do đó môi trường nuôi cấy nấm men cần phải cung cấp đầy

đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hóa Việc lựa chọn nguồn nitơ sử dụng cũng hết sức quan trọng, nấm men đồng hóa các muối amoni, urê và nguồn nitơ hữu cơ đều tương tự nhau và gắn với việc tách NH3 rồi hấp thụ vào tế bào (Nguyễn Đức Lượng Nguyễn Phượng Hải., 2000)

1.4.3 Ảnh hưởng của nguồn phosphate

Phosphate đóng vai trò quan trọng trong trao đổi chất của tế bào nấm men Phosphate chiếm 1/2 tổng lượng chất tro, nó tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân, hạt nhiễm sắc thể, các enzyme… Các hợp chất hữu cơ quan trọng trong tế bào

là hexo-mono phosphat, axit glycerin phosphat, dihydroxylaceto phosphate, các nucleic, co-enzyme, riboflavin, phospho-lipid Vì vậy, trong môi trường nuôi cấy phải đủ hàm lượng phospho để nấm men phát triển bình thường Sự thay đổi các hợp chất phospho của môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi các quá trình tổng hợp một số thành phần của tế bào có chứa phospho, tế bào chất và nhân Ngoài ra, phospho trong môi trường còn có tác dụng điều chỉnh hoạt tính hệ enzyme đồng hóa các hợp chất cacbon

Nguồn phosphate sử dụng trong nuôi cấy nấm men thường là các hợp chất phosphate hữu cơ (bã rượu, cao ngô…) và vô cơ (các muối phosphate, môn hoặc di kali phosphate, amon phosphate, super phosphate…) Nhu cầu về phosphate của nấm men triển để tạo ra mật độ tế bào cần thiết để đẩy nhanh quá trình khởi động lên men cũng như rút ngắn thời gian lên men lúc sau Sau giai đoạn đầu thì sự có mặt của oxy lại là tác nhân kìm hãm lên men rượu gây giảm hiệu suất

Đối với quá trình nhân giống (lên men thu sinh khối) sự khuấy trộn hay sục khí rất có lợi bởi ngoài việc cung cấp oxy cho nấm men nó còn có tác dụng đẩy nhanh các chất độc hại (sản phẩm trao đổi chất) ra khỏi môi trường Mặt khác sự đảo trộn còn có tác dụng giúp tăng cường diện tích tiếp xúc giữa tế bào và môi trường dịch thể đồng thời ngăn cản sự kết lắng của tế bào Để thực hiện được điều này, trong các thiết bị lên men người ta lắp đặt hệ thống các cánh khuấy và hệ thống sục khí Không khí trước khi bơm vào nồi lên men phải xử lý để đảm bảo sạch về cơ học (không bụi) và vô trùng bằng cách cho đi qua hệ thống lọc (màng lọc)

1.4.4 Ảnh hưởng của lượng giống tiếp

Trong sản xuất rượu etylic, lượng men giống thường chiếm 10% tổng thể tích dịch lên men Lượng men giống tăng thì quá trình lên men cũng tăng nhưng đến một giới hạn nào đó thì sự tăng lượng men giống không làm tăng quá trình lên men nữa

mà khi đó sẽ xảy ra sự cạnh tranh của nấm men về môi trường dinh dưỡng Kết quả

là hiệu suất lên men giảm xuống

1.5 Hiện trạng về nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu sinh học

1.5.1 Nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu sinh học ở Việt Nam

Cây trồng cây cung cấp nguyên liệu, sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học

là một vấn đề mới đối với Việt Nam Vừa qua Bộ Công nghiệp đã xây dựng đề án Phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn 2020, với mục tiêu sản xuất xăng E10 và dầu sinh học nhằm thay thế một phần nhiên liệu truyền thống hiện nay Theo đề án, trong giai đoạn 2006-2010, Việt Nam sẽ tiếp cận công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học, xây dựng mạng lưới thí điểm phân phối nhiên liệu sinh học tại

một số tỉnh, thành, quy hoạch vùng trồng cây nguyên liệu cho năng suất cao, đào tạo cán bộ chuyên sâu về kỹ thuật

Giai đoạn 2011-2015, sẽ phát triển mạnh sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu truyền thống, mở rộng quy mô sản xuất và mạng lưới phân phối phục vụ cho giao thông và các ngành sản xuất công nghiệp khác, đa dạng hóa nguồn nguyên liệu Đến năm 2020, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học

ở Việt Nam sẽ đạt trình độ tiên tiến trên thế giới, với sản lượng đạt khoảng 5 tỷ lít xăng E10 và 500 triệu lít dầu diesel sinh học B10/năm Theo các chuyên gia, xăng E10 là xăng pha cồn với hàm lượng cồn tối đa là 10%, đáp ứng hoàn toàn mọi hoạt động bình thường của ô tô, xe máy Dầu diesel sinh học luôn được pha trộn vào dầu

