Nghiên cứu sự đa dạng về trình tự ADN giống gen mã hóa enzym giới hạn giống haui ở các chủng loài microcystis aeruginosa

Thời gian gần Ďây, với sự phát triển nhanh chóng của tin sinh học Ďã cho phép dự Ďoán chức năng của enzym giới hạn dựa vào cấu trúc không gian ba chiều của nó, từ Ďó có thể tìm thêm nhiề

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ MAI PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ ADN GIỐNG GEN

MÃ HÓA ENZYM GIỚI HẠN GIỐNG HAUI Ở CÁC

CHỦNG LOÀI MICROCYSTIS AERUGINOSA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN HOA HỌC :

1 PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ

2 TS LÊ THỊ KIM TUYẾN

Hà Nội-2016

i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

LỜI CAM ĐOAN iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH VẼ vi

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Enzym giới hạn 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Lịch sử của enzym giới hạn 4

1.1.3 Phân loại enzym giới hạn 5

1.2 Enzym giới hạn-sửa Ďổi 6

1.3 Họ HauI 7

1.3.1 Giới thiệu về HauI 7

1.3.2 Khám phá in silico về các gen thuộc họ HauI 8

1.3.3 Giới thiệu về gen ORF8180 11

1.3.4 Giới thiệu về vùng TRD 13

1.4 Microcystis aeruginosa 15

1.4.1 Sinh thái 16

1.4.2 Các loại Ďộc tố 16

1.4.3 Tầm quan trọng sinh thái 17

1.4.4 Đa dạng di truyền của quần thể 17

1.5 Phương pháp phân tích sự Ďa dạng gen RFLP 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu 23

2.1.1 Nguyên liệu 23

2.2.2 Hóa chất và môi trường 23

2.2.3 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp 24

2.2.1 Chọn lọc in silico gen thuộc họ HauI 24

ii

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số 25

2.2.3 Khuyếch Ďại gen ORF8180 26

2.2.4 Tách sản phẩm PCR lần 1 trên gel agarose và thực hiện PCR lần 2 27

2.2.5 Tách dòng gen ORF8180 28

2.2.6 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào E coli 28

2.2.7 Kiểm tra E coli tái tổ hợp bằng PCR 29

2.2.8 Tách plasmid dùng Qiagen miniprep kit 30

2.2.9 Khuyếch Ďại Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD của gen ORF8180 30

2.2.10 Phân tích sự Ďa dạng trình tự Ďoạn mã cho vùng TRD bằng phương pháp RFLP 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

3.1 Chọn lọc in silico gen thuộc họ HauI 32

3.2 Tách chiết ADN tổng số 33

3.2.1 Tách chiết ADN tổng số bằng phenol 33

3.2.2 Tách chiết ADN tổng số bằng kit Dneasy 35

3.3 Khuyếch Ďại gen ORF8180 36

3.3.1 Thiết kế mồi Ďể khuyếch Ďại gen ORF8180 36

3.3.2 Kết quả khuyếch Ďại gen ORF8180 bằng PCR 37

3.4 Tách sản phẩm PCR lần 1 trên gel agarose và thực hiện PCR lần 2 39

3.5 Tách dòng gen ORF8180 39

3.6 Khuyếch Ďại Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD của gen ORF8180 41

3.7 Phân tích sự Ďa dạng trình tự Ďoạn mã cho vùng TRD của gen ORF8180 bằng RFLP 42

3.7.1 Phân tích Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD với enzym AluI 43

3.7.2 Phân tích Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD với enzym Hpy188I 44

3.7.3 Phân tích Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD với enzym HpyCh4III 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 56

iii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận này, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Trần Liên Hà, giảng viên chính bộ môn Vi sinh – Hóa sinh

-Sinh học phân tử, Viện Công nghệ -Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cô

đã động viên khuyến khích, chỉ bảo tận tình và đã cho tôi những điều kiện

tốt nhất để học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

TS Lê Thị Kim Tuyến, phòng Thí nghiệm Sinh học, giảng viên bộ

môn y tế công cộng, Trường Đại học Thăng Long, cô đã chỉ bảo tận tình, hướng dẫn và chia sẻ tôi những kiến thức, phương pháp nghiên cứu khoa học vô cùng quý giá trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn đối với Viện Đào tạo sau đại học-Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm- Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập giúp tôi hoàn thành khóa học và luận văn này

Cuối cùng, tôi cũng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần, là chỗ dựa vững chắc để tôi vượt qua mọi khó khăn, không ngừng phấn đấu trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Nguyễn Thị Mai Phương

iv

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam Ďoan Ďây là nghiên cứu của tôi Các số liệu trong luận văn này là do tôi thu thập và thực hiện trong quá trình nghiên cứu một cách khoa học và chính xác

Kết quả luận văn chƣa Ďƣợc Ďăng tải trên bất kỳ một tạp chí hay công trình khoa học nào

Tác giả

Nguyễn Thị Mai Phương

ATP: Adenosine Triphosphate

bp: base pair (Ďôi bazơ)

Chl : Chloramphenicol

EDTA: Ethylene Diamine Tetracetic Acid

IPTG:Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB: Luria Broth

PCR: Polymerase Chain Reaction

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (sự Ďa hình chiều dài các Ďoạn cắt giới hạn)

RM: Restriction-Modification (giới hạn-sửa Ďổi)

RE: Restriction Enzym (enzym giới hạn)

SNP: Single Nucleotide Polymorphism (Ďa hình nucleotide Ďơn)

TRD: Target Recognition Domain (vùng nhận ra trình tự Ďặc hiệu)

vi

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1: Cấu trúc enzym giới hạn 3

Hình 1.2: Trình tự axit amin của HauI lấy từ GenBank 11

Hình 1.3: Trình tự ADN của ORF8180 lấy từ GenBank 12

Hình 1.4: Trình tự axit amin của ORF8180 lấy từ GenBank 13

Hình 3.1: Motif của vùng cắt ADN của họ HauI 32

Hình 3.2: Motif của vùng bám AdoMet của họ HauI 33

Hình 3.3: Motif của vùng methyl hóa của họ HauI 33

Hình 3.4: Ảnh Ďiện di ADN tổng số của 4 mẫu TL, TC, S3, S4 34

Hình 3.5: Ảnh Ďiện di ADN tổng số của 4 mẫu ST, BK, CD, ML 35

Hình 3.6: Vị trí thiết kế cặp mồi LF và LR Ďể khuyếch Ďại gen ORF8180 36

Hình 3.7: Ảnh Ďiện di sản phẩm PCR gen ORF8180 với cặp mồi LF và LR 38

Hình 3.8: Ảnh Ďiện di sản phẩm PCR lần hai gen ORF8180 với cặp mồi LF và LR 39

Hình 3.9: Ảnh Ďiện di sản phẩm PCR Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD của gen ORF8180 41

Hình 3.10: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD của gen ORF8180 42

Hình 3.11: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD bằng enzym giới hạn AluI 43

Hình 3.12: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD bằng enzym giới hạn Hpy188I 44

Hình 3.13: Ảnh Ďiện di sản phẩm cắt Ďoạn trình tự mã cho vùng TRD bằng enzym giới hạn HpyCH4III 45

Phụ lục hình 1: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của TC với gen chuẩn 56

Phụ lục hình 2: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của TL với gen chuẩn 57

Phụ lục hình 3: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của S3 với BK 58

vii

Phụ lục hình 4: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của S3 với gen chuẩn 59

Phụ lục hình 5: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của S4 với gen chuẩn 60

Phụ lục hình 6: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của các gen ML2, ML6, ML7, ML_R6 với nhau 61

Phụ lục hình 7: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của ML2 với gen chuẩn 62

Phụ lục hình 8: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của ML1 với ML3 62

Phụ lục hình 9: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của ML1với gen chuẩn 63

Phụ lục hình 10: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của CD với gen chuẩn 64

Phụ lục hình 11: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của ST với gen chuẩn 65

Phụ lục hình 12: Kết quả sắp chuối trình tự axit amin vùng TRD của 14 gen với gen chuẩn bằng phần mềm PROMALS3D 67

3 enzym HpyCH4III, AluI, Hpy188I 47

Phụ lục bảng 1: Kết quả so sánh trình tự vùng TRD của 14 gen so với gen

chuẩn 66

Cách Ďây khá lâu, cấu trúc phân tử enzym giới hạn loại II Ďã Ďược mô

tả Cũng như với các protein-enzym khác, người ta không phát hiện có sự giống nhau giữa các enzym giới hạn mặc dù có chung chức năng sinh hóa hay chức năng tế bào Gần Ďây, nhóm nghiên cứu của Morgan Ďã tìm ra hai họ

enzym MmeI và HauI có Ďộ giống nhau về trình tự axit amin lên tới 40% [34]

Hai họ này có Ďặc Ďiểm mang cả hai chức năng giới hạn và sửa Ďổi trên cùng một phân tử

Microcystis aeruginosa là một loại vi tảo mọc rất nhiều trên tầng nước

mặt của các ao và hồ tù Ďọng Sự bùng nổ của vi tảo này làm ô nhiễm môi

trường và gây chết các loài thủy sinh bởi Ďộc tố nó tiết ra Loài này Ďã Ďược

giải trình tự ADN và tìm thấy gen ORF8180 mã hóa cho enzym giới hạn giả

Ďịnh thuộc họ HauI

Phân tích các mẫu Microcystis aeruginosa lấy trong thiên nhiên Ďể thấy

Ďược sự Ďa dạng trên gen giống enzym giới hạn sẽ Ďem lại nhiều hiểu biết mới cho lĩnh vực nghiên cứu khoa học cơ bản và ngành dịch tễ học trong phát hiện

quyết Ďịnh chọn Ďề tài “Nghiên cứu sự đa dạng về trình tự ADN giống gen

mã hóa enzym giới hạn giống HauI ở các chủng loài Microcystis

aeruginosa.”

