Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen 4CL1 vào cây xoan ta (melia azedarach l )

Việc áp dụng các kỹ thuật tiên tiến trong công nghệ sinh học để cải thiện giống cây trồng, vật nuôi là vô cùng quan trọng, trong đó kỹ thuật chuyển gen thực vật được xem là một giải pháp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN NHƯ NGỌC

ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ CẤU TRÚC VECTOR VÀ

CHUYỂN GEN 4CL1 VÀO CÂY XOAN TA ( Melia azedarach L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ QUANG HÒA

HÀ NỘI – 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, những nội dung được trình bày trong luận văn này là do

sự tìm tòi, nghiên cứu của chính bản thân Các kết quả nghiên cứu là trung thực

và chưa từng được công bố trong bất kỳ luận văn nào của các tác giả khác

Tôi xin chịu trách nhiệm về những nội dung cam đoan trên

Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2010

Tác giả

Nguyễn Như Ngọc

LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành

tới TS Lê Quang Hòa, người thầy đã trực tiếp, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn

Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Hồ Văn Giảng, Giám đốc trung tâm Giống và Công nghệ Sinh học- trường Đại học Lâm Nghiệp, chủ nhiệm đề tài

“Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) có sức sinh trưởng nhanh,

chất lượng gỗ tốt” đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng nghiệp, bạn bè cùng gia đình đã quan tâm động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Một lần nữa, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với tất cả mọi người

đã giúp đỡ và ủng hộ tôi!

Hà Nội, Tháng 10-2010 Tác giả:

Nguyễn Như Ngọc

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

1 FAO Food and Agriculture Organization

2 GMC Genetic Modified Crops

3 CNSH Công nghệ sinh học

4 EIQ Environmental Impact Quotient

5 Bt Bacillus thurigenesis

6 GHE Greenhouse Effect

7 ISAAA International Service for the Acquisition of Agri-biotech

14 A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1.1 Một số loài cây rừng đã và đang được nghiên cứu

2 Bảng 1.2 Đặc điểm của một số gen 4CL1 ở các đối tượng khác nhau 18

3 Bảng 2.1 Danh mục hóa chất lai southern blot 35

4 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng cắt các vector chuyển gen pBI 121 và

vector tách dòng PCR 2.1- 4CL1 bằng cặp enzym giới hạn 36

5 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng ghép nối vector pBI121 với gen 4CL1 để

6 Bảng 2.4 Cắt plasmid pBI121-4CL1 bằng cặp enzym BamHI/SacI 39

7 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR nhân gen 4CL1 44

DANH MỤC CÁC HÌNH

1 Hình 1.1 Biểu đồ diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu 5

2 Hình1.2 Biểu đồ diện tích một số loại cây trồng CNSH trên toàn cầu từ

1996 – 2008 (Clive James, 2009) 6

3 Hình 1.3 Cấu tạo hóa học các đơn phân của lignin 14

4 Hình 1.4 Mô hình gắn kết giữa các sợi polysaccharide bởi lignin 15

5 Hình 1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp lignin 17

6 Hình 1.6 Hình thái cây trưởng thành, Hoa và Quả của cây Xoan ta 22

7 Hình 1.7 Cấu trúc T – ADN và T – plasmid 25

8 Hình 1.8 Sơ đồ cấu trúc vùng T – ADN của vector pBI121 32

9 Hình 1.9 Sơ đồ cấu trúc vector pBI121 32

10 Hình 3.1 Kết quả cắt pBI121, pCR2.1-4CL1 bằng BamHI/SacI 49

11 Hình 3.2 Kết quả thôi gel thu nhận gen 4CL1 và vector pBI121 50

12 Hình 3.3 Vi khuẩn E.coli mang vector pBI121-4CL1 trên môi trường Kan 51

13 Hình 3.4 Plasmid tách chiết từ các dòng tế bào được biến nạp pBI121-4CL1 52

14 Hình 3.5 Kết quả PCR nhân gen 4CL1 53

15 Hình 3.6 Kết quả cắt kiểm tra pBI121-4CL1 bằng enzym giới hạn 53

16 Hình 3.7 Các khuẩn lạc của vi khuẩn A.tumefaciens chủng LBA 4404

sau khi biến nạp mọc trên môi trường chọn lọc 54

17 Hình 3.8 Kết quả colony PCR từ các khuẩn lạc của vi khuẩn A

18 Hình 3.9 Plasmid tách từ các dòng A tumefaciens LB1và LB2 56

19 Hình 3.10 Kết quả cắt plasmid dòng LB1 và LB2 bằng enzym giới hạn 56

20 Hình 3.11 Kết quả PCR nhân gen 4CL1 từ các dòng LB1 và LB2 57

21 Hình 3.12 Cây mầm Xoan ta in vitro tái sinh từ hạt 58

22 Hình 3.13 Thân mầm Xoan ta cộng sinh với vi khuẩn A tumefaciens

mang vector pBI121 – 4CL1 59

23 Hình 3.14 Các giai đoạn phát triển của vật liệu nhận gen trên môi trường

24 Hình 3.15 Cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 62

25 Hình 3.16 Cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 ở điều kiện tự nhiên sau 1 tháng 63

26 Hình 3.17 Ảnh điện di ADN tổng số từ 9 dòng Xoan ta chuyển gen 64

27 Hình 3.18 Kết quả PCR nhân gen 4CL1 từ 16 dòng Xoan ta chuyển gen 65

28 Hình 3.19 Kết quả southern blot từ ADN cây Xoan ta chuyển gen, dòng T5 66

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cam đoan

lời cảm ơn

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

MỞ ĐẦU……… 1

Chương 1 4

TỔNG QUAN 4

1 1 Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.1 Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam 6

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam 7

1.2.1 Tình hình nghiên cứu cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới 7

1.2.2 Tình hình nghiên cứu cây lâm nghiệp biến đổi gen ở Việt Nam 9

1.2.3 Các gen thường được chuyển vào cây lâm nghiệp 10

1.3 Gen điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật 13

1.3.1 Giới thiệu về lignin và vai trò của lignin trong thực vật 13

1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp lignin trong thực vật 16

1.3.3 Gen 4CL1 – điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật 17

1.3.4 Tình hình nghiên cứu gen 4CL1 trên thế giới 18

1.4 Tổng quan về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) 20

1.4.1 Giới thiệu về cây Xoan ta 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu phát triển giống Xoan ta 22

1.5 Chuyển gen thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 23

1.5.1 Giới thiệu về vi khuẩn A tumefaciens……….24

1.5.2 Cấu trúc của T-plasmid và T- AND……….24

1.5.3 Cơ chế và quá trình chuyển T - AND vào tế bào thực vật……… 25

1.5.4 Tương tác giữa T-ADN và genome tế bào thực vật……….27

1.6 Hệ vector sử dụng trong nghiên cứu 29

1.6.1 Giới thiệu về vector chuyển gen pBI121……… 29

1.6.2 Các thành phần cấu trúc của vector pBI121……… 29

Chương 2 33

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 Vật liệu và hoá chất nghiên cứu 33

2.1.1 Vật liệu 33

2.1.2 Hoá chất và thiết bị 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.1 Thiết kế vector chuyển gen 4CL1 35

2.2.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp chứa gen 4CL1 37

2.2.3 Tuyển chọn các dòng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen 38

2.3 Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta 39

2.3.1 Chuẩn bị vi khuẩn A tumefaciens chứa vector mang gen 4CL1 41

2.3.2 Tạo các đoạn thân mầm để cảm ứng phục vụ cho chuyển gen 42

2.3.3 Đồng nuôi cấy vi khuẩn với các đoạn thân mầm 42

2.3.4 Chọn lọc vật liệu nhận gen 42

2.3.5 Tái sinh chồi từ vật liệu nhận gen 43

2.3.6 Tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh 43

2.4 Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây Xoan chuyển gen 43

2.4.1.Nhân gen mục tiêu bằng phương pháp PCR 43

2.4.2.Phương pháp lai Southern blot 45

Chương 3 49

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49

3.1 Thiết kế vector chuyển gen tái tổ hợp pBI12-4CL1 49

3.1.1 Cắt vector chuyển gen pBI121 và pCR2.1-4CL1 bằng cặp enzym BamHI/SacI và thôi gel để thu nhận sản phẩm cắt 49

3.1.2 Ghép nối tạo vector tái tổ hợp, biến nạp vào vi khuẩn E.coli và sàng lọc các dòng vi khuẩn E.coli mang vector tái tổ hợp 51

3.1.3 Kiểm tra bằng kỹ thuật PCR 52

3.1.4 Kiểm tra bằng enzym giới hạn 53

3.2 Tạo chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector tái tổ hợp pBI121-4CL1 54

3.2.1 Biến nạp vector chuyển gen mang gen 4CL1 vào vi khuẩn A tumefaciens chủng LBA 4404 54

3.2.2.Tuyển chọn các dòng vi khuẩn mang vector chuyển gen 55

3.3 Chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta 58

3.3.1 Tạo các cây mầm in vitro để tạo vật liệu phục vụ cho chuyển gen 58

3.3.2 Đồng nuôi cấy với vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen 58