DO, với tỷ lệ phổ biến 5-30%, để giảm bớt ô nhiễm môi trường

Từ tháng 8-2007 một hệ thống sản xuất nhiên liệu sinh học từ dầu ăn phế thải với công suất 2 tấn/ngày sẽ được triển khai tại Công ty Phú Xương thành phố Hồ Chí Minh Dự án được triển khai với nguyên liệu đầu vào từ 4-5 tấn/ngày.Theo ước tính giá dầu là 7.500 đồng/lít thấp hơn giá bán diesel trên thị trường khoảng 400 đồng/lít

Bộ Công nghiệp đang triển khai công nghệ sản xuất các loại hóa chất, phụ gia cần thiết để pha chế nhiên liệu sinh học với xăng Các đơn vị thuộc bộ sẽ ứng dụng

và làm chủ công nghệ sản xuất các chất phụ gia, chất xúc tác để pha chế xăng với ethanol và diesel sinh học và diesel khoáng, triển khai sản xuất các hóa chất, phụ gia cung cấp cho các cơ sở pha chế Dự kiến năm 2011-2015 mở rộng cơ sở sản xuất phụ gia và bảo đảm cho nhu cầu trộn xăng E5/E10, dầu B5/B10 Tổng kinh phí dự kiến cho dự án này là 20 tỷ đồng Việt Nam

1.5.2 Hiện trạng nghiên cứu và sản xuất nhiên liệu sinh học trên thế giới

Theo thông tin của EU tháng 1-2007 tiêu thụ năng lượng toàn cầu đã tăng lên gấp đôi, từ 10 tỷ tấn qui ra dầu/năm tăng lên 22 tỷ tấn qui dầu/năm vào năm 2050 Giáo

sư Nghê Duy Đấu, Viện sĩ công trình Đại học Thanh Hoa (Bắc Kinh) cho biết theo

Bộ Năng lượng Mỹ và Ủy ban Năng lượng thế giới dự báo nguồn năng lượng hóa

thạch không còn nhiều: dầu mỏ còn 39 năm, khí thiên nhiên 60 năm, than đá 111 năm

Theo Trung tâm năng lượng ASEAN nhu cầu tiêu thụ năng lượng của khu vực này năm 2002 là 280 triệu tấn và tăng lên 583 triệu tấn vào năm 2020 Indonesia

là nước có nguồn năng lượng hóa thạch lớn nhất trong các nước ASEAN, tuy nhiên hiện nay dầu mỏ dự trữ của họ chỉ còn trong 25 năm, khí đốt 60 năm và than đá 150 năm

Ngày nay do thế giới phụ thuộc quá nhiều vào dầu mỏ và giá dầu biến động liên tục theo chiều tăng và sự cạn kiệt dần nguồn năng lượng hóa thạch và khí đốt nên việc tìm kiếm các nguồn năng lượng thay thế là việc làm có tính sống còn trong những thập kỷ tới, trong đó có năng lượng sinh học Vậy năng lượng sinh học là gì? Năng lượng sinh học bao gồm các nguồn năng lượng được sản xuất từ nhiều loại sản phẩm nông nghiệp khác nhau như thân, cành, vỏ, quả, cây, các sản phẩm dư thừa khi chế biến nông, lâm sản, gỗ củi, phân gia súc, nước thải và bã phế thải hữu cơ công nghiệp, rác thải Vì vậy, năng lượng sinh học là nguồn năng lượng thay thế có thể tồn tại, tái sinh và điều chỉnh theo ý muốn của con người

Hiện có 2 dạng năng lượng sinh học chủ yếu là ethanol sinh học và diesel sinh học Với nguyên liệu là tinh bột và đường nhờ quá trình phân giải của vi sinh vật có thể sản xuất ra ethanol, sau đó tách nước bổ sung các chất phụ gia thành ethanol biến tính gọi là ethanol nhiên liệu biến tính hay cồn nhiên liệu Diesel sinh học nói riêng hay nhiên liệu sinh học nói chung là một loại năng lượng tái tạo Về phương diện hóa học diesel sinh học là methyl este của axit béo Dầu diesel sinh học được chế biến từ dầu thực vật và mỡ động vật Vì vậy trên thế giới nhiều nước đã tiến hành nghiên cứu trồng các loài cây nông, lâm nghiệp để cung cấp nguyên liệu sinh học cho chế biến năng lượng sinh học

1.5.3 Các nước sản xuất nhiên liệu sinh học

Các nhiên liệu sinh học hiện đang được nhiều quốc gia chú ý đến như là một giải pháp khả thi để thay thế xăng dầu, vì khủng hoảng năng lượng thường xảy ra, giá cả leo thang không ngừng và hiện tượng hâm nóng toàn cầu đang được khoa học

xác nhận Từ 1970, Bazil là nước có quyết tâm nhiều hơn hết trong chính sách sản xuất rượu ethanol để thay thế phần nào xăng dầu sử dụng trong nước Sau đó, các nước tiến bộ và các nước đang phát triển tham gia tích cực hơn Trong năm 2006, 5 nước đứng đầu sản xuất ethanol trên thế giới là Mỹ (4,855 tỉ gallons/year), Brazil (4,491 tỉ gallons/year), Trung Quốc (1,017 tỉ gallons/year), Ấn Độ (0,502 tỉ gallons/year) và Pháp (0,251 tỉ gallons/year) Mỗi gallon bằng 3,785 lít Sản xuất ethanol tại hai nước Mỹ và Brazil chiếm hơn 90% ethanol thế giới