Mục tiêu của Ďề tài:

- Phát hiện sự có mặt của các gen giống HauI trong các mẫu tự nhiên khác nhau chứa Microcystis aeruginosa

- Nghiên cứu sự Ďa dạng trình tự các gen giống HauI

3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Enzym giới hạn

1.1.1 Định nghĩa

Enzym giới hạn (RE) là một enzym phân cắt ADN khi nhận ra các trình

tự nucleotide Ďặc hiệu Enzym giới hạn tồn tại trong vi khuẩn và là yếu tố di

truyền bảo thủ của vi khuẩn [38] Hiện nay, có hơn 5000 enzym giới hạn Ďã

Ďược xác Ďịnh và gần 300 enzym Ďã Ďược thương mại hóa [46] Nhiều kỹ thuật

sinh học phân tử và kĩ thuật di truyền hiện nay Ďều dựa vào các enzym giới

hạn Chức năng của enzym là phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ

khung ADN mạch Ďôi mà không gây tổn hại Ďến các bazơ Các liên kết hóa

học sau khi bị cắt có thể Ďược nối lại với nhau bằng enzym nối ligase Do Ďó,

việc cắt nối ADN tại ví trí mong muốn là hoàn toàn có thể Các Ďoạn cắt giới

hạn của một nhiễm sắc thể hay giữa các gen khác nhau sẽ nối lại Ďược với

nhau chỉ cần có trình tự Ďầu dính bổ sung

Hình 1.1: Cấu trúc enzym giới hạn

4

1.1.2 Lịch sử của enzym giới hạn

Hiện tượng giới hạn trong vi khuẩn Ďược phát hiện lần Ďầu tiên bởi

Luria và Human vào năm 1952 [26] Họ Ďã quan sát thấy khả năng tái sinh của

phage bị ức chế trong vi khuẩn, do vậy giúp tế bào vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm

Phage xâm nhiễm vào vi khuẩn Ďể tổng hợp ra axit nucleic và protein cho riêng mình Khi số lượng phage Ďạt Ďến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá

vỡ tế bào chủ và giải phóng ra ngoài Các vi khuẩn mà không có hàng rào bảo

vệ Ďặc hiệu sẽ bị giết chết Còn trong trường hợp vi khuẩn có các hàng rào Ďặc biệt bảo vệ thì tế bào sẽ vẫn nguyên vẹn trước sự tấn công của phage

Năm 1953, thí nghiệm của Bertani và cộng sự Ďã chứng minh rằng thực

khuẩn thể chỉ phát triển tốt trong một chủng Escherichia coli nhất Ďịnh [3], có

nghĩa là khi một thực khuẩn thể Ďã mọc trên một chủng vi khuẩn nhất Ďịnh thì khả năng phát triển trên chủng vi khuẩn khác sẽ bị ức chế Ví dụ λ phage chỉ

phát triển tốt trong chủng E coli C, nhưng khi kí sinh ở chủng khác như E

coli K, số lượng bản sao lại giảm Ďáng kể Nguyên nhân của hiện tượng này là

do tế bào vi khuẩn E coli C không có hệ thống bảo vệ nên bị giết chết còn tế bào vi khuẩn E coli K có hệ thống bảo vệ nên Ďã sống sót Các tế bào chủ như

E coli K Ďược gọi là tế bào chủ giới hạn và có khả năng làm giảm các hoạt

Ďộng sinh học của thực khuẩn thể λ

Năm 1960, Arber và Meselson Ďã chứng minh hệ thống bảo vệ này là các enzym giới hạn trong vi khuẩn Các enzym này có vai trò như chiếc kéo sinh học cắt vụn trình tự ADN phage khi chúng xâm nhập vào tế bào vật chủ [12, 21, 31] Kết quả là vật chất di truyền của phage sẽ bị phá hủy và chúng không còn khả năng nhân lên trong tế bào nữa

Enzym giới hạn hoạt Ďộng dự trên nguyên tắc là nhận ra các trình tự Ďặc hiệu trên ADN Các trình tự này tồn tại cả trong phage và trong vi khuẩn Các phage vốn không có cơ chế nào Ďể phòng vệ nên bị enzym giới hạn phân cắt Trong khi Ďó vi khuẩn luôn có các enzym sửa Ďổi Ďi kèm Cơ chế sửa Ďổi

5

của enzym rất Ďơn giản, Ďó là gắn thêm một nhóm CH3 vào bazơ nitơ trong trình tự Ďặc hiệu, lập tức enzym giới hạn sẽ bỏ qua vị trí Ďó Chính vì vậy, ADN vật chủ luôn miễn dịch với chính enzym giới hạn của nó

Năm 1971, Nathans và Danna Ďã phát hiện ra các enzym giới hạn có thể cắt ADN virus khỉ 40 (SV40) thành nhiều Ďoạn nhỏ với kích thước dài ngắn khác nhau và xem Ďược khi chạy Ďiện di trên gel polyacrylamide [8] Các hình vạch này là Ďặc trưng riêng của ADN virus khỉ 40 Do Ďó, các enzym giới hạn Ďược sử dụng Ďể lập bản Ďồ gen [25, 45]

Năm 1978, giải Nobel về Sinh lý học và Y học Ďã Ďược trao cho Arber, Nathans và Smith vì Ďã phát hiện và biểu hiện thành công hoạt tính của enzym giới hạn, giúp việc thao tác trên ADN trở nên dễ dàng hơn Cho Ďến nay kĩ thuật tái tổ hợp ADN Ďã rất phát triển, thu Ďược nhiều kết quả có ứng dụng trong thực tiễn, ví dụ sản xuất insulin tái tổ hợp ở quy mô lớn Ďể Ďiều trị cho những người mắc bệnh tiểu Ďường [26, 54]

1.1.3 Phân loại enzym giới hạn

Cho Ďến nay có rất nhiều enzym giới hạn khác nhau Ďược tìm thấy trong vi khuẩn Các enzym giới hạn này Ďược phân loại dựa trên các tiểu Ďơn

vị cấu tạo nên enzym, các thành phần tham gia xúc tác Ďặc Ďiểm trình tự nhận

ra và vị trí cắt xung quanh trình tự nhận [4, 6, 50, 55, 58], bao gồm 4 loại chính sau:

Enzym giới hạn loại I là những enzym có phân tử lượng khoảng 300.000 Da, Ďược phát hiện lần Ďầu tiên bởi Arber và Meselson khi cắt xa vị trí nhận biết từ 1.000 Ďến 5.000 nucleotide [37, 45], có sự tham gia xúc tác của

Mg2+, SAM, ATP

Enzym giới hạn loại II là những enzym có phân tử lượng thấp hơn loại

I, khoảng 20.000 Ďến 100.000 Da Loại II Ďược phát hiện lần Ďầu tiên bởi Smith khi cắt tại vị trí nhận biết [17, 51] Vị trí nhận biết của loại II thường là các trình tự Ďối xứng xuôi ngược dài từ 4-8 nucleotide [7] Enzym loại này xúc

6

tác không cần năng lượng ATP, chỉ cần Mg2+ làm cofactor [43, 5] Tuy nhiên, mới Ďây enzym loại II còn Ďược biết Ďến với nhiều Ďặc Ďiểm mới Ví dụ

enzym loại IIG (MmeI, HauI) [44], gồm 850-1250 axit amin, là các enzym

mang hai chức năng giới hạn-sửa Ďổi trên cùng một phân tử, trong khi hầu hết các enzym loại II Ďược biết Ďến trước Ďây Ďều có hai chức năng tách rời Các enzym này luôn có chung vùng nhận ra trình tự Ďặc hiệu TRD (Target Recognition Domain) [15] Kể cả khi vùng nhận ra trình tự Ďích Ďó thay Ďổi,

chúng sẽ vẫn phối hợp hoạt Ďộng Ďể bảo vệ vật chủ vi khuẩn Loại IIG hiện

nay Ďược chia thành nhiều dưới nhóm dựa theo trình tự nhận biết liên tục (ví

dụ, AcuI: CTGAAG) hoặc trình tự nhận biết không liên tục (ví dụ, BcgI:

(CGANNNNNNTGC với N là 1 trong 4 loại nucleotide), chỉ cắt một bên phía ngoài vị trí nhận biết hay cắt cả hai phía và giải phóng một Ďoạn nhỏ chứa trình tự nhận biết

Enzym giới hạn loại III gồm những enzym nhận ra một trình tự từ 5-7

bp bất Ďối xứng và cắt xa trình tự Ďó 20-30 bp [9] Loại III cần có sự tham gia xúc tác của AdoMet và ATP như các Ďồng yếu tố [30]

Enzym giới hạn loại IV là những enzym chỉ cắt ADN có trạng thái methyl hóa

Trong 4 loại RE nói trên chỉ có RE loại II Ďược ứng dụng nhiều nhất

1.2 Enzym giới hạn-sửa đổi

Hệ thống giới hạn – sửa Ďổi RM (Restriction Modification) gồm các enzym mang cả hai chức năng giới hạn và sửa Ďổi trên cùng một phân tử protein, là một tiến hóa trong cơ chế bảo vệ của vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của ADN lạ Với các hệ thống R-M cổ Ďiển, chức năng cắt và sửa Ďổi Ďược mang trên 2 protein khác nhau, tức là mỗi protein phải có vùng TRD (Target Recognition Domain) nhận ra trình tự nucleotide Ďặc hiệu riêng Dẫn tới, khi xảy ra Ďột biến trên vùng TRD của endonuclease làm thay Ďổi trình tự nhận biết, methyltransferase cũng phải có cùng thay Ďổi với endonuclease Ďể bảo vệ ADN vật chủ Nhưng xác suất Ďể methyltransferase có cùng thay Ďổi

