Nghiên cứu thu nhận beauverincin từ cordyceps spp và thăm dò khả năng ức chế tế bào ung thư

Do đó, việc nghiên cứu khai thác, phát triển nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana tạo quả thể chứa hoạt chất sinh học trong đó có Beauvericin, để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, Cordyceps spp hay Đông trùng hạ thảo được biết đến như một loại dược liệu quý sử dụng trong y học Trong Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis, Cordyceps militariss, Cordyceps takaomontana… có nhiều hoạt chất sinh

học có giá trị cao như adenosine, cordycepin, cordyceptic acid, D manitol, Beauvericin, nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy – Ethyl – Adenosine – Analogs)… với nhiều tác dụng như tăng cường khả năng miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư, điều trị hen và viêm phế quản, giảm khả năng suy thoái thận, kháng viêm, tiêu viêm, ức chế nhiều loại vi sinh vật có hại trong đó có vi khuẩn lao… Không chỉ sử dụng trong dược phẩm, Đông Trùng Hạ thảo còn được dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị một số bệnh trong đó có ung thư và nâng cao sức khỏe

Hiện nay, trên thị trường Việt Nam đang lưu hành một số sản phẩm Đông

Trùng Hạ Thảo Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana

đến từ Hàn Quốc, Thái Lan, Nhật Bản nhưng chủ yếu là từ Trung Quốc

Trên thực tế, Cordyceps sinensis phân bố đặc thù ở Tây Tạng, việc nghiên

cứu nhân nuôi nhân tạo cho đến nay chưa hiệu quả, nguồn sản phẩm vẫn khai thác

từ tự nhiên nên giá thành rất cao Cordyceps militaris đã được nghiên cứu nuôi nhân

tạo trên quy mô lớn ở một số nước như Trung Quốc, Thái Lan, Hàn Quốc… Việt Nam hiện cũng đã tiến hành nhân nuôi quy mô nhỏ, tuy nhiên do chưa chủ động được nguồn giống, còn phụ thuộc vào nước ngoài, nên bị động và khó kiểm soát được chất lượng của giống cũng như sản phẩm tạo ra

Trong khi đó, các nghiên cứu đã cho thấy, Cordyceps takaomontana có chứa các hợp chất sinh học quý như trong Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis tuy

hàm lượng thấp hơn Đặc biệt, dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol chỉ có trong

Cordyceps takaomontana có tác dụng diệt nhiều loại tế bào ung thư với giá trị IC50

ở mức ng/ml [13, 26] và mạnh hơn so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần [33] và beauvericin với 12 tác dụng gây độc các dòng tế bào ung thư và u ác tính ở người với các liều lượng gây độc khác nhau, kháng được 10 loại vi khuẩn

gram dương và 9 loại vi khuẩn gram âm gây bệnh trên người [42] Tại Việt Nam,

Phạm Quang Thu và cộng sự (2009, 2010) đã phát hiện được Cordyceps takaomona

ở vườn quốc gia Tam Đảo Còn tại khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống, tại Nghệ An đã

thu thập được 29 mẫu, trong đó có Cordyceps takaomontana và một số loài có hoạt tính sinh học cao như Cordycepssp2., Ophiocordyceps unilateralis…[58] Tại Vườn

Quốc gia Pù Mát, Trần Ngọc Lân và cộng sự (2008) đã xác định được trong hơn 200

mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 loài, đặc biệt chi Cordyceps takaomontana có 11 loài, trong đó Isaria tenuipes (thể vô tính của Cordyceps takaomontana) là loài phổ

biến

Như vậy, nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana ở Việt Nam rất phong

phú, có thể khai thác nên chủ động được nguồn giống Ngoài ra, kỹ thuật nhân nuôi không quá khắt khe, nguồn nguyên liệu đầu vào cho nghiên cứu và sản xuất loại nấm này ở Việt Nam như gạo, nhộng tằm rất dồi dào Do đó, việc nghiên cứu khai thác,

phát triển nguồn gen nấm Cordyceps takaomontana tạo quả thể chứa hoạt chất sinh

học trong đó có Beauvericin, để sử dụng làm nguyên liệu cho ngành dược có tính khả thi, có ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và đặt cơ sở cho sự phát triển một số ngành nghề mới, đầy tiềm năng

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: ―Nghiên cứu thu nhận

Beauvericin từ Cordyceps spp và thăm dò khả năng ức chế tế bào ung thƣ’’

Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được chủng Cordcyeps spp và tìm điều kiện thích hợp cho tạo

thể quả sinh hoạt chất sinh học Beauvericin có khả năng ức chế tế bào ung thư

Nội dung nghiên cứu

- Thu thập, phân lập, tuyển chọn và định tên chủng Cordyceps spp có khả

năng tạo thể quả

- Lựa chọn môi trường hoạt hóa giống trên thạch và trên môi trường lỏng

- Nghiên cứu môi trường và các điều kiện nuôi thích hợp cho việc tạo thể quả sinh hoạt chất Beauvericin

- Thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư

Chương I TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về nấm Cordyceps spp

1.1.1 Giới thiệu về Cordyceps spp

Cordyceps spp là loại nấm túi, được các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện

lần đầu tiên tại Cao nguyên Tây Tạng của Trung Quốc, loại dược liệu này thực chất

là hiện tượng sâu non (ấu trùng) của loài côn trùng thuộc chi Thiarodes hoặc Hepialus bị nấm Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.ký sinh Thường gặp sâu non của

loài Thiatarodes baimaensis hoặc Thiarodes armoricanus, ngoài ra còn 46 loài khác

thuộc chi Thitarodes cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh Theo một số tài

liệu, vào cuối mùa thu, đầu mùa đông các bào tử dính vào da của sâu non (ấu trùng), phát triển trên sâu non và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm ăn sâu vào ấu trùng, sử dụng dinh dưỡng của sâu non làm chất dinh dưỡng để phát triển Đến đầu mùa hạ, nấm phát triển mạnh, gây chết sâu sau đó chúng hình thành chồi, phát triển cao nhô lên khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính vào đầu sâu Vì vậy, dân gian thường gọi

Nấm Cordyceps spp là Đông Trùng Hạ Thảo, Nhộng trùng Thảo hay Đông trùng

Cordyceps spp là loại nấm dược liệu rất quan trọng và được sử dụng rộng rãi

trong y học truyền thống, đặc biệt là trong Y học cổ truyển Trung Hoa Các nhà

khoa học cho rằng chi Cordyceps có gần 400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60 loài Đông Trùng Hạ Thảo như Cordyceps

liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis, Zhang, C Shanxiensis Liu…Ngoài

ra, còn có các chủng Cordyceps Militaris, Cordyceps nutans Pat, C.tricentri Yasuda, C.gunnii Berk Tuy nhiên cho đến nay, các nước trên thế giới, mới chỉ nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng nhân tạo một số loại nấm như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana…, các loài nấm này được

phân bố rộng ở cao nguyên Tây Tạng Trung Quốc, Bhutan Nepal, Vùng Đông Bắc

Ấn Độ, ở độ cao 3500 – 5000 so với mặt nước biển Theo một số nghiên cứu cho

thấy, các chủng nấm Cordyceps khác cũng được tìm thấy tại Thái Lan, Hàn Quốc,

Nhật Bản, và Việt Nam [21, 47]

Hình 1.1: Nấm Cordyceps sinensis trong tự nhiên (Nguồn Mycotherapie.nl)

