Nghiên cứu ứng dụng công nghệ SPR trong chẩn đoán ung thư sớm

Tương tác cộng hưởng bề mặt SPR không chỉ đưa ra kết quả định tính định lượng của các phân tử cần phân tích mà còn cung cấp các thông số động học... Cảm biến sinh học quang học SPR đáp ứ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, được thực

hiện dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Trương Quốc Phong Nội dung luận văn

có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tác

phẩm, tạp chí và các website theo danh mục tài liệu tham khảo của luận văn

Kết quả trình bày trong luận văn được thu thập được trong quá trình nghiên

cứu là trung thực chưa từng được ai công bố trước đây

Hà Nội, tháng 6 năm 2012

Tác giả luận văn

Trần Thanh Hoài

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

Mục lục

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT……… 4

DANH MỤC CÁC BẢNG 4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 4

MỞ ĐẦU 6

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 8

1.1 Biomaker và ứng dụng trong chẩn đoán 8

1.1.1 Biomaker 8

1.1.2 Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán bệnh 8

1.2 Các phương pháp chẩn đoán dựa vào biomaker 14

1.2.1 Kỹ thuật PCR, real-time PCR 14

1.2.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 15

1.2.3 Kỹ thuật protein array 16

1.2.4 Kỹ thuật tương tác cộng hưởng bề mặt 17

1.3 Ứng dụng phương pháp tương tác cộng hưởng bề mặt trong nghiên cứu nhận diện protein huyết thanh 29

1.3.1 Tầm quan trọng của các protein trong huyết thanh 29

1.3.2 Những hạn chế trong nghiên cứu protein huyết thanh 33

1.3.3 Phương pháp tương tác cộng hưởng bề mặt giải pháp cho phân tích nhận diện protein huyết thanh 33

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 Vật liệu nghiên cứu 37

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 37

2.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 37

2.2 Phương pháp nghiên cứu 37

2.2.1 Phương pháp gắn ligand IL2-antibody lên chip GLC 37

2.2.2 Phương pháp phân tích mẫu 40

2.2.3 Phương pháp phân tích số liệu 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Đánh giá khả năng gắn kháng thể kháng IL-2 lên sensor chíp GLC 45 3.2 Đánh giá ảnh hưởng của mẫu huyết thanh đến tín hiệu đo 47

3.3 Phân tích protein IL-2 trong mẫu huyết thanh 52

3.3.1 Phân tích các nồng độ khác nhau của protein IL-2 trong huyết thanh 52 3.3.2 Phân tích tính ổn định của tín hiệu đo protein IL-2 trong huyết thanh 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA: Deoxyribo Nucleic Acid

IL-2 : Interleukin 2

IL-2 Ab : Interleukin 2 antibody – Kháng thể kháng interleukin 2

KD : Equilibrium kinetic – hằng số cân bằng

kd : Dissociation kinetic – hằng số động học liên kết

ka : Association kinetic – hằng số kết hợp

PCR: Polymerase Chain Reaction

RNA: Ribonucleic acid

RU: Response units

SPR: Surface plasma resonance – Cộng hưởng bề mặt

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các loại protein microarray [21] 17

Bảng 1.2 Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân ung thư [32] 32

Bảng 2.1 Điều kiện chạy trên chip GLC 38

Bảng 2.2 Vị trí đặt ligand và dung dịch đệm trên giá đựng mẫu 39

Bảng 2.3 Vị trí đặt IL-2 và dung dịch đệm trên giá đựng mẫu 41

Bảng 2.3 Vị trí đặt mẫu phân tích và dung dịch đệm trên giá đựng mẫu 41

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Trang Hình 1.1.Cụm tế bào lai (clone) dòng AFP-2 đang phát triển, độ phóng đại 10×20 và 10×10 [7] 10

Hình 1.2 BNP trong hướng dẫn chẩn đoán khó thở cấp và suy tim [5] 11 Hình 1.4 Động học của liên kết phân tích 21 Hình 1.5 Hình ảnh mô phỏng array tương tác protein-ligand 6x6 25 Hình 1.6 Hình ảnh các thông số động học của tương tác IL2 cytokine và IL2 antibody 26 Hình 1.7 Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết thanh [32] 31 Hình 3.1 Quá trình gắn IL-2 antibody lên bề mặt chip 47 Hình 3.2 Quá trình phân tích protein IL-2 49 Hình 3.2 Phân tích các hằng số động học tương tác giữa IL-2 với ligand 52 Hình 3.3 Quá trình tương tác IL-2 với các nồng độ trong mẫu huyết thanh 54 Hình 3.4 Phân tích các hằng số động học tương tác giữa IL-2 với ligand với các mẫu huyết thanh có độ pha loãng khác nhau 57 Hình 3.5 Phân tích tính ổn định của tín hiệu tương tác giữa các lần đo 59

Để chẩn đoán ung thư, có thể lấy các mẫu như sinh thiết, gen, máu hoặc nước tiểu Mẫu máu được xem là mẫu phân tích tiềm năng để phát hiện các chỉ thị sinh học nói chung và các chỉ thị ung thư nói riêng Vì máu được luân chuyển đến mọi cơ quan của cơ thể và chứa nhiều thành phần khác nhau như lipid, đường, các enzym, kháng thể…Xét nghiệm máu sẽ cung cấp nhiều thông tin quan trọng về tình trạng sức khỏe Có rất nhiều kỹ thuật có thể được dùng để phân tích mẫu máu đã và đang được ứng dụng như kỹ thuật PCR, real-time PCR, ELISA, kỹ thuật protein array Đây là các kỹ thuật chẩn đoán dựa vào các biomaker Mỗi phương pháp có một ưu nhược điểm riêng Trong

đó kỹ thuật protein array là kỹ thuật mới có độ nhạy cao và cho phép phân tích nhiều mẫu cùng lúc, tuy nhiên cần phải đánh dấu mẫu bằng phóng xạ, các chất phát quang…có thể làm biến đổi cấu trúc của mẫu cần phân tích Để khắc phục nhược điểm này, kỹ thuật phân tích mẫu bằng tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) không cần đánh dấu đang được nghiên cứu phát triển

Tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) cho phép phân tích tương tác của nhiều loại phân tử, từ những phân tử có khối lượng nhỏ đến những phân tử có khối lượng lớn (vài triệu Daltons), và những phân tử có hàm lượng thấp Tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) không chỉ đưa ra kết quả định tính định lượng của các phân tử cần phân tích mà còn cung cấp các thông số động học

của quá trình tương tác Một số nghiên cứu cho thấy tiềm năng của kỹ thuật tương tác cộng hưởng bề mặt (SPR) trong chẩn đoán ung thư sớm Kỹ thuật này đang thu hút sự quan tam của nhiều nhà khoa học trên thế giới Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật này còn rất mới mẻ Việc nghiên cứu và phát triển kỹ thuật này trong nghiên cứu proteomic nói chung và trong chẩn đoán sớm ung thư nói riêng sẽ mang lại nhiều lợi ích Chính vì vậy, tôi đã lựa chọn

đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ SPR trong chẩn đoán ung thư sớm”

Trong giới hạn của luận văn cao học, tôi xin trình bày những khảo sát ban đầu của nghiên cứu ứng dụng công nghệ SPR trong chẩn đoán ung thư sớm Nội dung chính của luận văn:

- Đánh giá khả năng gắn kháng thể kháng IL-2 lên sensor chip GLC

- Đánh giá ảnh hưởng của mẫu huyết thanh đến tín hiệu đo

- Phân tích IL-2 trong mẫu huyết thanh

+ Phân tích các nồng độ khác nhau của protein IL-2 trong huyết thanh

+ Phân tích tính ổn định của tín hiệu đo protein IL-2 trong huyết thanh

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Biomaker và ứng dụng trong chẩn đoán

1.1.1 Biomaker

Biomarker là những phân tử biểu hiện một dữ kiện sinh học Biomarker

có thể đơn thuần là hóa chất, như glucose là chỉ điểm của bệnh tiểu đường, hoặc phân tử protein như các kháng thể (antibody) là dấu hiệu của bệnh nhiễm trùng, và gene hay DNA marker là dấu hiệu cho các bệnh liên quan đến

di truyền Với phát triển của những kỹ thuật sinh học hiện đại có khả năng nghiên cứu nhiều phân tử trên cùng một mẫu phẩm như microarray, proteonomics, ngày nay biomarker có thể là một nhóm gene hay protein liên quan đến một trạng thái bệnh lý nào đó [6]

Về bệnh lý, khác với các yếu tố bệnh (pathogen agent) được mô tả dưới

dạng thức phân tử như gene hay vi khuẩn là những “nguyên nhân” gây bệnh, biomarker chỉ là “biểu hiệu” (symbol) của bệnh Những biểu hiện này bao

gồm tất cả mọi thay đổi của tế bào có liên quan đến bệnh lý.Như vậy, biomarker bao gồm những phân tử gây bệnh và những phân tử được tạo ra sau khi bệnh phát triển [6]

1.1.2 Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán bệnh

Những nghiên cứu gần đây đã chứng minh tính hữu dụng của biomarker trong các lĩnh vực sinh học từ nghiên cứu đến ứng dụng Các nhà nghiên cứu biomarker tin tưởng rằng chỉ điểm sinh học chứa đựng những bí

ẩn về bệnh lý, cho nên việc truy tìm biomarker sẽ giúp đạt được những kết quả có tầm ứng dụng hữu hiệu và lớn lao trong y học Những ứng dụng này gồm các phương pháp chẩn đoán chính xác cho các bệnh phức tạp liên hệ đến nhiều gene (ung thư, tiểu đường, tim mạch, thần kinh ), hoặc các bệnh miễn

nhiễm, di truyền, nhiễm trùng hay bệnh do yếu tố môi trường Biomarker cũng có nhiều kỳ vọng trong ứng dụng đo lường hiệu ứng của thuốc [6]

Chúng ta thường biết đến nhiều khám phá của gene và bệnh lý, nhưng trên thực tế việc ứng dụng của các gene này cho chẩn đoán cũng như trị liệu rất ít ỏi và giới hạn.Ngoại trừ một số bệnh do di truyền gây ra mà gen đóng một vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán, phần lớn các bệnh mãn tính như đái đường, ung thư, bệnh tim, tai biến, loãng xương, v.v… thì gen không đóng một vai trò quan trọng như nhiều người tưởng Do đó, việc chẩn đoán bằng gen cho các bệnh này chưa thể đem lại lợi ích cho người bệnh Có hai lý

do chính về hạn chế này Thứ nhất, phần lớn các gene liên hệ đến di truyền có tần số (frequency) rất thấp trong quần thể đa dạng sinh học; thứ hai, các bệnh đều có sự tham gia của một phức hệ gene, mà phần lớn chưa biết tới, chứ không phải từ một gene Vì những lý do trên, biomarker đã là một trong những nghiên cứu trọng yếu của sinh học hiện đại trong những năm qua, và

đã có những kết quả cho thấy tầm quan trọng của biomarker trong việc mang lại ứng dụng của gene cho chẩn đoán bệnh lý cũng như rất nhiều khía cạnh y học, khoa học khác Trong giới hạn của luận văn, tôi sẽ trình bày ứng dụng của chỉ thị sinh học (biomaker) trong chẩn đoán ung thư và bệnh tim mạch [6]

1.1.2.1 Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán ung thƣ

Để chẩn đoán bệnh ung thư, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp vật lý, phương pháp giải phẫu bệnh – sinh thiết và phương pháp hóa sinh, hoặc kết hợp các phương pháp này Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng Ví dụ phương pháp sinh thiết, giải phẫu bệnh cung cấp cho chúng ta thông tin chính xác về khối u, nhưng hạn chế về mặt tâm lý, đau khi chọc hút sinh thiết và có thể kích thích di căn Phương pháp hóa sinh “enzym-miễn dịch” áp dụng các thành tựu nghiên cứu

trong ung thư học về các chỉ thị ung thư (tumor marker) để chẩn đoán sớm căn bệnh Phương pháp này phát hiện chính xác các chỉ thị marker, thông qua mẫu máu hoặc nước tiểu [7]

Trong số các chỉ thị ung thư, alpha-fetoprotein (AFP) chính là marker được sử dụng để hỗ trợ chẩn đoán và theo dõi điều trị bệnh ung thư tế bào gan Ở người bình thường, hàm lượng AFP cao khi mới sinh nhưng giảm dần và duy trì rất thấp ở người trưởng thành, tuy nhiên hàm lượng này có thể tăng lên bất thường trong một số bệnh về gan như viêm gan B, viêm gan C Khi hàm lượng này tăng cao tới một mức nhất định nào đó (trong trường hợp này là >

100 ng/ml) thì các bác sĩ có thể nghi ngờ là ở người bệnh đã xuất hiện khối u ung thư ở gan Trong những trường hợp hàm lượng AFP vượt mức 4000 ng/ml bác sĩ có thể khẳng định bệnh nhân bị ung thư gan tiên lượng xấu Ngoài ra AFP cũng rất hữu ích trong việc kiểm tra hiệu quả chữa trị cho bệnh nhân ung thư tế bào gan Nếu khối u được cắt bỏ hoàn toàn sau phẫu thuật thì hàm lượng AFP sẽ trở lại bình thường và ngược lại, nếu hàm lượng này tăng cao trở lại có nghĩa là khối u lại phát triển [7]

Hình 1.1.Cụm tế bào lai (clone) dòng AFP-2 đang phát triển, độ phóng đại

10×20 và 10×10 [7]

1.1.2.2 Ứng dụng của biomarker trong chẩn đoán tim mạch

Nhiều chỉ thị sinh học đã được nghiên cứu trong hội chứng mạch vành cấp Các nghiên cứu nhằm tìm ra chỉ thị sinh học lý tưởng với độ nhạy và đặc

hiệu 100% vẫn còn tiếp tục Dưới đây là một số chỉ thị sinh học được dùng trong cấp cứu:

Peptide lợi niệu type B (BNP) [20]:

Peptide lợi niệu type B (BNP) được tiết ra chủ yếu từ cơ tâm thất để đáp ứng với sức căng thành thất như quá tải thể tích và quá tải áp lực của tâm thất.Nhiều nghiên cứu cho thấy BNP là một chỉ số có ích cho tiên lượng trong hội chứng vành cấp Nhóm nghiên cứu TIMI đã thực hiện vài nghiên cứu cho thấy nồng độ BNP giúp tiên đoán tử vong tim mạch và các biến cố tim mạch nặng khác của hội chứng mạch vành cấp Tỷ lệ tử vong gần như tăng gấp đôi khi cả TnI và BNP đều tăng

Hiện tại, BNP còn được dùng để hướng dẫn chẩn đoán suy tim (hình 1.2) Đây là một chỉ số đơn giản và khách quan giúp đánh giá chức năng tim Quan trọng hơn, BNP giúp phân biệt nguyên nhân tại tim hay ngoài tim của các khó thở cấp tính, nhất là giúp xác định có hay không có suy tim kèm theo ở bệnh nhân nhập viện vì đợt cấp COPD Giá trị tiên đoán âm cao của BNP đặc biệt

có ích để loại trừ suy tim Ngoài ra, BNP còn được dùng để hướng dẫn can thiệp sớm trong hội chứng mạch vành cấp [5]

Hình 1.2 BNP trong hướng dẫn chẩn đoán khó thở cấp và suy tim [5]

C-reactive protein (CRP) [20]:

CRP là một chỉ thị viêm không đặc hiệu, được xem là có liên quan trực tiếp đến mảng xơ vữa động mạch vành Nhiều nghiên cứu bắt đầu từ đầu những năm 1990 cho thấy CRP gia tăng giúp tiên đoán độc lập các biến cố tim mạch nặng tiên phát và thứ phát

Dữ kiện hiện tại cho thấy CRP là một yếu tố tiên lượng có ích ở bệnh nhân hội chứng mạch vành cấp Tăng CRP là yếu tố tiên đoán độc lập cho tử vong tim mạch, nhồi máu cơ tim và suy tim sung huyết Cùng với TnI và BNP, CRP là một chỉ thị có ích nhưng do không đặc hiệu nên làm hạn chế việc sử dụng CRP như là một chỉ thị trong hội chứng mạch vành cấp

Myeloperoxidase (MPO)[20]:

MPO là một men có trong bạch cầu, sinh phản ứng với các chất có gốc oxidant, làm cho mảng xơ vữa không ổn định và gây co thắt mạch Các nghiên cứu cho thấy nồng độ MPO tăng đáng kể ở bệnh nhân đã được xác định có bệnh mạch vành qua chụp mạch máu Điều này làm cho các nhà khoa học tin rằng MPO là một chỉ thị lý tưởng

Brennan và cộng sự đã xem xét MPO như là một yếu tố tiên đoán nguy cơ tim mạch trong 604 bệnh nhân liên tiếp nhập phòng cấp cứu vì đau ngực Kết quả cho thấy: Tăng MPO giúp tiên đoán nguy cơ bị các biến cố tim mạch nặng như nhồi máu cơ tim cấp, tái nhồi máu, sự cần thiết phải tái lưu thông mạch vành và tử vong vào ngày 30 và sau 6 tháng Ở nhóm nhập cấp cứu vì đau ngực nhưng đã được loại trừ nhồi máu cơ tim, tăng MPO giúp tiên đoán nguy

cơ bị các biến cố tim mạch nặng trong tương lai [15]

MPO có thể là một chỉ thị tim sớm và có ích trong cấp cứu vì nó phản ánh tình trạng không ổn định của mảng xơ vữa, nguyên nhân của hội chứng mạch vành cấp Nhiều nghiên cứu nữa về MPO để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương và âm thì cần thiết trước khi được áp dụng trên lâm sàng [20]

Albumin bị biến đổi do thiếu máu cục bộ (Ischemia modified albumin: IMA) [20]:

Các chỉ thị hiện có như troponin và CK-MB thì nhạy với hoại tử cơ tim Đó là chỉ thị của các tế bào cơ tim bị chết trong nhồi máu cơ tim cấp Tuy nhiên, phần lớn bệnh nhân với hội chứng mạch vành cấp có thiếu máu cục bộ cơ tim

mà không bị nhồi máu Vì vậy, một chỉ thị nhạy cho thiếu máu cục bộ cơ tim

là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu

Dấu ấn lý tưởng cho thiếu máu cục bộ cơ tim-Albumin bị biến đổi do thiếu máu cục bộ được tạo ra khi albumin huyết thanh trong hệ tuần hoàn tiếp xúc với mô cơ tim bị thiếu máu cục bộ IMA có thể được đo bằng thử nghiệm gắn Cobalt Albumin Thử nghiệm này dựa trên nguyên tắc không thể gắn Cobalt của Albumin bị biến đổi do thiếu máu cục bộ Thử nghiệm cho kết quả nhanh sau 30 phút, được Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ chấp thuận

và đã có trên thị trường

IMA tăng trong vòng vài phút sau khi thiếu máu cục bộ, đạt đỉnh sau 6 giờ và tăng kéo dài đến 12 giờ Các nghiên cứu sử dụng IMA ở bệnh nhân đau ngực trong phòng cấp cứu có độ nhạy là 71-98% và độ đặc hiệu là 45-65% với giá trị tiên đoán âm cho hội chứng mạch vành cấp là 90-97%

Sinha và cộng sự cho rằng, tiếp cận dựa trên nhiều chỉ thị như điện tim, TnT

và IMA có độ nhạy là 95% trong hội chứng mạch vành cấp [29] Anwarrudin

và cộng sự nhận thấy kết hợp myoglobin, CK-MB, IMA và TnI giúp phát hiện thiếu máu cục bộ cơ tim với độ nhạy là 97% [13] Tuy nhiên, IMA cũng tăng ở bệnh nhân xơ gan, vài loại nhiễm trùng và ung thư đang tiến triển nên làm giảm độ đặc hiệu của thử nghiệm này Nhiều nghiên cứu tiếp theo thì cần thiết để đánh giá ích lợi của IMA trong chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp khi ECG và các troponin tim không giúp ích cho chẩn đoán

Có nhiều chỉ thị khác nhau như AST, CK, LDH, CK-MB, Myoglobin, IMA nhưng hiện được sử dụng phổ biến nhất là CK-MB và troponin Tùy theo bệnh cảnh lâm sàng, các thầy thuốc sẽ chọn lựa chỉ thị thích hợp [20]