7

gần như bằng không, các trình tự không Ďược sửa Ďổi, ADN bị cắt nhỏ, gây chết tế bào chủ Trong khi Ďó, các enzym RM chỉ có một vùng chung TRD thì khi Ďột biến xảy ra trong vùng TRD làm trình tự nhận biết của cả endonuclease và methyltransferase cùng thay Ďổi Lúc Ďó, chức năng giới hạn

và sửa Ďổi sẽ tiếp tục phối hợp với nhau cùng làm việc trên một trình tự chung mới, kết quả là ADN genom của tế bào chủ vẫn Ďược bảo vệ

1.3 Họ HauI

1.3.1 Giới thiệu về HauI

HauI là một enzym giới hạn loại IIG, thuộc hệ thống RM khi mang hai

chức năng giới hạn và sửa Ďổi trên cùng một phân tử, có nguồn gốc từ vi

khuẩn Herpetosiphon aurantiacus DSM 785 HauI Ďược biết Ďến với khả năng

nhận ra trình tự Ďặc hiệu không Ďối xứng gồm 7 nucleotide 5'-GGCCAAG-3'

và cắt xa trình tự nhận biết Ďó 10/8 bp Gen mã hóa cho enzym có kích thước lên tới 3.075 bp, tương ứng với 1.024 axit amin Mã số truy cập của enzym trên GenBank là ABX04580

Trước Ďây, HauI chỉ là một enzym giả Ďịnh Ďược tìm thấy trên

REBASE [46] với tên gọi là HauORF1937P, trong Ďó, REBASE là cơ sở dữ liệu toàn diện về hệ thống các enzym giới hạn-sửa Ďổi Sau Ďó, HauORF1937P

Ďã Ďược tách dòng và biểu hiện hoạt tính trong E coli

Điều này chứng tỏ rằng từ một trình tự sẵn có trên GenBank, ta hoàn toàn có thể biểu hiện ra một enzym giới hạn có hoạt tính Không những vậy, sàng lọc ảo trên máy tính có tính ưu việt hơn so với sàng lọc vi khuẩn trong tự nhiên sản xuất enzym giới hạn như phương pháp truyền thống trước Ďây Sàng lọc ảo giúp tách dòng và biểu hiện gen trở nên dễ dàng hơn, giúp lựa chọn các gen có nhiều Ďặc tính tốt, chỉ cần người nghiên cứu biết cách sử dụng máy tính

8

1.3.2 Khám phá in silico về các gen thuộc họ HauI

1.3.2.1 In silico

In silico là thuật ngữ Ďể chỉ sự mô phỏng trên máy tính hoặc thông qua

mô phỏng máy tính Ďể thiết kế các phân tử protein-enzym mới

Kể từ khi các trình tự Ďầu tiên của protein insulin Ďược mô tả bởi Sanger vào năm 1951, các nhà sinh học Ďã cố gắng sử dụng kiến thức này Ďể tìm hiểu các chức năng phân tử [47, 48] Theo Levitt, các kết quả phân tích trình tự xuất hiện lần Ďầu tiên trong khoảng thời gian từ 1969-1977 [23], bởi trong năm 1969, trình tự chuỗi tARN vận chuyển lần Ďầu tiên Ďược sử dụng Ďể tìm ra tương tác giữa axit amin và nucleotide [22] Đến năm 1970, Needleman

và Wunsch Ďã tìm ra các thuật toán máy tính Ďầu tiên cho việc sắp chuỗi các

cơ chế tương tác ADN-protein trong tế bào vi khuẩn dần Ďược hé lộ Nhờ vậy việc dự Ďoán chức năng của một gen dựa vào những Ďặc Ďiểm Ďã tìm ra trở nên Ďơn giản [36]

Thực hiện nghiên cứu in silico này có tính chất Ďích xác, rút ngắn thời gian nghiên cứu khi bỏ qua bước phân lập như trong nghiên cứu in vivo

(nghiên cứu các chủng sống)

Ngày nay, có rất nhiều kỹ thuật và công cụ có thể so sánh nhiều trình tự (sequence alignment) cùng lúc và phân tích sự giống nhau của các trình tự Ďó [57] Phân tích trình tự trong sinh học phân tử bao gồm những nội dung cơ bản sau:

3 Xác Ďịnh sự khác biệt trong trình tự, tìm ra sự Ďa hình của một trình

tự nucleotide (SNP), giúp phân biệt gen Ďó với các gen khác

4 Phát hiện sự tiến hóa và sự Ďa dạng di truyền, xác Ďịnh loài sinh vật dựa vào cấu trúc phân tử

5 Xác Ďịnh cấu trúc phân tử từ trình tự

Trong hóa học có các kỹ thuật Ďể phân tích trình tự của một polymer hình thành từ những monome nào Trong di truyền và sinh học phân tử cũng

có kĩ thuật tương tự Ďược gọi Ďơn giản là "giải trình tự"

 Các giai Ďoạn trong nghiên cứu in silico

b Tìm ra gen giả Ďịnh

Nhìn chung dự Ďoán các gen của vi khuẩn thường Ďơn giản và chính xác hơn so với dự Ďoán các gen ở sinh vật nhân chuẩn vì có các vùng intron/exon phức tạp

1.3.2.2 Khám phá in silico về các gen thuộc họ HauI

Cơ sở của việc tìm kiếm in silico các enzym trong họ HauI là phải có

sự tương Ďồng về trình tự axit amin Nếu trình tự các gen quá Ďa dạng thì sẽ không có họ enzym giới hạn nào tìm Ďược

10

Trước Ďây, hệ thống enzym giới hạn loại II cổ Ďiển có trình tự rất Ďa dạng Hệ thống này gồm một enzym giới hạn và một enzym methyltransferase Hai gen mã hóa cho hai enzym này nằm sát nhau trên chuỗi ADN vi khuẩn Hai enzym này xúc tác phản ứng trên cùng một trình tự nucleotide Ďặc hiệu Những trình tự axit amin ngắn xuất hiện trên tất cả các enzym methyltransferase Ďánh dấu cho khả năng sửa Ďổi ADN Ďã Ďược tìm ra Các trình tự này Ďược gọi là các motif Tuy nhiên, các motif Ďánh dấu cho khả

năng cắt của enzym giới hạn chưa Ďược tìm thấy Bởi vậy, Ďể phát hiện in

silico một enzym giới hạn cổ Ďiển, ta chỉ có cách là xác Ďịnh sự tồn tại của gen

mã cho methyltransferase Ďi cùng với nó

Thời gian gần Ďây, với sự phát triển nhanh chóng của tin sinh học Ďã cho phép dự Ďoán chức năng của enzym giới hạn dựa vào cấu trúc không gian

ba chiều của nó, từ Ďó có thể tìm thêm nhiều enzym giới hạn trong vi khuẩn

[18, 40] Họ enzym giới hạn loại II Ďầu tiên Ďược tìm kiếm in silico với Ďộ tương Ďồng về trình tự của các enzym trong họ lên tới 60% là họ MmeI Họ

này thuộc hệ thống RM, mang cả hai chức năng giới hạn và sửa Ďổi trên cùng một phân tử với khả năng nhận ra trình tự ADN của các enzym trong họ rất khác nhau [35]

Cho Ďến nay, họ HauI cũng Ďược tìm in silico bằng cách so sánh trình

tự HauI với các trình tự sẵn có trên GenBank nhờ phần mềm BLAST [1] Tuy

các gen trong họ có nguồn gốc từ nhiều chủng vi khuẩn khác nhau nhưng Ďộ tương Ďồng về trình tự của các gen này khá cao, lên tới 40% Khi tiến hành

phân tích các vùng chức năng của họ HauI bằng phần mềm PROMALS3D

[42] thì thấy các motif Ďánh dấu cho khả năng cắt và sửa Ďổi ADN trong họ Các motif này xuất hiện ở gần Ďầu N gồm motif cắt nằm gần Ďầu N Trong khi vùng TRD nhận ra trình tự Ďặc hiệu thì nằm gần Ďầu C [28]