1.5.3.1 Brazil

Brazil sản xuất ethanol từ mía đường nên hiệu năng năng lượng cao hơn so với bắp gấp 6 lần, vì bắp cần thêm giai đoạn phân giải tinh bột thành chất đường trước khi biến chế thành rượu ethanol Chương trình này được đánh giá thành công

và lớn nhứt thế giới, nay đã cung cấp được 30% nhu cầu nhiên liệu vận chuyển trong nước Trước đây, Brazil là một nước nhập khẩu dầu rất lớn, nhưng nay đã tự túc hoàn toàn về năng lượng, nhờ sản xuất ethanol và số dầu mỏ nội địa (Washington Post, 2006) Trong năm 2004, nước này sản xuất 16,4 tỉ lít ethanol trên diện tích 2,7 triệu hecta đất đai, hay độ 4,5% diện tích canh tác của nước này Trong số này, độ 12,4 tỉ lít ethanol được dùng làm nhiên liệu cho xe ô tô Hiện nay, tất cả xe sản xuất bản xứ là loại xe dành cho sử dụng xăng pha trộn với ethanol và thích ứng với loại ethanol có chứa nước đến 4,4% (ethanol 95,6%) Trong 2008, Chính phủ mở rộng chương trình sản xuất diesel sinh học phải chứa 2% diesel sinh học, và tăng lên 5% trong 2013

Tuy nhiên, chương trình sản xuất và tiêu thụ rượu ethanol được thực hiện với bao cấp lớn của nhà nước dưới hình thức (American Council for an Energy-Efficient Economy, 1999):

- Lãi suất thấp cho xây cất các nhà máy nấu rượu

- Bảo đảm giá thu mua ethanol bởi các các công ty dầu quốc doanh với giá hợp lý

- Giá ethanol ngoài thị trường có sức cạnh tranh cao

Giảm thuế trong thập niên 1980s để khuyến khích loại xe dùng ethanol Các biện pháp hỗ trợ giá và bảo đảm nêu trên giảm bớt dần, đến nay đã chấm dứt hoàn toàn và kết quả rất tích cực Ở tiểu bang São Paulo đã thiết lập thành công một trung tâm nghiên cứu và phát triển trồng mía và sản xuất rượu ethanol hiệu quả cao

1.5.3.2 Hoa Kỳ

Hàng năm Hoa Kỳ tiêu dùng khoảng 142 tỉ gallon xăng dầu và giá cả tăng gia

từ độ 30-40 cent trong đầu 1970s lên 3,5 Mỹ kim/gallon trong tháng 3-2008 Nước này hiện tiêu thụ độ 25% tổng số dầu thế giới Cho nên, họ có nỗ lực lớn nhằm thay thế phần nào loại nhiên liệu chất khoáng này Hiện nay, hầu hết các loại xe ở nước

Mỹ có thể chạy bằng xăng pha trộn với 10% ethanol được chế tạo từ bắp Một số hảng xe như Ford, Daimler-Chrysler và GM đã bán loại xe có thể dùng xăng trộn với ethanol từ zero đến 85% ethanol (E85) Đến giữa 2006, có đến 6 triệu chiếc xe chạy E85 (America energy, 2006) Trong 2007, thành phố Portland, bang Oregon là thành phố đầu tiên bắt buộc tất cả các loại xe chạy trong giới hạn thành phố phải dùng xăng trộn tối thiểu 10% ethanol (Murphy, 2007)) Kể từ tháng giêng 2008, các bang Missouri, Minnesota và Hawaii đòi hỏi xe ô tô chạy xăng trộn với ethanol

Trong tháng 1-2006, trước Quốc hội lưỡng viện, Tổng Thống George W Bush tuyên bố Hoa Kỳ “đã nghiện dầu hỏa” nên cần phải thay thế 75% dầu nhập bằng những nguồn năng lượng hữu hiệu khác vào 2025, gồm cả nhiên liệu sinh học Ngày 19-12-2007, (Energy Independence and Security Act of 2007) đòi hỏi những nhà sản xuất xăng dầu phải dùng ít nhứt 36 tỉ gallons nhiên liệu sinh học trong 2022, hay tăng gấp 5 lần mức dùng hiện nay

Chương trình khuyến khích dùng xăng trộn với ethanol ở Mỹ đang bị chỉ trích

vì dựa vào hỗ trợ của nhà nước, làm tiêu thụ nhiều nhiên liệu hơn bình thường Sự hỗ trợ này đã khuyến khích nông dân biến đổi đất đai trồng bắp để sản xuất ethanol đáng kể và sử dụng nhiều phân hóa học và thuốc sát trùng hơn những đất đai dùng sản xuất các màu khác Chính phủ Liên bang đã hỗ trợ cho riêng chương trình này 7

tỉ Mỹ kim mỗi năm (tương đương 1,90 Mỹ kim/gallon)! Trong 2007, độ 90% diện tích màu di truyền biến đổi GM dành cho năng lượng sinh học được trồng ở Mỹ: 7

triệu ha bắp GM cho sản xuất rượu ethanol và 3,4 triệu ha đậu nành dành cho sản xuất dầu diesel sinh học (James, 2007)