Các chỉ thị tim được xem như là nền tảng trong chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp Chẩn đoán hội chứng mạch vành cấp thường khó và chủ yếu dựa vào bệnh sử, thăm khám lâm sàng và động học của các chỉ thị Các chỉ thị tim không giúp ích để loại trừ bệnh nhất là trong những giờ đầu sau khi khởi phát triệu chứng Tuy nhiên, các chỉ thị có giá trị tiên đoán dương cao nên các thầy thuốc không nên "xem nhẹ" các kết quả dương tính, nhất là khi trên lâm sàng nghi ngờ có hội chứng mạch vành cấp [5]

1.2 Các phương pháp chẩn đoán dựa vào biomaker

Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp chẩn đoán dựa vào biomarker đã và đang phát triển Trong giới hạn của luận văn, tôi xin trình bày một số kỹ thuật truyền thống đã được sử dụng và những kỹ thuật mới đang được phát triển trên thế giới

1.2.1 Kỹ thuật PCR, real-time PCR

Kỹ thuật PCR cho phép thu nhận thông tin về trình tự gen rất nhanh bằng cách khuếch đại đoạn gen chứa điểm đột biến và sau đó phân tích trực tiếp các sản phẩm PCR thu được Khả năng nhận dạng nhanh các đột biến không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâm sàng, mà còn đẩy nhanh việc nghiên cứu các bệnh di truyền Độ nhạy cao của kỹ thuật PCR cho phép ứng dụng dễ dàng trong các chẩn đoán bệnh nhiễm trùng Ví dụ: việc khuếch đại một số lượng lớn DNA virus trong các mẫu bệnh cho khả năng chẩn đoán bệnh sớm hơn trước khi triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện Điều này giúp cho thầy thuốc có phác đồ điều trị bệnh thích hợp, đặc biệt các bệnh ung thư

do virus gây ra (ví dụ: ung thư vòm họng do papillomavirus người gây ra) và thông thường có kết quả hơn nếu như bắt đầu điều trị ở giai đoạn sớm Tuy

nhiên phương pháp này phải tiến hành qua nhiều bước thí nghiệm: tách chiết thu DNA, phản ứng PCR với DNA thu được, và chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR [8]

Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích hiển thị được ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng Như vậy, có thể nói real-time PCR là kỹ thuật nhân bản DNA đích trong ống nghiệm thành hành tỷ bản sao dựa vào các chu kỳ nhiệt và kết quả khuếch đại trong ống phản ứng được hiển thị cùng lúc với phản ứng khuếch đại xảy ra để người làm thí nghiệm có thể thấy được

Đặc trưng của real-time PCR là phát hiện sản phẩm khuếch đại trong quá trình chạy PCR khi sản phẩm khuếch đại từ DNA đích được nhân bản đạt

đủ số lượng làm cho ống phản ứng phát được huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích Chính đặc trưng này mà người làm thí nghiệm có thể biết được số lượng bản DNA đích ban đầu có trong ống phẩn ứng dựa vào sự xuất hiện huỳnh quang của ống phản ứng sớm hay muộn, tức là chu kỳ ngưỡng (Ct) của ống phản ứng nhỏ hay lớn.Kỹ thuật real-time PCR cho kết quả nhanh và chính xác hơn kỹ thuật PCR truyền thống.Tuy nhiên, kỹ thuật này bị giới hạn bởi số lượng chất đánh dấu đặc hiệu Hơn nữa, hạn chế chung của PCR cũng như Real time PCR đó là cần tách chiết vật liệu di truyền của tác nhân gây bệnh hoặc đối tượng bệnh Việc tách chiết này đối với các tác nhân gây bệnh nhiều khi gặp khó khan về hàm lượng ít, do đó kết quả phân tích nhiều khi không chính xác [8]

1.2.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kế hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có

màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện Phương pháp này cho phép phát hiện, định lượng trực tiếp peptides, protein, kháng thể, hoocmon…có mặt trong mẫu phân tích Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ thấp (khoảng 0,1ng/ml) Vì phương pháp này đòi hỏi kháng nguyên và kháng thể phải gắn enzyme để nhận biết thông qua phản ứng tạo màu nên gây ra hạn chế của phương pháp trong việc gắn enzyme hay việc tìm ra hai kháng thể đặc hiệu cho một protein đích (trong phương pháp ELISA kẹp) [4]

1.2.3 Kỹ thuật protein array

Protein array là một trong những công cụ dùng để nghiên cứu tương tác giữa protein-protein, protein với các phân tử khác như DNA, RNA để phát hiện protein đích và dự đoán chức năng của protein nghiên cứu

Công nghệ microarray cho phép phân tích đồng thời hàng nghìn tham số trong một thí nghiệm.Protein microarray chứa một lượng nhỏ protein tinh khiết trên một mảng với mật độ lớn Các protein có thể được sàng lọc với hiệu suất cao cho hoạt tính hoá sinh, các tương tác protein-protein, protein-DNA, protein-RNA và protein-phối tử [34]

Trong kỹ thuật protein array, phiến kính thuỷ tinh là khuôn, trên đó gắn hàng ngàn mẫu dò protein.Sau đó cho mẫu sinh học đi qua chip và đánh giá hiệu quả gắn Protein chip là các công cụ được dành để xác định các cơ sở phân tử của bệnh, cơ chế cơ bản của hoạt tính thuốc và độc tính [25] Kết quả phân tích dựa trên các tín hiệu như huỳnh quang, phát quang hóa học, quang phổ, phóng xạ, điện hóa phát ra trên từng điểm nhỏ Cường độ tín hiệu tỉ lệ thuận với lượng protein liên kết với mẫu dò Nên phương pháp này cho phép định lượng protein đích trong mẫu thí nghiệm

Bảng 1.1: Các loại protein microarray [21]

Mảng kháng thể Sử dụng mẫu dò là các kháng thể đơn dòng hoặc đa

dòng để phát hiện hoặc định lượng các protein đặc hiệu trong mẫu sinh học

Mảng kháng nguyên Sử dụng mẫu dò là các kháng nguyên đơn dòng hoặc

đa dòng để phát hiện hoặc định lượng các protein đặc hiệu trong mẫu sinh học

Mảng chức năng Sử dụng chip có gắn các protein tinh khiết để xác

định tương tác protein-protein, protein-DNA, protein- các tiểu phân tử (lyposome, cơ chất )

receptor

Các phân tử không phải protein nhưng có khả năng tương tác với protein được cố định trên bề mặt khuôn Chúng có dải tương tác rộng hướng tới tính chất hóa học bề mặt như Ciphergen protein chip hoặc có tính đặc hiệu cao như các phân tử polyme hoặc aptammer oligonucleotide

Các kỹ thuật sử dụng protein array có độ nhạy cao và cho phép phân tích nhiều mẫu cùng lúc, tuy nhiên cần phải đánh dấu mẫu bằng phóng xạ, các chất phát quang…có thể làm biến đổi cấu trúc của mẫu cần phân tích Để khắc phục nhược điểm này, kỹ thuật phân tích mẫu bằng tương tác cộng hưởng bề mặt không cần đánh dấu đang được nghiên cứu phát triển