Theo các sách y học cổ truyền, các chủng nấm thuộc lớp Ascomycestes sống

ký sinh trên vật chủ là sâu non của loài bướm (Caterpilar) họ cánh vẩy, đặc biệt, ở loài bướm đêm Hepialus armoricanus Loài bướm này đẻ trứng, trứng nở thành ấu

trùng, rồi thành sâu non Mùa đông, sâu non chui xuống đất sinh sống Trong môi

trường ẩm, bào tử nấm Ascomycestes trên cơ thể sâu non, gặp điều kiện thích hợp sẽ

nảy mầm và phát triển trên thân sâu chuyển thành dạng sợi nấm Ban đầu, hệ sợi có màu trắng, dạng mảnh, dần về sau, chúng phát triển nhanh thành một khối dày, chắc, một số biến thành màu vàng đậm cho tới nâu, một số vẫn phát triển thành màu hồng nhạt, đến màu cam.Và khi nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, hệ sợi nấm nhanh chóng trở nên tối màu giống màu bùn từ 30 đên 60 ngày, khi đó toàn bộ thân sâu

chỉ còn là lớp vở bọc bao ngoài sợi nấm Khi mùa hè đến, từ miệng sâu mọc ra cuống nấm, nhô lên khỏi mặt đất, giữa cuống nấm phình ra, trên bề mặt cuống có những mầm nhọn Các mầm nhọn này nảy ra một số hạt tròn, trong chứa các bào tử nấm.Thân cây cao gần 10 cm Khi đào lên làm thuốc, người ta thấy gốc nấm còn dính liền với đầu của xác sâu Ấu trùng của bướm dài khoảng 3 đến 6 cm, dày 0.4 – 0.7 cm, sắc nâu vàng, mình ấu trùng với nhiều vạch ngang Sâu có 8 cặp chân cụp ở khúc bụng và 4 cặp chân khác hơi dài ở khúc trên Cắt ngang mình sâu, thịt sâu ở ruôt màu trắng hơi ngả vàng, xung quanh có màu vàng sẫm hơn.Cây nấm mọc ra từ miệng sâu có đầu hình chùy chồi thuôn nhỏ lại Cây màu nâu, đen sẫm lại, dài khoảng 4 dến 8 cm, đường kính khoảng 0,3 cm

1.1.2 Chu trình sống và cơ chế xâm nhiễm

Hàng năm, việc đi tìm Đông trùng hạ thảo tự nhiên từ các vùng núi cao, thường diễn ra và mùa hè Điều đặt ra là tại sao mà người dân lại đi tìm vào mùa hè

mà không phải các mùa khác? Câu trả lời được đưa ra dựa vào vòng đời phát triển

của Cordyceps spp

Hình 1.2: Cơ chế xâm nhiễm nấm Cordcyeps spp.vào côn trùng

Côn trùng sau khi biến đổi thành ngài, chúng để trứng vào trong đất, sau đó trứng phát triển thành sâu non Vào mùa đông, sâu non hoặc sâu trưởng thành của một số loài nấm ở dưới đất hoặc có thể ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm và sử dụng trực tiếp dinh dưỡng từ cơ thể con trùng làm thức ăn, làm

cho côn trùng chết Giai đoạn này, nhiệt độ và độ ẩm không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi Đến mùa hè, nhiệt độ và độ ẩm không khí cao, nấm chuyển sang giai đoạn hình thành quả thể và nhú lên khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dính liền thân sâu

Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải quả các giai đoạn khác nhau Giai đoạn xâm nhập, bắt đầu từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc kết thúc việc xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng Bào tử nấm sau khi mọc mầm, phát sinh mầm bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp

vỏ cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase, lipase, aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase, cenlulolase Các enzyme nay được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác nhau giữa các loài và ngay

cả trong một loài Enyzm protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein) Quan trọng nhất là enzyme phân hủy protein (protease) và enzyme phân hủy chitin (chitinase) của côn trùng Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu quả diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng [2]

Giai đoạn tiếp theo, giai đoạn sống ký sinh của nấm Hệ sợ nấm trong khoang cơ thể tiếp tục phát triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn Khi hệ sợi hình thành trong cơ thể, nó phân tán khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy và làm giảm tốc

độ lưu thông máu Toàn bộ các bộ phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm nhiễm vào hệ hô hấp, làm giảm khả năng hô hấp của ấu trùng khiến hoạt đông của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài Kết quả làm vật chủ mất khả năng kiếm soát hoạt động sống và dẫn đến chết [41]

Giai đoạn cuối cùng, giai đoạn phát triển sau khi vật chủ chết, sợi nấm phát triển rất nhanh và tiết ra độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch của côn trùng.Trong giai đoạn gây độc vật chủ, một số loài nấm giết chết vật chủ trước khi gây độc toàn

bộ cơ thể côn trùng [6]

1.2 Tình hình nghiên cứu Cordyceps spp trên thế giới

1.2.1 Sự đang dạng và phân bố

Cordyceps spp có trên 400 loài khác nhau và theo hệ thống phân loại truyền thống các loài này được xếp vào họ Clavicipitaceae Dựa trên đặc điểm hình thái

cũng như đặc điểm về cấu trúc phân tử, chúng được xếp trong 162 đơn vị phân loại

(Sung et al 2007) Cordyceps spp được phân bố ở các nước thuộc châu Á như

Trung Quốc, Nhật bản, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam [21, 47]

Mao X.L (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái, công dụng và ảnh minh họa

cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, đó là các loài : Cordyceps barnesii Thwaites, Cordyceps capiata (Holmsk;Fk) Link, C.crassiora Zang, Yang et Li, C.gunii (Berk), C.hawkesii Gray, Cordyceps kyushensis Kobayasi, C.martialis Gray, C.militaris Link, C nutans Pat, C.ophoglossoides (Ehrenb) Link, C sinensis (Beck) Sacc, C sobolifera (Hill).Berk , C.tubeculata

(Leb), Maire [30]

Hình 1.3: Nấm Cordyceps sobolifera trong tự nhiên (nguồn http://blog.goo.ne.jp)

Sung Jae Mo (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái của 25 loài nấm thuộc chi

Cordyceps phân bố tại Hàn Quốc, bao gồm các loài sau: C.adaesanensis, C.agriota Kawamura, C.bifisispora, C.crassispora, C.discoideocapiata, C.formicarum, C.gemiculata, C.gracilis, C.heteropoda, C.ishikariensis, C,kyushuensis, C martialis, C.militaris, C.nutans, C.ochraceostroma, C.ophoglossoides, C.oxycepphala, C.pentatoni, C.pruinosa, C.resea, C.scarabaeicola, C.sinensis, C.sphecocephala, C.tricentri, C.yongmoones [49]

Hình 1.4: Chủng nấm Cordyceps gunnii trong tự nhiên (Nguồn Australianfungi)

Tại Nhật Bản, Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả 33 loại

nấm Đông Trùng Hạ Thảo: C.arigota, C.Longissisma, C.yakushimensis, C sobolifera, C.heteropoda, C.tricentri, C.coccidiicola, C.nutans, C.ruinosa, C.crilalis, C.militaris, C.takaomontana, C.neovolkiana, C.nakazawai, C.purpureostroma, C.ferruginosa, C.nigripoda, C.roeostroma, C.annullata, C.clavata, C.atrovirens, C.gracilioides, C.michiganensis, C.subbssesillis, C.stylophora, C.macularis, C.discoideocapitata, C.spheciceophala, C.japonensis, C.japonica, C.ophioglossoides, C.capita, C.intermedia f.michiniluensis [51]

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt chất sinh học

Trong các loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo, 3 chủng nấm Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana và một số loài khác được quan tâm

nghiên cứu nhiều hơn cả thành phần hóa học và hoạt chất sinh học Các phân tích

hoá học cho thấy, trong sinh khối (biomass) của Đông trùng Hạ thảo Cordyceps militaris chứa 17 loại acid amin khác nhau Ngoài ra còn có D-mannitol, lipid và

nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na, Cu, Zn ) Quan trọng hơn là trong sinh khối Đông trùng Hạ thảo có nhiều chất mang hoạt tính sinh học cao đang được các nhà khoa học dần khám phá ra nhờ các tiến bộ của ngành hoá học các hợp chất tự

nhiên Nhiều hoạt chất trên được chứng minh là có giá trị dược liệu thần kỳ Trong

đó phải kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine và nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs) [1]

Ngoài ra, Đông trùng Hạ thảo còn chứa nhiều loại vitamin, như trong 100g Đông trùng Hạ thảo có 0,12 g vitamin B12; 29,19 mg vitamin A; 116,03 mg vitamin

C, ngoài ra còn có vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K Hơn nữa, rất nhiều loại polysaccharides và một loạt các nguyên tố hóa học (K, Na, Ca, Mg, Fe,

Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V) cũng được tìm thấy trong chi nấm này [1]

