Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu nhận n acetyl d glucosamin

Trên cơ sở khoa học, để thu được enzyme có hoạt tính cao và ổn định, khả năng thủy phân tốt thì ta phải chọn được giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme và tạo điều kiện tốt

ĐINH VĂN BÔN

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU

KIỆN NUÔI CẤY CHỦNG SINH CHITINASE CHO THU

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Đinh Văn Bôn xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài:

“Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy chủng sinhchitinase cho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin” là công trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi

đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cô giáo, gia đình và bạn bè

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà - Viện Công

nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tậ

p và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN 3

MỤC LỤC 4

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 7

MỞ ĐẦU 10

PHẦN I TỔNG QUAN 12

1.1 Chitinase 12

1.1.1 Cấu trúc 12

1.1.2 Cơ chế hoạt động của chitinase 13

1.1.3 Các đặc tính cơ bản của hệ chitinase [4] 14

1.1.3.1 Trọng lượng phân tử 14

1.1.3.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis 14

1.1.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 14

1.1.3.4 Ảnh hưởng của pH 15

1.1.3.5 Các ion kim loại 15

1.1.3.6 Sự ổn định 15

1.1.4 Các nguồn thu nhận chitinase [4],[15] 16

1.1.4.1 Vi khuẩn 16

1.1.4.2 Chitinase nấm 16

1.1.5 Sơ lược các nghiên cứu về chitinase từ vi sinh vật 16

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 19

1.2 Đặc điểm sinh học của chi nấm mốc Penicillium 20

1.2.1 Vị trí phân loại Penicillium trong các hệ thống phân loại nấm [1],[14] 20 1.2.2 Chitinase sinh tổng hợp bởi chi Penicillium [1] 20

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase 20

1.2.3.1 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng 21

1.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện lên men 22

1.3 Chitin 23

1.3.1 Nguồn gốc của Chitin 23

1.3.2 Cấu tạo của chitin 24

1.3.3 Các tính chất của chitin [15],[21] 25

1.4 N-Acetyl-D- glucosamin (GlcNAc) 26

1.4.1 Cấu tạo của N-Acetyl-D- glucosamin 26

1.4.2 Tính chất của N-Acetyl-D- glucosamin 26

1.4 3 Ứng dụng của N-Acetyl-D- glucosamin [12] 27

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28

2.1 Nguyên vật liệu 28

2.1.1 Giống vi sinh vật 28

2.1.2 Hóa chất 28

2.1.3 Dụng cụ 28

2.1.4 Các thiết bị 28

2.1.5 Môi trường 29

2.1.5.1 Môi trường nhân giữ giống 29

2.1.5.2 Môi trường czapeck (môi trường hoạt hóa) 29

2.1.5.3 Môi trường MS chitin cơ bản (môi trường lên men) 30

2.2 Các phương pháp 30

2.2.1 Phương pháp giữ giống 30

2.2.2 Phương pháp hoạt hóa giống 30

2.2.3 Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù [20] 31

2.2.4 Phương pháp lên men chủng Penicillium oxalicum 20B 31

2.2.5 Xác định hàm lượng N-acetyl glucosamin 31

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ của chitinase [33] 32

2.2.7 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh tổng hợp chitinase của chủng Penicillium oxalicum 20B 33

2.2.7.1 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới hoạt tính chitinase 33

2.2.7.2 Ảnh hưởng của các nguồn cacbon tới hoạt tính chitinase 33

2.2.7.3 Ảnh hưởng của hàm lượng chitin tới hoạt tính chitinase 33

2.2.7.4 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới hoạt tính chitinase 33

2.2.7.5 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men tới hoạt tính chitinase 34

2.2.7.6 Ảnh hưởng của thời gian lên men tới hoạt tính của chitinase 34

2.2.8 Phương pháp xác định sinh khối 34

2.2.9 Phương pháp xác định hoạt tính hexosaminidase [45] 34

2.2.10 Xác định hoạt độ endochitinase [55] 35

2.2.11 Phương pháp TLC xác định phổ sản phẩm của quá trình thủy phân 35

2.2.12 Phương pháp phân lập bào tử đơn [19] 35

2.2.12.1 Nguyên lý phương pháp 35

2.2.12.2 Các bước thực hiện 35

2.2.12.3 Chú ý 36

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Kết quả tuyển chọn chủng 37

3.2 Kết quả tuyển chọn bào tử đơn có khả năng sinh tổng hợp chitinase có hoạt tính cao 39

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ bào tử và thời gian hoạt hóa 41

3.4 Ảnh hưởng của các dạng nguyên liệu chitin tới hoạt tính chitinase 42

3.5 Ảnh hưởng của nồng độ chitin thô tới hoạt tính chitinase 43

3.7 Ảnh hưởng của các nguồn nito 46

3.8 Ảnh hưởng của hàm lượng cao nấm men 47

3.9.Kết quả động thái sinh trưởng Penicillium oxalicum 20B 48

PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

4.1 Kết luận 52

4.2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tỷ lệ chitin trong các loài khác nhau 23 Bảng 3.1 Hoạt tính chitinase của các chủng tuyển chọn 37 Bảng 3.2 Điều kiện lên men chủng Penicillium oxalicum 20B trước và sau khảo sát51