1.2.4 Kỹ thuật tương tác cộng hưởng bề mặt

1.2.4.1 Nguyên lý cộng hưởng bề mặt (Surface Plasmon Resonance

-SPR)

Tương tác cộng hưởng bề mặt (Surface Plasmon Resonance -SPR) là hiện tượng khi ánh sáng chiếu tới màng kim loại (như là vàng) được đặt ở mặt giới hạn giữa hai môi trường với độ khúc xạ khác nhau (như lăng kính và nước) [28]

Khi ánh sáng chiếu qua kính và đi vào môi trường nước thì tốc độ truyền của

nó sẽ tăng lên vì nước có chỉ số khúc xạ thấp hơn Nếu ánh sáng di chuyển với một góc nào đó để khi nó đi qua bề mặt giới hạn thì nó sẽ phản xạ lại kính Với một góc tới hạn nào đó, ánh sáng không thể đi vào môi trường nước

mà truyền dọc theo bề mặt giới hạn Bước sóng ánh sáng này được gọi là bước sóng evanescent, là bước sóng được tạo bởi sự hấp thụ một phần ánh sáng tới lên bề mặt vàng Vàng cũng như các kim loại khác có nhưng tính chất như các electron tự do hoạt động như một một thiết bị tích điện và có thể đáp ứng lại các kích thích Khi ánh sáng chiếu tới bề mặt vàng thì các hạt điện tích âm chuyển từ trạng thái cân bằng sang trạng thái hoạt động và dao động cùng tần số với bước sóng của ánh sáng tới Hiệu ứng này được gọi là cộng hưởng bề mặt (SPR) Khi quan sát kỹ thì nhận thấy một vệt mỏng trên hình ảnh phản xạ của ánh sáng tới bề mặt vàng với một góc tới thích hợp Vệt này được gọi là SPR dip và góc của ảnh sáng tới gây ra SPR dip (góc SPR) có thể được đo bằng detector quang học [28]

Cảm biến sinh học quang học SPR đáp ứng trong thời gian thực về sự thay đổi của các chỉ số khúc xạ gần bề mặt (trong vùng bước sóng evanescent) được gây ra bởi sự liên kết và phân ly của hai protein Protein thứ nhất sẽ được gắn trên lớp vàng của bề mặt cảm biến Protein thứ hai nằm trong dung dịch được bơm qua protein thứ nhất đã được cố định Khi protein trong dung dịch liên kết với protein cố định, chỉ số khúc xạ ở gần bề mặt cảm biến sẽ tăng lên, dẫn đến sự thay đổi góc SPR Khi phức hợp hai protein phân ly, protein thứ hai theo dung dịch được rửa khỏi bề mặt cảm biến, thì chỉ số phản

xạ giảm và góc SPR trở lại trạng thái ban đầu trước khi tương tác Cảm biến sinh học quang học ghi lại sự thay đổi của góc SPR dưới dạng hàm số thời gian trong dạng của một sensorgram Sự thay đổi của góc được đo bằng đơn

vị đáp ứng RU (response units) (1RU= 10-6 sự thay đổi chỉ số khúc xạ) Sensorgram biểu diễn khoảng thời gian liên kết của chất phân tích với ligand trên bề mặt chip Trong pha kết hợp, dung dịch chứa chất phân tích được bơm qua bề mặt ligand và chất phân tích sẽ liên kết với ligand Nếu pha kết hợp đủ dài thì phản ứng sẽ đạt tới cân bằng được thể hiện qua tỉ lệ kết hợp bằng tỉ lệ phân ly Khi chất phân tích được bơm hết, pha phân ly bắt đầu và sensorgram giảm khi chất phân tích bị đẩy ra khỏi bề mặt ligand [28]

Sự thay đổi của góc SPR có thể được đo chính xác nên động học liên kết của tương tác protein có thể được đo mà không cần đánh dấu, đo được đến khối lượng vài picogram protein trên mỗi milimet vuông bề mặt cảm biến [28]

Hình 1.3 Sự thay đổi vị trí của góc SPR [28]

Trong đó:

A Khi chất phân tích liên kết với phân tử ligand gắn trên bề mặt sensor chip, cường độ nhỏ nhất được tạo bởi sự cộng hưởng bề mặt Plasmon ảnh hưởng tới sự thay đổi vị trí của tia tới

B Cường độ thay đổi được đo bằng thời gian thực tại 36 điểm tương tác

Hầu như mọi cấu trúc tế bào và quá trình sống đều phụ thuộc vào các tương tác protein Sự sao chép và phiên mã DNA, sự ghép nối và dịch mã RNA, sự thay đổi và loại bỏ protein, sự điều khiển chu trình tế bào và sự tự chết của tế bào, sự phát triển của tế bào và sự trao đổi chất trung gian, sự truyền tính trạng, và sự biểu hiện gen Tất cả đều nhờ vào các tương tác protein phức tạp để thực hiện và duy trì các quá trình sống trong tế bào [28]

Tương tác cộng hưởng bề mặt plasmon (SPR) là một kỹ thuật phân tích không yêu cầu đáng dấu phóng xạ hay huỳnh quang để đưa ra dữ liệu về thời gian thực theo ái lực và động học của quá trình tương tác protein Tương tác cộng hưởng bề mặt đưa ra các dữ liệu tương tác cần cho việc xác định vai trò chức năng của protein, hiểu được chức năng tế bào và phát triển các loại thuốc mới trong điều trị một số bệnh [26]

Động học tương tác

Tương tác protein được xác định bằng cách sử dụng sự phân loại theo

ái lực, theo dữ liệu trong thư viện, và các phương pháp array cơ bản như array protein, phân giải protein, liên kết ngang Các cặp tương tác được xác định rất tiềm năng, tuy nhiên, đây chỉ là những bước đầu để hiểu được ảnh hưởng của các liên kết này trong tế bào Chúng ta cần phải tìm hiểu sâu hơn

về loại tương tác nào thực sự xuất hiện trong tế bào Chính vì vậy, động học liên kết của các tương tác này cũng như môi trường phản ứng trong tế bào phải được đánh giá [26]

Để đánh giá cường độ và phạm vi của tương tác xuất hiện trong tế bào thì cần phải hiểu các thông số động học của nó Cường độ tương tác giữa hai phân tử được thể hiện bằng hằng số phân ly KD= P L / PL , trong đó P là nồng độ protein tự do, L là nồng độ của ligand, và PL là nồng độ của phức hợp KD cho biết tỉ lệ phức hợp tạo thành (được biểu diễn bằng hằng số kết hợp ka) và

tỉ lệ phân ly (được biểu diễn bởi hằng số phân ly kd), như vậy KD= kd/ka Một

tương tác có ái lực mạnh sẽ cho KD thấp, các chất phản ứng nhanh chóng được nhận diện và liên kết với nhau (ka cao), và phức hợp hình thành ổn định (kd thấp) (hình 1.4 ) Nhiều kỹ thuật thông thường được sử dụng (ví dụ ngưng kết miễn dịch, sự thẩm tách cân bằng) cho việc đo KD Tuy nhiên, hầu hết các phương pháp này không đo được thời gian thực cần được xác định để tính các thông số động học liên kết và phân ly