11

1 MLSIKPNHKA VREYYASLRS LAEARAQHEG AVAPAFAALL RACASQMGWT LVEQYSIRLK

61 KSSIRADGAL LDSFTLIRGV WEAKDSNDDL ATEVRKKFAA GYPAENILFQ APQRIILWQN

121 QRQVLDVDIS QPDALIDALL LFFNYQPPQY LQWDHAVVEF RERVPELAQG VLRLIEREIS

181 EKNQRFITAL ERFMALVREA INPNISVSAV EEMLIQHLLT ERIFRKVFNN PDFVNRNVIA

241 REIETVIQAL TSRSFNRNDF LRELDRFYGA IESTAATIEN FSHKQDFLNT VYENFFQGFS

301 IKVADTHGIV YTPQPIVDFM VRSVEELLRR EFNTSLGNAG VHVLDPFVGT GNFLLRVMHE

361 IPRSKLRQKY AEELHCNEVM LLPYYIASMN IEHLYYELTN SYQEFNGICL VDTFELAQVG

421 AGQQLGLFVP ENTERVLKQQ QQDIFVIIGN PPYNARQVNE NDNNKNRKYE IIDQRVAMTY

481 SRDSQQTNKN ALNDPYVKSF RWAADRIIRN GDEGIVALVT NNSFIDDLSF DGMRKHLAQD

541 FDAIYVLDLG GNVRKNPKLS GTTHNVFGIQ VGVSIIFLIK KRGSTKASDA KIWYARAGEM

601 WKKQEKFNLL NQAETIDKIE WQEILPDKKH TWLTDGLEND FDNFIPLGTK EAKKGFGQAI

661 FTQFTNGVKS NRDAWVWNFD SDTLSNNIKT TIDYYNDHVS RWQRLVTKQE IDSFISTDDK

721 KISWSGDLKS NIQRGRYIQY DANKVIDGIY RPYTKQKIYF ERLLNERVYL IPSLFPTASE

781 NRVICVVNEA QIPFSAQITN VIPCLHYGGR QTQCFPYYVY DDDGSNQREN ISDWALEHFR

841 SQLGEPSIEK WDIFYYVYGL LHSPHYRERY AANLRRELPR IPIVALADFQ ALAQAGRELA

901 ELHINYESQP EYNLQWLENR DEPLNWRVES MKLSKDRTTL RYNNFLSLAG IPAAAFEYKL

961 GNRSALDWVI DQYRVSTDAR SGITNDPNRH DDPEYIVRLI GKIITISLKT VEIVTRIGDV

1021 ALTP

Hình 1.2: Trình tự axit amin của HauI lấy từ GenBank

Trên hình 1.2, các trình tự axit amin Ďược bôi vàng là các motif của họ

HauI gồm: motif D72-E82XK84: Ďánh dấu chức năng cắt nội mạch phụ thuộc ion kim loại Mg2+ [19], motif I: L344DPFVGTGNF Ďánh dấu chức năng bám AdoMet, motif X: G309IVYTP và motif IV: G449NPPY [28] Ďánh dấu chức năng sửa Ďổi Các motif này có thể có thay Ďổi Ďôi chút giữa các enzym trong

họ HauI nhưng riêng motif Ďánh dấu cho chức năng sửa Ďổi thì rất bảo tồn

Bởi vậy mà motif IV là motif dễ nhận biết nhất Trên hình còn thấy các trình

tự Ďược gạch là trình tự vùng TRD nhận ra trình tự Ďặc hiệu

1.3.3 Giới thiệu về gen ORF8180

Trong danh sách các gen thuộc họ HauI, có một gen mã hóa cho một enzym sửa Ďổi, có tên gọi là ORF8180 Gen này thuộc vi khuẩn Microcystis

aeruginosa NIES 843, có kích thước phân tử là 2.997 bp, mã cho một protein

gồm 998 axit amin Mã số enzym trên GenBank là BAG00640 Tên gọi của gen trên REBASE là RM.Mae843ORF8180P