3.3.3 Chọn lọc vật liệu nhận gen 59

3.3.4 Tạo cây con Xoan ta chuyển gen 4CL1 61

3.4 Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây chuyển gen 63

3.4.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số của cây con Xoan ta chuyển gen 63

3.4.2 Kết quả nhân gen 4CL1 64

3.4.3 Kết quả Southern blot 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

MỞ ĐẦU

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu gỗ đang gia tăng mạnh mẽ cả cho tiêu dùng nội địa và xuất khẩu Nước ta đã xuất khẩu sản phẩm gỗ sang 120 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới, tập trung vào các thị trường trọng điểm là Mỹ (chiếm 43,35%); Nhật Bản (chiếm 13,68% ); tiếp đến là Trung Quốc (với 7,62%) Dự kiến kim ngạch xuất khẩu đồ gỗ và lâm sản của Việt Nam năm 2010 là 2,95 tỷ USD, tăng 5,3% so với năm 2009, trong đó gỗ và các sản phẩm gỗ đạt 2,735 tỷ USD

Do đó, Chính phủ đã xếp sản phẩm gỗ vào nhóm 10 mặt hàng xuất khẩu chiến lược Nhưng khó khăn hiện nay của Việt Nam là hàng năm phải nhập khẩu 80% nguyên liệu cho việc sản xuất các sản phẩm từ gỗ Không những thế, trong tương lai gần việc nhập khẩu gỗ ngày càng trở nên khó khăn hơn vì nhiều nước nhiệt đới sẽ cấm xuất khẩu gỗ

Một trong các loài cây lấy gỗ đáp ứng nhu cầu và thị hiếu người tiêu dùng hiện nay là cây Xoan ta, với đặc điểm là cây gỗ lớn, thời gian thu hoạch ngắn, năng suất gỗ cao, gỗ có tính thẩm mỹ, không bị mọt, thích nghi với nhiều điều kiện gây trồng Gỗ Xoan được ưa chuộng dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng, trang trí nội thất và điêu khắc…

Do đó, Xoan ta đã được chọn là loài cây gỗ lớn quan trọng được xếp vị trí thứ nhất và thứ hai trong danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất ở 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm

Mặc dù vậy, các giống Xoan ta đang trồng hiện nay vẫn chưa đáp ứng được những yêu cầu của người trồng rừng sản xuất và người sử dụng bởi gỗ Xoan sau khi thu hoạch thường phải ngâm trong nước từ 5 đến 6 tháng thì gỗ mới bền, không bị mối, ít bị biến dạng khi sử dụng Chính vì vậy, thực tiễn luôn đòi hỏi tạo ra giống Xoan ta có sức sinh trưởng nhanh hơn, chất lượng gỗ tốt hơn nữa để đáp ứng nhu cầu gỗ cho con người

Công tác nghiên cứu nhằm cải tạo các giống cây trồng, vật nuôi truyền thống

đã được các nhà khoa học tiến hành từ rất sớm và đến nay đã đạt được những thành quả nhất định Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế, đặc biệt đối với các

loài cây lâm nghiệp có chu kỳ sinh trưởng dài Việc áp dụng các kỹ thuật tiên tiến trong công nghệ sinh học để cải thiện giống cây trồng, vật nuôi là vô cùng quan trọng, trong đó kỹ thuật chuyển gen thực vật được xem là một giải pháp phù hợp, cho phép các nhà khoa học nhanh chóng tạo ra các giống cây trồng mới mang các tính trạng đáp ứng mục tiêu của con người Đến nay, trong lĩnh vực nông nghiệp đã

có hàng loạt các giống cây trồng biến đổi gen được tạo ra và gây trồng thương mại như: Đậu tương, Ngô, Lúa, Bông, Cà chua, Khoai tây, Cải dầu,…góp phần quan trọng vào việc đảm bảo an ninh lương thực trên phạm vi toàn cầu Trong lĩnh vực tạo giống cây trồng lâm nghiệp biến đổi gen đã có một số đối tượng cây trồng được

quan tâm nghiên cứu như: Cây Dương, Bạch đàn, Thông…

Hướng nghiên cứu cải thiệt chất lượng gỗ cây lâm nghiệp bằng kỹ thuật chuyển gen thường tập trung vào các gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ sinh, đặc biệt là lignin ở thực vật, như gen PAL, COMT, CCR, CAD, C4H, C3H, 4CL,… Trong đó gen 4CL1 mã hóa cho 4-coumarate:coenzym A ligase được xem là enzym chìa khóa có vai trò quan trọng trong việc điều hoà sinh tổng hợp lignin ở thực vật Ở thực vật có mạch, lignin là một thành phần quan trọng tham gia vào cấu trúc thành tế bào, đặc biệt là các tế bào của mạch xylem Lignin có tác dụng gắn kết các sợi polysaccharide thông qua các kiểu liên kết hoá học khác nhau, từ đó giữ cho tế bào vững chắc, có khả năng chịu lực cơ học và bảo vệ các sợi xellulose không bị phân huỷ bởi các nhân tố hoá- sinh học Do

đó, chúng tôi chọn gen 4CL1 làm gen mục tiêu để chuyển vào đối tượng Xoan ta, nhằm tạo ra giống Xoan ta biến đổi gen có chất lượng gỗ tốt, góp phần nâng cao giá trị kinh tế và giá trị sử dụng gỗ Xoan ta Để góp phần thực hiện mục tiêu đó, chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu thiết kế cấu trúc vector và chuyển gen

4CL1 vào cây Xoan ta (Melia azedarach L.)” đây là một trong những nội dung

quan trọng của đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Melia azedarach L.) biến đổi

gen có khả năng sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt” thuộc Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020

Mục tiêu của đề tài:

Mục tiêu chung: Nhằm góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật chuyển gen vào cây

Xoan ta Làm cơ sở cho công tác tạo giống cây trồng biến đổi gen ở loài Xoan ta cũng như các loài cây lâm nghiệp khác

Mục tiêu cụ thể:

1 Thiết kế được cấu trúc vector chuyển gen và tạo được chủng vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens phù hợp cho biến nạp gen 4CL1 vào đối tượng

Xoan ta

2 Tạo được một số dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 trong phạm vi phòng thí nghiệm

Nội dung của đề tài:

- Xây dựng cấu trúc vector để biểu hiện gen 4CL1 trong cây Xoan ta chuyển gen

- Tạo chủng vi khuẩn A Tumefaciens mang vector biểu hiện gen 4CL1 trong

cây Xoan ta

- Chuyển gen 4CL1 vào cây Xoan ta

- Kiểm tra sự có mặt của gen 4CL1 trong cây Xoan ta chuyển gen

Chương 1 TỔNG QUAN

1 1 Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình cây trồng biến đổi gen trên thế giới

Theo bản báo cáo tổng kết số 34 năm 2005 của tổ chức ISAAA (International Service for the Acquisition of the Agribiotech Applications), tính đến năm 2005 tổng diện tích đất trồng cây biến đổi gen đạt 75 triệu hecta, tăng trên 205 lần trong khoảng thời gian 10 năm (từ 1996 đến 2005), liên quan tới khoảng 8,5 triệu nông dân canh tác trên khắp thế giới, 90% trong số họ là nông dân ở các nước đang phát triển và nghèo tài nguyên thiên nhiên Số nước trồng cây biến đổi gen đã tăng lên gấp 3 lần trong vòng 9 năm, từ 6 nước năm 1996 lên 9 nước năm 1998, lên

12 nước (1999) và lên 21 nước (2005) Hiện nay, cây trồng biến đổi gen chủ yếu được trồng ở các nước phát triển (chiếm 62%), còn lại ở các nước đang phát triển và một tỷ lệ nhỏ ở các nước kém phát triển Trong những năm gần đây thị phần cây trồng biến đổi gen tại các nước đang phát triển liên tục tăng nhanh hàng năm với mức tăng cao tại các nước châu Á (Trung Quốc, Ấn Độ và Philippin), cũng như châu Mỹ Latinh (Achentina, Braxin, Mexico, Uruguay và Paraguay) hay ở Nam Phi [12,35]

Diện tích cây trồng chuyển gen tính đến năm 2007 đã tăng lên 114,3 triệu ha Khoảng 670 sản phẩm cây trồng biến đổi gen đã được phép có mặt tại thị trường của 53 quốc gia Nông dân nhiều nước đã trồng các cây chuyển gen mang nhiều đặc tính tốt Việc trồng cây biến đổi gen trên thế giới đã giúp nông dân tăng năng suất

từ 5 – 50% Đã có tới 12 triệu nông dân trên thế giới tham gia vào việc trồng cây biến đổi gen [13]

Năm 2008, diện tích đất trồng cây CNSH tiếp tục tăng mạnh, đạt 125 triệu ha, tăng so với con số 114,3 triệu ha năm 2007

