Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza của một số chủng vi khuẩn phân lập được từ đậu tương lên men

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hóa sinh trường đại học Dược Chicago Mỹ và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng thủy phân fibrin nguyên nhân chính gây đông máu

-

ĐINH THỊ THU TRANG

ĐỀ TÀI:NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA ENZYM FIBRINAZA CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ ĐẬU TƯƠNG LÊN MEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS.NGUYỄN LAN HƯƠNG

HÀ NỘI - 2010

Mục lục

Mục lục 1

Lời mở đầu 6

Chương I 8

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

I.1 Fibrin 8

I.1.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thể 8

I.1.2 Cơ chế phân hủy Fibrin trong cơ thể người 12

I.2 Enzym fibrinaza………14

I.2.1 Cấu tạo và tính chất 14

I.2.2 Cơ chế tác động của Fibrinaza 15

I.3 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme Fibrinaza 16

I.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzym Fibrinaza trên thế giới và tại Việt Nam 20

I.5 Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp 22

I.5.1 Vector tách dòng 22

I.5.2 Tế bào chủ 24

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

II.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng 26

II.1.1 Chủng vi khuẩn 26

II.1.2 Vector pET22b(+) 26

II.1.3 Môi trường 27

II.1.4 Hóa chất 28

II.1.5 Thiết bị sử dụng 28

II.2 Phương pháp nghiên cứu 29

II.2.1 Phương pháp vi sinh vật 29

II.2.3 Phương pháp hóa sinh 31

II.2.4 Điện di DNA trên gel agarose 34

II.2.6 Phương pháp khuyếch đại DNA bằng phản ứng chuỗi polymerase

(Polymerase Chain Reaction- PCR) 36

II.2.7 Xử lý DNA bằng enzyme giới hạn 39

II.2.8 Ghép nối DNA 40

II.2.9 Biến nạp vector tái tổ hợp và tế bào vi khuẩn E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt 41

II.2.10 Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid 42

II.2.11 Kiểm tra plasmid mang sản phẩm PCR mong muốn 44

Chương III 45

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

III.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp fibrinaza 45

III.2 Định tên chủng vi khuẩn nghiên cứu 48

III.3 Nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza 52

III.3.1 Tách DNA của vi khuẩn 52

III.3.2 Nhân đoạn gen mã hóa enzym fibrinaza 53

III.3.3 Xử lý sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn 55

III.3.4 Ghép nối gen mã hóa enzym fibrinaza và vector pET-22b(+) 56

III.3.5 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E coli bằng phương pháp sốc nhiệt .57

III.3.6 Chọn lọc dòng pET-22b(+) mang gen mã hóa fibrinaza .58

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62

Danh mục các kí hiệu và chữ cái viết tắt

PCR Phản ứng dây chuyền polymerase

(Polymerase Chain Reaction)

hoạt hóa plasminogen mô)

(Chất hoạt hóa urokinase)

Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo của vector pET-22b(+)

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen

Bảng 2.3 Chế độ nhiệt cho phản ứng PCR

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng xử lý plasmid bằng enzym giới hạn

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng xử lý sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn

Bảng 3.1 Khả năng lên men của các chủng nghiên cứu

Bảng 3.2 Hoạt lực của enzym tách chiết được từ các chủng bằng phương pháp đo vòng thủy phân và phương pháp so màu

Bảng 3.3 Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng

Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu

Hình 3.2 Kết quả định tên bằng bộ Kit API 50CHB của 3 chủng T19, T21 và T23 Hình 3.3 DNA tổng số của M1

Hình 3.4 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza của chủng M, T19, T21

và T23

Hình 3.5 Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa fibrinaza của chủng M1

Hình 3.6 Kết quả xử lý bằng enzym giới hạn

Hình 3.7 Kết quả tinh sạch plasmid

Hình 3.8 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli

Hình 3.9 Chọn dòng pET-22b(+) mang gen ngoại lai mã hóa enzym fibrinaza Hình 3.10 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza bằng phương pháp xử lý enzyme giới hạn

Hình 3.11 Kiểm tra vector tái tổ hợp mang gen mã hóa enzyme fibrinaza bằng kỹ thuật PCR

Lời mở đầu

Trong những năm gần đây, bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch, cứ 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và cứ 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ [46] Nguyên nhân chính của các căn bệnh này do sự mất cân bằng giữa hai quá trình: quá trình đông tụ máu và quá trình hòa tan các cục máu đông, do trong cơ thể có tới hơn 20 loại enzym gây đông máu nhưng chỉ có mỗi một loại duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông là plasmin [34]

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hóa sinh trường đại học Dược Chicago (Mỹ) và các cộng sự đã phát hiện ra một loại enzym có khả năng thủy phân

fibrin (nguyên nhân chính gây đông máu) do vi khuẩn Bacillus trong quá trình lên

men đậu tương tiết ra Đó chính là enzym fibrinaza, enzym này được chiết xuất từ đậu tương lên men truyền thống của Nhật Bản - Natto nên còn được gọi là Nattokinase

Ở nước ta, theo thống kê của Bộ y tế tại các bệnh viện trong cả nước những năm gần đây cho thấy, tỷ lệ mắc và tỷ lệ tử vong của các bệnh tim mạch khá cao Một số hãng dược phẩm nước ngoài của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một

số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Nattokinase, NattoK, Fibrinaza… tuy nhiên các sản phẩm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam

Tính đến nay trên thế gới đã có nhiều nghiên cứu đi sâu vào lựa chọn các chủng vi sinh vật sinh enzym fibrinaza cũng như nghiên cứu đặc điểm của enzym này Bên cạnh đó để thu được enzym fibrinaza có hoạt lực cao việc nghiên cứu để tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza là rất cần thiết Tuy nhiên ở nước ta các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc phân lập và tối ưu điều kiện sinh trưởng của một số chủng sinh tổng hợp enzym fibrinaza, chưa có một nghiên cứu nào về tạo chủng tái tổ hợp của enzym này Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương dồi dào đây là điều kiện thuận lợi để chúng ta tiến hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiệu Việt Nam

Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài ”Nghiên cứu tách dòng gen mã hóa enzym fibrinaza của một số chủng vi khuẩn phân lập từ đậu tương lên men”

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I 1 Fibrin

Fibin là một loại protein dạng sợi được polyme hóa để tạo thành dạng lưới bao quanh vết thương có tác dụng cầm máu Nó được tạo thành từ chất tạo tơ huyết hay còn gọi là fibrinogen nhờ sự hoạt động của thrombin Khi đó, fibrin được tạo thành

sẽ liên kết với nhau bởi nhân tố VIII để tạo thành các cục máu Ngoài ra, fibrin còn tham gia vào một số quá trình sinh học trong cơ thể như: truyền tín hiệu, đông tụ máu trong mạch máu và polyme hóa protein…[34]

Hình 1.1: Các sợi fibrin làm đông tụ máu [44]

I.1.1 Cơ chế hình thành fibrin trong cơ thể

Khi cơ thể bình thường fibrin tồn tại ở dạng tiền chất không có hoạt tính, đó là dạng fibrinogen Khi cơ thể bị tổn thương, dạng tiền chất fibrinogen hòa tan trong máu sẽ được chuyển hóa thành fibrin không hòa tan trong máu tạo nên cục máu đông bịt kín chỗ tổn thương một cách vững chắc Quá trình này có sự tham gia của

các thành phần gây đông máu có trong huyết tương theo hai con đường nội sinh và ngoại sinh

Fibrinogen là một loại glycoprotein 340-HD được sinh tổng hợp ở gan và có nồng độ khoảng 1,5 ÷4,0 g/l trong huyết tương Do đó đối với những người bệnh suy gan hoặc mắc các bệnh về di truyền liên quan đến gen ở nhiễm sắc thể số 4 có thể dẫn đến việc giảm nồng độ và chất lượng fibrinogen gây ra bệnh trầm kha về máu Fibrinogen đóng vai trò chính trong việc tạo cầu nối các sợi tơ huyết bằng việc kết hợp các protein bề mặt GbIIb/IIIa của chúng lại với nhau và hình thành fibrin để cầm máu [34]

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng 6 cặp chuỗi polypeptit (chuỗi alpha, beta và gramma) Trên chuỗi alpha và beta có một trình tự peptit ngắn được gọi là fibrinopeptit Chính các chuỗi peptit ngắn này cản trở việc fibrinogen bị polyme hóa bởi chính nó một cách tùy tiện [34]

™ Một số yếu tố chính tham gia vào quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin

- Nhóm yếu tố tiếp xúc: gồm các yếu tố XI, XII, prekallikrein Các yếu tố thuộc nhóm này hoạt động không cần sự có mặt của ion Ca2+ cũng như vitamin K

- Nhóm yếu tố prothrombin: gồm các yếu tố II, VII, IX, X Đặc điểm chung của

nhóm này là cần sự có mặt của vitamin K để các yếu tố này gắn được với ion Ca

- Nhóm fibrinogen: gồm fibrinogen, V, VIII, XIII Nhóm này chịu tác dụng của

thrombin, kém bền vững

Tên của một số yếu tố chính tham gia vào quá trình đông máu:

+ Yếu tố I: fibrinogen

+ Yếu tố 2: prothrombin

+ Yếu tố 3: throboplastin của mô

+ Yếu tố IV: ion Ca2+

+ Yếu tố VII: proconvertin

+ Yếu tố VIII: globulin A

+ Yếu tố IX: globulin B

+ Yếu tố X: Stuart – Power

+ Yếu tố XI: globulin C

+ Yếu tố XII: Hageman

+ Yếu tố XIII: ổn định fibrin

Quá trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin được mô tả dưới hình sau:

Hình 1.2 Quá trình hình thành fibrin

™ Quá trình hình thành fibrin trong cơ thể diễn ra theo 3 giai đoạn:

- Giai đoạn tạo thành phức hợp prothrombinase: đây là quá trình phức tạp và

kéo dài nhất thông quá 2 cơ chế nội sinh và ngoại sinh tạo ra phức hợp prothrombinase Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thương thành mạch hoặc các mô kế cận Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chấn thương máu hoặc máu lấy ra ngoài cơ thể từ lòng mạch

+ Cơ chế ngoại sinh: khi mạch máu bị tổn thương, máu tiếp xúc với vị trí bị tổn thương Mô ở vị trí bị thương sẽ giải phóng ra yếu tố III và phospholipids Yếu

tố III, IV cùng yếu tố VII và phospholipids mô sẽ hoạt hóa yếu tố X tạo yếu tố X hoạt hóa (Xa)

Yếu tố Xa cùng với yếu tố V, phospholipids mô và ion Ca2+ tạo thành phức hợp prothrombinase Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca2+ làm cầu nối giữa các yếu tố

+ Cơ chế nội sinh: đồng thời khi máu tiếp xúc với vị trí bị tổn thương sẽ làm hoạt hóa yếu tố XII và tiểu cầu làm giải phóng ra phopspholipid Yếu tố XII hoạt hóa yếu tố XI, yếu tố XI sẽ hoạt hóa yếu tố IX Yếu tố IX cùng với phopspholipid tiểu cầu và ion Ca2+ sẽ hoạt hóa yếu tố X Yếu tố X hoạt hóa cùng với yếu tố V, phospholipids, Ca2+ sẽ tạo thành phức hợp prothrombinase

Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh chậm hơn rất nhiều (1-6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây)

- Giai đoạn tạo thành thrombin: prothrombinase theo cơ chế nội sinh và ngoại

sinh cùng với ion Ca2+ sẽ xúc tác cho phản ứng chuyển prothrombin thành thrombin

- Giai đoạn tạo thành fibin: thrombin sau khi được hình thành đã chuyển

fibrinogen thành fibrin đơn phân Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi Một mạng lưới fibrin đã hình thành và được ổn định nhờ yếu tố XIII Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca2+ Các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu đông

I.1.2 Cơ chế phân hủy Fibrin trong cơ thể người

Trong cơ thể người, fibrin có thể được thủy phân bởi plasmin Plasmin là một enzym phân hủy protein, chúng có tác dụng làm tan các sợi fibrin và làm tan các chất khác có tác dụng gây đông máu như fibrinogen, yếu tố V, VIII hay prothrobin

Do đó khi plasmin được hình thành bên trong cục đông máu nó có thể làm tan cục đông, đồng thời làm giảm khả năng đông máu Vì vậy, quá trình này cho phép dọn sạch những cục máu đông hình thành ở các mô trong một số ngày

Khi cơ thể bình thường thì plasmin tồn tại ở dạng không hoạt động là plaminogen Chỉ khi tế bào mạch bị tổn thương cơ thể sẽ giải phóng chất hoạt hóa plasminogen để chuyển hóa plasminogen thành plasmin, hoạt hóa hệ thống thủy phân fibrin Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzym duy nhất chuyển chất xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính

- Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA): chất này là sản phẩm chính của thận, có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu Bởi vậy chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết thanh Chất hoạt hóa plasminogen urokinase chỉ có thể hoạt hóa plasminogen khi có mặt của fibrin Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7 µg/ml [28]

- Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen activator, tPA): chất này có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu Ở người và động vật khác, tPA đóng vai trò quan trong trọng hệ thống tiêu hủy fibrin [37, 38] Đối với các trường hợp mắc bệnh khối huyết, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành khối huyết, nên tránh được tình trạng phân huyết ở những vùng khác trong cơ thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [26]

- Cuối cùng là enzym phân hủy tơ máu fibrinaza: được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa

Trong cơ thể có hơn 20 loại enzym gây đông máu nhưng chỉ có duy nhất plasmin có khả năng phá vỡ cục máu đông Đồng thời, sự có mặt của vi khuẩn, virus, nấm mốc và các độc tố ở trong máu cũng tạo ra liên kết chồng chéo quá tải của fibrin Khi không có hiện tượng mất máu hoặc các vết thương hở, các sợi fibrin liên kết chéo này sẽ luân chuyển trong máu và dính vào thành mạch máu, làm giảm

sự vận chuyển lưu thông máu, đồng thời làm tăng độ nhớt của máu gây ra huyết áp cao Những cục máu đông trong tim người làm cản trở sự vận chuyển máu tới các

mô cơ tim Nếu dòng máu bị chặn lại, khả năng cung cấp oxy tới các mô này sẽ bị cắt giảm một cách cục bộ (gây ra thiếu máu cục bộ), nguyên nhân chính gây ra các cơn đau thắt tim hoặc nhồi máu cơ tim Nếu hiện tượng này kéo dài có thể gây tử vong Các cục máu có mặt trong tim có thể ảnh hưởng tới não, tạo ra sự thiếu máu

và oxy từng phần, thường gặp ở những người có tuổi Như vậy sự tích tụ fibrin ở thành mạch máu tạo ra các cục máu làm tăng các chứng bệnh nghẽn mạch máu, gây

ra các bệnh về tim mạch đặc biệt quan trọng Người ta đã sử dụng những chất hoạt hóa như là một loại thuốc để chuyển hóa tạo tơ huyết thành plasmin có tác dụng phân hủy fibrin trong máu Tuy nhiên, những loại thuốc này đều rất đắt tiền và không hiệu quả trực tiếp Bản thân tPA và uPA cũng bị ức chế việc hoạt hóa tạo plasmin Hơn nữa, các chất chống plasmin cũng đã được tìm thấy là α2-macroglobulin ức chế quá trình thủy phân fibrin làm giảm hoạt lực của plasmin [10] Như vậy, quá trình phân hủy fibrin trong cơ thể người phụ thuộc rất nhiều và khả năng tạo các chất hoạt hóa plasmin Những chất này kích thích việc hình thành plasmin Tuy nhiên, sự có mặt của plasmin chưa đảm bảo cho việc phân giải fibrin cũng như các cục máu đông hiệu quả bởi có rất nhiều các chất kìm chế quanh nó, đặc biệt là trong cơ thể người già, khi mà các chất kích thích cho quá trình chuyển hóa tạo thành plasmin thì ít mà các chất ức chết hoạt lực plasmin thì nhiều [10]