1.5.3.3 Các nước châu Âu

Những nước dùng nhiều nhiên liệu ethanol sinh học trong Liên Âu là Đức, Thụy Sĩ, Pháp và Tây Ban Nha Trong 2006, lục địa này sản xuất loại nhiên liệu sinh học tương đương đến 90% nhu cầu Đức quốc sản xuất gần 70% nhu cầu, Tây Ban Nha 60% và Thụy Sĩ 50% Tại Đức quốc có đến 792 trạm xăng có E85, Pháp 131 E85 và với 550 trạm khác đang được xây cất (EUBIA, 2007) Liên Âu đã thông qua luật đòi hỏi các nước hội viên phải sử dụng nhiên liệu không có khoáng chất tối thiểu 5,75% tổng số thể tích nhiên liệu tiêu thụ trong năm 2010 và 10% trong 2020 Do đó,

họ có thể thay thế diesel hay xăng bằng bất cứ nguồn nhiên liệu sinh học nào Hiện nay, có ít trạm xăng E85 ở nhiều nước Liên Âu Nhiên liệu sinh học bị đánh thuế tương đương với xăng khoáng chất

1.5.3.4 Các nước châu Á

Trung Quốc có chính sách khuyến khích sử dụng nhiên liệu sinh học tại các vùng sản xuất dư thừa ngũ cốc để giảm bớt dùng xăng dầu Đầu tiên, nước này chọn năm thành phố thí điểm ở các vùng trung bộ và đông bắc, gồm có Zhengzhou, Luoyang and Nanyang ở tỉnh trung bộ Henan và Harbin, Zhaodong ở tỉnh Heilongjiang ở miền đông bắc Trong chương trình này, tỉnh Henan đang cổ động sản xuất nhiên liệu sinh học E10 khắp nơi trong tỉnh, với mục đích làm ổn định giá ngũ cốc, tăng lợi tức nông dân và giảm ô nhiễm môi trường do xăng dầu gây ra Nước này cũng dự tính dùng E15 trong năm 2010

Ấn Độ phát động chương trình nhiên liệu sinh học với mía đường trên toàn quốc cho E5, và đặt chỉ tiêu tăng lên E10 và sau đó E20 Ấn Độ cũng mở rộng các đồn điền trồng cây jatropha, một loại cây sản xuất dầu để sản xuất diesel sinh học Thái Lan có một chương trình tham vọng cao khuyến khích dùng xăng trộn với nhiên liệu sinh học 10% ethanol từ 2007 Cũng vậy, kỹ nghệ dầu cọ có kế hoạch sản xuất diesel sinh học ở Malaysia và Indonesia

Nhật Bản đang nghiên cứu sử dụng rơm rạ để sản xuất nhiên liệu sinh học Việt Nam có vài nỗ lực trong sản xuất các loại nhiên liệu sinh học, nhằm thay thế phần nào dầu mỏ và tăng an ninh năng lượng trong nước Vài dự án thành lập nhà máy sản xuất loại nhiên liệu này đang được xây cất ở tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi

và Đồng Nai Tại Quảng Nam, chính quyền tỉnh đang hợp tác với Nhật Bản dự trù khai triển xây dựng dự án nhà máy sản xuất rượu ethanol, với tiêu thụ nguyên liệu độ

1 triệu tấn sắn/năm và cần khoảng 300.000 ha đất ở các huyện phía tây của tỉnh để trồng sắn nguyên liệu phục vụ cho nhà máy (Hải - Nguyên, 2008) Một nhà máy sản xuất bio-ethanol khác tại khu kinh tế Dung Quất, Quảng Ngãi sẽ được xây dựng khai thác bởi công ty Dịch vụ Dầu khí (Petrosetco) và công ty Bronzeoak (Anh) với tổng

số vốn đầu tư 2.200 tỉ đồng Nhà máy có công suất 150 triệu lít ethanol/năm, với nguồn nguyên liệu là sắn lát (A Phương, 2008)

Đây là một cơ hội tốt cho Việt Nam góp phần vào nỗ lực cải thiện đời sống nông thôn, xóa đói giảm nghèo và thu hẹp khoảng cách đời sống giữa nông thôn và thành thị Cho nên, cần có một chính sách và quy hoạch quốc gia nhằm vừa hỗ trợ phát triển ngành sản xuất các loại nhiên liệu sinh học, vừa tạo thêm việc làm ở nông thôn, tăng gia lợi tức nông dân và bảo đảm an ninh năng lượng trong nước Tuy nhiên, cần phải nghiên cứu từng vùng sinh thái về đất đai, khí hậu và điều kiện kinh tế-xã hội để khoanh vùng sản xuất nguyên liệu đầy đủ cho các nhà máy nhiên liệu sinh học cũng như bảo đảm giá cả đầu ra Ở đồng bằng sông Cửu Long, cần khuyến khích nhiều hơn hết về đầu tư sản xuất ethanol dựa vào mía đường, loại ethanol cellulose dựa vào rơm rạ, thân lúa miến, bắp…, hoặc cây kỹ nghệ, cây ăn quả và các loại mỡ động vật như mỡ cá chẳng hạn Các nhà máy đường hiện hữu cần được thêm chức năng, bằng cách trang bị thêm các công nghệ và thiết bị cần thiết sản xuất ethanol làm nhiên liệu sinh học