Các con số này vẫn được tăng lên hàng năm, tính đến nay đã có 25 nước tham gia trồng cây trồng chuyển gen, trong đó có thêm các nước: Australia, Bulgaria,

Pháp, Đức, Rumani, Tây Ban Nha, Philipin, Colombia, Chile, Honduras, Séc, Slovakia, Bồ Đào Nha, Ba Lan, Paraguay, Uruguay…

Hình1.1: Biểu đồ diện tích cây trồng công nghệ sinh học trên toàn cầu

Tổng doanh thu mà cây trồng biến đổi gen mang lại kể từ khi được đưa vào thương mại (1996) đến nay khoảng 30 tỷ USD Như vậy, trên bình diện toàn cầu chúng ta có thể lạc quan tin rằng diện tích và số người trồng cây biến đổi gen trên thế giới, đặc biệt là các quốc gia đang phát triển, sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới [12,37]

Một số loại cây trồng biến đổi gen phổ biến được trồng thương mại với diện tích lớn, mang lại hiệu quả kinh tế rõ rệt cho các nước trên thế giới, đặc biệt là các cây đậu tương, ngô, bông và cây cải dầu [29,45]

Hình 1.2: Biểu đồ diện tích một số loại cây trồng CNSH trên toàn cầu từ 1996 –

2008 (Clive James, 2009)

1.1.2 Tình hình cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam

Ở Việt Nam, vấn đề chuyển gen vào thực vật vẫn còn là lĩnh vực mới mẻ, đang đi vào giai đoạn nghiên cứu và ứng dụng bước đầu, tuy nhiên trong lĩnh vực này, các nhà khoa học cũng đã thu được những kết quả đáng kể

Các nghiên cứu liên quan đến cây trồng biến đổi gen được tập trung triển khai tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các viện nghiên cứu, trường đại học thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

Tại Viện Công nghệ sinh học, hướng nghiên cứu tạo các giống cây trồng biến đổi gen đã được đẩy mạnh ngay từ cuối những năm 90 Các cán bộ của Viện đã tiến hành thu nhập và phân lập được nhiều nguồn gen quý có giá trị nông sinh như: gen chịu hạn, chịu lạnh ở lúa; gen cry, gen mã hóa protein bất hoạt ribosome (RIP) ở cây mướp đắng và gen mã hoá α-amylase của cây đậu cô ve có hoạt tính diệt côn

trùng, gen kháng bọ hà khoai lang của vi khuẩn Bt, gen mã hoá protein vỏ của virus gây bệnh đốm vòng ở cây đu đủ… [10,11,13,14]

Ngoài ra, trong khuôn khổ các đề án hợp tác trong nước và quốc tế, những vấn đề nghiên cứu tăng cường tính chịu hạn và chịu mặn ở cây lúa bằng công nghệ

biến đổi gen, chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ, chuyển gen cry và

gen chịu hạn vào cây bông… đã và đang được triển khai hiệu quả với một số loài cây biến đổi gen trồng thử nghiệm ở nhà kính [56]

Việc đưa một số giống cây trồng biến đổi gen vào sản xuất cũng đang được triển khai Ngày 12/01/2006, Thủ tướng Chính phủ đã ký Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg về việc phê duyệt "Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020" với tầm nhìn đến năm 2020 đưa diện tích trồng trọt các giống cây trồng mới tạo ra bằng kỹ thuật CNSH chiếm trên 70%, trong đó diện tích trồng trọt các giống cây trồng biến đổi gen chiếm 30 – 50% Cho đến nay, đã có 3 cây trồng biến đổi gen hiện diện trên đồng ruộng là lúa, ngô và bông, dự tính đến cuối năm 2011 cây trồng chuyển gen sẽ được trồng trên một diện tích lớn ở nước ta [1,2,56]

1.2 Tình hình nghiên cứu về cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Tình hình nghiên cứu cây Lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới

Nhìn chung, lĩnh vực nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen thường phát triển chậm hơn so với cây nông nghiệp, tuy nhiên những nghiên cứu chuyển gen vào cây rừng đã được thực hiện ở một số nước trên thế giới như Singapo, Trung Quốc, Đài Loan, Australia, Braxin, Ấn Độ,…(Wang, 2006) Nếu như vào năm 1996 cây nông nghiệp biến đổi gen chính thức được trồng thương mại hoá, thì đến năm 2002, Trung Quốc là nước duy nhất đã có 2 loài cây lâm nghiệp

biến đổi gen được trồng thương mại hoá Đó là cây Bạch dương (Populus nigra) chuyển gen Bt kháng côn trùng ăn lá được trồng khảo nghiệm trên 80 hecta vào năm

1999 và trồng thương mại 200-300 hecta vào năm 2002; cây Bạch dương lai 741(P

alba X [P davidiana + P simonii] X P tomentosa) chuyển gen cry1A(c) và API

kháng côn trùng ăn lá được trồng khảo nghiệm năm 2001 và trồng thương mại năm

2003 [20,26,38]

Theo báo cáo tổng kết của FAO (2004), trong khoảng 10 năm gần đây các nghiên cứu về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen chỉ chiếm 19%, trong khi đó những nghiên cứu không có liên quan đến biến đổi gen chiếm tới 81% (vi nhân giống 34%, đa dạng di truyền 26%, phân tích hệ gen và lập bản đồ di truyền 21%) Điều đó có nghĩa là lĩnh vực nghiên cứu về tạo cây lâm nghiệp biến đổi gen còn rất mới mẻ Đến năm 2004 các nghiên cứu về cây lâm nghiệp biến đổi gen chủ yếu tập

trung vào 6 loài cây chính là: Thông, Dương, Bạch đàn, Sồi, Vân sam và Keo

8 Eucalyptus

camadulensis

Giảm hàm lượng lignin

CecropinD Shao et al.,

1.2.2 Tình hình nghiên cứu cây lâm nghiệp biến đổi gen ở Việt Nam

Ở nước ta, các nghiên cứu ứng dụng CNSH vào cải tiến giống cây lâm nghiệp đang còn nhiều hạn chế Phần lớn mới chỉ dừng lại ở kỹ thuật vi nhân giống

một số loài cây lâm nghiệp Do giá thành cây con in vitro còn cao nên các cây được đưa vào nhân in vitro chủ yếu là các loài khó nhân bằng phương pháp truyền thống

Trong đó, bạch đàn, keo lai được nhân ở hầu hết các trung tâm nghiên cứu giống cây lâm nghiệp, qui trình đã được tối ưu hoá và sản xuất cây con phục vụ trồng rừng nguyên liệu cho nhiều tỉnh thành trong cả nước Một số loài cây khác cũng đã và đang được nghiên cứu vi nhân giống như Tếch, Vù hương, Thông, Keo, Bách xanh, Dổi, Dó trầm,… Hoàn thiện quy trình vi nhân giống các loài cây này rất có ý nghĩa trong việc sản xuất cây giống chất lượng cao và làm cơ sở khoa học cho công tác chuyển các gen có giá trị vào các cây này trong tương lai [14,55]

Hưởng ứng Chương trình phát triển trọng điểm công nghệ sinh học đến năm

2020, trong lĩnh vực giống cây lâm nghiệp với mục tiêu “Nghiên cứu ứng dụng, tạo được một số giống cây lâm nghiệp mới bằng công nghệ gen với đặc tính lâm, sinh học ưu việt như: có năng suất, chất lượng tốt; sức kháng sâu hại thân, hại lá và sức chống chịu cao trước các điều kiện bất lợi của môi trường, các nhà khoa học đang nghiên cứu chuyển một số gen vào cây lâm nghiệp và chọn giống cây lâm nghiệp dựa vào việc đánh giá đa dạng di truyền [1,2,56]

Lĩnh vực chuyển gen vào cây lâm nghiệp ở Việt Nam còn là vấn đề rất mới

mẻ, đang ở giai đoạn nghiên cứu thử nghiệm bước đầu

1.2.3 Các gen thường được chuyển vào cây lâm nghiệp

Hiện nay, một số gen tiêu biểu thường được chuyển vào cây lâm nghiệp như sau:

1.2.3.1 Gen kháng côn trùng

Từ lâu người ta đã phát hiện ra các protein kết tinh được tạo ra từ các vi

khuẩn B thurigiensis có khả năng tiêu diệt côn trùng Các gen mã hoá cho protein

độc tố này được gọi là Cry (crystal)

Người ta phân nhóm gen này thành 6 nhóm chính ký hiệu là Cry I-VI Các gen này được tách ra, xác định trình tự, tiến hành tổng hợp và thiết kế vào vector

sau đó chuyển vào cây trồng như các cây Popular hybrid 741, Populus deltosis;

Populus nigra, , hoặc gen peptide từ nhện được chuyển vào cây Beltula platyphylla, [26,38,48]

1.2.3.2 Gen kháng thuốc diệt cỏ

Gen kháng thuốc diệt cỏ là gen mã hoá cho enzym enolpyruvat sikimat phosphat synthetase (EPSPS) Enzym EPSPS có chức năng chuyển hoá sản phẩm quang hợp thành axit mang mạch vòng có tên là axit sikimic