Hình 1.4 ộng h c của li n kết ph n t ch: đường cong ph a tr n biểu di n cho tương tác có ái lực cao với hằng số ka cao (li n kết nhanh chóng), kd thấp (ph n ly chậm); đường cong ph a dưới biểu di n cho tương tác có ái lực thấp

với hằng số ka thấp, kd cao [26]

Việc xác định được mối liên hệ tỷ lệ giữa hằng số động học liên kết và phân ly rất có giá trị khi nghiên cứu sự biến đổi của các acid amin còn lại cho nghiên cứu tương tác protein hoặc khi thay đổi các hợp chất dẫn có kích thước phân tử để tối ưu liên kết của thuốc với đích Sự thay đổi của các phân

tử tường tác có thể vẫn chưa ảnh hưởng đến toàn bộ ái lực liên kết nhưng có thể dẫn đến thay đổi đáng kể về tỷ số giữa hằng số kết hợp và phân ly Từ công thức KD= kd/ka cho thấy nếu cả hai hằng số đều tăng hoặc giảm trong liên kết sau sự thay đổi của một phân tử thì khi đó các thay đổi có thể xem xét nếu xác định được riêng lẻ từng hằng số liên kết Khi xác định được hai hằng

số kết hợp và phân ly thì sẽ mang lại nhiều lợi ích trong việc tìm hiểu chức năng sinh học của các tương tác, xác định các phân tử thích hợp khác có thể liên kết trực tiếp, và lựa chọn các hợp chất có thể liên kết với đích với những tính chất thân thiện Những dữ liệu về ái lực cũng cung cấp thông tin liệu hai phân tử có thực sự tương tác với nhau trong môi trường tế bào Nếu một protein và một ligand tương tác trong tế bào trong một thời gian đáng kể thì nồng độ của chúng trong tế bào phải nằm trong vùng nồng độ với giá trị KD Giá trị KD càng thấp thì nồng độ cần để hai phân tử protein này có thể liên kết với nhau trong tế bào càng thấp, giá trị KD càng cao, thì nồng độ kết hợp trong

tế bào càng cao Vì vậy, dữ liệu về ái lực kết hợp với nồng độ trong tế bào được xác định sẽ cung cấp những chuẩn đoán đáng tin cậy hơn về sự tác động của protein trong tế bào [26]

Từ protein bề mặt đến các phức hợp của nhiều đơn vị, hệ thống tương tác sẽ cung cấp dữ liệu đáng tin cậy để giải mã các tương tác cơ bản nằm dưới chức năng của protein

Dù một protein và ligand của nó thể hiện ái lực liên kết mạnh với nhau

và được biểu hiện ở đủ các mức độ trong một mô cụ thể thì có ảnh hưởng qua lại đến chức năng Một phân tử nào đó như là các ion và cofactors có thể quyết định đến sự liên kết, trong khi đó một số khác lại có thể ức chế liên kết Những biến đổi ở mức độ phân tử, những thay đổi về cấu tạo, sự phân chia tế bào, các động học màng tế bào, hay sự thay đổi pH của môi trường tế bào cũng có thể làm tăng hay ức chế sự tương tác Hơn nữa, proteins là một phần của mạng lưới chức năng tạp nên các tương tác chặt chẽ của các protein trong một nhóm, tham gia các liên kết lỏng lẻo với nhóm khác (Spirin và Mirny 2003) [30] Cảm biến sinh học SPR có thể cung cấp những dữ liệu hữu ích ở mức độ cao của cấu trúc tế bào bằng cách đưa ra những dữ liệu nhất định của thí nghiệm về sự hình thành và ổn định của các nhóm protein

Tương tác cộng hưởng bề mặt [28]

Tương tác cộng hưởng bề mặt đưa ra tín hiệu với độ nhạy cao và trong thời gian thực về sự xuất hiện, sự liên kết và phân ly của hai phân tử tương tác với nhau để từ đó cung cấp dữ liệu về tỷ số của liên kết và phân ly

Tương tác cộng hưởng bề mặt phân tích các tương tác mà không cần đánh dấu huỳnh quang hay phóng xạ, do đó tiết kiệm được thời gian phản ứng và hạn chế được sự biến đổi ngẫu nhiên của các nhóm hóa học trong phản ứng đánh dấu Cảm biến sinh học SPR có thể xác định các protein ở các mức độ dưới một phần triệu phân tử và nhiều phân tử khác có khối lượng nhỏ đến vài triệu Daltons và tương thích về nhiệt độ, môi trường hóa học trong phạm vi sinh học Tương tác cộng hưởng bề mặt phân tích nhanh ,có thể phân tích mẫu có hàm lượng thấp và có thể ứng dụng để nghiên cứu hầu hết các loại phân tử sinh học bao gồm DNA, RNA, lipids, và carbohydrate cũng như đối với protein Khi sử dụng tương tác cộng hưởng, trạng thái tự nhiên của protein có thể được mô phỏng và biến đổi nếu cần để giải mã cơ chế tương tác của nó với các phân tử sinh học khác Tương tác cộng hưởng bề mặt được bổ sung rất nhiều kỹ thuật để liên kết một cách hiệu quả giữa cơ chế tương tác và chức năng sinh học Cảm biến sinh học SPR được sử dụng hiệu quả trong mô tả, phát triển kháng thể, và trong nghiên cứu tương tác của thuốc với đích Sử dụng cùng với các kỹ thuật khác như lai tế bào nấm men và phage display, tương tác cộng hưởng bề mặt sẽ cung cấp các dữ liệu về động học để xác định phạm vi mà một tương tác có thể xảy ra Kết hợp với sự đột biến có định hướng và tinh thể X-ray, SPR có thể giúp nhận diện và xác nhận những thành phần đóng vai trò là chìa khóa hay phần then chót trong liên kết; dữ liệu SPR

có thể phân biệt các thành phần của liên kết bề mặt mà ảnh hưởng đến sự nhận biết và hình thành từ những phần duy trì ổn định [16] Tóm lại, với những kỹ thuật được sử dụng để định dạng và mô tả các phức hợp protein và

các nhóm protein, Tương tác cộng hưởng bề mặt có thể cung cấp các dữ liệu

về sự hình thành và sự ổn định của các phức hợp protein gồm rất nhiều các chất có khả năng tương tác với protein [30]

Hệ thống tương tác Protein ProteOn XPR36 array [26]

Hệ thống ProteOn XPR36 là một thiết bị hoạt động dựa trên nguyên lý của tương tác cộng hưởng có khả năng đo đồng thời 36 tương tác của từng phân

tử Nó được tích hợp một hệ thống vi điều khiển chất lỏng rất hiệu quả và một

hệ thống quang học có độ nhạy cao để đưa dữ liệu tương tác trên từng điểm trên array khi phân tích tương tác của 6 protein với 6 ligand