12

1 ATGTCTAGAT TATTAATCAG CCAGTATCAG GCGGAAGTTG AGAAGATTGT CCAATATGGC

61 GGCAGTCGCA AGGAAACTTC GATTAGAGTC GCTTTTCAGA ATTTGTTAAA TGACTATTGC

121 AAGGCGCGGG ATTTTTTGTT AATTCCGGAG TTGGATTATC GCACTAAGTC GGGAAAAGTT

181 GTCTATCCTG ACGGGACGGT AAAGGATGCT TTGCGGTTAG ATTGGGGATA TTGGGAAAGT

241 AAGGATCAAT ACGATAATTT AGACGAAGAA ATTGAGAAAA AGTTGGCGAA AGGCTATCCT

301 AATGACAATA TTTTATTTGA AGATTCCCAG ACGGCGGTTT TAATTCAAGG AGGAGAGGAA

361 AGACTGCGCG TCTCCATGCG CGATGATGAG GCTTTGGATG GGATTATTAA TGCTTTTATT

421 AATTATGTAC GTCCGGAGGT TGAGGATTTT CGAGAGGCAA TTGATAGTTT TAAGGAAGAT

481 TTACCAACAA TTTTAGAAGC GTTGCGGGAT TTAATTGCGT TGCAGTCGGA GACGAATCGT

541 AATTTTGTGA CAGCGCGGGA CAATTTTTTA GAGATTTGTC GCAAGTCAAT CAATCCAGAA

601 ATTAGTCTGG AAGATGTGCG AGAGATGATT ATTCAGCACA TCCTGACAGA GGATATTTTT

661 ATCAATATTT TTAATGAGTC TCAGTTTCAC CGGGAAAATA ATATCGCCAG GGAATTACAG

721 GGAGTGATTG AAACTTTCTT TACTGGTAAT ACCAAGCGCA ATACTTTAGG GACTATTGAA

781 CGTTATTATG CGGTAATTCG GCGGACAGCG GCGAATATTT ATAACCACCA CGAGAAGCAG

841 AAGTTTCTCA AGGCGATTTA TGAGAATTTT TATAAAGCAT ACAATCCGAA AGCGGCGGAC

901 CGGTTGGGAA TTGTCTATAC ACCCAATGAA ATTGTCCGTT TTATGATTGA AAGTGTCGAT

961 TATTTAGTTC ACAAGCATTT TAGGAAGTTG TTGGCGGATC CAGGAGTAGA AATTTTAGAT

1021 CCGGCGACGG GGACAGGAAC TTTTATAACG GAGTTAATTG AGTATTTACC GAAGGATAAG

1081 TTACGGTACA AGTATAAGCA TGAGATGCAC TGTAACGAGG TGGCAATTCT GCCTTATTAT

1141 ATCGCTAATT TGAATATTGA GTTCACCTAC AAGCAGAAGA TGGGTGAGTA TGAAGAGTTT

1201 GAGCATATCT GTTTTGTGGA TACCCTGGAC CATGCTGCTT TTCATCTCAA GCAGATGGAT

1261 TTGTTTGCTA TGTCGGTGGA GAATACCCAA CGCATTCAAA ATCAAAATGA CCGCAATATT

1321 TCTGTAATTA TTGGGAATCC TCCTTATAAT GCTAATCAGC AAAATGAGAA TGACAATAAT

1381 AAAAATCGGA AGTATCCTGC TATTGATAAG CGCATTAAGG ATACTTACAT CGAAGAGAGT

1441 ACAGCGCAGA AGACAAAGCT ATATGATATG TATTCTCGCT TCTTTCGTTG GGCTACAGAT

1501 AGGTTAGGTG AAAATGGTAT AATAGCTTTT ATTACTAACT CTTCTTTTAT CGATGCGAGG

1561 ACATTTGACG GTTTTAGAAA AGTAGTAGAG AATGAGTTTA GTGAAATTTA TATCATTGAT

1621 TTAGGTGGTA ATGTCAGGAA AAATCCTAAA CTTTCAGGGA CAACTCATAA TGTTTTCGGT

1681 ATTCAGACGG GGGTGGCGAT TAGTTTGATA GTGAAGCGAG AAAGTAATAA TCTTCCTTGT

1741 CGAATTTTAT ATACTCGCCG TCCTGAATTG GATACAGCAT CGCAAAAATT AGAGTTTTTG

1801 TCATCGACAA AACTTAATCA GCTTGATTTT GAGCATATCA TCCCAGATAA AAAACATAAC

1861 TGGATTGAAC AATCAGATAA TGATTTTAAT GACTTGATAC CTGTAGTTGA CAAAAATACT

1921 AAACTGCTCA AAAATAAAAC TGACATTCAA GCATTATTTG AATTTTTCTC TCTAGGTGTT

1981 TCTACGAATA GAGATGAATG GGTCTTTGAA GACGATGAGC AATTATTGTC CAAAAAGATG

2041 CAATATTTTA TTTCTATCTA TAATAAATCG ATTGAGTGTA ATCACATAAA TTATTCGATA

2101 AAATGGAGTT CTTCTTTAAT ATCCAAATTT AAGAACAAAG AAAAATCAGA GTATTTCCCA

2161 AGATTCGTAA TTTCTCTTAT TTATAGACCA TATATTACCA AGTATTACTA TTCTAATAAA

2221 TTTTTTTCAG ATCGACTTAC CTCAAATCAT TATCAAGTAT TTGGCAATGA ATTAATTAAT

2281 TCAAATCAAG TCATAATGTT TTCAGGAGTT GGCTCTTCAA AACCAAATTC TGTGTTAGTA

2341 ACTAACAAGA TATTTTGTTT AGATACACTT GAAAAAACTC AATGTCTCCC CCTCTACTAC

2401 TATGAAAAAG AAGGAAACCG TATCGACAAT ATCACCGATT GGGGATTGCA ACAATTCCAA

2461 AACCATTACA ACGATAAAAA CCTCACCAAA CTCGACATCT TCCACTACAC TTATGCAGTC

2521 CTCCACTACC CGGAATATCG CAGTAAATAT GAATTAAACC TTAAGCGAGA ATTTCCCCGA

2581 CTTCCCTTTT ACGATAACTT CTCTCAATGG GTAGAATGGG GAAGCAAACT AATGGAATTA

2641 CATATCAACT ATGAAACCGT CGCACCCTAC CCACTAACCC GCATTGATAC TAATAATAAT

2701 CTCAAACCCA AAACTAAACT AAAAGCTGAC CGAGAAAAAA ATTCTATCAA CCTCGATGAT

2761 GTCACTTTCC TACAAGATAT TCCCAAAATT GCTTGGGAAT ATAAACTCGG TAATCGTTCG

2821 GCCTTAGAAT GGATTTTAGA TCAATATAAG GAAAAGAAAC CCAAAGATCA AACCATCGCC

2881 GAAAGATTTA ATAATTATCG CTTCGCCGAT TATAAAGAAA CAGTAATTGA CTTATTACAA

2941 CGAGTCTGTA CTGTCAGCGT CGAAACCATG AAAATAATAG AAGCGATGAG ACATTAA

Hình 1.3: Trình tự ADN của ORF8180 lấy từ GenBank

13

1 MSRLLISQYQ AEVEKIVQYG GSRKETSIRV AFQNLLNDYC KARDFLLIPE LDYRTKSGKV

61 VYPDGTVKDA LRLDWGYWES KDQYDNLDEE IEKKLAKGYP NDNILFEDSQ TAVLIQGGEE

121 RLRVSMRDDE ALDGIINAFI NYVRPEVEDF REAIDSFKED LPTILEALRD LIALQSETNR

181 NFVTARDNFL EICRKSINPE ISLEDVREMI IQHILTEDIF INIFNESQFH RENNIARELQ

241 GVIETFFTGN TKRNTLGTIE RYYAVIRRTA ANIYNHHEKQ KFLKAIYENF YKAYNPKAAD

301 RLGIVYTPNE IVRFMIESVD YLVHKHFRKL LADPGVEILD PATGTGTFIT ELIEYLPKDK

361 LRYKYKHEMH CNEVAILPYY IANLNIEFTY KQKMGEYEEF EHICFVDTLD HAAFHLKQMD

421 LFAMSVENTQ RIQNQNDRNI SVIIGNPPYN ANQQNENDNN KNRKYPAIDK RIKDTYIEES

481 TAQKTKLYDM YSRFFRWATD RLGENGIIAF ITNSSFIDAR TFDGFRKVVE NEFSEIYIID

541 LGGNVRKNPK LSGTTHNVFG IQTGVAISLI VKRESNNLPC RILYTRRPEL DTASQKLEFL

601 SSTKLNQLDF EHIIPDKKHN WIEQSDNDFN DLIPVVDKNT KLLKNKTDIQ ALFEFFSLGV

661 STNRDEWVFE DDEQLLSKKM QYFISIYNKS IECNHINYSI KWSSSLISKF KNKEKSEYFP

721 RFVISLIYRP YITKYYYSNK FFSDRLTSNH YQVFGNELIN SNQVIMFSGV GSSKPNSVLV

781 TNKIFCLDTL EKTQCLPLYY YEKEGNRIDN ITDWGLQQFQ NHYNDKNLTK LDIFHYTYAV

841 LHYPEYRSKY ELNLKREFPR LPFYDNFSQW VEWGSKLMEL HINYETVAPY PLTRIDTNNN

901 LKPKTKLKAD REKNSINLDD VTFLQDIPKI AWEYKLGNRS ALEWILDQYK EKKPKDQTIA

961 ERFNNYRFAD YKETVIDLLQ RVCTVSVETM KIIEAMRH

Hình 1.4: Trình tự axit amin của ORF8180 lấy từ GenBank

Trên hình 1.3, ta thấy trình tự ADN của ORF8180 có codon ATG mã cho axit amin mở Ďầu là methionine ở Ďầu gen Cuối gen có codon TAA mã cho axit amin kết thúc

Trên hình 1.4, ta thấy các motif Ďặc trưng Ďánh dấu cho hoạt tính endonuclease và adenine specific ADN methyltransferase (vùng trình tự bôi vàng) Vùng trình tự Ďược gạch chân là vùng TRD nhận ra trình tự Ďặc hiệu

1.3.4 Vùng TRD

1 Giới thiệu vùng TRD

Vùng TRD (Target Recognition Domain) là vùng nhận ra trình tự Ďặc

hiệu của enzym giới hạn, Ďược tìm thấy lần Ďầu tiên ở các enzym giới hạn loại

I, gồm 150 axit amin [53]

Năm 2007, vùng TRD của enzym loại II Ďược tìm ra khi tiến hành tráo Ďổi các vùng Ďược dự Ďoán là mã cho vùng TRD của 3 enzym khác nhau [15] Kết quả cho thấy các enzym mới Ďược tạo ra có Ďặc hiệu không giống với bất

kì enzym nào từng mô tả trước Ďây Điều này chứng tỏ vùng Ďược dự Ďoán Ďúng là vùng nhận ra trình tự Ďặc hiệu

14

Việc tìm ra vùng TRD của enzym giới hạn loại II có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử cũng như kĩ thuật di truyền khi tạo ra các Ďặc hiệu mới theo ý muốn

2 Đa dạng trình tự vùng TRD

Năm 2009, Morgan và cộng sự Ďã tìm ra sự Ďa dạng trong trình tự vùng

TRD của họ MmeI Họ này có trình tự axit amin vùng cắt và sửa Ďổi rất bảo

tồn, trong khi trình tự vùng TRD gồm 200 axit amin nằm cuối gen, tính từ axit amin 621 Ďến axit amin 820, rất hay thay Ďổi [35] Sau Ďó, nhóm nghiên cứu cũng Ďã xác Ďịnh và biểu hiện Ďược 20 enzym trong họ với tống số 19 Ďặc hiệu khác nhau Các Ďặc hiệu này không giống với bất cứ Ďặc hiệu nào của các enzym giới hạn-sửa Ďổi Ďã mô tả trước Ďây Điều này chứng tỏ sự Ďa dạng về trình tự vùng TRD Ďã tạo ra sự Ďa dạng về Ďặc hiệu của các enzym trong họ Đồng thời cũng chỉ ra sự tiến hóa của các enzym giới hạn-sửa Ďổi loại II trong

vi khuẩn

Cũng trong năm 2009, Morgan và Luyten tiếp tục tìm ra quy luật tương

tác giữa acid amin trong vùng nhận ra trình tự Ďặc hiệu TRD của họ MmeI với

ba vị trí trong trình tự ADN Ďích [34] Để tìm ra quy luật này, nhóm tác giả Ďã Ďổi vị trí axit amin Ďược dự Ďoán là nhận ra base nitơ này cho axit amin Ďược

dự Ďoán là nhận ra base nitơ khác Kết quả thu Ďược là tạo ra enzym mới có trình tự nhận phù hợp với dự Ďoán từ trước và có hoạt tính tương tự như các enzym phân lập trong tự nhiên Điều này chứng tỏ một vài thay Ďổi nhỏ về axit amin quan trọng trong vùng nhận ra vị trí Ďích TRD Ďã làm thay Ďổi khả năng nhận ra ADN của enzym trong họ Từ Ďó gợi ra hướng nghiên cứu mới trong thiết kế nhiều enzym giới hạn-sửa Ďổi loại II có Ďặc hiệu như mong muốn

Họ HauI cũng có Ďặc Ďiểm giống MmeI khi có 306 axit amin trong

trình tự vùng TRD rất hay thay Ďổi, trong khi các trình tự còn lại rất bảo tồn Nguyên nhân dẫn Ďến sự phong phú các trình tự gen giới hạn này là do sự chuyển gen ngang giữa các loài sinh vật khác nhau sống trong cùng một hệ sinh thái, giúp vi khuẩn thích nghi với môi trường sống có nhiều phage [13,

Xác Ďịnh Ďặc hiệu cụ thể của từng gen sẽ Ďem lại những hiểu biết về tương tác giữa axit amin và nucleotide trong trình tự nhận, gợi ý thiết kế nhiều

enzym loại II với Ďặc hiệu mới (như Ďã tìm ở họ MmeI) [33, 34]

1.4 Microcystis aeruginosa

Microcystis aeruginosa (M aeruginosa) là các vi khuẩn lam (blue green algae), thuộc họ Cyanobacterium, mọc phổ biến tại các ao hồ tù Ďọng chưa Ďược xử lí và gây hiện tượng nước nở hoa Đặc Ďiểm của M aeruginosa

là có chứa diệp lục, hay nổi lên trên mặt nước Ďể thu nhận năng lượng ánh

sáng mặt trời phục vụ cho quang hợp M aeruginosa phát triển rất mạnh ở các

quốc gia có Ďiều kiện khí hậu nóng ẩm quanh năm với số giờ chiếu sáng trong ngày nhiều Bởi vậy, các ao hồ ở Việt Nam rất dễ bắt gặp sự bùng nổ của các

vi khuẩn lam này Ở nhiều quốc gia khác như Nga, Hy Lạp, Brazil, Nhật Bản,

Cộng Hòa Séc, Phần Lan, M aeruginosa cũng mọc rất phổ biến

Trong y tế công cộng, việc phát hiện sự có mặt của vi khuẩn lam trong

mẫu nước là rất quan trọng bởi Ďộc tố microcystin mà M aeruginosa sinh ra

có thể gây hại cho con người và Ďộng vật uống phải nguồn nước Ďó Nhiều nghiên cứu trong nước và trên thế giới Ďã tìm ra cấu trúc genome của các

chủng M aeruginosa khác nhau trong tự nhiên [56] Cho Ďến nay, các số liệu

Ďó vẫn không ngừng tăng lên

16

1.4.1 Sinh thái

Trong môi trường sống, M aeruginosa là các tế bào dạng hạt (hình

cầu), liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành các Ďám tế bào có hình dạng không Ďều nhau, Ďường kính từ 3,5-6,5µm và thường tạo lỗ rời rạc [11]

Trong các sinh vật nhân sơ, M aeruginosa là loài duy nhất thực hiện

quang hợp và có khả năng lây lan rộng rãi nhất Chỉ cần gặp Ďiều kiện môi

trường thuận lợi như nhiệt Ďộ thích hợp, môi trường giàu dinh dưỡng, M

aeruginosa sẽ phát triển bùng nổ, còn gọi là hiện tượng nước nở hoa Nhiệt Ďộ

tối ưu cho sự phát triển của M aeruginosa là 32°C Khi tăng nhiệt Ďộ lên trên

38°C hoặc giảm nhiệt xuống thấp hơn 15°C, tế bào sẽ ngừng tăng trưởng và lượng Ďộc tố cũng giảm Ďi [11]