Axit sikimic không được hình thành sẽ làm rối loạn toàn bộ quá trình trao đổi chất của cỏ và làm cho cỏ chết Chuyển gen này vào thực vật sẽ tạo ra thực vật kháng thuốc diệt cỏ [26]

1.2.3.3 Gen kháng bệnh

Ở cây lâm nghiệp có nhiều loại vi nấm, vi khuẩn, virus kí sinh và gây nên những loại bệnh làm ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây

Để hạn chế hiện tượng này một cách hiệu quả nhất người ta đã thiết kế vector chuyển gen mang gen kháng bệnh rồi chuyển vào thực vật để tạo ra các cây lâm nghiệp có khả năng chống chịu bệnh tật cao

Ví dụ như gen CecropinD được chuyển vào cây Eucalyptus urophylla để tạo

ra cây có khả năng kháng bệnh gây ra bởi Pseudomonas solanaceanum [10,11]

1.2.3.4 Gen chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường

Các cây lâm nghiệp được trồng nhiều ở những vùng có điều kiện khắc nghiệt như hạn hán, mặn, lạnh Để nâng cao khả năng chống chịu của cây, người ta đã chuyển các gen có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường

như gen chịu mặn Bet-A, mtlD được chuyển vào cây Populus xiaozhuanica,

Populus simonii x P nigra, gen NP-1 chống chịu bệnh và các điều kiện bất lợi được

chuyển vào cây Populus tomentosa Hiện nay, người ta nghiên cứu thiết kế vector

chuyển gen mang nhiều gen để chuyển đa gen vào thực vật, đây có thể là triển vọng cho việc chuyển các gen có khả năng giúp cây trồng chống chịu với điều kiện hạn hán [29,38]

1.2.3.5 Gen làm thay đổi hàm lượng cellulose và lignin

Thành tế bào được cấu tạo từ cellulose liên kết với pectin hay hemicellulose Trong vách tế bào có các khoảng trống, khoảng trống này có thể chứa pectin, lignin, suberin,… Cellulose là hợp chất quan trọng để sản xuất giấy Bột gỗ của loài cây nào có hàm lượng cellulose càng cao thì loài cây đó có giá trị càng cao trong sản xuất bột giấy Lignin là hợp chất phenol thơm có đặc tính là cứng Tuy nhiên, lignin lại là hợp chất không có lợi trong sản xuất giấy, nên người ta thường phải loại bỏ lignin khi nấu bột giấy Vì vậy, để phục vụ cho công nghiệp sản xuất bột giấy người

ta đã và đang tiến hành phân lập gen làm tăng tổng hợp cellulose, thiết kế vector và chuyển gen này vào cây lâm nghiệp Hoặc cũng với mục đích này người ta còn chuyển các gen làm giảm hàm lượng lignin để tăng chất lượng bột giấy Theo hướng này Chen và cộng sự, 2001 đã thiết kế thành công vector mang gen C4H

(cinnamate 4-hydroxylase) được phân lập từ cây Bạch Dương để chuyển vào cây

Eucalyptus camaldulensis Với mục đích tăng chất lượng gỗ phục vụ cho các mục

đích: thiết kế đồ nội thất, đồ gia dụng, gỗ trang trí hoặc gỗ xây dựng thì người ta tiến hành chuyển gen làm tăng hàm lượng lignin (gen 4CL) [7,31,33,40,41]

1.2.3.6 Gen tăng khả năng cố định nitơ

Nitrogenase là enzym thực hiện quá trình biến đổi nitơ phân tử thành dạng

nitơ mà thực vật có thể sử dụng được Gen tổng hợp nitrogenase gọi tắt là gen Nif

tồn tại ở một số loài vi khuẩn lam sống cộng sinh trong bèo hoa dâu, các vi khuẩn

sống cộng sinh trong các vi khuẩn nốt sần cây họ đậu (Leguminoseae) như

Rhizobium, hai nhóm vi sinh vật tự do là Azotobacterium và Clostridium,…(Lê

Trần Bình et al., 1997) Nhờ kỹ thuật gen người ta có thể tách gen Nif từ các cơ thể

cố định đạm và chuyển vào cây lâm nghiệp không có khả năng này để tạo ra các giống cây trồng cố định đạm, có khả năng sinh trưởng tốt trên các điều kiện lập địa cằn cỗi, nghèo chất dinh dưỡng khoáng, nitơ và cải tạo đất trống đồi núi trọc [27,38]

1.2.3.7 Gen tăng khả năng sinh trưởng cho cây

Khả năng sinh trưởng của cây do hoạt động của các hormone kích thích sinh trưởng tạo ra Để tăng khả năng sinh trưởng của cây người ta tiến hành tách gen mã hoá tổng hợp hormone như auxin, cytokinin, gibberilin (họ gen GA), rồi chuyển vào thực vật Người ta còn giữ lại vùng gen gây khối u của T-ADN để thiết kế vector mang gen kích thích sinh trưởng, rồi chuyển các gen này vào thực vật [28,38]

Đối với các loài cây lâm nghiệp trồng rừng kinh tế thì tốc độ sinh trưởng và chất lượng gỗ là những tính trạng được quan tâm hàng đầu Nhằm nâng cao giá trị kinh tế trên một đơn vị diện tích trồng rừng Trong những năm gần đây phần lớn các nghiên cứu về tạo giống cây lâm nhiệp là nhằm tạo ra những giống biến đổi gen

có tốc độ sinh trưởng nhanh và chất lượng gỗ tốt Theo báo cáo của FAO (2004) các nghiên cứu về cải thiện chất lượng gỗ liên quan đến thành phần lignin chiếm 57%, còn các nghiên cứu về tăng tốc độ sinh trưởng chỉ chiếm 6% [36,49]

Các nghiên cứu về cải thiện chất lượng gỗ thường được tiến hành theo một trong hai hướng: giảm hàm lượng lignin (cho mục tiêu lấy gỗ làm nguyên liệu giấy) hoặc tăng hàm lượng lignin (cho mục tiêu lấy gỗ làm đồ mộc, nội thất, thủ công mỹ nghệ, xây dựng, ) Cả hai hướng này đều tập trung tác động vào cơ chế điều hoà sự tổng hợp enzym chìa khoá có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin trong cơ thể thực vật [22,40,52]

1.3 Gen điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

1.3.1 Giới thiệu về lignin và vai trò của lignin trong thực vật

1.3.1.1 Giới thiệu về lignin

Trong cơ thể thực vật, lignin là một hợp chất polymer thơm của các đơn phân phenylpropan Lignin là hợp chất chiếm tỷ lệ lớn trong tự nhiên, đứng thứ hai chỉ sau cellulose, chiếm từ 18 – 36% khối lượng khô của cây gỗ Tham gia vào cấu trúc thành tế bào, đặc biệt là các tế bào của mạch xylem, Lignin có tác dụng gắn kết các sợi polysaccharide thông qua các kiểu liên kết hoá học khác nhau, từ đó giữ cho

tế bào vững chắc, có khả năng chịu lực cơ học và bảo vệ các sợi cellulose không bị phân huỷ bởi các nhân tố hoá- sinh học [15,24]

Lignin thực vật có thể được chia thành ba lớp là: lignin ở cây gỗ mềm (cây hạt trần), lignin ở cây gỗ cứng (cây hạt kín), và lignin ở cây thân cỏ Ba lớp lignin này khác nhau bởi các đơn phân cấu tạo nên lignin trong mỗi lớp [44,46,53]

Guaicyl lignin tìm thấy phần lớn trong cây gỗ mềm, được cấu tạo chủ yếu bởi các đơn phân Conyferyl alcohol, Guaicyl, Syringyl lignin có mặt nhiều trong cây gỗ cứng với các đơn phân cấu thành là coniferyl và synapyl alcohol Trong khi lignin ở cây thân cỏ lại được cấu tạo nên chủ yếu bởi các đơn phân p – coumaryl alcohol [ 23,24,46]

Hình 1.3: Cấu tạo hóa học các đơn phân của lignin

1.3.1.2 Vai trò của lignin trong thực vật

Cấu tạo hóa học và cơ học của gỗ là những nhân tố chủ yếu quyết định đến tính chất của gỗ

Trong cấu tạo gỗ, vách tế bào chủ yếu do cellulose và lignin tạo nên Cellulose có vai trò như những khung (sườn) cốt sắt vững chắc, còn lignin có vai trò như “xi măng” điền đầy khoảng trống và bám quanh sườn sắt ấy.[15,46]

Khung cellulose do nhiều phân tử cellulose liên kết lại, tạo nên chuỗi cellulose Nhiều chuỗi cellulose liên kết thành các mixen cellulose Khi đó, nhiều mixen cellulose liên kết lại tạo thành bó và điều quan trọng là vô số bó mixen cellulose sẽ được liên kết bởi lignin để tạo nên cấu trúc vững chắc của vách tế bào

gỗ [15]