Còn trong C takaomontana có adenosin 0,1%, manitol 7,42%, 17 loại amino

acid, protein 40,24%, 6 loại acid béo trong đó cao nhất là Oleic acid 38,35%, Linolenic acid 28,3%, Palmitic acid 17,08%, Linoleic 12,35%, Stearic acid 3,16%, Palmitoeic acid 0,76% (In Pyo Hong 2007) Polysaccharides phân lập từ thể vô tính

của C takaomontana có hoạt tính chống ung thư (Ban et al., 1998)

Đặc biệt các dẫn xuất nhóm acetoxyscirpenol là một thành phần hoá học

quan trọng đã được phát hiện ở thể vô tính của loài Cordyceps takaomontana Các

hợp chất này thể hiện tác dụng diệt tế bào ung thư rất hiệu quả thông qua cơ chế gây chết theo chương trình (apoptosis)

Beauvericin được phát hiện trong nhiều loài nấm ký sinh côn trùng như

Isaria tenuipes (thể vô tính của Cordyceps takaomontana) Beauvericin là một chất

chuyển hóa cyclohexadepsipeptide liên quan đến nấm sở hữu một loạt các hoạt động sinh học như thuốc trừ sâu, điều trị nhiễm ký sinh trùng, kháng khuẩn, kháng nấm, chống trùng sốt rét và ức chế ung thư (Shin et al., 2009)

1.2.3 Nghiên cứu về giá trị dược liệu của Đông Trùng Hạ Thảo

Trong các loài nấm Đông Trùng Hạ Thảo, loài nấm Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana được quan tâm nghiên cứu nhiều về

giá trị dược liệu

Các nghiên cứu cho thấy, trong sinh khối (biomass) của Đông trùng Hạ thảo

Cordyceps militaris chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học cao đã được chứng minh

là có giá trị dược liệu thần kỳ, có thể kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine

và nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs) [1]

Cordiceptic acid: là một dạng D-manitol, chất này có tác dụng giảm ho và

hen suyễn, giảm đường huyết và kháng lại vi khuẩn nên rất tốt cho hệ miễn dịch cũng như người mắc bệnh tiểu đường

Cordycepin: là một dạng analoge của Adenosine (3’-deoxyadenosine), có tác

dụng ngăn chặn vi khuẩn, chống sự xâm nhiễm của virus, ngăn ngừa ung thư và có tác dụng rất tốt cho những người mắc bệnh lao

Adenosine: có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của

cơ thể, giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, phục hồi năng lực cơ bắp,

ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư, tăng cường khả năng vận chuyển oxi trong máu

Nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine – Analogs) có hoạt tính

sinh học rất mạnh, đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm do khả năng hỗ trợ hệ miễn dịch, chống lại sự xâm nhiễm của một số retrovirus như virus HIV

Các nhà y học cổ truyền ở Trung Quốc đã nghiên cứu dùng nấm Đông trùng

Hạ thảo điều trị thành công khá nhiều bệnh như: rối loạn lipit máu (hiệu quả đạt 76,2%), viêm phế quản mãn tính và hen phế quản, viêm thận mãn tính và suy thận (đạt hiệu quả từ 44,7 - 70%), rối loạn nhịp tim (đạt hiệu quả 74,5%), tăng huyết áp, viêm mũi dị ứng, viêm gan B mãn tính (đạt hiệu quả 70%), ung thư phổi và thiểu năng sinh dục (đạt hiệu quả từ 31,57- 64,15%) [47]

Không những vậy, Đông trùng Hạ Thảo còn có nhiều tác dụng và đã được các nghiên cứu về y học chứng minh Với tác dụng bảo vệ thận: Chống lại các dụng phụ của thuốc tân dược đối với thận ví dụ như đối với độc tính của Cephalosporin

A, bảo vệ thận trong trường hợp gặp tổn thương do thiếu máu, chống lại sự suy thoái thận, đẩy nhanh quá trình tái sinh và phục hồi các tế bào ở thận, tăng cường tác dụng nội tiết tố tuyến thượng thận và làm trương nở các nhánh khí quản; giữ ổn định hệ tuần hoàn: giảm hiện tượng thiếu máu, tăng cường khả năng lưu thông, điều tiết lượng đường, Cholesteron trong máu, chống xơ vữa động mạch và ổn định nhịp

tim; tăng khả năng miễn dịch, làm chậm quá trình lão hóa, ức chế vi sinh vật có hại; đẩy nhanh tác dụng của nội tiêt tố…

Ngoài những tác dụng nêu trên, thì nấm Cordyceps còn trực tiếp ảnh hưởng đến một số hệ cơ quan quan trọng khác trong cơ thể và đặc biệt có tác dụng ức chế

tế bào ung thư đã được mô tả bởi nhiều tài liệu [12, 24, 26, 34]

Y học phương Tây cũng đã công nhận tính năng bổ dưỡng của nấm

Cordyceps, dịch chiết của loại nấm này có khả năng nâng cao thể lực, điều hòa khí

chất, đặc biệt những người do tính chất công việc phải ngồi liên tục và ít vận động Dựa trên kết quả nghiên cứu về tác dụng nâng cao sức luyện tập, khả năng chịu đựng và làm giảm mệt mỏi ở những người trong độ tuổi trung niên 40 đến 70, các nhà khoa học thuộc trung tâm Pharmanex, California đã phát triển một loại thuốc

lấy tên là Cordymax chứa chiết xuất của nấm Cordyceps và được thử nghiệm trên

131 người tình nguyện trong 12 tuần và cho kết quả khả quan [44]

Nấm Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa chứa hợp chất 4 -

acetyl - 12,13 – epoxyl - 9-trichothecene-3,15 - diol Đây là hợp chất được dùng để

hỗ trợ điều trị bệnh ung thư, đặc biệt là bệnh máu trắng ở người [7, 14, 31] Nấm

Paecilomyces tenuipes (Peck) Samon (=Isaria japonica Yasuda hoặc Isaria tenuipes)

là thể vô tính của Cordyceps takaomontana Yahushiji et al Kumazawa [38] Quả thể của nấm Paecilomyces tenuipes có giá trị cao về mặt dược liệu do chứa các hoạt

chất như Leucinostatins A, D, Polygalactosamine kháng khối u, Saintopin, Sphingofungins E và F, UCE1002, Paeciloquinones A, B, C, D, E và F, Ergosterol peroxide, Acetoxyscirpenediol…[11, 19, 27] Các hoạt chất Ergosterol peroxide và

Acetoxyscirpenediol tách chiết từ nấm Paecilomyces tenuipes nuôi cấy nhân tạo có

khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư dạ dày, ung thư gan, ung thư ruột kết, ruột thẳng với giá trị IC50 rất thấp (thậm chí ở mức ng/ml) (Lee et al 2006, Han et al

2004, Chung et al., 2003; Bunyapaiboonsri et al., 2009) và mạnh hơn so với thuốc chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần (Nam et al., 2001) Ngoài ra lớp chất này cũng có tác dụng ức chế protein vận chuyển SGLT-1 liên quan đến bệnh tiểu đường [Yoo et al 2006]

Năm 2009, Sung Hak Lee và cộng sự tiến hành nghiên cứu sản xuất

polysaccharides bằng nuôi lỏng Cordyceps takaomontana và tìm hiểu ảnh hưởng

của chúng tới tế bào ung thư neuroblastoma người Hiệu quả ức chế của IPS và EPS tới sự phát triển của tế bào SKN-SH được thử nghiệm đánh giá với nồng độ IPS và EPS là 0.5, 1, 2 mg/ml tương ứng với các thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Ảnh hưởng ức chế trên các tế bào ung thư SK-N-SH đạt 64,6% khi IPS ở nồng độ 2mg/ml trong 72 giờ Kết quả này chỉ ra rằng, IPS có tiềm năng trong việc ức chế tế bào neuroblastoma (Sung Hak Lee và cộng sự, 2009)

Hình 1.5: Nấm Cordyceps takaomontana trong tự nhiên

(nguồn Cordyceps.us)

1.2.4 Tình hình nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps trên thế giới

Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps spp được tiến hành ở nhiều

nước trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ … Tại Trung Quốc, thủ phủ của Đông trùng hạ thảo, có một số khu nuôi chuyên biệt cho loại nấm