Array tương tác ghép với hệ thống điều khiển chất lỏng [26]

Array tương tác 6x6 được tạo ra bởi hệ thống điều khiển chất lỏng ở chính giữa, là một module nhiều kênh (Multichannel module-MCM) MCM tạo thành 6 kênh trên bề mặt cảm biến chip ProteOn và trên đó 6 mẫu ligand khác nhau được cố định trên mỗi kênh Nhóm kênh thứ 2 hình thành trực giao với 6 nhóm kênh thứ nhất tạo thành mô hình đan chéo của 2 dòng kênh trực giao (Hình 1.5) Trên nhóm kênh thứ hai, sáu mẫu phân tích có thể được bơm song song vào Sự phản hổi tương tác ở mỗi spot sẽ được ghi lại và đưa ra 36 sensorgram tương ứng với 6 mẫu phân tích tương tác với 6 ligand Dòng chất lỏng liên kết đảm bảo sự ổn định và êm dịu của dòng mẫu và đệm để đo chính xác động học liên kết

Hình 1.5 Hình ảnh mô phỏng array tương tác protein-ligand 6x6

A Sáu ligand được cố định trên sáu kênh ligand song song

B Sáu mẫu ph n t ch được bơm vào sáu k nh ph n t ch trực giao với sáu kênh ligand

C Chi tiết từng spot tương tác ligand- chất phân tích cho thấy các vị trí của 2 spot đối chứng (màu vàng)

Cải tiến thiết bị quang học [26]

Hệ thống ProteOn 36XPR cũng được có những được điểm của thiết bị quang học có khả năng tạo ra phản hồi có chất lượng cao qua toàn bộ array Sự chiếu sáng liên tục đồng bộ và hệ thống hình ảnh phát hiện sự đáp ứng SPR khi ánh

sánh chiếu qua góc tới phù hợp Hệ thống quang học có những cải tiến thêm vào bộ phận cố định quét điện tử

Cường độ ánh sáng phản xạ được đo trên từng điểm của sensor chip và sự thay đổi của góc SPR được đo chính xác và độc lập tại mỗi điểm trên hình ảnh bề mặt chip

Hình 1.6 Hình ảnh các thông số động h c của tương tác IL2 cytokine và IL2

antibody

Từng kết quả của sáu sensorgram biểu di n các phản hổi tương ứng với sáu nồng độ IL2 cytokine tương tác với cùng một mức IL2 antibody được cố định.Các sensorgram cho thấy 5 mức độ của của IL2 antibody được cố định

và k nh đối chứng.Các đường màu đen cho thấy sự phù pjcuar sensorgram với mô hình tương tác động h c 1:1

Thiết kế cải tiến vi điều khiển chất lỏng dạng trực giao của hệ thống ProteOn XPR36 làm cho thí nghiệm trên nhiều mẫu tiến hành dễ dàng và nhanh chóng Array 6x6 và hệ thống vi điều khiển chất lỏng của hệ thống ProteOn XPR36 cho phép thực hiện hiệu quả nhiều mẫu thí nghiệm song song, ngoài ra còn một điểm được cải tiến đó là khả năng đo những đáp ứng tại các interspot làm mẫu đối chứng Các interspot là những vùng nằm trên các sensor chip, ở giữa các kênh và liền kề hai vị trí có tương tác Các interspot không được hoạt hóa

để gắn các ligand, nhưng trong quá trình tương tác thì dòng chất phân tích vẫn được bơm qua các interspot Vì vậy, các interspot là những kênh không có tương tác xảy ra và được coi là các kênh đối chứng Chính vì vậy 6x6 vi kênh

sẽ được dung để phân tích tương tác, với lượng mẫu kiểm tra đưa vào là lớn nhất và linh hoạt trong thiết kế thí nghiệm [16] Hệ thống còn có thể phân tích động học chuỗi các nồng độ khác nhau của một chất phân tích Sáu mẫu phân tích với nồng độ khác nhau được bơm tự động qua ligand có cùng nồng độ, hoặc sáu mẫu phân tích với nồng độ khác nhau được bơm qua sáu kênh ligand

có nồng độ khác nhau cho phép thống kê một cách nhanh chóng các kết quả thí nghiệm Vì nhiều điều kiện thí nghiệm có thể được kiểm tra song song, nên quá trình tối ưu phản ứng liên kết và cố định có thể tiến hành nhanh và hiệu quả, với lượng mẫu đưa vào lớn, hệ thống có thể được ứng dụng trong phân tích chọn lọc, so sánh nhiều mẫu như đối với kỹ thuật chọn lọc tế bào lai

và kiểm tra miễn dịch

Hiểu được đầy đủ vai trò của một protein là quan trọng để tiến tới phân tích những mô hình biểu hiện và xác định các tương tác đa dạng của protein với các phân tử sinh học khác, đánh giá phạm vi mà các tương tác này có thể xảy

ra và phân tích tầm quan trọng của chúng trong chức năng tế bào Giải mã các

đặc điểm và phạm vi các tương tác protein sẽ cho biết các thông số động học của các quá trình trong tế bào Từ các protein bề mặt đến các phức và nhóm protein, hệ thống ProteOn XPR36 sẽ đưa ra các dữ liệu cần để giải mã các tương tác cơ bản nằm dưới chức năng tế bào Với thiết kế array 6x6 của hệ thống sẽ là công cụ linh hoạt để gia tăng các kỹ thuật phân tích protein khác cho các ứng dụng đa dạng khác nhau

1.2.4.3 Khả năng ứng dụng của phương pháp tương tác cộng hưởng bề

mặt

Dựa trên nguyên lý tương tác cộng hưởng (SPR), cảm biến sinh học SPR (biosensor chip) phân tích nhanh, có thể phân tích mẫu có hàm lượng thấp và có thể ứng dụng để nghiên cứu hầu hết các loại phân tử sinh học bao gồm DNA, RNA, lipids, và carbohydrate cũng như đối với protein.Các đối tượng nghiên cứu khác nhau thì sử dụng các cảm biến sinh học khác nhau.Chip cảm biến ProteOn cấu tạo gồm lớp polymer alginate liên kết với lớp vàng mỏng trên một lăng kính cảm biến.Lớp alginate có khả năng phản ứng với một số nhóm chức khác nhau để cố định các ligand trên bề mặt chip Bản chất ưa nước của lớp alginate tạo ra một môi trường ngăn chặn sự biến tính của ligand đã cố định và không hấp thụ chất phân tích Ngoài ra, trọng lượng phân tử và cấu trúc của lớp phủ alginate có thể được sửa đổi để tạo ra chip cảm biến với khả năng bề mặt khác nhau [14] Có sáu loại chip khác nhau được sử dụng cho các mục đích phân tích khác nhau Các chip GLC, GLM, GLH được thiết kế để gắn với nhóm amine của ligand Trong khi