Với cấu tạo của gỗ bên trong vách tế bào thì cũng được cấu tạo bởi đại bộ phận các mixen xếp song song với trục dọc thân cây Khi gỗ chịu lực ép dọc thớ, lực đặt trên đầu các mixen và lúc này các mixen sẽ sản sinh nội lực chống lại Khi

gỗ chịu lực ép ngang thớ, gỗ sẽ có biến dạng đàn hồi Sức hút và sức đẩy tương hỗ giữa các mixen cân bằng nhau (tạo bởi lignin) làm cho khối gỗ vững chắc theo chiều ngang

Do đó, khả năng liên kết các mixen bởi lignin làm cho các mixen ổn định vững chắc khi chịu lực

Cũng chính sức hút tương hỗ giữa các thành phần cấu tạo nên gỗ (do lignin) tạo cho gỗ trở thành một khối vững chắc và tạo ra ứng lực của gỗ

Như vậy, trong cấu tạo của gỗ, lignin là nhân tố chính tạo nên độ rắn của gỗ Mặt khác, bởi lignin là chất keo vô định hình nên còn làm nên tính chất đàn hồi, dẻo dai của gỗ Chính vì vậy, loại gỗ nào, gỗ ở vị trí nào trong cây nếu hàm lượng lignin càng cao thì ở đấy gỗ vừa cứng vừa dẻo dai Còn ngược lại, ở gỗ nào có hàm lượng lignin càng thấp thì cấu tạo gỗ càng mềm, càng xốp và nội lực của gỗ càng thấp.[15,44]

Khi nghiên cứu về vai trò của lignin, một số tác giả cũng đã khẳng định rằng: lignin có vai trò gắn kết các sợi polysaccharide với nhau thông qua 7 loại liên kết chủ yếu:

+ Direct ester linkage

+ Direct ether linkage

+ Hydroxycinnamic acid ester

+ Hydroxycinnamic acid ether

+ Ferulic acid bridge

+ Dehydrodiferulic acid diester bridge

+ dehydrodiferulic acid diester-ether bridge

Hình 1.4: Mô hình gắn kết giữa các sợi

polysacharide bởi lignin

Kết quả làm cho gỗ có kết cấu vững chắc hơn, có khả năng chịu lực cơ học

và bảo vệ các sợi polysaccharide không bị phân hủy bởi các tác nhân hóa, lý và sinh học [34,44]

1.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp lignin trong thực vật

Quá trình sinh tổng hợp lignin đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu trong suốt hơn 30 năm qua, họ đã đưa ra kết luận chung: quá trình sinh tổng hợp lignin là một quá trình rất phức tạp, trải qua nhiều giai đoạn chuyển hóa các chất, với sự tham gia xúc tác của hàng loạt enzym trong cơ thể thực vật.[22,23,53]

Trong quá trình sinh tổng hợp lignin, hợp chất ban đầu là phenylalanin, dưới tác dụng của các enzym đặc hiệu, trải qua hàng loạt các biến đổi để tạo thành vô số các đơn phân tử hay còn gọi là các monolignol Các monolignol này, sau khi hình thành được trải qua quá trình polyme hóa để tạo nên đại phân tử lignin, cụ thể như sau:

Phenylalanin được đeamin hóa dưới tác dụng của enzym PAL để tạo thành Cinnamate Cinamate bị thủy phân để tạo p – Coumarate dưới tác dụng của enzym C4H P – Coumarate có thể chuyển dạng liên hợp thành dạng hoạt động là p – coumaryl –CoA dưới sự xúc tác của enzym 4CL P-coumaryl - CoA là một tiền chất cho quá trình tạo thành monolignol thứ nhất p- coumaryl alcohol

Tiếp theo, p – coumarate và p – coumaryl – CoA có thể bị thủy phân để tạo nên hai chất là axit caffeic và caffeoyl – CoA dưới sự xúc tác của các enzym C3H

và CcoA – 3H Trong khi đó, axit Caffeic và Caffeoyl – CoA lại được chuyển hóa dưới tác dụng của enzym OMT và CcoA – OMT để tạo nên axit Ferulic và feruloyl – CoA Đồng thời, axit caffeic và ferulic cũng có thể được hoạt hóa thành dạng hoạt động là caffeoyl – CoA và feruloyl – CoA dưới tác dụng của enzym 4CL Trong đó, hợp chất feruloyl – CoA đóng vai trò là tiền chất cho quá trình tạo thành monolignol thứ hai là Coniferyl alcohol [22,42,46,53]

Tiếp tục quá trình này, axit Ferulic bị thủy phân dưới tác dụng của enzym F5H thành axit 5 – hydroxyferulic Axit 5 – hydroxyferulic lại được metyl hóa dưới tác dụng của enzym OMT tạo thành axit Sinapic Sau đó axit Sinapic được chuyển

thành dạng hoạt động là Sinapoyl – CoA dưới sự xúc tác của enzym 4CL Dạng hoạt hóa này là tiền chất cho sự tạo thành monolignol thứ 3, Synapyl alcohol

Sau khi tổng hợp nên các đơn phân monolignol, trong cơ thể thực vật sẽ diễn

ra quá trình polymer hóa các đơn phân này để tạo nên đại phân tử lignin

Hình 1.5: Sơ đồ sinh tổng hợp lignin Như vậy, quá trình tìm hiểu về cơ chế của con đường sinh tổng hợp lignin trong thực vật có thể thấy được: hầu hết các con đường nhánh, các phản ứng chính tổng hợp nên ba dạng đơn phân của lignin, đều có sự tham gia xúc tác của enzym 4CL Điều này cho thấy 4CL là một enzym “chìa khóa” trong quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

Hiện nay, trên thế giới đã và đang nghiên cứu để tạo ra các giống cây trồng

có hàm lượng lignin tăng, giảm theo ý muốn của con người thông qua sự tác động vào gen tham gia trong quá trình sinh tổng hợp lignin

1.3.3 Gen 4CL1 – điều hòa quá trình sinh tổng hợp lignin ở thực vật

Enzym 4CL : 4 – Coumarate : coenzym A ligase (4CL; EC 6.2.1.12) là enzym xúc tác các phản ứng để hoạt hóa 4 – coumarate và một số hợp chất tương tự

thành dạng ester CoA tương ứng trong hàng loạt quá trình sinh tổng hợp các hợp

chất thứ cấp của thực vật, đặc biệt là lignin Enzym này được mã hóa bởi gen 4CL

[31,40,52]

Gen 4CL1 được xem là một công cụ có hiệu quả để cải thiện chất lượng gỗ

cây lâm nghiệp Do đó, gen 4CL1 là đối tượng quan trọng được các nhà khoa học

nghiên cứu về cải thiện giống cây lâm nghiệp đặc biệt quan tâm Gen 4CL1 thuộc

họ gen 4CL mã hoá cho các enzym xúc tác cho các phản ứng trong chuỗi phản ứng

sinh tổng hợp lignin Gen 4CL1 ở các đối tượng khác nhau có sự khác nhau nhất

định về kích thước, trình tự nucleotide [33] Ví dụ:

Bảng 1.2: Đặc điểm của một số gen 4CL1 ở các đối tượng khác nhau

Stt Kí hiệu Nguồn mang gen Kích thước

(bp)

Số axit amin Mã số

1 4CL1 Populus tomentosa 1611 537 AY043495

2 4CL1 Eucalyptus camaldulensis 1635 545 DQ147001

3 4CL1 Arabidopsis thaliana 1686 562 NM_104046

4 4CL1 Pinus taeda 1614 538 PTU12012

Trong thực vật có mạch, gen 4CL1 được biểu hiện mạnh nhất ở các tế bào

của mô mạch xylem (Hai Lu et al, 2004) [40]

Hiện nay, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm Giống và CNSH trường Đại học

Lâm nghiệp đã nghiên cứu phân lập thành công gen 4CL1 từ cây thông đuôi ngựa (Pinus

massonia Lamb), và đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế với mã số FJ810495 [7]

1.3.4 Tình hình nghiên cứu gen 4CL1 trên thế giới

Với mục đích tạo ra những giống cây trồng có hàm lượng lignin tăng lên hay

giảm đi tùy theo mục đích sử dụng gỗ, các nhà khoa học thực vật trên thế giới đã

tiến hành các nghiên cứu nhằm tác động vào cơ chế sinh tổng hợp lignin, chủ yếu

là tác động vào gen 4CL (tăng cường hay hạn chế mức độ biểu hiện của gen)

Đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu về gen 4CL1 như: phân lập, xác định và so sánh trình tự nucleotide của gen 4CL1 ở các đối tượng khác nhau; biểu hiện gen 4CL1, thiết kế vector chuyển gen 4CL1, chuyển gen 4CL1 vào cây trồng, đã được tiến hành từ rất sớm và đã đạt được một số thành tựu quan trọng