Do vậy, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu các chất có khả năng phân hủy fibrin, làm tan các cục máu đông Một trong số đó là enzym fibrinaza - enzym

có khả năng thủy phân trực tiếp fibrin

I.2 Enzym fibrinaza

I.2.1 Cấu tạo và tính chất

Năm 1980, tiến sĩ Hiroyuki Sumi tại khoa hóa sinh trường đại học dược Chicago (Mỹ) và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để tìm ra hợp chất tự nhiên

có tính chất làm giảm chứng nghẽn mạch gây ra nhồi máu cơ tim Ông đã phát hiện

ra enzym thủy phân fibrin (fibrinaza) do vi sinh vật sinh ra và công trình được công

bố đầu tiên vào năm 1987 Cho đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về enzym fibrinaza và một trong số các nghiên cứu ấy đã chỉ ra rằng: enzym fibrinaza

có hoạt tính thủy phân fibrin cao gấp 4 lần enzym plasmin trong cơ thể

Enzym fibrinaza là một loại proteaza có khả năng tương tự như plasmin trong việc làm tan các cục đông máu loại fibrin trong huyết tương – nguyên nhân chính gây ra hiện tượng tắc mạch máu Fibrinaza được chiết xuất từ một loại thực phẩm lên men truyền thống của Nhật Bản có tên là natto nên còn có tên là nattokinase

Hình 1.3 Cấu trúc vòng xoắn của fibrinaza [44]

Fibrinaza là enzym ngoại bào, có khối lượng M = 27,4 – 44 kDa [44]

Điểm đẳng điện pI = 8,6

Theo nghiên cứu của Kim W và các cộng sự năm 1996, pH tối ưu cho hoạt tính thủy phân fibrin của fibrinaza trong khoảng từ 7 đến 12 và hoạt tính của enzym giảm rất nhanh ở pH nhỏ hơn 6,0 và lớn hơn 11 Enzym bền trong dải pH từ 7 đến 10,5 và thích hợp nhất là ở pH là 7,4 [20]

Kim W và các cộng sự (1996) cũng đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền vững của enzym thủy phân fibrin Dải nhiệt độ thử nghiệm là từ 10oC đến 80oC Nhiệt độ thích hợp cho độ bền của enzym là dưới 40oC

Ở nhiệt độ trên 40oC hoạt lực của enzym giảm rất nhanh Theo một số nghiên cứu khác, hoạt tính enzym cao nhất trong khoảng nhiệt độ từ 30oC đến 40oC và nhiệt độ tối ưu là 37oC [20]

Cũng theo một số nghiên cứu, hoạt lực của enzym fibrinaza tăng khi môi trường có tồn tại ion Ca2+ Deepak V đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ion

Ca2+ và thu được hoạt lực fibrinaza lớn nhất tại nồng độ 0,5g/l [13]

Fibrinaza không chỉ thủy phân fibrin mà còn có khả năng phân hủy cả cơ chất plasmin H-D-Val-Lcu-Lys-pNA (S-2251) (cơ chế tổng hợp) – một chất nhạy cảm với enzym hơn các cơ chất khác nhau [27]

I.2.2 Cơ chế tác động của Fibrinaza

Fibrinaza có thể làm tan những protein loại fibrin trong huyết thanh người một cách trực tiếp Sự tác dụng của fibrinaza theo ba con đường:

- Con đường A, bản thân nó cản trở sự hình thành các cục máu và làm tan các cục máu đông (bản chất là fibrin) đã tồn tại trong huyết thanh người

- Con đường B, fibrinaza kích thích tạo thành enzym urokinase từ tiền tố prourokinase Urokinase sẽ tạo nên các phân tử plasminogen rồi hình thành nên enzym plasmin, và enzym plasmin sẽ thủy phân fibrin

- Con đường C, fibrinaza kích thích tạo thành các tiền tố t-PA, tiền tố này là tác nhân hoạt hóa enzym plasmin [27]

Ngoài ra enzym fibrinaza còn có khả năng ngăn chặn sự sinh ra của các chất

ức chế hoạt hóa enzym plasmin.Theo một số nghiên cứu, fibrinaza có hoạt tính cao gấp 4 lần enzym plasmin

Hình 1.4: Cơ chế phân hủy fibrin của fibrinaza [10]

Hoạt tính sinh học của fibrinaza đã được nhiều nghiên cứu ứng dụng trên động vật và người chứng minh Người ta đã đo được các chỉ số về hoạt độ phân giải fibrin của euroglobulin và hàm lượng sản phẩm phân giải fibrin (FDP) tăng lên, đồng thời hàm lượng kích thích tố của plasminogen tPA được giải phóng trong tế bào màng trong của thành mạch và ở tế bào gan cũng tăng lên khi có mặt fibrinaza [10]

I.3 Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme fibrinaza

Các vi sinh vật có khả năng tạo ra enzym thủy phân cơ chất fibrin bao gồm vi

khuẩn, xạ khuẩn và tảo Streptomyces megasporus SD5, được phân lập từ suối nước

Thrombin

t-PA

Fibrin degration product (FDP) A

B

C

nóng có thể cho enzym fibrinaza có khả năng chịu nhiệt Một số loại nấm cũng cho

thấy có thể sinh ra proteaza có hoạt tính fibrinaza cao, ví dụ như Aspergillus

ochraceus 513, Fusarium oxysporum, Penicillum chrysogenum, Rhizopus chinesis

12,… Ngoài ra Matsubara cùng các đồng sự (1998, 1999, 2000) đã tìm thấy hoạt

tính fibrinaza trong tảo biển Codium divaricatum và Codium intricatum [27]

Bảng 1.1: Vi khuẩn Bacillus sp phân lập được từ một số thực phẩm

lên men truyền thống [27]

Nattokinase Subtilisin DEF

CK Subtilisin DJ-4 bpDJ-2

Enzym joet-gal QK-1 và QK-2

Vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất về khả năng sinh enzym fibrinaza đó

là loài Bacillus Loài Bacillus tổng hợp ra fibrinaza đã được tìm thấy lần đầu tiên

bởi Sumi và cộng sự vào năm 1987 từ natto Tương tự một số vi khuẩn khác được

phát hiện có khả năng sinh tổng hợp fibrinaza, chúng bao gồm Bacillus

amyloliquefaciens DC-4 từ một loại thực phẩm làm từ đậu tương lên men có xuất sứ

từ Trung Quốc tên là douche, Bacillus sp CK từ nước chấm đậu nành lên men của Hàn Quốc có tên là chungkook-jang, các chủng Bacillus sp DJ-2 và DJ-4 từ món doen-jang và Bacillus sp KA38 từ cá muốn lên men có tên là jeot-gal cũng của