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của chitinase 13

Hình 1.2.Công thức cấu tạo của chitin 24

Hình 1.3 Các kiểu sắp xếp trong mạch đại phân tử của chitin 25

Hình 1.4 Cấu tạo của N-Acetyl-D- glucosamin 26

Hình 2.1 Bào tử nấm mốc Penicillium oxalicum nảy mầm………36

Hình 2.2 Các bào tử đơn phát triển thành những khuẩn lạc riêng rẽ 36

Hình 3.1 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân của các chủng nghiên cứu 38

Hình 3.2 Hoạt tính NAHase của 4 chủng nghiên cứu 39

Hình 3.3 Hoạt độ chitinase và khả năng thủy phân của chitinase từ các bào tử đơnTB1-TB8 39

Hình 3.4 Hoạt độ chitinase và khả năng thủy phân của các bào tử đơnTB1, TB2, TB6 40

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ cấp giống tới hoạt tính chitinase và khă năng thủy phân 24h 41

Hình 3.6 Ảnh hưởng của dạng chitin tới hoạt tính và khả năng thủy phân của chitinase 43

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ chitin thô tới hoạt tính và khả năng thủy phân của chitinase 44

Hình 3.8 Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới hoạt tính và khả năng thủy phân của chitinase 45

Hình 3.9 Ảnh hưởng của các nguồn nito tới hoạt tính chitinase và khả năng thủy phân của chitinase 46

Hình 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng CNM tới hoạt tính chitinase và khả năng thủy phân của chitinase 48

Hình 3.11 Sự thay đổi pH của dịch lên men 49

Hình 3.12 Sự thay đổi hoạt tính chittinase, hoạt độ endochittinase, hoạt độ N-acetyl-D-hexominidase 50

Hình 3.13 Sắc ký đồ sản phẩm TP 24h của chitinase ở các thời điểm lấy mẫu 50

MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của toàn xã hội, cuộc sống của con người ngày càng được cải thiện, con người cũng có điều kiện để quan tâm chăm sóc sức khỏe của mình hơn Môi trường bị ô nhiễm, các sản phẩm thực phẩm không hợp vệ sinh hay còn tồn dư hóa chất độc hại lan tràn khắp nơi trên thị trường Chính những yếu tố khách quan như vậy khiên sức khỏe của chúng ta bị suy yếu, một trong số đó là các bệnh về khớp

N-Acetyl-D-glucosamin (NAG) là một đường đơn, tồn tại nhiều trong sụn khớp, chất nhầy, não, là thành phần liên kết tế bào với tế bào, truyền đạt thông tin

từ tế bào này sang tế bào khác N-Acetyl-D-glucosamin là thành phần cấu tạo nên axit hyaluronic và thúc đấy quá trình sinh sản chodroitin - đây là 2 thành phần chính cấu tạo nên sụn khớp ở gối, tay, bả vai, xương chậu… NAG được sử dụng nhiều trong y học để phục hồi, điều trị tận gốc căn nguyên của bệnh về khớp Ngoài ứng dụng trong điều trị bệnh viêm khớp, NAG đã được ứng dụng để chữa các bệnh viêm ruột, ứng dụng trong mỹ phẩm làm đẹp da, là cơ chất để sản xuất axit sialic (ứng dụng trong chữa bệnh cúm) và được chứng minh có khả năng chữa nhiều bệnh (ung thư và di căn, phản ứng miễn dịch…)

N-axetyl-D-glucosamin (NAG) hay còn gọi là glucose, là đơn phân cấu tạo nên chitin có nhiều trong vỏ tôm, cua, mực…

2-acetamino-2-deoxy-β-D-Mặt khác, giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xác chiếm từ 70 – 80% công suất chế biến Hàng năm các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000tấn/năm Nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin, chitosan, glucosamin và các sản phẩm khác Do vậy việc nghiên cứu và phát triển sản xuất các sản phẩm từ vỏ tôm là rất cần thiết nhằm nâng cao giá trị sử dụng phế liệu này và làm sạch môi trường

NAG sản xuất từ chitin bằng rất nhiều phương pháp khác nhau như: hóa học

và sinh học Phương pháp hóa học được thực hiện bằng thủy phân axit mạnh Do đó

năng suất thấp, chất thải có tính axit và không thân thiện với môi trường Vì vậy phương pháp sinh học với việc sử dụng hệ enzyme chitinase từ các nguồn vi sinh vật đã được quan tâm nhiều hơn, đã có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase trong sản xuất glucosamin và N-acetyl glucosamine Trên cơ sở khoa học, để thu được enzyme có hoạt tính cao và ổn định, khả năng thủy phân tốt thì ta phải chọn được giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình lên men Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu tuyển chọn và xác định điềukiện nuôi cấy chủng sinh

chitinasecho thu nhận N-acetyl-D-glucosamin”

Mục tiêu của đề tài:

- Lựa chọn bào tử đơn có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất từ chủng giống đã thoái hóa

- Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp chitinase thu nhận N-acetyl-D-glucosamin

Nhiệm vụ của đề tài:

- Tuyển chọn chủng sinh chitinase ứng dụng cho thu nhận glucosamine

N-acetyl-D Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủngđã tuyển chọn để tìm ra điều kiện thích hợp nhất

PHẦN I TỔNG QUAN 1.1 Chitinase

1.1.1 Cấu trúc

Chitinase [Poly-ß-1-4-(2-acetalmido-2deoxy)- D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,2 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N–acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14

Họ Glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực

vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus

influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua

cơ chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I,II,IV

Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-axetyl–D–Glucosamine

axetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người

Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của ezyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành

5 nhóm:

- Nhóm 1: Là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạng giàu glycin hoặc prolin ở đầu cacboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác

- Nhóm 2: Là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino axit tương tự chitinase ở nhóm 1 Chitinase nhóm 2 có ở thực vật, nấm và vi khuẩn

- Nhóm 3: Trình tự amino axit hoàn toàn khác với chitinase nhóm 1 và 2

- Nhóm 4: Là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 – 47% trình tự amino axit ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm 1, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm 1

- Nhóm 5: Dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao

1.1.2 Cơ chế hoạt động của chitinase

Enzyme phân giải chitin bao gồm: Endochitinase, chitin 1-4-β-chitobiosidase

và β-N-acetyl hexosaminidase

Hình 1.1 Cơ chế hoạt động của chitinase

Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân

tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa

Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2

β-N-acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-axetyl glucosamine[4]

1.1.3 Các đặc tính cơ bản của hệ chitinase [4]

1.1.3.1 Trọng lượng phân tử

Chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng phân tử khoảng 30kDa (kilodalton) Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng

cư, thú), một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90kDa hoặc cao hơn cả

là khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử của chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn

có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120kDa

1.1.3.2 Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis

Chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3-10 ở thực vật bậc cao

và tảo; pI từ 4,7- 9,3 ở cồn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5- 8,8 ở vi sinh vật

Hệ số hấp thu E280 (mg/ml) =1,24; phổ hấp thu chỉ là bước sóng đơn 280 µm Hằng số Michaelis: 0,010 - 0,011 (g/100ml)

1.1.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20-50oC (Frandberg và Schnure, 1994; Huang vàcộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal,1998; Wiwat và cộng sự, 1999;Bendt và cộng sự, 2001) [4]

Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 40o

C, ngoại

trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin có nhiệt độ tối

thích là 50oC (Jeuniaux, 1993) Tùy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các chitinase

có thể có những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau Các chitinase thực vật thuộc nhóm

III và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nóng cho thấy khả năng

chịu đựng nhiệt độ cao đến 80oC Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp.Từ 30- 45oC và chịu nhiệt từ chủng Bacillus

cơ chất là glucol chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu

Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH

từ 4,0 -8,5 Chitinase của nấm hoạt tính cao nhất ở pH =5, trong khi ở vi khuẩn pH

tối thích là 8,0, hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp BG-11 cao nhất ở pH= 8,5 [4],

[26]

Chitinase từ Penicillium oxalicum 20B có pH thích hợp cho quá trình thủy

phân chitin tạo thành GlcNAc là pH =3,5 -5 và tối ưu trong khoảng 4,5 -5 [6]

1.1.3.5 Các ion kim loại

Các ion kim loại Hg2+

, Ag+ là những chất ức chế Đối với ion Cu+, có 2 dạng chitinase: một bị ức chế và một được tăng cường nhờ Cu2+

được tìm thấy ở một số

loài cá và vi sinh vật như Pseudomonas aeruginosa

1.1.3.6 Sự ổn định

Chitinase thô hoặc tinh sạch ổn định trong trạng thái đông lạnh khoảng 2 năm

Sự ổn định của chitinase sẽ cao hơn khi có mặt của cơ chất là chitin Chúng bị khử hoạt tính nhanh chóng ở 37oC trong trường hợp không có mặt chitin Chu kỳ bán hủy ở 37o

C là 40 ngày và ở 5o

C là 230 ngày Chitinase bất hoạt bởi oxygen, hằng số bất hoạt ở 20oC là k = 0,145/h [6]

1.1.4 Các nguồn thu nhận chitinase [4],[15]

Chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật

Chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium,

Pseudomonas, Bacillus…và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp

chitinase nhằm phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho

sự sinh trưởng và phát triển

Chitinase có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng Tuy nhiên trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật, người ta đều cho thêm chitin – cơ chất của chitinase để làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau quá trình chiết tách

1.1.4.2 Chitinase nấm

Chitinase cũng được tạo ra bởi các loài nấm sợi Các chủng nấm mốc cho

chitinase cao như: Trichoderma, Aspergillus… đặc biệt là ở các loài nấm lớn như

Lycoperdon, Coprinus…

Tương tự như ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dưỡng nhưng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm

1.1.5 Sơ lược các nghiên cứu về chitinase từ vi sinh vật

1.1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Takahashi (1993) và Stoyachenko (1994) đã tinh sạch và khảo sát một số

tính chất của chitinase từ Vibrio sp và Streptomyces kurssanovii [23, 38, 47] Wang

và Hang (2001) đã xử lí nước thải chứa động vật có vỏ bằng cách sử dụng chitinase

từ vi khuẩn Bacillus cereus, B alvei, và B sphaericus phân lập từ nước thải [52] Vi

khuẩn C4 thuộc chi Sanguibacter được Tao (2005) phân lập từ đất, vi khuẩn này đã

cho ra nguồn chitinase ngoại bào có khối lượng phân tử từ 57-58,8kDa, pI= 4,2 Tuy nhiên, enzyme có vùng pH hoạt động rộng từ 3,0- 8,0, hoạt động tối ưu ở pH 4,6 và khả năng chịu nhiệt lên đến 60o

C vẫn duy trì 50% hoạt tính và ứng dụng chitinase trong phòng trừ côn trùng gây hại [54] Dahiya và cộng sự (2006) nghiên

cứu chitinase từ Baccilus circulans và ứng dụng để phân giải thành tế bào nấm men

(Rhaffia Rhodozyme)[41] Lee (2007) đã nuôi cấy, tinh sạch và khảo sát một số đặc

điểm của chitinase từ vi khuẩn Bacillus sp.[53] De-hui Dai (2011) phát hiện được nhóm vi khuẩn chịu nhiệt Bacillus sp HU1 từ đất ở suối nước nóng Trung Quốc

cho nguồn chitinase mới có khả năng chịu nhiệt, khi ủ ở pH tối ưu 6,5 vẫn giữ được hoạt tính khi gia nhiệt ở 60oC trong thời gian là 100 phút

Nấm sợi được xem là nguồn cung cấp enzyme cho hoạt tính cao và ổn định,

là đối tượng được chú ý để nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực enzyme Pedraza-Reyes

và Lopez-Romero (1989) đã nghiên cứu về các đặc tính của hai loại enzyme ngoại

bào chitinase ở nấm mốc Mucor rouxii[37] Abdel-Naby và cộng sự (1992) đã tinh sạch và khảo sát tính chất của chitinase từ Aspergillus carneus[39] Chitinase từ dịch tự phân Penicillium oxalicum đã được Rodriguez, Copa Patino, Pesrez Leblic

(1995) tinh sạch bằng phương pháp tủa muối amoni sunfat và tính chất của nó cũng

đã được khảo sát với pH và nhiệt độ tối ưu là 5,0 và 35o

C, enzyme này bền vững ở nhiệt độ tối đa 45oC và pH dao động từ 4,0 đến 6,0 [25]

Escott, Hearn và Adams (1998) đã tủa và tinh sạch chitinase từ chủng

Aspergillus fumigatus, phát hiện chitnase có khối lượng 45kDa khác biệt rõ nét với

enzyme từ chủng Aspergillus carneus có khối lượng khoảng 25kDa Bên cạnh đó, qua phân tích thành phần axit amin trong chủng Aspergillus carneus đã cho thấy

enzyme chứa nhiều axit amin asparagine, serine, threonine hoạt động trong điều kiện tối ưu pH 5,2 ở 50oC [22] Kawachi (2001) nghiên cứu phương pháp tinh sạch

và các đặc tính của chitinase ngoại bào từ chủng nấm kí sinh Isaria japonica và tách

chiết được hai loại chitinase với khối lượng tương ứng 43,2kDa và 31,1kDa hoạt động tốt trong khoảng pH khá thấp từ 3,5 đến 4,5 ở nhiệt độ từ 40-50o

C [24]

Những đặc điểm của chitinase và endo-β-1,3-glucanase từ Trichoderma harzianum Rifai T24 có liên quan tới phòng trừ nấm bệnh Sclerotium rolfsii và Rhizoctonia

solani đã được El-Katatny và cộng sự nghiên cứu (2001) [36] Nghiên cứu đường

hóa chitin sử dụng môi trường nuôi cấy bán rắn với chủng nấm Aspergillus sp

S1-13 với cơ chất lấy từ chất thải trong thủy sản nhằm tận dụng nguồn phế thải để tạo

ra nguồn enzyme có giá trị kinh tế cao Với phương pháp tủa muối ammonisulfate

và sắc kí đã tách được một exochitinase có khối lượng phân tử khoảng 73kDa và hai endochitinase có khối lượng lần lượt là 45kDa và 52kDa [43]