Đã có thông báo về kết quả trong việc nghiên cứu tạo ra những giống cây trồng mới có hàm lượng lignin thay đổi theo mong muốn của con người Tại Trung Quốc, một số nhà khoa học đã tiến hành chuyển gen Pt 4CL- là antisense gene của 4CL, trong quá trình điều hoà âm (downregulation) mức độ biểu hiện của 4CL trong cây Dương (aspen), kết quả thu được các dòng cây chuyển gen có hàm lượng lignin giảm đến 45% so với các cây bình thường không chuyển gen, tạo ra nguồn nguyên liệu có giá trị sử dụng cao cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và tơ sợi…[40]

Hai Lu và cộng sự của ông cũng thu được kết quả tương tự ở một số loài cây

khác khi nghiên cứu chuyển gen 4CL vào cây thuốc lá và Arabidopsis nhằm làm

tăng hàm lượng lignin cho thấy dòng cây chuyển gen có hàm lượng lignin cao hơn 1- 2 lần so với mẫu cây đối chứng [41]

Gen 4CL1 đã được nghiên cứu phân lập từ nhiều đối tượng khác nhau như: Bạch Dương, Bạch Đàn, Arabidopsis, Thông,

Tác giả Jiang Xiang Ning và cộng sự thuộc trường Đại học Lâm nghiệp Bắc Kinh – Trung Quốc đã tiến hành nghiên cứu phân lập, thiết kế vector biểu hiện, tạo

các chủng vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen để chuyển gen 4CL1

vào một số đối tượng, như: thuốc lá, Bạch Dương [33]

Tác giả Zenn Zong Chen và cộng sự ở Đài Loan cũng đã tiến hành nghiên cứu phân lập gen, thiết kế vector biểu hiện và tạo chủng vi khuẩn biểu hiện gen 4CL1 từ cây Bạch Đàn

Một số nghiên cứu về chuyển gen 4CL vào cây Bạch dương cũng đã thu được dòng Bạch dương chuyển gen có hàm lượng lignin cao hơn hẳn so với cây đối chứng, hứa hẹn tạo ra dòng gỗ nguyên liệu có cấu trúc bền vững cung cấp cho các ngành công nghiệp xây dựng và chế biến gỗ

1.4 Tổng quan về cây Xoan ta (Melia azedarach L.)

1.4.1 Giới thiệu về cây Xoan ta

1.4.1.1 Đặc điểm phân bố

Cây Xoan ta có tên khoa học Melia azedarach Linn thuộc họ Xoan (Meliaceae) hay còn gọi là họ Dái ngựa, bộ Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Họ Xoan có khoảng 50 chi và 550 loài, phân bố khắp miền nhiệt đới; một chi

(Toona) phát triển tới tận vùng ôn đới phía Bắc của Trung Quốc và về phía Nam tới

Đông nam Australia, một chi khác gần như phân bố hầu hết ở các vùng phía Bắc

Ở Việt Nam, cây Xoan ta được gây trồng thành rừng hoặc phân tán ở hầu hết các tỉnh từ Bắc đến Nam, trên nương rẫy cũ hoặc ven sông một số tỉnh vùng Tây Bắc có thể gặp các đám Xoan thuần loài do nhân dân trồng [3,18]

1.4.1.2 Đặc điểm sinh thái

Xoan ta là cây gỗ lớn, chiều cao có thể đạt tới 30m và đường kính gần 100cm Thân cây khá thẳng, tán lá thưa, vỏ màu xám nâu, nứt hoặc rạn dọc, lúc non thường có đốm xếp vòng quanh thân Lá kép lông chim 2-3 lần, mọc cách Lá chét mép có răng cưa Hoa đều, lưỡng tính, màu tím nhạt, hợp thành cụm hình chùy ở nách lá phía đầu cành, có mùi thơm hắc, bầu nhụy có 5-6 ô Quả hạch dài 1-2cm khi chín màu vàng, qua đông trên cành sang mùa xuân mới rụng, vỏ trong hóa gỗ cứng

có 5-6 ô, mỗi ô chứa một hạt [3,17,43]

Xoan ta là cây nguyên sản ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới châu Á Cây

ưa sáng, sinh trưởng nhanh, sau khi trồng 6-8 năm có thể sử dụng được Xoan ta không chịu bóng, ưa khí hậu nóng ẩm, sinh trưởng được trên nhiều loại đất khác nhau, nhưng thích hợp nhất là đất cát pha, đất phù sa ven sông có độ phì cao và sâu

ẩm Xoan có thể chịu được muối, lượng muối trong đất từ 0,4-0,5% Những nơi đất bạc màu, khô hạn hoặc úng nước đều không thích hợp với cây Xoan ta Cây Xoan ta

có hệ rễ ngang khá phát triển, thường ăn nông và lan rộng, rễ cọc ăn sâu Xoan ta thường phân cành sớm, khả năng đâm chồi mạnh Đặc biệt, cây Xoan có khả năng tái sinh mạnh (mọc lại từ gốc cũ đã thu hoạch cây) từ 3 – 4 lần [17,51]

Với các đặc điểm và giá trị sử dụng nêu trên mà Xoan là loài cây Lâm nghiệp có tiềm năng phát triển rộng rãi

Tuy nhiên, gỗ Xoan ta có nhược điểm là dễ nứt, dễ bị mối phá hoại, độ bền

cơ học chưa được cao nên dễ dẫn đến bị biến dạng (cong, vênh) khi sử dụng Trong xây dựng và đóng đồ gỗ nội thất, người ta thường sử dụng gỗ Xoan đã ngâm trong nước 5 – 6 tháng để chống mối mọt và tăng độ bền của gỗ Với phương pháp thủ công này, người ta đã khắc phục được nhược điểm trên nhưng lại dẫn đến một số nhược điểm khác như: tiến hành với số lượng không đủ lớn, mất thời gian Mặt khác, khi ngâm gỗ trong nước sẽ gây ra sự phân huỷ vỏ cây, gây ô nhiễm môi trường, cộng thêm chất lượng thẩm mỹ của gỗ sau khi ngâm bị giảm đi, không giữ được vẻ đẹp của gỗ xoan tự nhiên [3]

Chính vì những lý do trên, việc tạo ra giống Xoan ta cho gỗ có độ bền cao, không bị mối mọt, giữ được vẻ thẩm mỹ tự nhiên của gỗ là rất có ý nghĩa

Hình 1.6: Hình thái cây trưởng thành, Hoa và Quả của cây Xoan ta

1.4.2 Tình hình nghiên cứu phát triển giống Xoan ta

Để đáp ứng được nhu cầu thị trường về nguồn nguyên liệu gỗ phục vụ cho ngành xây dựng và chế biến gỗ trên quy mô lớn với chất lượng gỗ đồng đều, Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sinh học, công dụng của cây Xoan đối với con người và môi trường sinh thái Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến chất lượng giống Xoan ta lại chưa được quan tâm nhiều Một số các đề tài nghiên cứu về cải thiện giống và kỹ thuật gây trồng đối với Xoan ta đã được triển khai Đối với cải thiện giống, ngoài hướng chọn giống phù hợp với các vùng sinh thái khác nhau, thì hướng gây tạo giống mới cũng đã được quan tâm, trong đó có hướng tạo giống cây Xoan ta có chất lượng gỗ tốt trên cơ sở gây biến đổi vật chất di truyền bằng kỹ thuật chuyển gen

Tác giả Đinh Thị Phòng, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam cũng đã

nghiên cứu Phân tích mối quan hệ di truyền tập đoàn giống cây Xoan ta (Melia

azedarach L) bằng chỉ thị RAPD và ISSR để chọn ra giống Xoan ta có chất

lượng tốt

Nhưng trên thực tế, hầu như chưa có công trình nào thông báo về chuyển gen vào cây Xoan ta trên thế giới Các nghiên cứu cũng chỉ mới dừng lại ở việc xây

dựng thành công quy trình tái sinh in vitro cây Xoan ta thông qua đa chồi hoặc phôi

soma để phục vụ các nghiên cứu chuyển gen, chọn dòng chịu hạn hay nhân giống sinh dưỡng [50,51]

Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cây Xoan ta được đánh giá là một trong những cây trồng quan trọng trong 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm (QĐ số 16/2005/QĐ-BNN) Một số trung tâm nghiên cứu như Trung tâm Giống và công nghệ sinh học thuộc Đại học Lâm nghiệp, Viện Khoa học lâm nghiệp,… cũng

đã tiến hành nhân giống in vitro loài cây này từ các dòng cây trội để sản xuất giống

chất lượng cao Đặc biệt, trong chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn năm 2020

Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã giao cho Trường Đại học lâm nghiệp chủ trì đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen có sức sinh trưởng nhanh, chất lượng gỗ tốt”, đây là tiền đề quan trọng để cải tiến chất lượng giống Xoan ta hiện nay

1.5 Chuyển gen thực vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens

Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen ngoại lai

đã được thiết kế dạng plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ, hoặc được gắn vào hệ gen của tế bào chủ

Trong tế bào chủ, gen ngoại lai hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng, từ đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể đã mang gen chuyển [16]