Cordyceps tại một số tỉnh như: Thượng Hải, Quảng Châu, Vân Nam…Mỗi năm, tại

mỗi khu nuôi nấm này đưa ra thị trường với một sản lượng khá lớn Ví dụ tại Kaiping, Quảng Châu, một năm thu được hang trăm kilogram sản phẩm [28]

Tại Hàn Quốc, một số phòng thí nghiệm đã sử dụng giá thể là tằm, nhộng để nuôi trồng thể quả [19] Tại thành phố Hayward, Bang California, Mỹ, Công ty

Công nghệ sinh học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô công nghiệp Cordyceps militaris trên giá thể gạo Sản phẩm của các khu nuôi của các nước được tiêu thụ tại

nội địa và xuất ra nước ngoài

Hình 1.6: Thể quả của Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt

(Nguồn anamuriel.org/medicinal-mushrooms/) Sản phẩm nấm Đông trùng hạ thảo và Nhộng trùng thảo từ nuôi trồng nhân tạo đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới và mang lại lợi nhuận cao cho người nuôi trồng (Li Cui et al., 2008)

1.3 Tình hình nghiên cứu Cordyceps trong nước

1.3.1 Sự đa dạng và phân bố của Chi Cordyceps

Trịnh Tam Kiệt (1996) và đồng tác giả năm (2001) đã đưa ra danh mục các

loài nấm Cordyceps có ở Việt Nam thuộc Họ Clavicitaceae, trong đó có 3 loài thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps marialis Speg., Cordyceps sinensis (Berk) Sacc và loài Cordyceps sobolifera (Hill) Berk & Br Các tác giả đã ghi nhận nấm Đông

Trùng hạ thảo có phân bố ở các tỉnh của Việt Nam như: Lai Châu, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh [4,5] Năm 2009, Phạm Quang

Thu đã phát hiện thêm hai loài nấm Đông trùng hạ thảo mới tại Việt Nam có phân

bố ở Bắc Giang và Vĩnh Phúc, đó là hai loại nấm: Cordyceps nutans và Cordyceps gunnii [7]

Tại vườn quốc gia Hoàng Liên, tỉnh Lào Cai đã phát hiện nấm Đông trùng

Hạ thảo Cordyceps militaris

Năm 2009, Phạm Thị Thùy đã thu thập nấm Cordyceps ở vườn quốc gia Cúc Phương, tỉnh Ninh Bình Tác giả đã xác định được loài Đông trùng Cordyceps militaris, đây là loài lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam Loài nấm

này phân bố ở rừng tự nhiên có độ cao từ 1.900m đến 2.100m so với mực nước biển Ký chủ của loài này là nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 - 6,5cm, hình chùy, phần thân và cuống nhỏ, phần đầu phình to có chiều rộng đến 0,6cm Màu sắc của phần cuống nấm và phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn và có màu da cam nhạt, phần sinh sản có màu da cam đậm và có nhiều mụn nhỏ Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản Túi bào tử có kích thước 300-510µm x 3,5-5µm, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,5-5µm

Một số khu vực khác cũng đang được triển khai tìm kiếm và nghiên cứu nấm

Cordyceps, thường thì Cordyceps ở Việt Nam phân bố ở những khu rừng nhiệt đới

thường xanh, có độ cao từ 800m đến 2.000m

Trong chương trình nghiên cứu nghị định thư giữa Việt Nam và Trung Quốc

cấp nhà nước về nghiên cứu nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps militaris, PGS.TS

Phạm Thị Thùy - Viện Bảo vệ thực vật đã chủ trì đề tài phát triển nấm Đông trùng

Hạ thảo làm nguyên liệu thực phẩm chức năng cho người Kết quả đã nghiên cứu và xác định được 3 loài nấm Đông trùng Hạ thảo đó là:

- Cordyceps nutans ở Cúc Phương - Ninh Bình và Tam Đảo - Vĩnh Phúc

- Cordyceps militaris ở Vũ Quang, Hà Tĩnh

- Cordycep spl ở Sơn Động, Bắc Giang

Các tác giả cũng đã xác định được một số giá trị dược liệu của Cordyceps militaris ở Việt Nam gồm chất Cordycepin, Adenosin, HEAA, một số vitamin và

một số nguyên tố vi lượng

Nấm Cordyceps gunnii (Berk.) Berk thuộc họ Clavicipitaceae, bộ

Hypocrales, lớp Sordariomycetes, ngành nấm túi Ascomycota, là loài nấm nhỏ, đỉnh nấm nhọn được mọc từ phần đầu của sâu non Toàn bộ cây nấm màu trắng xám, khi non phần gốc nấm to hơn phần ngọn, nơi chứa các cơ quan sinh sản của nấm Sâu non bị nấm kí sinh nằm ở tư thế thẳng đứng và bị đất vùi kín Toàn bộ chiều dài cây nấm lúc thu hái là 55mm, phần nhô lên khỏi mặt đất dài 30 mm Khi thành thục cuống màu trắng dài 10 - 90mm, rộng 2 - 3mm, đỉnh nấm màu xám đến đen, hình trứng đến ống dài, mọc đơn, phân nhánh hoặc mọc thành chùm, chiều dài 8 - 22mm, rộng 5 - 8mm, màu sắc giữa phần cuống và phần đỉnh khác nhau Thể quả hình trứng dài hoặc hình bình, chiều dài 700 – 900µm, chiều rộng 200 - 300µm, ngập sâu trong mô của nấm Khi thành thục miệng lộ ra ngoài Túi bào tử hình ống, kích thước 200-250 x 6,5-7,5µm, chứa 8 bào tử hình sợi, khi thành thục, bào tử túi hình sợi dễ dàng đứt đoạn thành đoạn bào tử túi hay bào tử túi thứ sinh, kích thước 4-6,5 x 2-3µm Bào tử túi thứ sinh dễ nảy mầm, khi chưa phóng ra khỏi túi một số bào tử nảy mầm thành sợi nấm dài gấp mấy lần bào tử Nấm ký sinh trên sâu non ở

dưới đất, nên thường bị nhầm là Đông trùng Hạ thảo Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc [7] Nấm Cordyceps gunnii (Berk.)Berk phân bố trong rừng tự nhiên lá rộng

thường xanh, ở độ cao trên 800 m so với mực nước biển Tính đa dạng các loài cây

gỗ ở kiểu rừng này rất cao với rất nhiều loài đại diện của các họ Đậu (Fabaceae), họ Dầu (Dipterocarpaceae), họ Xoan (Meliaceae), họ Trám (Burseraceae), họ Sim (Myrtaceae) và họ Xoài (Anacardiaceae) Đây là kiểu rừng đang bị xuống cấp mạnh Sâu non là ký chủ của nấm vẫn còn nguyên hình dạng, nằm ở trong lớp đất mặt có độ sâu 2 - 7 cm Loài nấm này ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn, nấm hình thành quả thể trong điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ 0,5 - 0,6

Ký chủ của nấm Cordyceps gunnii (Berk.)Berk ở ngoài tự nhiên ký sinh trên

sâu non Sâu non thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera có da đen bóng, có miệng dạng gặm nhai, có 3 đôi chân thật và 2 đôi chân giả, trên các chân giả có móc [2].Năm 2010, Phạm Quang Thu và Nguyên Mạnh Hà phát hiện thêm loài nấm Đông Trùng Hạ

Thảo Cordyceps takaomontana nâng tổng số loài nấm Đông trùng hạ thảo được

phát hiện tại Việt Nam Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, loài nấm này phân bố ở rừng nhiệt đới lá rộng thường xanh, ở độ cao từ 800 – 1000m so với mặt nước biển tại Vườn Quốc gia Ba Vì (Hà Nội) và Vườn Quốc gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc) [8]

Hình 1.7: Chủng nấm Cordyceps nutans trong tự nhiên

(Nguồn Phạm Quang Thu)