Gkargkas (2004) nghiên cứu về N-acetyl-D glucosamineidase được sinh ra

bởi Fusarium oxysporun F3 phát triển trên môi trường bán rắn và ứng dụng trong

trừ muỗi, nấm và côn trùng gây bệnh [27] Những nghiên cứu gần đây về điều kiện tối ưu trong nuôi cấy nhằm tạo nguồn enzyme hoạt tính cao và có sản lượng lớn từ

những vật liệu giá trị thấp cũng được quan tâm rất nhiều 14 chủng Penicillium sp

có hoạt tính chitinase được phân lập và khảo sát trên môi trường lên men bán rắn

[46] Rattanakit (2007) sử dụng chitinase phân lập từ Aspergillus sp để xử lý môi

trường nhiễm chitin [44] Swiontek-Brzezinska và cộng sự (2007) dựa vào cơ chế hoạt động của enzyme thủy phân chitin từ các chủng nấm phân lập từ vỏ tôm cho thấy chitinase từ vi khuẩn cho hoạt tính mạnh nhất ở pH=8 khi được ủ ở 40oC khác biệt so với chitinase từ nấm cho hoạt tính mạnh trong môi trường axit pH=5 ở nhiệt

độ 50o

C [32] Chủng nấm như Pencilium sp LYG 07 được Lee và cộng sự (2009)

phân lập từ đất cho hoạt tính chitinase từ ngày đầu tiên và tiếp tục tăng dần cho đến khi đạt được hoạt tính tối ưu sau 3 ngày nuôi cấy Chitinase được tủa với isopropanol và sắc kí cột MonoQ và Butyl-Sepharose Khối lượng phân tử chitinase sau khi điện di SDS-PAGE cho kết quả là 46 kDa Enzyme có hoạt tính tối ưu ở pH=5,0 và nhiệt độ là 40o

C [20]

Gần đây, Ghanem và cộng sự (2010) đã nghiên cứu cải thiện điều kiện nuôi

cấy nấm Aspergillus terreus trên cơ chất vảy cá nhằm tăng sản lượng chitinase sinh

ra [28] Năm 2011 ông đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho chitinase cao từ

Alternaria alternata và ứng dụng cho sản xuất Chitooligosaccharides và N-acetyl-D

glucosamine [29]

1.1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nhìn chung những nghiên cứu về chitinase trong nước còn hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là không thể phủ nhận

Đặng Trung Thành (2008) nghiên cứu thu nhận nguồn chitinase từ khoai lang (Ipomoea batatas) ở Khánh Hòa đã thu được những kết quả ban đầu khả quan khi tận dụng nguồn phế phẩm từ lá khoai lang để sản xuất nguồn enzyme có giá trị (hoạt độ đạt 192UI/ml) [2] Nguyễn Đình Nga (2008) khảo sát khả năng tác động

lên nấm Candida albicans của chitinase thu nhận từ thực vật và nấm Trichoderma

Nguyễn Quang Nhân (2009) nghiên cứu thu nhận, tinh sạch và xác định tính chất

của chitinase từ mủ cây cao su Hevea Brasiliensis, đề ra quy trình thu nhận

chitinase từ mủ cây cao su cũng như các đặc tính hóa lý của enzyme [8]

Vi sinh vật là một trong những đối tượng chính để trích li nguồn chitinase có hoạt tính cao Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp có công trình nghiên cứu đặc tính

của chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarlus và một số ứng dụng trong

lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược [7]

Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu có công trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá

trình sinh tổng hợp hệ chitinase của các chủng nấm mốc Trichoderma sp Năm

2004, tác giả Tô Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở

Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh [13] Quỳnh

Hương (2006) nghiên cứu về chuyển gen kháng nấm chitinase gluconase vào cấy

sắn thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và đã thu được một số kết quả

ban đầu Lê Thị Huệ (2010) khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số

chủng thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng [7] Đinh Minh Hiệp (2010) nghiên cứu chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp và khả

năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [5]

1.2 Đặc điểm sinh học của chi nấm mốc Penicillium

1.2.1 Vị trí phân loại Penicillium trong các hệ thống phân loại nấm [1],[14]

Robert K Noyd (2000) xếp Penicillium vào trật tự như sau:

Ngành (Division): Deuteromycota

Lớp (Class): Hyphomycetes

Bộ (Order): Moniliales

Họ (Family): Moniliaceae

Chi (Genus): Penicillium

1.2.2.Chitinase sinh tổng hợp bởi chi Penicillium[1]

Nhiều nghiên cứu chỉ ra một số loài thuộc chi Penicillium có khả năng sinh tổng hợp chitinase như P aculeatum, P citrinum, P oxalicum… Chitinase sinh tổng hợp từ Penicillium thường hoạt động ổn định trong khoảng nhiệt độ khá cao

tới 450C với P oxalicum[50], Penicillium sp LYG 0704 [34], và Penicillium

aculeatum ở 500C[18] Theo Y G Lee et al năm 2009 nghiên cứu enzyme chitinase của nấm hoạt động tốt trong khoảng pH từ 4-7 So sánh với một số enzyme

chitinase từ các chủng Penicillium như Penicillium sp LYG 0704 pH tối ưu ở 5,0 [34]và Penicillium aculeatum ở pH 5,5[18], pH tối ưu của enzyme chitinase từ chủng nấm Penicillium oxalicum thích hợp để thủy phân là 4,5-6,5[50]