1.4.2 Các loại độc tố

M aeruginosa có khả năng sinh tổng hợp hai loại Ďộc tố là Ďộc tố gan

(microcystins) và Ďộc tố thần kinh (lipopolysaccharides - LPSs) [29] Lượng

Ďộc tố sinh ra nhiều nhất ở Ďiều kiện nhiệt Ďộ môi trường thấp khoảng 20°C

Độc tố gan Ďầu tiên Ďược phát hiện trong M aeruginosa là nhóm

heptapeptides Các heptapeptides này khi vào trong cơ thể bằng Ďường uống

sẽ liên kết chặt chẽ với các protein phosphatase trong tế bào Ďộng vật có vú và gây Ďộc tế bào [10]

Ở các nước Địa Trung Hải như Hy Lạp, tỷ lệ M aeruginosa nở hoa

thường diễn ra trong thời gian dài Người dân sống trong các khu vực Ďó thường mắc các bệnh về viêm gan và viêm dạ dày ruột với nồng Ďộ các enzym trong huyết tương cao do uống phải nguồn nước có chứa Ďộc tố microcystins Không những vậy, microcystins còn gây ra các vấn Ďề nghiêm trọng về sức khỏe hoặc thậm chí gây tử vong ở người và Ďộng vật Do những ảnh hưởng này, Tổ chức Y tế Thế giới Ďã thiết lập chỉ tiêu về nồng Ďộ cho phép của microcystins là 0,04 g/kg trọng lượng cơ thể [52]

17

Ngoài các Ďộc tố gây hại cho sức khỏe, M aeruginosa cũng Ďược biết

Ďến trong nghiên cứu trong sản xuất hydroxytoluene butylated, một chất chống oxy hóa, phụ gia thực phẩm và hóa chất công nghiệp [2]

1.4.3 Tầm quan trọng trong sinh thái

Năm 2009, một cuộc Ďiều tra về mức Ďộ ảnh hưởng của M aeruginosa

tới các loài sinh vật cùng sinh sống tại Công viên Quốc gia Kruger Ďã Ďược

mở ra Các kết quả Ďiều tra cho thấy, nhiều loài Ďộng vật có vú cư trú tại Công viên Quốc gia Kruger Ďã bị giết chết do uống phải nguồn nước có sự phát triển

mạnh mẽ của các M aeruginosa Nguyên nhân là vì Ďộc tố microcystins mà các M aeruginosa liên tục sinh ra Ďã gây tổn thương gan, gây viêm dạ dày và dẫn Ďến tử vong cho các loài Ďộng vật Không những vậy, M aeruginosa còn

giết hại các loài thủy sinh sống cùng hồ với nó, bởi sự phát triển quá mức của

M aeruginosa làm thay Ďổi nồng Ďộ oxy hòa tan trong nước khiến các loài

thủy sinh này không thể thích nghi kịp và chết [41] Điều này chứng tỏ các M

Aeruginosa rất Ďộc hại với hầu hết sinh vật nói chung Tuy nhiên, Ďối với các

Ďộng vật có vú to lớn như voi, trâu, hà mã hay cá sấu, việc sử dụng nguồn

nước có chứa nhiều M aeruginosa không làm ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và

phát triển của chúng Bởi chúng hay lội qua nước trước khi uống Ďể xua Ďi các

Ďám vi khuẩn M aeruginosa mọc nhiều ở lớp nước mặt và chỉ uống nguồn

nước sạch hơn bên dưới

Một thời gian sau, vấn Ďề về ô nhiễm M aeruginosa tại Công viên

Kruger chỉ Ďược giải quyết khi xây các tường ngăn Ďập và lắp Ďặt các Ďường ống thoát nước

1.4.4 Đa dạng di truyền của quần thể

Nghiên cứu sự Ďa dạng quần thể M aeruginosa trước Ďây thường chỉ

dừng lại ở mức Ďánh giá hình thái quần thể Tuy nhiên, việc Ďánh giá Ďa dạng theo phương pháp cổ Ďiển này còn nhiều hạn chế bởi chưa phản ánh Ďược sự

Ďa dạng về mặt di truyền trrong quần thể, Ďặc biệt Ďối với các quần thể vi

18

khuẩn Ngoài sự Ďa dạng về hình thái, quần thể M aeruginosa còn xuất hiện nhiều Ďa dạng về di truyền Các Ďa dạng di truyền này không chỉ xảy ra giữa

các hồ khác nhau với nhau mà còn xuất hiện ngay trong cùng một hồ Có Ďến

59% biến thể biến thể di truyền của M aeruginosa Ďược tìm thấy trong cùng

một hồ, trong khi chỉ có 41% biến thể còn lại Ďược tìm thấy giữa các hồ với

nhau [56] Theo thống kê AMOVA, cứ 4 quần thể M aeruginosa sẽ có 2 quần

thể khác nhau

Đa dạng di truyền của các quần thể M Aeruginosa có tiềm năng tạo ra

các nhiều biến thể của microcystin, Ďặc biệt là các biến thể trong túi gắn cơ chất của enzym Do Ďó, mức Ďộ ảnh hưởng của Ďộc tố tới tế bào Ďộng vật cũng khác nhau Trong thập kỷ qua, nhiều con Ďường sinh tổng hợp Ďộc tố Ďã Ďược phát hiện

Ngoài tiềm năng tạo ra nhiều biến thể của microcystin thì khả năng tạo

ra các biến thể di truyền của enzym giới hạn trong các quần thể M Aeruginosa

cũng rất cao, tập trung chủ yếu trong vùng TRD nhận ra trình tự Ďặc hiệu Sự tiến hóa trong trình tự vùng TRD sẽ tạo ra nhiều enzym cắt có Ďặc hiệu khác nhau, từ Ďó giúp vi khuẩn thích nghi với Ďiều kiện môi trường sống thay Ďổi

Như vậy, việc tiến hành sàng lọc gen ORF8180 trong các ao, hồ ở Việt Nam sẽ cho phép tìm ra nhiều enzym cắt có Ďặc hiệu mới, Ďồng thời giúp phát hiện sự có mặt của các vi khuẩn lam sinh tổng hợp Ďộc tố gan có trong nguồn nước

1.5 Phương pháp phân tích sự đa dạng gen RFLP

Định nghĩa

RFLP là viết tắt của Restriction Fragnent Length Polymorphism, nghĩa

là Ďa hình Ďộ dài Ďoạn cắt giới hạn Phương pháp RFLP Ďược Bistein và cộng

sự sử dụng lần Ďầu tiên vào năm 1980 Ďể xây dựng bản Ďồ liên kết di truyền ở người Đến năm 1993, Judge và cộng sự Ďã sử dụng phương pháp RFLP Ďể

phân tích sự Ďa dạng trình tự rARN của vi khuẩn Alexandrium [16]

19

Ý nghĩa của phương pháp

a Phân biệt hai cá thể khác nhau

Để phân biệt hai loài sinh vật ta cần dựa vào những Ďặc Ďiểm về hình thái, kích thước, màu sắc, và các yếu tố di truyền khác trong loài Để phân biệt hai cá thể trong cùng một loài, ta phải dựa vào những thay Ďổi về kiểu hình và kiểu gen của các cá thể trong loài Ďó Lấy ví dụ trong loài người, khi quan sát nhanh, ta dễ nhầm lẫn hai người khác nhau Khi muốn phân biệt hai người chắc chắn phải dựa vào dấu vân tay Dấu vân tay có Ďộ chính xác tuyệt Ďối cao vì mỗi người có một vân tay riêng Đối với phương pháp RFLP cũng vậy, việc tạo ra các hình vạch Ďặc trưng của ADN sau khi bị cắt bằng các enzym giới hạn cho phép quan sát những thay Ďổi ở mức Ďộ phân tử, bởi phương pháp dựa vào phân tích ADN genom- một yếu tố di truyền thay Ďổi nhiều nhất trong tế bào sống

b Phát hiện những rối loạn trong bệnh lý

Về y học, RFLP giúp phân tích ADN genom, từ Ďó chỉ ra những căn nguyên gây rối loạn sinh lý trên người Nói cách khác, RFLP giúp phát hiện những thay Ďổi di truyền nhỏ nhất liên quan Ďến protein mất chức năng, enzym mất hoạt tính thông qua những hình vạch ADN có chiều dài khác nhau sau khi cắt với enzym giới hạn

Ứng dụng

Phương pháp RFLP rất hữu ích trong việc chẩn Ďoán bệnh di truyền hoặc các loại bệnh lây nhiễm Phương pháp RFLP cho phép phân biệt từng cá thể các chủng vi sinh vật gây bệnh với nhau, cung cấp số liệu chính xác về cách lây nhiễm và lan ra của chủng gây dịch Từ Ďó, Ďóng góp hiệu quả cho nghiên cứu dịch tễ học khi cần Ďề ra các chiến lược phòng bệnh

Bên cạnh Ďó, RFLP còn giúp lập bản Ďồ gen, xác Ďịnh số bản sao của gen, phân tích cấu trúc và chức năng gen, Ďịnh vị gen chịu trách nhiệm cho các rối loạn di truyền, xác Ďịnh nguy cơ mang bệnh, và xét nghiệm phả hệ

20

RFLP cũng Ďược ứng dụng trong nghiên cứu di truyền ở nhiều Ďối tượng như một chỉ thị Ďồng trội, giúp phân biệt Ďược các cá thể Ďồng hợp tử hoặc dị hợp tử

Cơ sở kĩ thuật

Phương pháp RFLP ban Ďầu Ďược tiến hành chủ yếu nhờ các enzym cắt

sẽ cho phép phân tích toàn bộ ADN genom Sau khi PCR Ďược phát minh, người ta dựa trên phản ứng này Ďể phân tích những sự thay Ďổi ở các vùng nhỏ ADN