Chuyển gen vào thực vật có rất nhiều phương pháp, như: chuyển gen bằng vi khuẩn, virus, súng bắn gen, vi tiêm, xung điện, siêu âm, PEG, … Trong đó, Phương

pháp chuyển gen gián tiếp sử dụng A tumefaciens để chuyển gen vào thực vật là

phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định [8,16,19]

1.5.1 Giới thiệu về vi khuẩn A tumefaciens

Từ những năm đầu của thế kỷ 20, các nhà khoa học đã phát hiện ra một loại

vi khuẩn Agrobacterium có khả năng gây bệnh khối u ở thực vật

A tumefaciens là một loài vi khuẩn đất thuộc vi khuẩn gram âm Cả chủng A tumefaciens và A rhizogenes đều được sử dụng phổ biến trong chuyển gen vào thực

vật Theo cơ chế tự nhiên, hai loài này có khả năng xâm nhiễm qua vết thương của hầu hết thực vật hai lá mầm, kết quả là gây ra những khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy roots) [40] Những tế bào của khối u hay lông rễ có thể phát

triển in vitro khi vắng mặt bất cứ hormone thực vật nào Đây là do trong tế bào của các dạng hoang dại A tumefaciens hay A rhizogenes chứa một loại plasmid đặc biệt

gọi là Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid) Ti-Plasmid có kích thước khoảng 200kb đã được xác định trình tự, chứa một đoạn ADN có chiều dài khoảng 25Kb gọi là T-ADN (transfer ADN) có thể chuyển sang tế bào chủ theo cơ chế tự nhiên

[40] Do đó Agrobacterium là một hệ thống chuyển gen tự nhiên Bằng cách cải

biên (cắt bỏ các gen gây khối u hay lông rễ, cài xen vào vùng T-ADN những gen thích hợp, gen này sẽ được chuyển và gắn vào hệ gen tế bào thực vật dễ dàng Những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng cho sự ra đời của phương pháp

chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A tumefaciens [19,30]

1.5.2 Cấu trúc của Ti-plasmid và T-ADN

Ti-plasmid có chứa 4 vùng A, B, C, D Trong đó vùng A là T-ADN có mang

2 hệ gen: một hệ gen gồm 3 gen tổng hợp phytohormone là auxin và cytokinin chính hệ gen này gây bệnh khối u cho thực vật; hệ gen thứ hai điều khiển tổng hợp các dẫn xuất của axit amin hay đường gọi là opine Ở hai đầu của đoạn T-ADN có hai trình tự lặp lại dài khoảng 25bp gọi là bờ trái (left border) và bờ phải (right border), vùng này hoạt động giống như yếu tố tín hiệu cho vị trí chuyển Vùng B là vùng tái bản có mang điểm khởi đầu sao chép (oriT) Vùng C có liên quan đến sự tiếp hợp Vùng D gọi là vùng độc (virulence region) có chứa các gen mã hoá các protein/enzym Vir Có 9 loại protein Vir là A, C, G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H,

J/AcvB Các protein Vir này có vai trò quan trọng trong việc chuyển T-ADN sang tế bào thực vật [8,16,36]

Hình 1.7: Cấu trúc T – ADN và T – plasmid

1.5.3 Cơ chế của quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật

Vùng Vir bao gồm ít nhất 6 operon (VirA, VirB, VirC, VirD, VirG và VirE)

và hai vùng không cơ bản (VirF, VirH) Số lượng gen trong một operon là khác nhau: VirA, VirG, VirF chỉ có một gen; VirE, VirC, VirH có hai gen; VirD, VirB có

từ 4 -11 gen Hai operon giữ chức năng cơ bản là VirA và VirG mã hoá cho hệ thống hai thành phần (VirA-VirG), hai thành phần này có vai trò hoạt hoá quá trình dịch mã của các gen Vir khác Các protein mã hoá từ gen Vir đóng vai trò chủ yếu

trong quá trình chuyển gen của A tumefaciens Các vài trò này đã được thảo luận

trong nhiều tài liệu, ở đây chỉ nêu một số nét chính trong quá trình vận chuyển đó Protein VirA và protein VirG đóng vai trò là thành viên của hệ thống điều chỉnh di truyền hai thành phần mẫn cảm với tính hiệu vận chuyển Đầu tiên là hoạt động của VirA, dấu hiệu để hoạt hoá VirA bao gồm pH axit, hợp chất phenol được tiết ra từ thực vật như acetosyringone và một vài loại monosacharide như glucose, galactose Gen VirA hoạt động sinh ra protein VirA Protein VirA tự photphorin hoá và sau đó

photphorin hoá protein VirG Dạng protein VirG không photphorin hoá không có hoạt tính Protein VirG bị photphorin hoá có khả năng điều khiển sự biểu hiện các gen Vir khác [16,39]

Hoạt động của các gen Vir sinh ra sợi đơn T-ADN làm xuất hiện bản copy sợi bên dưới của T-ADN Chỉ đoạn sợi đơn ADN giữa hai trình tự biên (LB và RB) của T-ADN mới được chuyển vào tế bào thực vật, và được gắn vào genome của tế bào Đó là các yếu tố hoạt động cis của hệ thống vận chuyển T-ADN Protein VirD1, D2 đóng vai trò chìa khoá trong bước này, chúng nhận ra trình tự biên T-ADN và cắt sợi bên dưới tại mỗi bên Điểm cắt là điểm đầu và kết thúc của sợi tái sinh Sau đó, protein VirD2 vẫn còn gắn kết với đầu cuối 5’ của sợi T-ADN Sự kết hợp ngăn cản enzym exonuclease tấn công vào đầu 5’ của sợi đơn T-ADN và nhận

ra đầu 5’ như là đầu dẫn đường cho quá trình chuyển T-ADN vào tế bào thực vật Nếu gây đột biến hay loại bỏ đoạn RB thì hầu như mất hoàn toàn khả năng chuyển T-ADN, còn nếu làm biến đổi LB sẽ làm giảm hiệu quả chuyển T-ADN Điều đó chứng tỏ tổng hợp sợi T-ADN là từ đầu 5’ đến 3’, được bắt đầu từ đoạn RB và kết thúc ở LB

Phương tiện để chuyển đoạn T-ADN vào nhân tế bào thực vật là phức protein và sợi T-ADN Theo đa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi đơn T-ADN- VirD2 được bao bọc bởi protein VirE2 có trọng lượng 96kDa Sự phối hợp này giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi đơn T-ADN duỗi thẳng làm giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ 2nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di truyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào Protein VirE2 chứa đựng

2 tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein VirD2 Thực tế cho thấy hai protein này có vài trò quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào trong nhân tế bào thực vật Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong các protein này bị giảm, nhưng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T-ADN và tương tác giữa T-ADN với genome của tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác có thể đảm nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu Protein VirE cần thiết đối với quá trình bài xuất protein VirE2 sang tế bào thực vật

Các nghiên cứu công bố đã miêu tả vai trò của operon VirB có kích thước 9,5kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển phức từ vi khuẩn sang tế bào thực vật [16,39,48]

Protein VirD4 cũng là bắt buộc với sự vận chuyển phức ssT-ADN Chức năng của protein VirD4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết với quá trình di truyền T-ADN Protein VirB là protein có đặc tính kị nước tương tự protein kết hợp trên màng khác Phần lớn protein VirB đã được phát hiện giống như kênh protein xuyên màng Tuy nhiên, cũng có thể vài protein VirB khác được phân phối lại trong quá trình phát sinh sinh vật và thực hiện chức năng của kênh kết hợp qua tế bào vận chuyển Có thể có trường hợp của protein VirB2, một protein có nguồn gốc thực hiện chức năng ngoại bào VirB2 có dạng tiền protein trọng lượng 12kDa, nó phải trải qua quá trình hoạt hoá để trở thành dạng protein chức năng có trọng lượng 7kDa Protein Vir B4, B11 là các ATPase kỵ nước cần thiết đối với hoạt động chuyển T-ADN VirB11 cấu tạo nên các phần nhỏ hoà tan, trong thời gian ngừng hoạt động được giữ lại để kết hợp với màng nguyên sinh chất Đây là tính chất không điển hình đối với dạng protein này và chứng tỏ có thể cùng tồn tại các dạng cấu tạo khác nhau trong cơ thể sống Protein VirB4 kết hợp chặt chẽ với màng nguyên sinh chất Tổng hợp protein VirB4 có liên quan đến sự tích luỹ và phân phối protein VirB3 Protein VirB7 được xem là dạng cấu tạo chủ yếu của bộ máy vận chuyển Protein VirB7 tương tác với dạng nhị phân VirB9 và có khả năng tạo đa phức Tổng hợp protein VirB9 và tích lũy ổn định của nó phụ thuộc vào dạng

di nhị phân, điều đó chỉ ra rằng protein VirB9 có thể không ổn định và đòi hỏi kết hợp với protein VirB7 Protein VirB2, VirB11 là thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển T-ADN từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật [39,48]