Một số các nghiên cứu đã công bố khả năng sinh tổng hợp chitinase của

chủng Penicillium như Pencillium citrinum [11], Pencillium janthinell [35],

Penincillium aculeatum [46], Pencillium chrysogenum [47] Trong 70 chủng nấm

sợi phân lập từ đất ở thành phố Cần Thơ có 10 chủng thể hiện hoạt tính chitinase,

trong đó Penicillium oxalicum có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao nhất [10]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase

Thức ăn không chỉ cung cấp các nguyên liệu để cơ thể nấm sợi sản xuất thường xuyên chất nguyên sinh, sợi nấm, chất dự trữ mà còn cung cấp năng lượng cho hoạt động của cơ thể sống, trong đó có thành tế bào Vì vậy thành phần dinh dưỡng đóng một vai trò quan trọng đến khả năng tổng hợp chitin, chitosan của sợi nấm Nếu cacbon, nito có mặt hầu hết trong các thành phần cấu tạo của tế bào thì

chất khoáng, vitamin, nguyên tố vi lượng cũng là thành phần không thể thiếu, chúng ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất, đến hoạt tính của vi sinh vật, bằng cách thay đổi tốc độ các phản ứng enzyme

1.2.3.1 Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng

1.2.3.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Cacbon chiếm tỉ lệ trên 50% trọng lượng khô tế bào, nó tồn tại trong tế bào chất, trong tất cả các phân tử của enzyme, axit nucleic và các sản phẩm trao đổi chất Ngoài nhiệm vụ là nguồn cung cấp năng lượng, tạo thành những tiền chất, hợp chất cacbon còn tạo ra các quá trình oxy hóa khử để biến đổi những tiền chất này thành những sản phẩm trung gian hoặc những sản phẩm cuối cùng dùng để xây dựng tế bào, đồng thời tích tụ trong môi trường một vài sản phẩm sinh tổng hợp

Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon dễ hấp thụ như glucose, tinh bột tan thì vi sinh vật phát triển về mặt sinh khối, nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng chitinase mà vi sinh vật tiết ra môi trường là rất ít Muốn thu được enzyme thì cần phải có chất cảm ứng để vi sinh vật có thể tiết ra enzyme để thủy phân nguồn cơ chất đó Nguồn cacbon chitin đóng vai trò là chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitinase là chitin[40]

Cơ chất dùng để cảm ứng sợi nấm sinh chitinase là chitin và các dẫn xuất của chitin Theo Anil Kumar Singh khi sử dụng các nguồn cacbon khác nhau như chitin keo, chitin thô, chintin từ vỏ cua và chitin từ vỏ tôm cũng đều cho hoạt tính chitinase cao[16].Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong môi trường nuôi cấy sinh chitinase, cần có nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn carbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp chitinase

1.2.3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ nito

Tất cả các thành phần quan trọng của tế bào đều chứa Nito (Protein, axit nucleic, enzyme ) Nito chiếm 10- 15% trọng lượng khô của tế bào Nito tham gia cấu tạo protit như: Protein, axit amin, glycoprotein, lipitprotein, peptidoglucan Protit chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần chất khô, phổ biến từ 60-85% trong lượng khô của tế bào Protit giữ chức năng tham gia cấu trúc mọi bào quan trong tế

bào, đặc biệt là enzyme giữ vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất ở nấm sợi Trong đó cả enzyme deacetyl hóa chitin thành chitosan trên thành tế bào [27]

Việc chọn nguồn nito là rất cần thiết để đảm bảo được hiệu suất cao và có lợi

về mặt kinh tế trong lên men Các loại hợp chất nito mà nấm sợi có thể đồng hóa được thường là cao nấm men, cao malt, cao ngô, và các nguồn nito vô cơ như

NH4NO3, (NH4)2SO4, NaNO3, urea…Trong đó nguồn cao nấm men, pepton là thành phần mà các loài nấm tiếp hợp và ưa sử dụng nhất [48][16]

1.2.3.1.3 Ảnh hưởng của các nguyên tố khoáng

Ngoài nguồn cacbon, nito thì các nguyên tố khoáng cũng có tác dụng nhất định đối với quá trình phát triển của vi sinh vật, chúng cần thiết cho sự duy trì cân bằng sinh lý tế bào Các nguyên tố khoáng bao gồm các nguyên tố vi lượng như

Mn, Cu, Fe, Zn…được bổ sung dạng muối vô cơ như KH2PO4, MgSO4… Mỗi nguyên tố khoáng có chức năng riêng đối với vi sinh vật như photpho tham gia thành phần cấu tạo của axitnucleic, phophoprotein,photpholipit và nhiều coenzyme quan trọng như ATP, NADP, ADP…

1.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện lên men

1.2.3.2.1 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ và OH– trong môi trường tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay đổi sự vận chuyển của chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzym ra ngoài môi trường

Mặt khác ion H+ và OH– cũng ảnh hưởng đến hệ enzyme của vi sinh vật, tham gia hoạt động sống, sinh tổng hợp của vi sinh vật

Chitinase thường hoạt động trong vùng axit yếu Khoảng pH thích hợp là từ 4,0-6,5 Tùy vào nguồn gốc chủng mà pH tối thích của nó khác nhau