2 Cắt ADN bằng enzym giới hạn

Sản phẩm ADN làm sạch ở trên Ďược phân tích với các enzym giới hạn

Ďã lựa chọn từ trước Việc cắt nhỏ ADN bằng các enzym giới hạn Ďể lại những Ďoạn nhỏ có kích thước xem Ďược trên gel Ďiện di giúp phân biệt các trình tự gen khác nhau từ cùng một nguồn gốc

3 Quá trình Ďiện di

Phương pháp Ďiện di cho phép phân tách các Ďoạn ADN có kích thước khác nhau trên gel khi di Ďộng từ cực âm Ďến cực dương Gel agarose Ďược sử dụng như một dụng cụ rây cho phép các phân tử kích thước nhỏ chui qua nhanh hơn các phân tử kích thước lớn Khoảng cách di Ďộng của các phân tử theo thời gian là một Ďồ thị hàm số log và phụ thuộc vào gel agarose Tốc Ďộ dịch chuyển của ADN khi Ďiện di phụ thuộc vào kích thước gel và số vôn của dòng Ďiện Số vôn càng cao các phân tử di Ďộng càng nhanh Nhưng dòng Ďiện quá lớn sẽ làm gel nóng lên, do Ďó ADN không tạo thành vạch rõ Để xem Ďược ADN ta dùng Bet là một chất màu bám vào ADN một cách Ďặc hiệu và

21

quan sát Ďược dưới Ďèn UV Sau Ďiện di, mỗi ADN Ďược phân tích sẽ tạo nên một hình vạch Ďặc trưng

4 Chuyển ADN từ gel sang màng

ADN cần loại trừ purin bằng HCl pha loãng và biến tính bằng NaOH trước khi chuyển sang màng Việc loại trừ purin giúp phân tử ADN chuyển sang màng một cách hiệu quả hơn Còn việc biến tính ADN tạo ra các phân tử Ďơn cần thiết Ďể có thể lai ghép trong giai Ďoạn tiếp theo Sau khi xử lý bằng HCl và NaOH xong, ADN sẽ Ďược chuyển từ gel sang màng nitrocellulose hoặc nilon dựa trên nguyên tắc mao dẫn, hoặc dùng máy hút chân không tự Ďộng, hoặc máy truyền Ďiện di Sau Ďó, Ďể cố Ďịnh các liên kết giữa phân tử ADN với màng, ta cần ủ màng ở nhiệt Ďộ cao trong chân không hoặc xử lý màng dưới tia UV

5 Giai Ďoạn lai ghép

ADN sau khi chuyển sang màng lai sẽ Ďược lai ghép với các ADN dò

Ďã Ďánh dấu phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang Ďể phát hiện Một Ďiều rất quan trọng là phải bão hòa màng bằng ADN trung tính như ADN tinh trùng cá hồi

Ďể tránh hiện tượng ADN gắn lên màng một cách không Ďặc hiệu Các lai ghép Ďặc hiệu lên tới vài chục, thậm chí vài trăm nucleotide sẽ tạo ra liên kết rất bền vững hơn nhiều so với các liên kết khác không Ďặc hiệu Do vậy, cần lai ghép ADN dò và ADN Ďích ở nhiệt Ďộ cao trong thời gian từ vài tiếng Ďến qua Ďêm

Ďể loại trừ những lai ghép không Ďặc hiệu Ngoài ra, các yếu tố như pH, lực ion của dung dịch phản ứng cũng ảnh hưởng tới hiệu quả lai ghép

6 Biện pháp Ďánh dấu ADN

Để Ďánh dấu ADN, Ďầu tiên người ta phải chọn ADN dò làm khuôn Sau Ďó, Ďánh dấu ADN bằng Ďồng vị phóng xạ, dNTP, biotin, digoxigenin hoặc các chất phát quang

7 Quá trình phát hiện những vạch lai ghép

22

Sau khi lai ghép, màng sẽ Ďược rửa với các Ďệm NaCl và chất xà phòng

Ďể loại trừ ADN còn lại Việc rửa màng rất quan trọng cho lúc Ďọc kết quả Nồng Ďộ NaCl trong Ďệm rửa càng thấp thì hiệu quả rửa màng càng cao Trên

cơ sở Ďó người ta phải tiến hành rửa màng nhiều lần với các dung dịch muối nồng Ďộ giảm dần Ďể loại dần phân tử ADN dò gắn không Ďặc hiệu Thêm nữa nhiệt Ďộ càng cao thì hiệu quả loại bỏ ADN dò càng tốt Vì vậy cần Ďiều chỉnh nồng Ďộ NaCl và nhiệt Ďộ Ďể chỉ còn lại ADN Ďích trên màng Với ADN dò Ďánh dấu bằng Ďồng vị phóng xạ 32P hoặc chất phát quang, các vạch lai ghép Ďược hiện rõ trên phim sau khi cho màng tiếp xúc trực tiếp một tấm phim ảnh trong khoảng thời gian nhất Ďịnh Còn với ADN dò Ďược Ďánh dấu bằng biotin hoặc dioxigenin, ta cần tiếp tục xử lý màng với những phức hợp kháng thể-enzym Cụ thể là kháng thể kháng bitoin hoặc dioxigen Ďược gắn với một enzym xúc tác các phản ứng màu Khi kháng thể kết hợp với những kháng nguyên Ďánh dấu các ADN dò, enzym gắn trên kháng thể sẽ xúc tác chuyển hóa cơ chất và giải phóng các phân tử màu Nhờ Ďó, ADN dò Ďược hiện lên trực tiếp trên mặt màng và tạo hình Ďặc hiệu ADN genom Ďược phân tích

Tóm lại, với mỗi enzym Ďược lựa chọn Ďể phân tích Ďa dạng di truyền

sẽ cho một kiểu hình vạch khác nhau tương ứng với sự xuất hiện của các vị trí cắt của enzym Ďó trên gen Do Ďó, khi sử dụng nhiều enzym giới hạn trong phân tích RFLP, càng nhiều trình tự nhận biết Ďược tìm kiếm trên Ďoạn, càng thấy sự thay Ďổi rõ ràng hơn, từ Ďó có thể Ďánh giá sự tương Ďồng một cách chính xác hơn Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3 enzym giới hạn Ďể phân tích sự Ďa dạng và chỉ thực hiện 3 bước Ďầu

23

CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguyên liệu

- Mẫu vi khuẩn lam:

12 mẫu nước thu thập trong tự nhiên, 2 chủng M aeruginosa S3 và S4

từ bộ sưu tập chủng vi sinh vật của Viện Hải Dương học Nha Trang

Các mẫu Ďược thu thập tại 9 ao, hồ khác nhau là Bách Khoa, Cầu Diễn,

Mê Linh, Sơn Tây, Thành Công, Từ Sơn, Thăng Long, Phúc Thọ, Tây Tựu, Hoài Đức Thời gian thu mẫu là từ tháng 3 năm 2014 cho Ďến tháng 8 năm

2014

Các mẫu nước thì chỉ lấy trên lớp nước mặt, lấy liên tục hàng tháng và lưu ý bảo quản mẫu trong lạnh trước khi Ďưa về phòng thí nghiệm

- 2 chủng vi khuẩn biến nạp (New England Biolabs_NEB, Mỹ):

Chủng E coli ER3081: F- l- fhuA2 lacZ::T7 gene1 [lon] ompT gal

attB::(pCD13-lysY, lacIq) sulA11R(mcr-73::miniTn10-TetS)2 [dmc] 210::Tn10-TetS) endAI D(mcrC-mrr)114::IS10 D)

R(zgb-Chủng E coli ER2683: F′proA+B+ lacIq Δ(lacZM15) (KanR)

miniTn10/λ− fhuA2 glnV44 e14− rfbD1 relA1 endA1 spoT1 thi-1 mrr)114::IS10 Δ(lacI-lacA)200

Δ(mcrC Plasmid pSAPv6 (25 ng/µl), pRRS (50 ng/µl) (NEB)

2.1.2 Hóa chất và môi trường

Hóa chất:

- Các hóa chất của Công ty NEB, Mỹ gồm:

Q5 Hot Start DNA polymerase, Q5 reaction buffer, Phusion Fidelity DNA polymerase, Taq DNA polymerase, Thermopol buffer, Taq 2X Master Mix, dNTP, MgCl2, Primer LF và LR, Primer SF và

High-24

SR, Primer pUC NEB1248 và NEB1271, Antarctic phosphatase, T4

ligasa, S-adenymethionine, NEBuffer 4, BSA, BamHI, BglII, NdeI,

PstI, AluI, Hpy188I, HpyCH4III, Gel loading Dye, Marker ADN 1 kb,

Marker ADN Phi X 174 – HaeIII

- Các hóa chất của Zymo Research, Mỹ gồm: DNA clean Concentrator 25- Kit, DNA clean Concentrator 5- Kit

- Môi trường LB thạch: môi trường LB lỏng có thêm 1,5% agar

- LB + Chl: Chloramphenicol Ďược thêm vào môi trường LB ở nồng Ďộ

- Máy ly tâm nhiệt Ďộ phòng Eppendorf 5415D (Harlow Scientific, Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh Labofuge 400R (Thermo Scientific, Mỹ)

- Tủ Ďông lạnh WiseCryo -30°C (DAIHAN Scientific, Hàn Quốc)

- Máy PCR Applied System (ABI, Mỹ)

- Máy lắc (Biosan, Latvia)

- Tủ ấm (ESCO, Singapore)

- Máy Ďiện di ngang (Thermo Scientific, Mỹ)

2.2 Phương pháp

2.2.1 Chọn lọc gen in silico gen thuộc họ HauI

Tiến hành tìm kiếm các gen có trình tự axit amin giống với trình tự của

HauI bằng phần mềm BLASTP trên NCBI Có hai cách Ďể BLASTP trình tự

25

HauI trên NCBI Cách thứ nhất là BLASTP toàn bộ trình tự axit amin của HauI Cách thứ hai là BLASTP mã truy cập của HauI trên GenBank là