Loài Cordyceps nutans: nấm mọc ở phần đầu, ngực và phần cuối bụng bọ

xít, nhưng chủ yếu ở phần đầu và ngực Nấm khi còn non hình thuôn nhọn hoặc hình lưỡi liềm, khi già chia thành 2 phần rõ rệt: phần cuống nấm có màu hơi đen và phần đầu nấm hình chùy có màu đỏ da cam đặc trưng Số lượng nấm trên một ký chủ từ 1 – 5 cây nấm, nấm trưởng thành thu được có chiều dài từ 60 – 180mm, chiều ngang phần thân nấm từ 2 – 2,5mm Phần đầu nấm hay còn goi là cơ quan sinh sản của nấm, chiếm từ 1/6 đến 1/4 chiều dài của cả cây nấm, chiều ngang từ 2,5 – 4mm Trên phần sinh sản màu đỏ da cam chứa thể quả dạng chai, chìm sâu, vách không màu, mọc xiên, cổ cong, miệng thể quả vẫn nhìn thấy trên thể hình chùy Kích thước của thể quả 550-810 x 130-210 µm Túi bào tử hình trụ, chiều dài 760-780µm, đường kính 7-8 µm Mỗi túi bào tử chứa 8 bào tử Bào tử túi rất dễ gãy

thành những đoạn nhỏ được gọi là ―đoạn bào tử‖ Đoạn bào tử hình trụ hoặc hình tang trống, hơi phình to ở đoạn giữa, hai đầu bằng, kích thước 9-14,8 x 1,2-2 µm Nấm ký sinh trên bọ xít và được tìm thấy trong rừng tự nhiên, ở độ cao từ 400-1400m, gần khe suối, ven đường mòn…Nấm mọc nhô lên khỏi lớp thảm mục rừng, phần thể quả có màu đỏ da cam nổi lên khỏi lớp thảm mục Ký chủ của nấm là bọ xít vẫn còn nguyên hình dạng hoặc còn một phần nhưng rất dễ nhận dạng, nằm ngay dưới lớp thảm mục [10]

Loài nấm Isaria tenuipes (Peck.) Samson thuộc họ Clavicipitaceae, bộ

Hypocrales, lớp Sordariomycetes, ngành phụ nấm túi Ascomycota, là giai đoạn vô

tính của nấm Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa Hình thái của quả

thể nấm bao gồm 2 phần chính: cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính Cuống của nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và số lượng quả thể có trên một ký chủ, thường từ 0,5 - 4,5mm Phía trên của cuống nấm

là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh và căng phồng chứa đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào tử Bào tử vô tính hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5-1,0 x 2,5-3,0µm Loài nấm

Isaria tenuipes (Peck.) Samson phân bố trong rừng tự nhiên lá rộng thường xanh á

nhiệt đới đến nhiệt đới, ở độ cao trên 400 - 1800m, so với mực nước biển Đây là một loài nấm ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn và dưới lớp thảm mục rừng Nấm hình thành quả thể trong điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ 0,5-0,8 Tổ thành thực vật chủ yếu là các loài thuộc họ Sồi, Dẻ (Fagaceae), họ Đậu (Fabaceae), họ Mộc lan (Magnoliaceae) Ký chủ của loài nấm này là nhộng thuộc

bộ Cánh vẩy Lepidoptera [9] Nấm Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa tồn tại ở 2 thể hữu tính và vô tính, ở thể vô tính, được gọi bằng những tên khác nhau là Isaria tenuipes, Paecilomyces tenuipes, Isaria japonica [8,44]

+ Thể hữu tính: Nấm (stromata) mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên nhộng thuộc bộ Cánh vảy, nấm màu vàng chanh nhạt, cuống nấm hình trụ, kích thước 10-45 x 1-1,5mm Thể quả dạng chai (perithecia), có hình dạng bình nổi trên

bề nặt của phần chóp nấm.Túi bào tử hình chùy, kích thước 1100-1200 x

2,2-3,0µm, phần mũ của túi bào tử có hình trứng đến gần cầu, kích thước 2,5 x 3,0µm Bào tử túi dài, mảnh và dễ bị gãy thành đoạn bào tử, đoạn bào tử có kích thước 6-8

x 0,5-0,8µm [8]

+ Thể vô tính: Hình thái của thể quả nấm (synnemata) bao gồm 2 phần chính: Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structure) Cuống của nấm màu vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và

số lượng thể quả có trên một ký chủ, thường có chiều dài từ 0,5 đến 4,5cm Phía trên của cuống nấm là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh

và căng phồng chứa đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào

tử Bào tử vô tính có hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5 - 1,0 x 2,5

- 3,0µm [8]

Cordyceps takaomontana Yakushiji & Kumazawa phân bố chủ yếu trong

rừng tự nhiên lá rộng thường xanh, ở độ cao trên 800-1000 m so với mực nước biển Đây là loài nấm ưa ẩm, phân bố dọc theo khe cạn, nấm hình thành quả thể trong điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che thích hợp từ 0,7-0,8 Màu sắc và kích

thước của thể quả thay đổi theo độ che phủ của rừng [8]

1.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị dược liệu của nấm Đông trùng hạ thảo

Đỗ Tất Lợi (1977) đã viết, Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc bổ, dùng để chữa thần kinh suy nhược, chữa ho, bổ tinh khí, chữa đau lưng, bổ thận Liều dùng 6-12 gram theo cách ngâm rượu

Nguyễn Lân Dũng, Dương Văn Hợp và Nguyễn Thế Hải (2005) đã tổng quan các tài liệu nghiên cứu của Trung Quốc, Hàn Quốc và tài liệu ở các nước

phương Tây về giá trị dược liệu của loài nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris và Cordyceps sinensis Các loài nấm này có thể dùng đễ chữa trị cho 25

loại bệnh khác nhau nên các tác giả đã gọi nấm Đông trùng hạ thảo là thần dược

Thành phần hóa học trong nấm ký sinh côn trùng được Đái Duy Ban và cs

(2009) lần đâu tiên phân tích và mô tả loài Isaria cerambycidae, một loại nấm ký

sinh trên xén tóc, lần đầu tiên được phát hiện tại Việt Nam Trong loài nấm này có

chứa 17 loại acid amin, điều đặc biệt là hàm lượng các acid amin trong sâu và nấm

của loài này là tương tự nhau Giống như Isaria tenuipes, qua phân tích Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã xác định thành phần adenosine có trong nấm Isaria cerambycidae

Nguyễn Mậu Tuấn (2011) phân tích về thành phần sinh hóa trong nấm

―Đông trùng hạ thảo tằm dâu‖ (Paecilomyces tenuipes) cho thấy, hàm lượng protein

59.61 - 70.45%, hàm lượng mannitol 1.21 - 1.78%, tổng acid amin 27.75 - 48.02% với các thành phần vi lượng và vitamin cao

1.3.3 Nghiên cứu về nhân nuôi thể quả nấm tại Việt Nam

Hiện nay, vấn đề nghiên cứu và nuôi trồng thể quả nấm Codyceps tại Việt

Nam vẫn đang ở mức độ phòng thí nghiệm và quy mô nhỏ, chủ yếu tập trung vào

chủng Cordyceps militaris Phạm Quang Thu và cs (2012) đã báo cáo tổng kết đề tài ―Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi trồng nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link có giá trị dược liệu và thương mại cao‖ Đây là nghiên cứu nhân nuôi đầu tiên tại Việt Nam về loài nấm Đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris

Cùng với việc phát hiện ra loài Isaria cerambycidae, Đái Duy Ban và cs

(2009) đã tiến hành phân tích thành phần hóa sinh và thử nghiệm nhân nuôi loài này Sử dụng một số cơ chất để nuôi cấy nhân tạo bước đầu cho thấy chúng phát triển rất tốt và khi phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu nuôi được có chứa các hợp chất sinh học quan trọng so với mẫu tự nhiên

Tại Bảo Lộc, Nguyễn Mậu Tuấn và cs (2010) ở trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng đã nghiên cứu nhân nuôi thành công nấm đông

trùng hạ thảo tằm dâu (Cordyceps takaomontana hay Paecilomyces tenuipes) chủng Hàn

Quốc và chế biến một số sản phẩm như rượu, viên nang, viên nén

Hình 1.8: Một dòng sản phẩm từ chủng Cordyceps takaomontana

(Nguồn Trung tâm Nghiên cứu Thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng)