1.2.3.2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ cấp giống

Thông thường đối với nấm sợi, để cấp giống thực hiện quá trình lên men người ta dùng cấp giống bằng bào tử hoặc cấp giống cấp 2 ngay sau khi bào tử đã phát triển thành hệ sợi Lượng giống khi cấp vào dịch lên men phải có mật độ phù

hợp đối với từng chủng Nếu lượng giống cấp vào quá cao thì tốn nhiều giống và chưa chắc hiệu quả đã tốt, nếu lượng giống cấp vào quá thấp thì lãng phí môi trường lên men, lên men kéo dài dẫn đến hiệu suất tổng hợp chitinase không tốt [48]

1.2.3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của chủng Nhiệt độ từ 28-32oC là tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số chủng, nhiệt độ tối đa dưới 50oC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp có thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí có thể giết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế

1.3 Chitin

1.3.1 Nguồn gốc của Chitin

Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/m2

bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin được tìm thấy ở hai nguồn động vật và thực vật

Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [3]

Bảng 1.1 Tỷ lệ chitin trong các loài khác nhau

Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp

vỏ của một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn

Trong giới thực vât, chitin có ở thành tế bào nấm và một số tảo Chlorophiceae Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ ngoài của loài nấm

mà nó còn được liên kết với những thành phần khác Lượng chitin được tinh chế từ một số loài nấm thông thường từ 3% -5%

Trong giới động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vậy vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng

Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ vỏ cua và tôm

1.3.2 Cấu tạo của chitin

Chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N- axetyl- β- D- glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glucoside

Chitin có công thức phân tử (C8H13O5)n , còn gọi là glucosamine Trong đó có chứa 47,29 % C; 6,45% H; 39,37% O và 6,89% N

β-1,4-poly-N-axetyl-D-Phân tử lượng: Mchitin= (203,09)n

Hình 1.2.Công thức cấu tạo của chitin

Trong tự nhiên cấu trúc bậc 1 chitin tồn tại dưới 3 dạng là α-chitin,β-chitin

và γ- chitin, sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp các chuỗi Trong thực tế chitin tồn tại chủ yếu dưới dạng α-chitin α-chitin có cấu trúc mạng tinh thể rất chặt chẽ do các mắt xích sắp xếp đảo chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng, nên ngoài liên kết hydro trong cùng một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững Đây cũng là dạng phổ biến trong tự nhiên Ở chuỗi β-chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, còn ở

chuỗi γ-chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều sole với một chuỗi ngƣợc chiều trong cấu trúc Ở cấu trúc β-chitin và γ-chitin giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn [31]

Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên sao cho phần đầu của mũi tên chỉ nhóm –CH2OH, phần đuôi chỉ nhóm –NHCOCH3, thì các cấu trúc α, β, γ-chitin đƣợc mô tả nhƣ sau:

Hình 1.3 Các kiểu sắp xếp trong mạch đại phân tử của chitin

Các chuỗi bậc 1 liên kết với nhau thông qua các liên kết hydro tạo ra cấu trúc bậc 2, các vi sợi liên kết với nhau hình thành sợi lớn hay các tấm tạo cấu trúc bậc 3 Cấu trúc bậc 4 đƣợc tạo thành do các phân tử protein bao quanh các vi sợi gọi là tấm chitin- protein

1.4 N-Acetyl-D- glucosamin (GlcNAc)

Là một hoạt tính sinh học có tiềm năng trong chữa trị một số loại bệnh Acetyl-D-glucosamin có thể tạo ra từ quá trình thủy phân chitin bằng axit hoặc hệ enzyme chitinase

N-1.4.1 Cấu tạo của N-Acetyl-D- glucosamin

Hình 1.4 Cấu tạo của N-Acetyl-D- glucosamin

N- Acetyl- D- glucosamin tên gọi khoa học là: glucopyranose; N-Acetyl-β-D- glucosaminide; N-acetylchitosamine

2-acetoamido-2-deoxy-D-Công thức phân tử: C8H15O6N

N-Acetyl-D-glucosamin tham gia trong thành phần cấu tạo nên glycoprotein,proteoglycan và glycosaminoglycan- những hợp chất có vai trò tái tạo

mô liên kết và ngăn chặn các phản ứng viên trong cơ thể

N-Acetyl-D-glucosamin là các đơn vị tạo thành chitin, một loại polimer tự nhiên không độc có nhiều thứ 2 trong tự nhiên sau cellulose

1.4.2 Tính chất của N-Acetyl-D- glucosamin

Phân tử lượng: 221,21g/mol

Điểm nóng chảy: 201 -210o

C Tan được trong nước: 0,1g/ml

N-Acetyl-D-glucosamin được tổng hợp trong cơ thể do đó nó không độc hại với cơ thể, không gây rối loạn tiêu hóa

N-Acetyl-D-glucosamin (GlcNAc) là thành phần cấu tạo nên axit Hyaluronic

và thúc đấy quá trình sinh sản chodroitin- đây là 2 thành phần chính cấu tạo nên sụn khớp ở gối, tay, bả vai, xương chậu…Sự thiếu hụt N-Acetyl-D-glucosamin ngày càng tăng theo thời gian và độ tuổi Điều này gây khó khăn cho sự vận động các khớp [12]