Ethanol (E) và cả các sản phẩm tái sử dụng của nó được tin tưởng là sự lựa chọn tốt nhất thân thiện với môi trường Có thể thấy rằng, vào năm 2010 tổng sản phẩm E đạt 80 tỷ lít Ước tính hiện nay có trên 94% sản phẩm nhiên liệu sinh học là

E và phần lớn đi từ đường mía

Theo (Balat et al., 2008) có 60% E sản suất từ cây mía và 40% từ những cây trồng khác Brazil và Mỹ là những nước dẫn đầu trong việc khai thác từ cây mía và hạt ngũ cốc và 70% sản phẩm E toàn thế giới là từ 2 nước này (bảng 1.3)

Bảng 1.3 10 nước dẫn đầu thế giới về sản lượng E (Tỷ gallons/ năm)

Gần đây, ở Mỹ E được sản suất chủ yếu từ đường hạt ngũ cốc còn ở Brazil họ lên men từ đường Saccaroza, tuy nhiên với mỗi nước đều có nền nông nghiệp khác nhau và họ sử dụng kỹ thuật khác nhau trong lên men E Bởi vậy, trong suốt thập kỷ qua, công nghệ sản suất E từ đường thực vật được phát triển trên qui mô rộng rãi và

nó sẽ phát triển trong những năm tới (Lin và Tanaka, 2006)

Ở Mỹ 90% E được chuyển hoá từ hạt ngũ cốc (de Oliveria et all., 2005) Sản xuất E ở Mỹ trong năm 2004 là 3.54 tỷ gallon và sang năm 2006 tăng lên 4.85 tỷ gallon Ở Brazil hầu hết E sản xuất từ đường mía, ước tính khoảng 40% dùng để thay thế dầu đốt trong gia đình, ≈ 20% xuất khẩu sang Châu Âu và các thị trường khác Quá trình sản xuất E nhiên liệu từ sinh khối thực vật được phát triển rộng rãi ở Brazil bắt đầu vào năm 1975, trong đó đường mía được sử dụng đặc biệt cho việc sản xuất nhiên liệu với diện tích sử dụng là 2,7 triệu hecta và có khoảng 350 nhà máy chưng cất được đưa vào sử dụng cho mục đích này Theo (Balat et al., 2008) trên 40% tổng sản lượng nhiên liệu cung cấp cho ô tô và thắp sáng

Sản xuất E có thể thay thế 353 tỷ lít gas (32% tổng lượng gas toàn cầu) Theo (Kim và Dale, 2004) E sử dụng trong xăng E85 chủ yếu dùng cho xe chở khách loại nhỏ E xuất sang Châu Âu 6 tỷ lít trong năm 2006 và 12,7 tỷ lít vào năm 2010, điều này vẫn không đáp ứng được mức thông dụng sử dụng các sản phẩm của Châu Âu:

2 tỷ lít/ năm (Balat et al., 2008)

1.6 Các lợi ích của nhiên liệu sinh học

Phát triển nhiên liệu sinh học là một trong các biện pháp tốt không những giúp đối phó với cuộc khủng hoảng năng lượng thế giới mà còn tạo cơ hội hiếm có cho cải tiến đời sống nông thôn; nhưng đồng thời cũng có một số vấn đề tiềm ẩn về khả năng thiếu hụt thực phẩm cho những vùng thiếu đất canh tác, cũng như gây ảnh hưởng môi trường không kém gì các loại xăng dầu trong quá trình sản xuất Tuy nhiên, các vấn đề này hiện đang còn tranh cải trên diễn đàn quốc tế Các chuyên gia tin tưởng rằng công nghệ, kỹ thuật và quản lý sản xuất sẽ giúp giải quyết các khó khăn nêu trên nếu xảy ra

1.6.1 Giảm bớt dầu nhập

Mục tiêu đầu tiên của các chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học là nhằm giảm bớt hoặc không lệ thuộc hoàn toàn vào dầu nhập, và bảo đảm an ninh năng lượng quốc gia Người ta ước lượng nguồn dầu hỏa thế giới chỉ còn có thể sử dụng trong thế kỷ 21 Hơn nữa, kinh nghiệm thế giới cho thấy mỗi khi giá dầu tăng cao, vật giá các khâu liên hệ cũng leo thang, ngoại trừ những nước có chính sách hỗ trợ