Hàn Quốc [27]

Các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp fibrinaza đều được phân lập từ đậu tương lên men như natto, douchi hay chungkook-jang

Ở Việt Nam, tương là sản phẩm lên men truyền thống từ đậu tương rất được ưa chuộng, Đã có nghiên cứu của Đặng Thu Hương và Nguyễn La Anh (2005) về các chủng vi khuẩn phân lập từ Tương Bần có hoạt tính fibrinaza Nguyễn Lan Hương

và cộng sự đã phân lập được 11 chủng vi khuẩn có hoạt tính fibrinaza cao từ tương, natto và chao

Dưới đây là đặc tính của một số enzym fibrinaza được sinh tổng hợp từ vi sinh vật (bảng 1.2)

Bảng 1.2 Đặc tính của một số enzym fibrinaza sinh tổng hợp từ vi sinh vật [27]

Enzym Khối lượng phân

tử, pI, nhiệt độ tối

ưu

pH, nhiệt độ ổn định (t)

Cơ chất tốt nhất là subtilisin, không phân hủy đông máu

10 T= 70

pH= 7 ÷ 10,5 t<50 trong 60 phút

Cơ chất plasmin hoạt tính cao gấp 8 lần fibrinaza của subtilisin Carlsberg

Subtilisin

DJ4

M=29kDa; pH=10, t=40

pH= 4 – 11 nhiệt độ phòng

Hoạt tính fibrinaza cao gấp 2,2 lần của subtilisin BPN

trong 48 giờ Subtilisin

QK-2

M=28kDa; pH 8,5;

t=55

pH= 3 -12; t=40 trong 30 phút

Hoạt tính mạnh hơn với

Ưu tiên thủy phân chuỗi

Aα fibrinogen trước chuỗi Bβ và γ

Có giá trị Km thấp khi phân giải fibrin

Phân giải fibrin cũng đồng thời phân chia các chuỗi α, β và γ của fibrinogen

SW – 1 M= 30kDa, pI= 8,5;

pH=8

pH= 4 – 9; t=4-37 Phân giải trực tiếp fibrin

Ở Việt Nam, tỷ lên người mắc bệnh tim mạch ngày càng gia tăng nên một số hãng dược của Mỹ và Nhật Bản đã đưa ra thị trường một số sản phẩm chứa enzym fibrinaza như: Nattokinase, NattoK, Fibrinaza… tuy nhiên các sản phẩm này thường rất đắt so với thu nhập của người dân Việt Nam Hơn nữa, nước ta với nguồn đậu tương dồi dào và chúng ta cũng có tương là sản phẩm lên men truyền thống từ đậu tương, đây là điều kiện thuận lợi để chúng ta tiến hành các nghiên cứu nhằm tạo ra sản phẩm mang thương hiệu Việt Nam đáp ứng đầy đủ yêu cầu và thị hiếu của người tiêu dùng

I.4 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzym Fibrinaza trên thế giới và tại Việt Nam

Nghiên cứu về enzym fibinaza do vi sinh vật sinh ra có khả năng làm tan fibrin được công bố vào năm 1987 Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu khác nhau về khả năng cũng như ứng dụng của enzym này [27]

Enzym fibrinaza đã chứng tỏ là có tác dụng lâu dài hơn các thuốc chống đông máu khác từ 8 đến 12 giờ bởi hai cơ chế tác dụng: vừa ngăn ngừa sự đông máu và vừa làm tan các khối máu đã đông

Tiến sĩ H Sumi và các cộng sự của ông đã thực hiện một thí nghiệm trên chó

để chứng minh điều này Họ đã tạo ra các cục đông máu trong cơ thể chó và sau đó cung cấp một lượng enzym fibrinaza vào cơ thể chúng bằng được miệng Phim chụp X-quang của những thành mạch máu đã cho thấy những con chó đã được uống thuốc chứa fibrinaza đã trở lại tình trạng vận chuyển máu bình thường (không còn những cục máu đông) sau 5 giờ xử lý Trong khi đó, các cục máu đông trong cơ thể những con chó không được bổ sung fibrinaza vẫn hoàn toàn không có dấu hiệu hòa tan 18 giờ sau đó [33]

Các nhà nghiên cứu của phòng thí nghiệm nghiên cứu công nghệ sinh học thuộc công ty Dược phẩm JCR, Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm thành công về khả năng hòa tan các mạch máu nghẽn trong động mạch chuột bằng enzym fibrinaza Những con chuột được xử lý bằng enzym fibrinaza đã đạt được tốc độ dòng chảy của máu là 62% trong khi xử lý bằng plasmin chỉ đạt 15,8% [16]

Một nhóm các nhà nghiên cứu khác từ trường Đại học Oklahoma (Mỹ) và trường Dược Miyazaki (Nhật Bản) cũng làm những thử nghiệm về hoạt tính thủy phân fibrin trên 12 người tình nguyện viên khỏe mạnh (6 nam và 6 nữ ở lứa tuổi từ