1.4 Ảnh hưởng của các điều kiện lên men tới khả năng tạo thể quả sinh hoạt

chất Beauvericin của chủng Cordyceps takaomontana

Quá trình tạo thể quả của nấm được nuôi trên hai môi trưởng lỏng và trên môi tường rắn Việc lên men trên môi trường trường lỏng để tạo thể quả có một số lợi ích nhât định khi so sánh với lên men bề mặt, đặc biệt là sự tiêu thụ ít năng lượng Tuy nhiên, khi nuôi trên môi trường lỏng để thu thể quả còn tồn tại một số hạn chế là sản lượng thể quả thu được thấp, thời gian lên men lâu, khó triển khai trên quy mô công nghiệp Lên men rắn đã khắc phục được những hạn chế của việc lên men trên môi trường lỏng tạo thể quả Lên men bề mặt tiêu thụ ít năng lượng của môi trường dinh dưỡng, có thể thu được khối lượng thể cao cao hơn rất nhiều so với lên men tạo thể quả trên môi trường lỏng Đặc biệt, nguồn nguyên liệu cho quá trình lên men dễ kiếm, rẻ tiền dẫn tới hạ giá thành sản phẩm đầu ra Cơ chế hoạt động của lên men bề mặt đơn giản Các thông số nhiệt độ, độ ẩm, cường độ sáng được điều khiển tự động trên quy môi phòng thí nghiệm, và xa hơn nữa có thể nhân nuôi trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời với các điều kiện thích hợp

Trong quá trình lên men bề mặt, nấm Cordyceps chịu tác động trực tiếp của

các yếu tố môi trường bao gồm: điều kiện môi trường, thành phần môi trường (hàm lượng gạo lứt, độ pH, nhiệt độ…) các nghiên cứu đã chỉ ra rằng lựa chọn chính xác

hàm lượng cơ chất và các thông số ảnh hưởng sẽ mang tính quyết định nhằm tối ưu quá trình tạo thể quả và các sản phẩm trao đổi chất, các yếu tố vật lý và hóa học cũng ảnh hưởng tới khả năng tạo ra các sản phẩm đích

1.4.1 Hàm lượng cơ chất (gạo lứt) và tốc độ thông khí

Hàm lượng gạo lứt là thành phần chính của môi trường dinh dưỡng, đảm bảo

cho sự phát triển của sinh vật và tạo các hợp chất trong Cordyceps như Adenosine,

Beauvericin… Khi cố định dung tích bình nuôi, khối lượng gạo lứt trên một bình không chỉ ảnh hưởng tới hàm lượng dinh dưỡng cung cấp cho sự phát triển của thể quả, mà còn ảnh hưởng tới mật độ oxy Khi hàm lượng gạo lứt tăng, tương đương với hàm lượng dinh dưỡng tăng đồng thời hàm lượng oxy giảm xuống, không cung cấp đủ cho thể quả hô hấp và phát triển Và ngược lại, khi hàm lượng gạo lứt giảm xuống, mật độ oxy trong bình tăng nhưng hàm lượng dinh dưỡng không cung cấp

đủ để nuôi thể quả Do vậy, việc lựa chọn khối lượng gạo lứt trên một bình là cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thể quá để đạt được khối lượng thế quả cao nhất

1.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là một trong những yếu tố ngoại cảnh then chốt trong quá trình

nhân nuôi Nấm Cordyceps tạo thể quả Quá trình nhân nuôi thể quả của Cordyceps

trải qua 3 giai đoạn, giai đoạn đầu – giai đoạn phát triển của hệ sợi Tại giai đoạn này, nhiệt độ thích hợp cho hệ sợi phát triển là 24oC cho đến 25oC Sau khi hệ sợi phủ kín bề mặt và chuyển màu, nhiệt độ nuôi được chuyển sang giai đoạn hai – giai đoạn kích thích tạo thể quả Ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp xuống dưới

20oC, với từng loài Cordyceps khác nhau, nhiệt độ kích thích tạo quả thể khác nhau

Giữ vùng nhiệt độ thấp dưới hai mươi độ đến khi xuất hiện các mầm quả thể nhú lên trên môi trường gạo, khi đó chuyển sang nhiệt độ nuôi tại 25o

C - giai đoạn 3, là nhiệt độ tối ưu cho quá trình phát triền của thể quả Nếu nhiệt độ tăng lên trên 25oC

độ, thể quả phát triển kém, vì nhiệt độ cao, ảnh hưởng tới sự thoát hơi nước của quả thể Khi nhiệt độ giảm xuống dưới 24oC, quả thể phát triển chậm Trong 3 giai đoạn, giai đoạn nảy mầm là giai đoạn quan trọng Khi nhiệt độ không kiểm soát tốt,

thì không xảy ra quá trình nảy mầm của thể quả Đặc biệt, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn tới quá trình sinh Beauvericin Beauvericin được sinh ra khi nhiệt độ ở ngưỡng

23oC – 25oC Tại 25oC là nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh Beauvericin, khi nhiệt

độ tăng lên 30oC, quá trình tổng hợp Beauvericin dừng lại

1.4.3 Ảnh hưởng của pH

Giá trị pH ban đầu ảnh hưởng không nhỏ tới quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp của vi sinh vật, các quá trình trao đổi chất và giai đoạn tổng hợp các hoạt chất trung gian đòi hỏi những điều kiện nuôi cấy nhất định pH ban đầu tác dụng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, tạo điều kiện thích hợp cho những giai đoạn đầu của quá trình đồng hóa, tích tụ những bán thành phẩm để tổng hợp phân tử

và các hợp chất cần thiết pH phù hợp cho sự phát triển tạo thể quả từ 4 – 9 Mỗi

chủng Cordyceps khác nhau, giá trị pH tạo thể quả cũng khác nhau nhưng chỉ dao

động trong khoảng từ 4 đến 9 khi giá trị pH xuống dưới 4, hệ sợi và thể quả vẫn phát triển, nhưng phát triển chậm, khi pH tăng lên trên 9, thể quả phát triển kém Giá trị pH cũng ảnh hưởng tới quá trình sinh Beauvericin

1.4.4 Ảnh hưởng của cường độ sáng và độ ẩm môi trường

Hàm lượng ẩm và cường độ ánh sáng của môi trường nuôi ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình sinh trưởng của thể quả Khi độ ẩm thấp, quá trình hình thành thể quả không xảy ra, và khi độ ẩm đạt giá trị trong khoảng 95% – 100 %, thể quả có hiện tượng bị hỏng khi đã mọc, đọng nước bề mặt khi chưa hình thành, gây ức chế quá trình hình thành và phát triển của thể quả Cường độ ánh sáng ảnh hưởng tới quá trình kích thích nảy mầm và tốc độ phát triển của thể quả Mỗi chủng nấm

Cordyceps khác nhau có giá trị chiếu sáng kích thích nảy mầm và phát triển thể quả

khác nhau Có những loài chịu được cường độ ánh sáng chiếu cao lên tới 2000 lux

như Cordyceps militaris, nhưng có những loài chỉ mọc khi cường độ ánh sáng yếu

từ 150 lux – 200 lux, như Codyceps takaomontana

1.5 Sơ lƣợc về Beauvericin

1.5.1 Cấu tạo hóa học Beauvericin

Beauvericin là một ―cyclic hexadepsipeptide‖, là một loại độc tố được sản

xuất bởi nhiều loại nấm như Beauveria basiana, Fusarium, Isaria… đồng thời hoạt

chất này cùng thuộc nhóm kháng sinh Nó có chứa hai tiểu phần

Tên theo IUPAC: (3S, 6R, 9S, 12R, 15S, triisopropyl-4,10,16 trimethyl-1,7,13-trioxa-4,10,16-triazacyclooctadecane-2,5,8,11,14,17-hexone