để ổn định giá cả và thị trường Nguồn nhiên liệu sinh học còn là nhu cầu cấp bách tại các nước đang có nền kinh tế phát triển mạnh như Việt Nam Tình trạng mất quân bình cung-cầu về năng lượng đang đe dọa sự bành trướng các ngành công kỹ nghệ và phát triển kinh tế trong nước

1.6.2 Tạo việc làm mới và nông sản chế biến mới ở nông thôn

Nhiều nhà nghiên cứu tin rằng nhiên liệu sinh học có thể làm giảm mức độ nghèo khó ở nông thôn nếu có quy hoạch và chương trình thực hiện hữu hiệu, vì tạo

ra nhiều việc làm với nông sản biến chế mới, mở ra kỷ nguyên kinh tế nông thôn

mới, sống động do ảnh hưởng của giá nhiên liệu này Sản phẩm mới đó có giá trị kinh tế cao hơn các nông sản truyền thống Nhưng viễn ảnh này sẽ gặp trở ngại nếu không có các chính sách hỗ trợ hợp lý để vượt qua các khó khăn như đã gặp trong nền nông nghiệp truyền thống mang lại nghèo khó cho nông thôn Hướng phát triển này có thể đưa đến thành lập các dự án khu công nghiệp hay đô thị nông thôn khép kín, trong đó các chất thải từ nông nghiệp được dùng để tạo ra năng lượng sinh học,

và đồng thời mang sinh hoạt mới, nếp sống mới đến nông thôn

1.7 Những mặt trái của nhiên liệu sinh học

Bên cạnh lợi ích của phát triển nhiên liệu sinh học, còn có không ít nguy cơ về môi trường, kinh tế và xã hội Đây là hai mặt của một quá trình phát triển Vấn đề là thúc đẩy lợi ích của nhiên liệu sinh học và hạn chế những nguy cơ Nhiên liệu sinh học (biofuel) được biết đến với rất nhiều lợi thế: là một trong những biện pháp kìm hãm hiện tượng nóng lên toàn cầu; giúp các quốc gia chủ động, không bị lệ thuộc vào vấn đề nhập khẩu nhiên liệu, đặc biệt đối với những quốc gia không có nguồn dầu mỏ và than đá; kiềm chế sự gia tăng giá xăng dầu, ổn định tình hình năng lượng cho thế giới; tạo thêm công ăn việc làm cho người dân; và cũng không đòi hỏi phải

có những thiết bị và công nghệ đắt tiền

Braxin là một trong những quốc gia đi đầu trong phong trào phát triển nhiên liệu sinh học của thế giới Từ một nước phải nhập khẩu dầu mỏ hàng năm, đến nay Braxin đã hoàn tự chủ về nhiên liệu, đồng thời chứng tỏ được ưu thế tuyệt đối của nhiên liệu sinh học đối với các nguồn nhiên liệu được khai thác từ lòng đất

Nhận thức được tầm quan trọng và lợi ích từ nhiên liệu sinh học, Mỹ, cộng đồng Châu Âu và nhiều nước khác trên thế giới cũng theo gương Braxin, gấp rút phát triển nền công nghiệp còn nhiều tiềm năng này

Nhưng những bài học từ Braxin cũng cho thấy mọi thứ đều có có giá của nó Bên cạnh các ưu điểm đã biết, công cuộc phát triển nhiên liệu sinh học cũng chứa đựng không ít nguy cơ về môi trường, kinh tế và xã hội Nếu không được quản lý và kiểm soát tốt, các tác dụng xấu sẽ xảy ra, thậm chí có thể lớn tới mức nhấn chìm cả

những mặt tích cực do nhiên liệu sinh học mang lại Nguy cơ sẽ càng rõ hơn theo quy mô ngày càng tăng của nền công nghiệp nhiên liệu sinh học

Braxin tiến tới sẽ có lượng nhiên liệu sinh học dồi dào xuất khẩu sang Mỹ và nhiều nước khác trên thế giới Để đạt mục tiêu, quốc gia này sẽ phải mở rộng diện tích trồng mía đường (một loại cây nguyên liệu để sản xuất nhiên liệu sinh học) từ

13, 6 triệu arce (1 arce~0,4 ha) như hiện nay lên 20,5 triệu arce vào năm 2012-2013, lớn hơn cả diện tích của Maine, một bang lớn thuộc nước Mỹ

Trong năm qua, chỉ riêng Braxin đã chiếm tới 65% lượng ethanol xuất khẩu toàn thế giới, đạt khoảng 898 triệu gallon, tăng 31% so với năm 2005 Cứ đà này, đến năm 2013 lượng ethanol xuất khẩu của Braxin sẽ tăng gấp đôi hiện nay, ước tính

là 1,85 triệu gallon Sự phát triển quá nhanh sẽ tạo nhiều áp lực đối với nguồn tài nguyên đất, đặc biệt là diện tích đất trồng trọt, chăn nuôi truyền thống và đất rừng của Braxin, thậm chí đe doạ cả vùng lưu vực sông Amazon vốn được biết đến như một trong những khu sinh thái giàu có nhất thế giới cần được bảo tồn