1.4 3 Ứng dụng của N-Acetyl-D- glucosamin [12]

Glucosamin là một amino-mono-saccharid có nguồn gốc nội sinh, là một thành phần giúp tổng hợp glycosaminoglycan cấu tạo nên mô sụn trong cơ thể Glucosamin được tổng hợp bởi cơ thể nhưng khả năng đó giảm đi theo tuổi tác Glucosamin trên thị trường có nguồn gốc từ vỏ tôm cua, động vật biển và có 3 dạng glucosamine dùng trong điều trị là glucosamin sulfat, glucosamin hydrochorid và GlcNAc, trong đó GlcNAc được cho là có hiệu quả nhất

“N” trong N-Acetyl- glucosamin là nhóm amin (NH2) trong glucosamin đã được acetyl hóa (COCH3) Đây là phương pháp được thực hiện theo một quy trình chặt chẽ nhằm mục đích không làm mất đi nhóm acetyl, giữ cho phân tử có cấu trúc tương tự như glucosamine trong cơ thể người Do vậy, GlcNAc nhanh chóng được hấp thụ và bổ sung vào sụn khớp mà không cần thông qua xử lý hay liên kết với cấu trúc nào khác

GlcNAc trị đau khớp hiệu quả, tăng sức mạnh liên kết cơ -gân- sụn khớp, phòng ngừa và làm chậm quá trình thoái hóa khớp, giúp các khớp gối, tay, chân, bả vai, xương chậu vận động dễ dàng hơn, hỗ trợ chống lão hóa và giữ ẩm cho da và cải thiện trí nhớ (tính năng này đang trong quá trình nghiên cứu)

GlcNAc đã được sử dụng rộng rãi ở Mỹ và Nhật bản như một lựa chọn hàng đầu cho điều trị bệnh thoái hóa khớp

PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Giống vi sinh vật

Các chủng nấm mốc Trichoderma harzianum 34A, Penicillium oxalicum và

vi khuẩn Bacillus licheniformis SD2, Baccillus cereeusMD2-1, Bacillus

licheniformis 23, Bacillus licheniformis 213.do phòng thí nghiệm, Bộ môn Công

nghệ sinh học, Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội cung cấp

2.1.2 Hóa chất

- K2HPO4 ( Trung Quốc )

- KH2PO4 ( Trung Quốc )

- MgSO4.7H2O ( Trung Quốc )

- NaCl ( Trung Quốc )

- KCl ( Trung Quốc )

- CaCl2 ( Trung Quốc )

- Chitin (Việt Nam)

- NaNO3 ( Trung Quốc )

- FeSO4 ( Trung Quốc )

- Saccaroza (Việt Nam)

- Potato extra ( Trung Quốc )

- Agar (Việt Nam)

- Cao nấm men ( Trung Quốc )

Ngoài ra còn sử dụng một số hóa chất khác như: Ethanol, Axit axetic, Axit Clohidric… trong quá trình nghiên cứu

2.1.3 Dụng cụ

Bao gồm những dụng cụ sau:

- Bình tam giác các kích cỡ khác nhau (100ml, 250ml, 500ml)

- Ống nghiệm, phancol, eppendof

Thiết bị Nhãn hiệu Thiết bị Nhãn hiệu

Tủ ấm ổn nhiệt Trung quốc

2.1.5 Môi trường

2.1.5.1 Môi trường nhân giữ giống

Môi trường PDA: giữ giống nấm

2.1.5.3 Môi trường MS chitin cơ bản (môi trường lên men)

2.2.1 Phương pháp giữ giống

Chuẩn bị môi trường PDA có các thành phần như đã nêu ở mục [2.1.5.1] Môi trường được chia vào các ống nghiệm, sau đó được đem đi thanh trùng ở ở 121o

C trong 20 phút, lấy ra để nguội tạo môi trường thạch nghiêng Thực hiện trong tủ cấy: Cấy bào tử chủng nấm nghiên cứu lên bề mặt thạch trong ống nghiệm Để ống vừa cấy vào tủ nuôi ở nhiệt độ 30o

C trong thời gian 6 ngày,sau đó giữ tủ giữ giống ở 4oC Sau 1 tháng cấy chuyển một lần và được hoạt hóa trước khi nhân giống

2.2.2 Phương pháp hoạt hóa giống

Chuẩn bị môi trường czapeck có các thành phần như đã nêu ở mục [2.1.5.2] Dùng giống trong thạch nghiêng, cho 10ml nước muối sinh lý 0,9% có bổ sung tween 80 đã thanh trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cầy nhẹ trên bề mặt thạch nghiêng để lấy hết bào tử tạo dạng huyền phù Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hồng cầu Sau đó pha loãng mẫu để cấp giống cho môi trường hoạt hóa với nồng độ 20.104 tế bào/ml, dùng pipet hút 1ml mẫu đã pha loãng vào mỗi bình tam