21 đến 55) và cũng cho kết quả tương tự như các thí nghiệm đối với động vật [27] Đặc biệt, tại trường Đại học Tottori (Nhật Bản), người ta đã sử dụng enzym fibrinaza như là một loại thực phẩm chức năng để chữa các bệnh do chứng nghẽn mạch máu gây ra ở vùng đáy mắt Các bệnh nhân này đều đã bị mù sau khi các cục

máu đông cản trở sự luân chuyển máu và làm yếu các dây thần kinh của mắt Sau

10 ngày sử dụng enzym fibrinaza, các bệnh nhân này đã lấy lại được thị lực và không có một dấu hiệu bất thường nào được quan sát sau 2 tháng

Gần đây, một nhóm các nhà khoa học người Hàn Quốc và Thái Lan cũng có công bố tên một loại rau quả bản xứ của Thái Lan có chứa enzym thủy phân fibin Những loại rau này được đánh giá là có khả năng chống oxy hóa cao Từ kết quả đó,

họ đưa ra khuyến cáo cho người dân ở đất nước đang có tỷ lện những người mắc các bệnh về tim mạch gia tăng một cách nhanh chóng như Thái Lan nên bổ sung thực phẩm trong khẩu phần ăn hàng ngày tuy nhiên việc nấu rau chín quá 10 phút ở

Hiện nay trên thế giới, fibrinaza thường được sử dụng trong sản xuất thuốc chống các bệnh về đường thành mạch, thuốc bổ dưỡng chức năng chống lão hóa Công nghệ sản xuất fibrinaza tuân theo một quy trình sản xuất enzym chung từ khâu chuẩn bị giống, lên men, thu hồi tinh sạch, ổn định và bảo quản sản phẩm Thị trường Mỹ, Nhật và các nước phát triển đã chấp nhận và lưu hành thực phẩm chức năng dòng này Mới đây, các quốc gia phát triển ở Châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Singapor, Thái Lan cũng bắt đầu quan tâm đến lĩnh vực dược phẩm và thực

phẩm chức năng trong công nghệ sinh học này, tuy nhiên các nghiên cứu này cũng mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm [16]

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc bệnh tim mạch khá cao và có xu hướng tăng trong vài năm tới do sử dụng các thực phẩm ăn nhanh Hiện nay, một số sản phẩm thuốc của Việt Nam có bổ sung fibrinaza như Tuần Hoàn Não, Tây Thi, Tamado do công ty Dược Sao Thái Dương, hay Nattospec của Dược phẩm Á Âu, Nattotech của DETECH Tuy nhiên, nguồn enzym phần lớn vẫn nhập từ Mỹ và Nhật Bản với giá khá cao Do đó việc hoàn thiện nghiên cứu sản xuất fibrinaza từ nguồn vi sinh vật

có ý nghĩa rất lớn trong việc chủ động nguồn enzym dùng để sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng chứa fibrinaza có tác dụng hỗ trợ và phòng chống các bệnh tim mạch

I.5 Sử dụng kỹ thuật gen vào nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp

Các protein hay enzyme được tạo ra trong tế bào chỉ ở mức vừa đủ và cần phải được xử lý sau dịch mã, có vậy chức năng của protein mới được đảm bảo và sinh lý của tế bào hay sinh vật mới được duy trì ở trạng thái bình thường Do chỉ được tạo

ra với hàm lượng rất thấp nên việc tinh chế protein/enzym nội bào thường khó khăn, điều đó đưa giá thành sản phẩm lên rất cao

Một trong những liệu pháp để khắc phục sự thiếu hụt đó là sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp Công nghệ này về lý thuyết cho phép con người tạo ra bất cứ protein nào với một lượng không giới hạn

Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường là được tạo thành từ việc gắn những đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách dòng Những vector tách dòng mang DNA tái tổ hợp này có thể biểu hiện thành các protein tái tổ hợp trong các sinh vật

I.5.1 Vector tách dòng

- Khái niệm vector tách dòng

Vector tách dòng là các phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài các đoạn DNA cần thiết, có khả năng tái bản không phụ thuộc vào sự phân chia của tế bào, tồn tại trong tế bào vật chủ qua nhiều thế hệ không gây biến đổi bộ gen của vật chủ [4]

Vector tách dòng phải có nhiều điểm cắt đặc hiện duy nhất cho các loại enzym giới hạn khác nhau, đồng thời mang các gen chỉ thị (chỉ thị màu hoặc chỉ thị kháng sinh) để dễ dàng nhận biết các tế bào mang vector tái tổ hợp [4]

- Nguyên tắc chọn vector tách dòng

Tách dòng gen là một quá trình phức tạp, gồm nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau Chọn vector tách dòng thích hợp có vai trò quyết định sự thành công hay thất bại trong tách dòng gen Để đảm bảo tách dòng gen thành công, khi chọn vector tách dòng cần chú ý một số nguyên tắc:

Dựa vào kích thước và bản chất của đoạn DNA cần tách dòng làm căn cứ chọn vector Nếu đoạn cài DNA có nguồn gốc từ gen của sinh vật prokaryod có thể chọn plasmid, phage, comid, làm vector tách dòng, tùy thuộc kích thước của đoạn cài DNA Sử dụng đoạn cài DNA có nguồn gốc từ các gen sinh vật bậc cao cần chọn vector tách dòng là phage, nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men, virus [4]

Khi chọn vector tách dòng cần lưu ý đến sự tương đồng các vị trí cắt đặc hiệu của các enzym giới hạn giữa đoạn cài DNA và vector tách dòng Nghĩa là đoạn cài DNA và vector tách dòng phải có các vị trí cắt đặc hiệu của cùng một loại enzym giới hạn (để đảm bảo quá trình cắt và nối đoạn DNA vào vector tách dòng dễ dàng

và thuận lợi)