Nhưng đó chưa phải là tất cả, những nguy cơ chính trong quá trình phát triển nhiên liệu sinh học cần phải kể đến là:

1.7.1 Vấn đề lương thực

Việc sử dụng đất để trồng cây nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học có thể ảnh hưởng đến nguồn cung cấp lương thực hoặc làm tăng giá lương thực, đặc biệt đối với các nước đang phát triển Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ ) có lợi hơn trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ thôi cấy lúa, chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm

1.7.2 Ô nhiễm và cạn kiệt nguồn tài nguyên nước

Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng,

vì vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước trong khu vực Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan vinhoto, một chất được dùng để bón và tưới khi trồng mía đường cũng có thể gây ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch và

làm cho các loài thuỷ sinh không thể tồn tại Năm 2003, người ta đã ghi nhận được một trường hợp bội nhiễm vihoto xảy ra tại Sao Paolo khiến cá chết hàng loạt trên suốt 95 dặm sông Rio Grande của Braxin

Các nghiên cứu đầu tiên cho biết các loại nhiên liệu sinh học là loại nhiên liệu thân thiện môi trường Xăng sản xuất 2,44 CO2 tương đương kg/l trong khi ethanol chỉ sinh ra 1,94, nên sẽ làm giảm rất nhiều khí thải CO2 trong bầu khí quyển Năm

2006, nghiên cứu của trường Đại học California, Berkley ước lượng khí thải nhà kính của ethanol bắp là 13%, sau giảm xuống còn 7,4% thấp hơn so với xăng dầu (Bourne and Clark, 2008) Tạp chí National Geographic ghi nhận 22% ít khí thải

CO2 hơn cho ethanol bắp và 56% cho ethanol mía Hảng chế tạo xe Ford báo cáo đã sản xuất một loại xe có thể chạy xăng hoặc rượu ethanol hoặc hòa trộn có thể giảm bớt 70% khí thải CO2 (EUBIA, 2007)

Nhưng vài nghiên cứu gần đây cho kết quả trái ngược, nghĩa là nhiên liệu sinh học cũng sản xuất khí thải nhà kính trong chu kỳ sản xuất khép kín Sản xuất nguyên liệu để tạo ra nhiên liệu sinh học cũng đòi hỏi một số lượng lớn xăng dầu trong hoạt động vận chuyển ở ngoài đồng và hậu thu hoạch Tháng 10-2007, nhà Nobel hóa học Paul Crutzen đã báo cáo khí thải nitrous oxide (N2O) từ sản xuất dầu hột cải (rapeseed, họ Mù tạt) và bắp tạo ra chất khí làm ấm trái đất hơn khai thác dầu khoáng, vì quá trình canh tác sản xuất hai màu này cũng dùng nhiều phân hóa học và nhiên liệu chuyên chở trong hoạt động nông nghiệp Tuy nhiên, nếu trồng các loại cây và cỏ đòi hỏi ít phân sẽ gây ít ảnh hưởng đến môi trường Nhiều nhà nghiên cứu cho biết sử dụng các loại ethanol cellulose làm bằng các chất thải thảo mộc có lợi cho môi trường hơn

Ở Malaysia và Indonesia, nông dân đã khai phá hàng ngàn hecta rừng nhiệt đới để trồng dầu cọ sản xuất nhiên liệu sinh học và xuất khẩu qua châu Âu, đã làm xáo trộn môi trường thiên nhiên và làm ô nhiễm không khí do tệ nạn đốt phá rừng bừa bãi để khai thác trồng trọt

1.7.3 Giảm diện tích rừng

Để có đất trồng cây nguyên liệu, người ta có thể tiếp tục phá rừng Điều này

đi ngược lại với mục tiêu cắt giảm khí thải nhà kính mà những nhà phát triển nhiên liệu sinh học vẫn mong muốn Giảm diện tích rừng cũng đồng nghĩa với tai hoạ từ sự xói mòn đất, giảm lượng gỗ dùng cho xây dựng và các nhu cầu khác của người dân

Tại tỉnh Pernambuco, nơi trồng nhiều mía đường nhất của Braxin, hiện diện tích rừng chỉ còn lại 2,5% so với thủa ban đầu Đây là kết quả từ chính sách phát triển trồng cây mía đường trong nhiều năm qua của Braxin, cả trước và sau khi đặt mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học

Một số nhà nghiên cứu lo ngại rằng, để đạt được tham vọng thoả mãn nhu cầu nhiên liệu sinh học của thể giới, Braxin có thể phải trả giá bằng 148 triệu acre rừng tiếp tục bị chặt phá

1.7.4 Nguy cơ từ sự độc canh

Trồng duy nhất một loại cây trong một thời gian dài trên cùng diện tích đất sẽ làm đất đai trở nên cằn cỗi và không thể tiếp tục canh tác được Để tránh ảnh hưởng xấu từ sự độc canh, chính quyền Sao Paolo đã phải thông qua một đạo luật về chính sách xoay vòng cây trồng, theo đó 20% diện tích trồng mía đường hàng năm phải được trồng thay thế bằng một loại cây khác, trước khi tiếp tục trở lại trồng cây mía đường