đó, các chip NLC và HTG/THE được thiết kể để gắn các ligand biotinyl hoặc các protein có chứa polyhistidine [14].Với khả năng gắn kết với nhiều loại ligand khác nhau lên bề mặt cảm biết sinh học, thiết bị dựa trên nguyên lý cộng hưởng bề mặt Plasmon (SPR) cho phép

- Nghiên cứu động học enzyme cơ chất

- Nghiên cứu động học kháng nguyên kháng thể

- Nghiên cứu động học tương tác protein với phân tử nhỏ

1.3 Ứng dụng phương pháp tương tác cộng hưởng bề mặt trong nghiên

cứu nhận diện protein huyết thanh

1.3.1 Tầm quan trọng của các protein trong huyết thanh

Huyết tương - plasma là một dịch trong, màu vàng nhạt và vị hơi mặn, thu được khi máu chống đông đã được loại bỏ toàn bộ các thành phần tế bào Huyết tương là thành phần quan trọng của máu, là môi trường sống của các tế bào máu và tất cả các tế bào trong cơ thể, chiếm 55-60% thể tích máu [31] Huyết thanh - serum là phần dịch lỏng, trong suốt còn lại của máu sau khi đã loại bỏ các thành phần tế bào và các yếu tố đông máu hay là phần còn lại của huyết tương sau khi đã loại bỏ các yếu tố đông máu Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, các enzyme, kháng thể và các protein hòa tan khác Như vậy, huyết thanh rất giống huyết tương và các protein của nó thực hiện các vai trò rất đa dạng như đông máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng và nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác trong cơ thể Huyết thanh không chỉ

là mẫu xét nghiệm lâm sàng mà còn thể hiện rất nhiều đặc tính hữu ích cho các nghiên cứu proteomics Theo phương diện này, nó là mẫu phân tích tiềm năng cho việc phát hiện ra các chỉ thị sinh học [12]

Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - 5 lít huyết thanh với khoảng 200 -

250 gam protein Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác nhau xuất hiện trong huyết thanh tại một thời điểm nhất định, phần lớn trong số chúng có mặt ở nồng độ rất thấp, cỡ ng/ml Đây là mẫu rất giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [10] Các protein có hàm lượng cao trong huyết thanh gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng

số (hình 1), trong đó có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein, [23] Ngoài ra còn có rất nhiều protein khác tồn tại với hàm lượng thấp hoặc rất thấp nhưng lại giữ những chức năng quan trọng như các protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu giữa các mô, cơ quan hay các protein giải phóng vào máu do kết quả của sự phá hủy mô, do nhiễm vi sinh vật, Như vậy, các protein xuất hiện trong huyết thanh do nhiều nguyên nhân khác nhau và nó cũng gợi ý cho việc áp dụng các phương pháp nghiên cứu khác nhau để phát hiện chúng

Protein trong huyết thanh được coi là một trong những hệ protein phức tạp nhất ở người Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) như albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50- 70%), do sự tổng hợp hàng ngày ở gan (khoảng 12g) và có thời gian bán hủy là 21 ngày nên nó được coi là chỉ thị của bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [10, 11] IgG khoảng 5-7 mg/ml chiếm 10% Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chỉ chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số như interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA-125), b2-microglobulin thông thường thay đổi từ 0 - 5 pg/ml và được coi là những chất chỉ thị có độ nhạy cao trong chẩn đoán nhiều quá trình bệnh lý [32]

Hình 1.7 Biểu đồ biểu di n thành phần 22 protein (chiếm 99%) trong huyết

thanh [32]

Các nghiên cứu đã chứng minh rằng các protein huyết thanh có thể là các chỉ thị sinh học đủ tin cậy trong chẩn đoán một số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan (alpha-fetoprotein) và các bệnh về tim mạch (C-reactive protein) [3] Tuy nhiên, trải qua nhiều thập

kỷ nghiên cứu mới chỉ có một lượng nhỏ các chỉ thị sinh học này được phát hiện và sử dụng cho mục đích chẩn đoán

Huyết thanh là một hệ protein khá toàn diện, là phiên bản lớn nhất và cũng là một mẫu nghiên cứu hấp dẫn [1, 10] Sự hấp dẫn của huyết tương đối với việc chuẩn đoán bệnh được quyết định bởi hai đặc trưng: (i) mẫu có thể lấy dễ dàng và an toàn, (ii) mẫu không chỉ phản ánh toàn diện kiểu hình người mà còn cho biết trạng thái của cơ thể ở một thời điểm đặc biệt nào đó Trong khi

đó, những mẫu khác như nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc chỉ được coi

là một tập con nhỏ của huyết tương hoặc mang tính địa phương và phản ánh hoạt động của tế bào [2].Huyết thanh là một thành phần quan trọng trong máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc và chức năng khác nhau, tác động lên nhiều cơ quan, nhiều quá trình sinh học khác nhau trong cơ thể Chính vì thành phần protein phức tạp của huyết thanh bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc

mà việc nghiên cứu hệ protein huyết thanh hứa hẹn sẽ mang lại nhiều thông tin bổ ích để phát triển các công tác nghiên cứu, chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là các bệnh trao đổi chất như đái tháo đường và các bệnh ung thư Những thay đổi bất thường về thành phần protein huyết thanh chắc chắn có liên quan đến các quá trình bệnh lý (bảng 1.2) Nói cách khác, huyết thanh là dạng mẫu đặc biệt, chứa đựng nhiều thông tin cần thiết cho việc nghiên cứu và chẩn đoán bệnh, vì thế việc sử dụng huyết thanh cho mục

đích nghiên cứu là cách tiếp cận hợp lý, đã và đang được minh chứng qua những thành tựu thu được trong nhiều thập kỷ qua

Bảng 1.2 Sự thay đổi nồng độ protein trong huyết thanh bệnh nhân ung thư [32]

Thực tế là nhiều loại protein trong huyết thanh đã được nghiên cứu trước khi chúng ta biết đến sự tồn tại của gen [10 Năm 2002 Adkins và cộng sự bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đã phát hiện được 490 loại protein khác nhau trong huyết thanh [11 Năm 2004, Chan và cộng sự bằng phương pháp điện di đẳng điện, sắc ký lỏng đa chiều-khối phổ đã phát hiện được 1444 protein [17] và gần đây nhất năm 2005, theo kết quả xác định và so sánh của

35 phòng thí nghiệm trong dự án proteome huyết tương người của HUPO (Human Proteome Organization), con số này đã là 3020 Lượng thông tin phong phú do các nghiên cứu về proteome huyết thanh thu được hoàn toàn bổ trợ cho những thông tin di truyền từ các nghiên cứu genome Với những cải tiến nhanh chóng, các kỹ thuật phân tích proteomics đang trở thành cơ sở cho

sự phát triển của genomics chức năng.Sự phối hợp giữa proteomics và genomics sẽ đóng vai trò chủ đạo trong những nghiên cứu về sinh-y học, là