Vector tách dòng phải thích hợp với loại tế bào chủ, có khả năng tái bản trong tế bào chủ, tạo số lượng bản sao lớn nhưng không gây ảnh hưởng tới hoạt động của tế bào chủ Gen chỉ thị trong vector tách dòng càng dễ nhận biết càng tốt Các điểm cắt của enzym giới hạn hoặc vùng đa cắt nối MCS thường nằm trong các gen chỉ thị, giúp cho sự nhận biết và sàng lọc thể tái tổ hợp thuận lợi [4]

I.5.2 Tế bào chủ

Biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kỹ thuật quan trọng, quyết định sự thành bại của kỹ thuật gen Hệ thống các tế bào chủ thường được sử dụng trong biểu hiện gen gồm: tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men, tế bào trứng động vật có

vú và Baculovirus Trong đó phổ biến tế bào chủ phổ biến và ưa chuộng nhất trong biểu hiện gen đó là vi khuẩn E coli

Một số ưu điểm khi chọn E coli làm tế bào chủ:

- Vi khuẩn E coli có tốc độ sinh trưởng nhanh, khả năng biểu hiện protein tái

tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy ở điều kiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm gen cao từ 50mg/l đến 500mg/l

- Biểu hiện gen trong tế bào E coli có thể giảm được các chi phí cho công

nghệ và hóa chất, nên giá thành sản phẩm hạ

- Cấu trúc bộ gen E coli và các đặc điểm di truyền đã được biết tương đối đầy

đủ, tạo nên nhiều thuận lợi khi biểu hiện protein tái tổ hợp ở E coli

Có rất nhiều chủng vi khuẩn E coli được sử dụng trong biểu hiện gen, trong

đó chủng E coli BL21 là một trong những chủng E coli được ưa chuộng và sử

dụng rộng rãi để biểu hiện các loại gen khác nhau [4]

I.5.3 Các nghiên cứu về chủng tái tổ hợp

™ Gen mã hóa enzym fibrinaza

Theo Nakamura và cộng sự thì gen mã hóa enzym fibrinaza của chủng

Bacillus natto (aprN) có độ dài khoảng 1473 bp Trong đó vùng mang mã di truyền

bắt đầu bằng bộ ba mở đầu GTG, tiếp theo là khung đọc mã mở (ORF- Open reading frame) với 1143 nucleotid và cuối cùng là kết thúc bằng ba bộ ba TAA TAG TAA [25]

Đoạn gen này mã hóa cho chuỗi polypeptid gồm có 29 axit amin ở chuỗi tín hiệu, 77 axit amin ở chuỗi propeptid (dạng không hoạt động) và 275 axit amin ở chuỗi peptid (dạng hoạt động có hoạt tính enzym) [25]

™ Một số nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mã hóa enzym fibrinaza hiện có

Trong vài năm gần đây, trên thế giới, đặc biệt là các nước Châu Á đã có rất nhiều nghiên cứu nhằm tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa enzym fibrinaza Đoạn gen cần tách dòng thường được tách từ các chủng vi sinh vật phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống

Bảng 1 Một số nghiên cứu tạo chủng tái tổ hợp mang gen mã hóa fibrinaza

tham khảo

E coli JM109

và

B subtilis

WB600

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị sử dụng

II.1.1 Chủng vi khuẩn

Chủng vi khuẩn được chọn để tiến hành các thí nghiệm có:

- Chủng M1, N, V là những chủng vi khuẩn được phân lập từ Natto Nhật Bản

- Các chủng T16, T19, T21, T23, T26 là 5 chủng phân lập được từ tương Bần của Việt Nam

II.1.2 Vector pET22b(+)

Trong nghiên cứu này chúng tôi chọn pET22b(+) để chuyển gen vào Plasmid pET-22b(+) là một vector tách dòng đang được sử dụng phổ biến hiện nay Plasmid pET-22b(+) có kích thước 5493bp, thành phần cấu tạo của vector được thể hiện ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần cấu tạo của vector pET-22b(+)

Hình 2.1 Vector pET-22b(+)

II.1.3 Môi trường

™ Môi trường nhân giống

II.1.4 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng cho đề tài

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Fibin ICN-Mỹ

Các loại enzym giới hạn MBI Fermentas (Mỹ)

II.2 Phương pháp nghiên cứu

II.2.1 Phương pháp vi sinh vật

™ Quan sát hình thái khuẩn lạc

Lấy 15-20ml môi trường thạch vô trùng, để nguội đến 500C rồi đổ vào đĩa petri (thao tác vô trùng) Nếu có nước ngưng tụ trên nắp hộp cần úp ngược xuống để vào tủ ấm 30-370C để làm khô mặt thạch

- Lấy một vòng que cấy gạt 3-4 lần trên mặt thạch ở một góc Quay đĩa thạch sang hướng khác và ria cấy từ một vạch thành 3-4 đường khác sao cho không trùng với các đường trước Lặp lại theo một hướng thứ ba để pha loãng hơn nữa phần vi khuẩn dính trên que cấy

- Đặt vào nhiệt độ thích hợp trong 1-2 ngày để chọn ra các khuẩn lạc mọc riêng rẽ

- Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này từ các phía (từ trên xuống, từ bên cạnh), chú ý về kích thước, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng mép, bề mặt, độ dày, có núm hay không, độ trong, màu sắc (trên, dưới, có khuếch tán ra môi trường hay không)

™ Quan sát hình thái tế bào

Tiến hành quan sát hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram

- Nguyên tắc: phương pháp nhuộm Gram dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuối nhuộm tím kết tinh và iot mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau

- Loại phức chất thứ nhất vẫn còn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương

Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm

- Cách tiến hành:

Nhỏ 3µl nước cất vô trùng lên phiến kính sạch, dùng que cấy vô trùng lấy một phần nhỏ khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa petri cho vào giọt nước, dàn đều và để khô

Hơ phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 lần để cố định vết bôi Sau đó nhuộm với tím trong 1 phút, rửa nước Tiếp tục nhuộm với dung dịch lugol trong 1 phút rồi tráng nước Tẩy cồn 30 giây Cuối cùng nhuộm với fuchsin 1 phút rồi tráng nước, để khô

và tiến hành quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100x

Ly tâm 10000 vòng/phút ở 4 ºC Thu dịch enzyme thô

II.2.3 Phương pháp hóa sinh

II.2.3.1 Xác định hoạt tính bằng phương đo vòng thủy phân

™ Nguyên tắc:

Fibrin bị kết tủa bởi axít tricloaxetic (TCA), còn các sản phẩm thuỷ phân của axít thì không bị kết tủa, vì vậy khi fibrinaza thuỷ phân fibrin sẽ quan sát thấy vòng thuỷ phân trong trên nền trắng đục của hộp thạch có chứa fibrin khi đổ TCA vào

™ Tiến hành:

Lấy 30 ml môi trường fibrin 0,4% bằng ống đong bổ sung 0,6g agar ( 2%), đun bằng lò vi sóng (hoặc bếp) Đổ toàn bộ vào hộp petri nhựa, khi bề mặt thạch đã khô tiến hành đục lỗ, đường kính mỗi lỗ thạch là 7,5mm

Hút 100µl dịch enzym vào các lỗ thạch chú ý không được hút tràn ra ngoài.Sau đó để ở 37°C trong 18 giờ rồi lấy ra Đổ TCA láng một lớp trên bề mặt thạch Để 30 phút rồi đổ TCA trên bề mặt đi Đem quan sát đường kính vòng thuỷ phân Hoạt tính enzym được so sánh dựa trên đường kính, hoặc diện tích của vòng thuỷ phân

Kết quả :

Công thức tính diện tích vòng thuỷ phân:

S= 3,14* ( D2/4 – 7,52/4 ) (mm2)

Trong đó: D - đường kính vòng thuỷ phân (mm)

S - diện tích vòng thuỷ phân (mm2)

II.2.3.2 Xác định hoạt tính bằng so màu

™ Nguyên tắc:

Fibrinaza trong điều kiện thích hợp về nhiêt độ và pH (370C và pH= 7,4) sẽ phân cắt các fibrin không tan thành các phân tử peptit ngắn hơn, có khả năng hòa tan trong dung dịch

™ Chuẩn bị mẫu:

− Mẫu thí nghiệm:

Cho vào ống phacol 500µl dung dịch Fibrin và 1,3ml dung dịch đệm Tris-HCl Đặt trong bình ổn nhiệt ở 37ºC trong 10 phút Sau đó cho tiếp 200µl dung dịch enzym mẫu đã pha loãng (100 lần) Để phản ứng trong 1h ở 37ºC rồi thêm tiếp 1ml TCA

để đình chỉ phản ứng Đem li tâm lạnh với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 15 phút Hút lấy dịch trong để tiến hành so màu

− Mẫu kiểm chứng:

Cho vào ống phancol 500µl dung dịch fibrin và 1,3ml dung dịch đệm Tris-HCl

Để ở nhiệt độ 37ºC trong 10 phút rồi thêm 1ml TCA 1,5M Thêm tiếp 200µl dịch enzym mẫu đã pha loãng Để trong 10 phút rồi tiến hành tương tự như đối với mẫu thí nghiệm

™ Tiến hành so màu:

Lấy 1ml dịch trong đã ly tâm ở bước trên vào ống nghiệm sạch thêm vào 5ml

Na2CO3 0,5M khuấy đều liên tục và cho thêm 1ml thuốc thử folin 0,1M Để yên hỗn hợp phản ứng trong 20 phút Sau 20 phút tiến hành đo cường độ màu của dung dịch trên máy so màu ở bước sóng 660nm

™ Dựng đường chuẩn Tyrozin:

Muốn tính được hoạt độ của enzym fibrinaza phải xây dựng đường chuẩn theo tyrozin, rồi sau đó dựa theo đường chuẩn này mà tính đương lượng tyrozin, tức là mật độ quang có được của 1µg tyrozin trong 1ml dung dịch tyrozin chuẩn

Phương pháp và cách xây dựng đường chuẩn được thể hiện ở phụ lục Chúng tôi xác định được đường chuẩn để tính toán có công thức như sau:

y = 0,0152x +0,0093

Từ đường chuẩn đã xây dựng được và kết quả đo quang sẽ tính được hoạt độ của enzym như sau

60- Thời gian diễn ra phản ứng (phút)

Atn- Giá trị OD của mẫu thí nghiệm

Akc- Giá trị OD của mẫu kiểm chứng

0,2- lượng Enzym dùng phản ứng (ml)

0,0152- Độ tăng độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ứng với tăng nồng độ tyrosine 1 µg/ml

II.2.3.3 Định tên chủng vi khuẩn bằng kit API 50CHB của hãng bioMérieux

API 50 CHB được dùng để xác định Bacillus và các chi liên quan Bộ Kit này

là một môi trường pha sẵn cho phép lên men 49 carbonhydrat trên băng API 50 CHB đã được nghiên cứu Trong quá trình phản ứng, carbonhydrat sẽ được lên men tạo thành axit Æ làm giảm pH và thay đổi màu sắc chất chỉ thị Các kết quả sẽ cho biết các thông tin sinh hóa và sử dụng phần mềm nhận dạng để xác định tên chủng Thành phần môi trường API 50CHB (10ml)