ABX04580 Kết quả tìm Ďược sẽ là một danh sách các gen tương tự với HauI

có nguồn gốc từ nhiều chủng vi khuẩn khác nhau với sự tương Ďồng xuất hiện trên khắp chiều dài phân tử Các gen mà có motif cắt Ďặc trưng D-EXK sẽ Ďược chọn và kiểm tra lần nữa trên hệ thống phân tích enzym giới hạn-sửa Ďổi REBASE Ďể chắc chắn Ďó Ďúng là một gen mã hóa enzym giả Ďịnh Khi Ďó ta mới lựa chọn gen Ďể tách dòng

2.2.2 Tách chiết ADN tổng số

Mẫu nước Ďược cô Ďặc bằng ly tâm ở tốc Ďộ 4.000 vòng/phút trong 8 phút và thu lại 50 µl cặn tế bào trong ống eppendorf 1,5 ml Sau Ďó, rửa 3 lần với 3 ml TE và bảo quản ở -30oC trước khi tách chiết ADN

Có rất nhiều phương pháp trước Ďây Ďược sử dụng Ďể tách chiết ADN

vi khuẩn, nhưng chúng tôi chỉ chọn ra 2 cách thức tiêu biểu nhất cho

Cyanobacteria là tách chiết bằng kit và tách chiết bằng phenol

2.2.2.1 Tách chiết bằng phenol

Thực hiện theo phương pháp của Kurmayer, 2003 [20] và có cải biên

Các bước thực hiện gồm:

 Ly tâm mẫu 3.000 vòng/phút trong 2 phút

 Thêm 500 µl TE (10 Tris/1 EDTA)

 Thêm 50 µl SDS 10% và 50 µl lyzozym nồng Ďộ 50 mg/ml, ủ ở 70oC trong 15 phút

 Thêm 12 µl protease K nồng Ďộ 20 mg/ml, ủ 55oC trong 40 phút

 Thêm 600 µl phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), lắc mạnh,

ly tâm 12.000 vòng/phút trong 30 phút

 Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới, xử lý tiếp với 400 µl chloroform, lắc mạnh, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút

26

 Chuyển dịch nổi sang ống eppendorf mới, thêm EtOH 100% có bổ sung NaCl 0,5M

 Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút Ďể thu ADN tủa

 Rửa tủa hai lần trong EtOH 70% Sau Ďó ly tâm 12.000 vòng/phút trong

5 phút

 Để khô ADN và giữ trong 20 µl TE

2.2.2.2 Tách chiết ADN tổng số bằng Dneasy Plant Mini Kit

Quy trình tách chiết Ďược thực hiện theo Eva Schober, 2006 [49]

Các bước thực hiện gồm:

 Ly tâm mẫu 3.000 vòng/phút trong 2 phút

 Thêm 400 µl Ďệm AP1 và 4 µl RNase, ủ 65oC trong 10 phút, lắc 2-3 lần

 Thêm 500 µl AW2, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ nước qua cột

 Thêm 100 µl TE, Ďợi 5 phút, ly tâm 1 phút 8.000 vòng/phút, sau Ďó thu lại ADN tinh sạch

Kiểm tra ADN tổng số trên gel agarose 0,8%

2.2.3 Khuyếch đại gen ORF8180

Gen ORF8180 có kích thước 3000 bp Ďược khuyếch Ďại với cặp mồi Ďặc hiệu tự thiết kế

27

Thành phần phản ứng gồm 0,5 µl polymerase Q5 Hot Start hoạt Ďộ 1U,

10 µl buffer Q5 polymerase 5x, 1 µl dNTP 10 mM, 0,2 µl mồi xuôi LF 100

µM và 0,2 µl mồi ngƣợc LR 100 µM, H2O cho Ďủ 60 µl Mỗi mẫu Ďƣợc thử ở

2.2.4 Tách sản phẩm PCR lần 1 trên gel agarose và thực hiện PCR lần 2

1 Tách sản phẩm PCR lần 1 trên gel agarose

Sau khi tinh sạch sản phẩm PCR lần 1 bằng kit, tạp nhiễm vẫn chƣa Ďƣợc loại bỏ hoàn toàn nên phải tiếp tục tinh sạch lần 2 bằng gel agarose 0,8% Khi ADN Ďã tách rời hoàn toàn khỏi tạp nhiễm, tiếp tục tinh sạch lại ADN Ďích bằng kit Zymoclean Gel DNA Recovery và giữ trong 20 µl TE

2 PCR lần 2

Thực hiện PCR lần hai với ADN tinh sạch Thể tích mỗi phản ứng là 60

µl gồm 0,5 µl Phusion polymerase hoạt Ďộ 1U, 10 µl buffer Phusion polymerase 5x, 1 µl dNTP 10 mM; 0,2 µl mồi xuôi LF 100 µM và 0,2 µl mồi ngƣợc LR 100 µM, 2 µl MgCl2 nồng Ďộ 50 mM Làm 4 ống phản ứng với tổng thể tích 240 µl Chu trình nhiệt của phản ứng gồm giai Ďoạn khởi Ďầu 98oC 1 phút, sau Ďó là 10 chu kì lặp lại: 98oC 10 giây, 72oC 2 phút và cuối cùng là hoàn thiện quá trình kéo dài chuỗi ở 72oC 5 phút

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng Ďiện di trên gel agarose 0,8%

Tinh sạch sản phẩm PCR lần 2 bằng kit DNA Clean & Concentrator-25

và giữ trong 50 µl

28

2.2.5 Tách dòng gen

Thực hiện cắt và nối sản phẩm PCR lần hai Ďã Ďược làm sạch

a Phản ứng cắt

ADN Ďược cắt với BglII và NdeI Ďể nối với vectơ pSAPv6, cắt với

BglII và PstI Ďể nối với pRRS

Tổng thể tích dung dịch phản ứng 200 µl gồm

 NEBuffer3 10x: 20 µl

 BSA 100x: 2 µl

 Sản phẩm PCR: 15 µl

 3 µl BglII (10 U/µl) và 2 µl NdeI (20 U/µl) Ďể nối với (pSAPv6), hoặc

3 µl BglII và 2 µl PstI (20 U/µl) Ďể nối với (pRRS)

 H2O: 158 µl

Phản ứng cắt Ďược ủ 37°C trong 1 giờ Sau Ďó, ADN Ďược làm sạch bằng kit DNA Clean & Concentrator-5

b Phản ứng nối

Sản phẩm ADN sau khi cắt sẽ có Ďầu cuối nối lại Ďược với plasmid

Ďã cắt với enzym tương ứng và loại gốc phosphat bằng Antarctic phosphatase Phản ứng nối có tổng thể tích là 20 µl gồm:

Ủ ở nhiệt Ďộ phòng trong 1 giờ

2.2.6 Biến nạp ADN tái tổ hợp vào E coli

a Phương pháp tạo tế bào khả biến sử dụng CaCl 2 :

Hai chủng vi khuẩn ER3081 và ER2683 Ďược nuôi qua Ďêm ở 37°C

trên môi trường LB thạch Lấy một khuẩn lạc cấy vào môi trường 50 ml LB,

29

nuôi trên máy lắc ở tốc Ďộ 300 vòng/phút trong 3 giờ ở 37°C, mật Ďộ tế bào là 5x107 CFU/ml (không vượt quá 108 tế bào/ml)

Các bước tiếp theo Ďược tiến hành như sau:

- Ly tâm thu sinh khối ở tốc Ďộ 4.000 vòng/phút trong 8 phút ở 4°C

- Thêm 10 ml CaCl2 0,1 M lạnh Trộn Ďều và ủ trong Ďá 10 phút

- Ly tâm 4.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4°C và Ďổ hết nước nổi

- Thêm 2 ml CaCl2 0,1 M lạnh, chia nhỏ thể tích và bảo quản ở 4°C

b Phương pháp biến nạp:

Các bước thực hiện gồm:

- Thêm 4 µl ADN tái tổ hợp vào 50 µl tế bào khả biến và giữ trong Ďá 30

phút Lưu ý với ADN-pSAP Ďưa vào chủng ER3081 và ADN-pRRS Ďưa vào chủng ER2683

- Sốc nhiệt ở 42°C trong 50 giây và cho lại vào Ďá trong 2 phút

- Hồi phục tế bào bằng cách nuôi tế bào trong 200 µl LB chứa glucose 20

mM và MgCl2 10mM ở 37°C trong 1 tiếng Ďối với chủng ER3081 và trong 15 phút Ďối với chủng ER2683

- Cấy chủng ER3081 biến nạp trên hộp Petri LB + Chl và chủng ER2683 trên hộp Petri LB + Amp, sau Ďó Ďể nuôi qua Ďêm ở 37°C

2.2.7 Kiểm tra E coli tái tổ hợp bằng PCR

Chủng vi khuẩn tái tổ hợp mọc trên trên hộp Petri Ďược kiểm tra sự có mặt của gen ORF8180 Các bước thực hiện gồm:

- Dùng một que tăm vô trùng lấy một khuẩn lạc

- Cho vào trong 100 µl H2O, ủ 95°C trong 5 phút Ďể phá vỡ tế bào E coli

- Chạy PCR với 1 µl dịch phá vỡ tế bào

Tổng thể tích phản ứng 30 µl gồm: 15 µl Taq Master Mix, 0.1 µl mồi xuôi và 0.1 µl mồi ngược

Các cặp mồi Ďược sử dụng Ďể kiểm tra E coli tái tổ hợp gồm:

- Primer NEB1248 và primer NEB1271 cho pSAPv6 [33]