1.5.4 Tương tác giữa T-ADN và genome tế bào thực vật

Trong tế bào thực vật, phức ssT- ADN được đưa qua màng nhân vào nhân Hai protein đóng vai trò quan trọng trong bước này là VirD2 và VirE2 Tín hiệu định vị trong nhân của VirD2 và VirE2 đóng vai trò chủ yếu Protein VirD2 có chức năng xác định vị trí cho T-ADN trong nhân Phức ssT-ADN là phức nucleoprotein

lên đến 20Kb chứa một đầu 5’ gắn với protein VirD2 Nhưng phức được bao bởi

số lượng lớn phân tử VirE2 (xấp xỉ 600/20Kb T-ADN) và mỗi phức này có hai tín hiệu định vị trong nhân Hai tín hiệu này của VirE2 đóng vai trò quan trọng đối với việc nhận liên tục phức T-ADN của nhân, có khả năng kích thích mở lỗ màng nhân Khả năng nhận phức của nhân được điều khiển bởi protein kết hợp tín hiệu định vị đặc trưng trong nhân, protein này được tìm thấy trong tế bào chất của tế bào thực vật [39,48]

Bước cuối cùng trong quá trình vận chuyển T-ADN là sự tương tác trong genom tế bào thực vật Các phản ứng trong sự tương tác T-ADN không có tính điển hình Sự tương tác này tìm thấy bởi sự tái tổ hợp không theo quy luật Theo cách nhìn nhận này việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, được cần đến đối với bước lặp lại giữa cặp vận chuyển T- ADN với VirD2 và ADN thực vật Sự tương đồng này rất thấp và cung cấp đặc trưng nhỏ nhất đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác định vị trí của VirD2 để gắn kết Ở trình tự gần kề hay đầu 3’ của T-ADN tìm thấy một vài sự tương đồng nhỏ với ADN thực vật, kết quả ở sự tương tác đầu tiên giữa sợi T-ADN và ADN thực vật là tạo lỗ hổng ở sợi 3’-5’ của ADN thực vật Sau

đó ADN thực vật được cắt ở vị trí đầu 3’ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotide của đầu 5’ bắt cặp với VirD2 bởi một nucleotit trong đầu sợi (5’-3’) ADN thực vật Phần 3’ nhô ra của T-ADN cũng như ADN thực vật thay thế bị phân huỷ bởi endonuclease hay 3’-5’ exonuclease Đầu 5’ của T- ADN gắn với VirD2 còn đầu 3’ kia cặp đôi với ADN thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trinh tương tác, nối liền với vết cắt trong sợi ADN dưới của thực vật Sự đưa vào của sợi T-ADN trong sợi 3’-5’ của ADN thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt trong sợi đối ngược được sản sinh [19,39]

Tình trạng này hoạt hoá phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T-ADN như là sợi khuôn VirD2

có vai trò hoạt hoá trong sự hoà hợp chính xác sợi T-ADN vào nhiễm sắc thể thực vật Phóng thích protein VirD2 có thể cung cấp năng lượng chứa đựng trong các liên kết phosphodieste, như Tyr29 với nucleotit đầu tiên của sợi T-ADN, qui định

đầu 5’ của sợi T-ADN để nối vào ADN thực vật Khi protein VirD2 bị đột biến được vận chuyển gắn vào sợi T-ADN, quá trình tương tác với vị trí phù hợp với nucleotit ở đầu 5’ của sợi T-ADN không còn Ngoài ra quá trình chuyển T-ADN

còn có sự tương tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium

quy định và protein trong tế bào thực vật [39,48]

1.6 Hệ vector sử dụng trong nghiên cứu

Trong kỹ thuật chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium, thiết kế

vector chuyển gen là bước rất quan trọng Thiết kế vector (vector construction) là việc xây dựng cấu trúc phân tử ADN (vector) gồm các thành phần cần thiết cho chuyển gen và cho phép gắn gen mục tiêu vào vector đó Công việc thiết kế vector gồm có lựa chọn hệ vector thích hợp, lựa chọn promoter, terminater, và lắp ráp các thành phần trên cùng với gen mục tiêu để tạo ra vector chuyển gen tái tổ hợp mong muốn [5,6,16]

Trong chuyển gen vào thực vật, hệ vector chuyển gen được sử dụng phổ biến hiện nay là vector nhị thể pBI121 Vector pBI121 đã được nghiên cứu thiết kế và cho hiệu quả chuyển gen cao

1.6.1 Giới thiệu về vector chuyển gen pBI121

Vector chuyển gen pBI121 là vector nhị thể, loại plasmid, ký hiệu là AF

485783 Kích thước toàn bộ vector là 14758bp trong đó:

- Kích thước vùng T – ADN là 6193bp

- Kích thước vùng ngoài T – ADN là 8565bp, được thiết kế dựa trên vector Bin 19

1.6.2 Các thành phần cấu trúc của vector pBI121

a) Đoạn khởi động gen (promoter) CaMV35S-P

Promoter là điểm nhận biết và gắn của enzym RNA polymerase

Để các gen ngoại lai có thể biểu hiện thành protein cần phải có các tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí thích hợp Những tín hiệu không thể thiếu trong quá trình điều khiển biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và các đoạn kết

thúc gen Đoạn khởi động bao gồm trình tự nucleotide phía 5’ của gen cấu trúc Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng bảo đảm các vị trí nhận biết cho enzym RNA polymerase, cho các yếu tố hoạt hoá và khởi động Promoter thường được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen thực vật là promoter CaMV35S-

P (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter) Promoter CaMV35S-P có khả năng hoạt động mạnh ở nhiều loại mô của cây hai lá mầm, nhưng lại ít hoạt động ở cây một lá mầm Để khắc phục nhược điểm này, promoter CaMV35S-P được kết hợp với các thành phần khởi động khác Promoter CaMV35S-P dài 350 bp, gồm 3 thành phần:[4]

- Hộp TATA (ở vị trí từ -46 đến - 8)

- Vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí -90 đến -46, làm tăng biểu hiện của gen ngoại lai ở rễ

- Vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện gen

ở mô lá Trong vùng B gồm 5 phần nhỏ từ B1-B5 phân chia theo mức độ phản ứng của mỗi vùng đối với các yếu tố dịch mã khác nhau [4,5]

b) Đoạn kết thúc (Terminator)

Các đoạn kết thúc thường chứa đuôi poly A như AATTAA, hoặc AACCAA giúp bảo vệ phân tử mRNA được bền vững hơn và tránh được sự phá huỷ bởi enzym Hai đoạn kết thúc được sử dụng nhiều trong công nghệ gen thực vật là đoạn kết thúc của gen CaMV35S và đoạn kết thúc NOS-Ter

pBI121 có đoạn kết thúc NOS – Ter với kích thước 253bp

c) Gen chỉ thị

- Chỉ thị chọn lọc (selectable marker): sự biểu hiện của gen kháng npt2 (neomycin phospho transferase gene) được điều khiển bởi đoạn khởi động NOS-Pro (nopaline synthase promoter), chỉ có những biến nạp mang vector tái tổ hợp mới sống được trên môi trường có bổ sung thêm kháng sinh Kan Việc sử dụng gen chỉ thị cần đạt một số yêu cầu sau: chất chọn lọc ức chế sinh trưởng các tế bào không

được biến nạp, sự thể hiện của gen chọn lọc không làm ảnh hưởng tới trao đổi chất của các tế bào được biến nạp [21]

d) Chỉ thị sàng lọc (screenable marker)

Chỉ thị sàng lọc không chỉ giúp nhận biết các thể biến nạp mà còn dự đoán được mức độ biểu hiện của gen quan tâm trong mô thực vật được chuyển gen Ở vector này, chỉ thị β-glucuronidase (GUS) với kích thước khoảng 1,8kb, cho phép sàng lọc hoạt tính của enzym dễ dàng trên cơ sở kỹ thuật nhuộm tế bào Gen chỉ thị cần có đặc điểm sau: sản phẩm của gen là duy nhất và không độc với tế bào thực vật, các enzym chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptide ngoài mà không ảnh hưởng hoạt tính enzym.[21]

+ Vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt của rất nhiều loại enzym như HindIII,

SmaI, BamHI, SacI, XbaI, SphI, PstI, EcoRV,

Đặc điểm quan trọng của vector pBI121 là trong vùng MCS có chứa trình tự điểm cắt duy nhất của hai enzym BamHI và SacI (Sst1) ở hai đầu gen GUS Ở hai đầu của gen 4CL1 cũng được thiết kế trình tự cắt của hai enzym này Chính vì thế,

dễ dàng tạo điều kiện để thiết kế vector tái tổ hợp mang gen 4CL1 Đây là lý do quyết định lựa chọn vector pBI121 là hệ vector chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta

f) Thành phần khác

Ngoài ra, vector pBI121 có các thành phần cần thiết khác của một plasmid để tạo thành vector chuyển gen hoàn chỉnh