1.7.5 Nguy cơ từ sự biến đổi gen cây nguyên liệu

Nhằm tăng năng suất, ngày nay các cây công nghiệp đều được biến đổi gen Nguy cơ từ thực vật biến đổi gen đã được nhiều nhà khoa học nhắc tới Trong đó có

sự mất cân bằng sinh thái, hoặc kéo theo sự biến đổi gen tự nhiên ở những loài động thực vật sinh sống trong môi trường xung quanh, trong đó có cả các sinh vật gây hại, làm cho các sinh vật này có khả năng tồn tại mạnh mẽ hơn, khó diệt trừ hơn và phá hoại các cây trồng nông nghiệp vô tội khác

Tóm lại, ngoài những vấn đề chính, khó có thể kể hết những nguy cơ trong quá trình phát triển nhiên liệu sinh học Nhưng vượt lên trên hết, rõ ràng nhiên liệu

sinh học vẫn mang những lợi ích khổng lồ, không thể tranh cãi nhằm đảm bảo an ninh năng lượng của mỗi quốc gia, xoá đói, giảm nghèo cho người dân và góp phần chung vào công cuộc giữ gìn, bảo vệ môi trường chung trên thế giới

Vì vậy mặc dù vẫn còn nhiều tranh cãi về nhiên liệu sinh học giữa các nhà kinh tế, hoạch định chính sách, khoa học, bảo vệ môi trường xung quanh vấn đề giải pháp phòng ngừa, hạn chế, khắc phục nguy cơ, nhưng tất cả đều đồng ý kết luận: phát triển nhiên liệu sinh học là tất yếu, nhưng cần nhận thức rõ được cả 2 mặt của quá trình này và tiến hành hết sức cẩn trọng, nếu không những lợi ích hứa hẹn gặt hái

từ nhiên liệu sinh học sẽ không còn

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn lên men glucose và xylose được phân lập từ quả Dứa - Việt Nam Để phục vụ sàng lọc, một số chủng thuộc bộ sưu tập giống của Phòng Công nghệ vật liệu sinh học

2.1.2 Hoá chất

Ethanol, peptone, cao nấm men, glucose, xylose (Merck - Đức); Các hóa chất thông dụng khác(Shantou Xilong - Trung quốc); Taq polymeraza, dNTP, MgCl2 của Anh; Ethydium Bromid, Agaroza của Đức;

Cặp mồi tổng hợp gene 16S rARN được đặt tổng hợp tại hãng GENSET (Singapore BioTech pte, Ltd)

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường MPA có thành phần (/l): Pepton 5 g; Cao thịt 3 g; NaCL 5 g;

Môi trường thử khả năng di động của VK (/L): Agar 5g; Pepton 10g; NaCl 5g; Gelatin 80g

Môi trường lên men (/l): Glucose (hoặc xylose) 30 g; (NH4)2SO4 1 g; Nước cất; pH = 6

Các môi trường được hấp thanh trùng ở nhiệt độ 1150C trong 20 phút (với đường nhất thiết cần được hấp riêng sau đó bổ sung vào môi trường trong điều kiện

vô trùng, tránh hiện tượng đường bị cháy làm giảm hiệu suất lên men)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phân lập vi sinh vật

- Lấy mẫu: Quả dứa được rửa sạch bằng nước vô trùng, thấm khô Tách bỏ lớp vỏ ngoài để loại bỏ VSV ngoại lai Lấy vô trùng phần thịt quả bị dập hỏng Mỗi mẫu lấy khoảng 100g, nghiền nát, trộn đều

- Xác định mật độ VSV theo phương pháp Koch (TCVN 4881-89, ISO 1983: hướng dẫn chung về cách pha chế dung dịch pha loãng để kiểm nghiệm VSV)

6887-Cân chính xác (tới 0,01g) 10g mẫu sau khi được trộn đều cho vào bình đựng

90 ml dung dịch nước muối sinh lý (8,5 g NaCl/l nước cất) vô trùng Lắc ở 200 vòng / 20 phút Sau đó tiến hành pha loãng tới hạn đến 10-6

¾ Lấy 0,05 ml dịch từ các độ pha loãng (10-1, 10-2, 10-3) cấy gạt trên đĩa pettri chứa môi trường Czapec để phân lập vi nấm

¾ Lấy 0,05 ml dịch từ các độ pha loãng (10-4, 10-5, 10-6) cấy gạt trên đĩa pettri chứa môi trường MPA cải tiến để phân lập VK

¾ Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần Nuôi những đĩa cấy ở 37°C Sau 3-5 ngày quan sát các khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt đĩa thạch Phân lập VSV dựa trên loại khuẩn lạc chiếm ưu thế

- Mật độ VSV được tính theo công thức: Y = Ā 20.10n

Y: Số tế bào/g mẫu (cfu/g)

Ā: Trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa được cấy từ cùng một độ pha loãng (Chỉ tính đĩa có chứa 5-50 khuẩn lạc)