18R)-3,9,15-Tribezyl-6,12,18-Về mặt Hóa học, beauvericin là một hexadepsipeptide cyclic xen kẽ phenylalanyl và hydroxy-iso-valeryl dư lượng, có khả năng tạo phức ion cho phép beauvericin vận chuyển kim loại kiềm thổ và các ion kim loại kiềm qua màng tế

methyl-bào

1.4.2 Con đường tổng hợp Beauvericin

Theo các nghiên cứu tổng hợp Beauvericin, theo hình A ― nguồn Nito có thể

là bất kỳ amino axit có thể cung cấp L-phenylalanine hoặc valine bằng sự vẫn chuyển từ nhóm amino sang keto axit Ngoài ra, nguồn cơ chất là đường 5C và đường 6C có thể là nguồn cacbon thay thế glucose Theo Xu et al [18] glucose là chất tốt nhất trong 7 nguồn cac bon cho quá trình sinh tổng hợp Beauvericin Bước

cuối quá trình chuyển hóa ở hình A, là chìa khóa của quá trình sinh Beauvericin là

sự có mặt của axit amin L-phenylalanine (L-Phe), axit amin D-hydroxy hydroxyisovaleric (D-HYIV), ATP/ Mg2+, S-adenosyl-methionine (AdoMet), và enzyme tổng hợp beauvericin Enzym tổng hợp Beauvercin là một enzyme đa chức năng xúc tác hình thành depsipeptide và là một chuỗi polypeptide đơn với khối lượng phân tử khoảng 250kDa Beauvericin sinh tổng hợp nhờ enzyme xúc tác tổng hợp qua một tiểu phần ribosom, theo cơ chế thiol Năm bước trung gian quan trọng tổng hợp Beauvericin Đầu tiên,hai tiểu phần enzyme tổng hợp Beauvericin được hoạt hóa bởi L-Phe và D-HYIV, đó là đồng hóa trị gắn liền với 4'-phosphopantetheinyl cánh tay enzyme-ràng buộc như thioesters Tiếp theo, tiểu phần L-phenylalanyl được N-methyl hóa bởi AdoMet Theo sau đó, một peptit được hình thành Kế tiếp, chuỗi hexadepsipeptide tuyến tính trung gian được tổng hợp Trong bước cuối cùng, các hexadepsipeptide tuyến tính được cyclized để tạo beauvericin pH tối ưu cho sự hình thành Beauvericin là pH 7.2, và nhiệt độ tối ưu

là 25 ~ 27 ° C, Enzym tổng hợp beauvericin đã không hoạt động khi nhiệt độ cao hơn 30 ° C [35,37] Cho đến nay, các chuỗi axit amin và các gen mã hóa synthetase

beauvericin chưa rõ ràng [ 38, 39, 40]

Hình 1.11: Sơ đồ chuyển hóa tạo thành Beauvericin

30, 34, 46] Không giống như những kháng sinh khác (như penicillin) là ngăn cản

sự tổng hợp peptidoglucan của vi khuản gram (+), Beauvericin ức chế theo một hướng khác có thể tấn công vào bào quan của vi khuẩn hoặc hệ thống enzyme của

vi khuẩn đó Dựa vào tính kháng khuẩn kháng lại các tác nhân gây bệnh trên thực

vật, hoạt chất này có thể sử dụng trong kiểm soát các bệnh của cây trồng không phỉ lương thực Bên cạnh đó, Beauvericin có tác dụng diệt nấm, theo báo cáo của Qinggui Wang et al (2012), beauvericin kết hợp với ketoconazole ở liều lượng 0,1

mg / ml trên chuột bị nhiễm nấm Candida parapsilosis kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của chuột tăng lên Về hoạt tính kháng virus với mức gây độc tế bào là IC50 là 1.9 µmol theo như Shin et al [39] Beauvericin chất ức chế hiệu quả nhất của hexadepsipeptides cyclic ức chế HIV-1 integrase Vì vậy, khả năng kháng virus của beauvericin cần được điều tra cho các hiệu ứng lâm sàng tiềm năng của nó và hoạt động chống lại khác virus nghiêm trọng, chẳng hạn như viêm gan B, SARS, H1N1

và AIV

Và cuối cùng phải kể đến khả năng ức chế tế bào ung thư của Beauvericin Beauvericin có khả năng ức chế ung thư nguyên bào sợi thận ở khỉ xanh châu Phi Vero (IC50 10µg/ml), ung thư vú ở người BC-1 1 (IC50 15µg/ml), nhân ung thư biểu

bì KB (IC50> 20µg/ml) [44], nhân tế bào ung thư vú MCF-7(IC50 1.4µg/ml), ung thư thần kinh trung ương ở người (glioma) SF-268 (IC50 1.8 µg/ml),ung thư tế bào phổi

ở người NCI-H460, ung thư nhân biểu mô tuyến tụy MIA Pa Ca-2 [48] Ngoài một

số dòng tế bào kể trên, Beauvericin còn có khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư khác như ung thư hạch, tế bào lympho B, tế bào lympho T, bệnh Hodgkin, bệnh bạch cầu dòng tủy, ung thư bàng quang, ung thư não, ung thư hệ thống thần kinh, đầu và ung thư cổ, ung thư biểu mô tế bào vảy ở đầu và cổ, ung thư thận, ung thư phổi như ung thư phổi tế bào nhỏ và không nhỏ ung thư phổi tế bào, neuroblastoma / glioblastoma, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tụy, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư da, ung thư gan, u ác tính, ung thư biểu mô tế bào vảy của thư miệng, họng, thanh quản, ung thư ruột kết, ung thư cổ tử cung, ung thư biểu mô cổ tử cung, ung thư máu; ung thư tinh hoàn; đại tràng và RECTA ung thư, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư tuyến tụy Như vậy, có thể nhận thấy phổ ức chế lên các dòng tế bào ung thư của Beauvericin là khá rộng, trên nhiều dòng tế bào Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng kháng các dòng tế bào ung thư của Beauverincin đang được các nhà khoa

học tập trung nghiên cứu

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

Chủng nấm ký sinh côn trùng Cordyceps spp thu thập từ vườn quốc gia Pù

Mát, Nghệ An

Gạo lứt, khoai tây, nhộng tằm nguồn gốc Việt Nam

Dòng tế bào ung thư: do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và

GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

2.1.2 Hóa chất sử dụng

Hóa chất sử dụng nuôi Cordyceps spp xuất xứ từ Ấn Độ, Đức, Trung Quốc,

Việt Nam như: glucose, cao nấm men, pepton……

Hóa chất dùng trong phân tích của Merk (Đức), Sigma (Mỹ) và Fermentas, như: maker, agarose, EDTA, …

Kính hiển vi Quang học Nikon, Nhật Bản

Hệ thống chụp ảnh gel Bio Rad, Mỹ

Máy đo quang phổ kế Hewlett Packard, Mỹ

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy

Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy

2.1.5 Địa điểm nghiên cứu

Phòng Thí nghiệm trọng điểm quốc gia về Công nghệ Gen đặt tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh vật

2.2.1.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn

Các mẫu thu thập được phân lập theo phương pháp Kobayashi (1982), Samson và cộng sự (1988)

- Tạo các khuẩn lạc riêng rẽ từ các mẫu ban đầu: Mẫu nấm thu về được cắt thành miếng và đặt lên đĩa môi trường PDA, nuôi ở 25oC trong 5 đến 7 ngày Quan sát thấy trên đĩa có nấm và có thể có các vi sinh vật khác mọc lên Dùng que cấy chuyển phần nấm không nhiễm từ đĩa vừa nuôi cấy sang đĩa khác tiếp tục nuôi ở điều kiện và thời gian trên, để tạo ra được các khuẩn lạc riêng rẽ

- Hòa tan 0,1 mm mẫu nấm từ đĩa petri trong 1 ml nước cất, hút 100µl dịch vào ống eppendorf chưa 1ml nước cất và đảo đều

- Hút 10 µl cho lên đĩa môi trường PDA và ria theo chiều ngang 1/3 đĩa, xoay ngang ria vuông góc với lần ria trước hoặc ria theo bốn góc thành hình tam giác Nuôi các đĩa nấm ở 25o

C trong 7 ngày

- Tách khuẩn lạc và tiếp tục nuôi trên các đĩa môi trường PDA nhằm thu được chủng thuần khiết

- Quan sát sự sinh trưởng của vi nấm qua vết cấy trên môi trường PDA, giữ lại

các mẫu nấm có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất

Phương pháp tuyển chọn chủng nấm (dựa vào sinh trưởng phát triển của hệ sợi, khả năng sinh bào tử và sinh thể quả của chủng đã phân lập): Nuôi mẫu đã được phân lập trên môi trường gạo, nuôi tại nhiệt độ 25°C, có chiếu sáng, quan sát sự hình thành thể quả của các chủng Chủng có khả năng sinh trưởng, phát triển tạo thể quả tốt sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo

2.2.1.2 Phương pháp hoạt hóa giống

Hoạt hóa giống trên hai môi trường : trên thạch và trên môi trường lỏng Trên môi trường thạch, giống được cấy chuyển lên môi trường PDA, SDAY, SMAY nuôi tại nhiệt độ 25°C, quan sát theo dõi tốc độ phát triển của hệ sợi, và đặc điểm của hệ sợi hình thành đến khi phủ kín đĩa, lựa chọn ra môi trường thạch thích hợp cho hoạt hóa giống Tiến hành cấy chấm điểm trên đĩa petri và cấy rích rắc trên ống nghiệm

Quan sát hàng ngày các chỉ tiêu màu sắc, sự phát triển của sợi nấm cả mặt trước và mặt sau của khuẩn lạc để xác định sắc tố

Đo đường kính khuẩn lạc ở cả 2 mặt của đĩa sau 3, 6, 9, 12, 15 ngày Tính trị

số trung bình theo công thức

D1 + D2

D = -

2 Trong đó: D: đường kính trung bình của khuẩn lạc

D1, D2: đường kính khuẩn lạc của hai đường vuông góc

Trên môi trường lỏng: sau khi hoạt hóa giống trên môi trường thạch, để nâng

cao hiệu suất tạo thể quả, tiếp tục đem hoạt hóa giống trên môi trường lỏng Cấy mẫu đã được hoạt hóa trên môi trường thạch sang 3 môi trường lỏng (CT1, CT2, CT3), với thể tích dịch lỏng trên thể tích bình là 1/5 đem nuôi tại 25°C, tốc độ lắc

150 vòng/phút Kiểm tra mật độ bào tử vào các ngày nuôi 3, 5, 7, 9, 11 lựa chọn môi trường có mật độ bào tử cao hơn cho các nghiên cứu tiếp theo Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần

2.2.1.3 Lên men bề mặt

Sau khi được hoạt hóa trên môi trường lỏng, giống được sử dụng cho nhân nuôi trên môi trường gạo lứt trong bình thủy tinh với dung tích 500 ml Sau khi mẫu được cấy vào môi trường, đem nuôi ở nhiệt độ 25°C trong bóng tối, đến khi phủ kín chuyển sang chế độ chiếu sáng kích thích quả thể nảy mầm Mẫu được thu hoạch

sau 45 ngày nuôi cấy

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong định danh chủng nấm Gardes

và cộng sự (1993) và cái biến để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm

Ly tâm 13000 v/ph trong 10 phút để loại bỏ cặn, lấy dịch

Cho RNAase (10 mg/ml) vào, ủ 370C trong 2- 4 giờ để loại bỏ RNA

Cho thêm amoni acetate tỉ lệ 1:1 theo thể tích, đảo đều

Bổ sung hỗn hợp Phenol, Chloroform, Isoamilalcohol (25:24:1),tỉ lệ 1:1, đảo đều Ly tâm 13000v/p trong 20 phút, lấy dịch

Cho Ethanol 100 % và Natri acetate theo tỉ lệ tương ứng 2:1 và 1:10 Đảo đều và giữ ở - 200C trong khoảng 3 giờ

Ly tâm thu tủa 13000 v/p trong 20 phút, loại dịch

Rửa tủa bằng Ethanol 70 %, tỉ lệ 1:1, ly tâm 13000 v/p trong 10

Làm khô và hòa tan trong TE

2.2.2.2 Kiểm tra độ sạch và nồng độ DNA

Kiểm tra tinh sạch và nồng độ của DNA trong mẫu tách chiết bằng cách đo trên máy quang phổ (Beckman DU-65 spectrophotometer)

Nồng độ DNA được tính theo công thức sau:

Nồng độ DNA (g/l) =

1000

/ µ 50 50

2.2.2.3 Điện di kiểm tra DNA và sản phẩm PCR

Thực hiện trên gel agarose 0,8% sau đó quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, chụp ảnh ở máy geldoc hoặc máy ảnh kỹ thuật số

2.2.2.4 Nhân gen

Quá trình nhân gen bằng phản ứng PCR trên máy luân nhiệt GeneAmpPCR System 9700, primers do hãng Genset Singapore Biotech và Invitrogen tổng hợp

Tổng thể tích dùng cho một mẫu là 20 l với thành phần bao gồm đệm PCR 10x, MgCl2 2mM, dNTP 2mM, primer 2,5mM, Taq 0,5u (5 u/1l) ADN 20 ng, nước

Chu trình nhiệt theo Peter W (2005) được thực hiện như sau: 95oC-7 phút, sau đó lặp lại 35 chu kỳ 95oC - 50 giây, 48oC-50 giây, 72oC-50 giây, cuối cùng là

72oC-10 phút và lưu ở 4oC

Sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu có trình tự ghi trong bảng 1

Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi sử dụng

TT Tên mồi Trình tự mồi (5’-3’)

2.2.2.5 Xác định trình tự gen

Việc xác định trình tự được thực hiện trên máy tự động ABI PRISM 3100 – Avant Data Collection v1.0 của Mỹ, sau đó được phân tích bằng phần mềm CLUSTALX (1.81) và so sánh với các trình tự trên ngân hàng gen bằng chương trình BLAST

2.2.3 Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC)

Sắc ký lỏng cao áp (High-performance liquid chromatography), đôi khi gọi

là sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-pressure liquid chromatography_HPLC) là một

kỹ thuật sắc ký sử dụng để phân tách một hỗn hợp trong lĩnh vực hóa phân tích (analytical chemistry) và sinh hóa (biochemistry) với mục đích xác định, định lượng

và tinh khiết từng thành phân riêng lẻ của hợp chất HPLC cũng được xem là một

kỹ thuật đo đạc trong hóa phân tích, thay vì kỹ thuật trọng lượng (gravitimetric technique) HPLC dựa trên áp lực của bơm cơ học lên một chất dung môi lỏng đẻ

tải một chất hỗn hợp đơn giản vào cột hóa học, qua đó quá trình phân tách xảy ra Một cột phân tách HPLC được làm đầy bởi các nguyên tử rắn (như silica, polymers hay chất hấp phụ) và hỗn hợp mẫu được phân tích thành những hợp chất tương tác với các nguyên tử trong cột Sự phân tách HPLC bị ảnh hưởng bởi điều kiện của các dung môi lỏng (như áp suất và nhiệt độ), tương tác hóa học giữa hỗn hợp mẫu và dung môi lỏng (như tính không ưa nước, quá trình proton hóa, v.v) và tương tác hóa học giữa các hợp chất mẫu và nguyên tử đặc rắn bên trong cột phân tích (như ái lực ligand, trao đổi ion,…) HPLC được phân biệt với các phương pháp sắc ký thông thường vì áp lực của HPLC tương đối cao (~150 bar, ~2000 PSI) trong khi sắc ký thông thường phần lớn dựa vào lực của trọng lực cung cấp áp lực Do điều kiện phân tách dưới áp lực cao của HPLC, nên cột của HPLC có đường kính trong tương đối nhỏ (ví dụ 4.6 mm) ngắn (250 mm) và đặc hơn với các nguyên tử nhỏ hơn, giúp cho quá trình phân tích tối ưu hợp chất mẫu hơn là sắc ký thông thường

Pha động sử dụng hệ dung môi: MeOH/H2O với gradient được thiết lập trình bày trong bảng 2.4

Bảng 2.4: Gradient nồng độ thiết lập

Thời gian (phút) 0 5 12 15 17 29 30 40

Phương pháp khối phổ ( Mas spectrometry) là một kỹ thuật dùng để đo đạc

tỷ lệ khối lượng trên điện tích của ion, dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế Khối phổ kế thường được nối với hệ thống HPLC, là một thiết bị dùng cho phương pháp khối phổ, cho ra phổ lượng của một mẫu để tìm ra thành phần của nó Có thể ion hóa mẫu và tách ion của nó với các khối lượng khác nhau và lưu lại thông tin dựa vào việc đo đạc cường độ dòng ion Hóa chất khác nhau thì có khối lượng khác nhau Dựa vào đó, khối phổ kế sẽ xác định được chất hóa học nào có trong mẫu Lượng mẫu bơm:1µl, tốc độ dòng: 0,5 ml/phút