nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su thiên nhiên

LỜI CAM ĐOAN Tôi Đỗ Công Thịnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài “Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su thiên nhiên” là công t

LỜI CAM ĐOAN

Tôi Đỗ Công Thịnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với đề tài

“Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su thiên nhiên” là công trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tôi thực hiện

dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Nguyễn Lan Hương Số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác

LỜI CẢM ƠN

Tôi Đỗ Công Thịnh xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới PGS.TS.Nguyễn Lan Hương – Bộ môn Công nghệ sinh học – Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã hướng dẫn chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin cảm ơn các thầy cô thuộc Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học C10 đã giúp đỡ dạy bảo tôi trong thời gian làm việc tại phòng thí nghiệm

Bên cạnh đó người thân và bạn bè luôn là động lực, là nguồn động viên tôi đặc biệt là các anh chị và các bạn làm việc cùng tôi tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học C10 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cao su thiên nhiên 3

1.1.1 Cây cao su 3

1.1.2 Mủ cao su thiên nhiên 3

a Thành phần hóa học 3

b Cấu trúc và tính chất 4

1.1.3 Tình hình sản xuất cao su 4

a Tình hình sản xuất cao su trên thế giới 4

b Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam 5

1.2 Vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên 6

1.2.1 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su trên thế giới 6

1.2.2 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su ở Việt Nam 11

1.2.3 Sự phân hủy cao su bằng tập hợp vi sinh vật 12

1.3 Con đường phân hủy cao su 13

1.4 Một số phương pháp đánh giá KNPH cao su bằng vi sinh vật 14

1.5 Một số phương pháp xác định sự biến động của hệ vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử 16

1.5.1 Kỹ thuật DGGE 18

1.5.2 Metagenomics 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Nguồn vi sinh vật 21

2.1.2 Cơ chất thử KNPH cao su của vi sinh vật 21

2.1.3 Thiết bị 21

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 22

2.1.5 Hóa chất 23

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 23

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 24

2.2.2.1 Làm giàu tập hợp vi sinh vật 24

2.2.2.2 Sự giảm khối lượng miếng cao su 24

2.2.2.3 Quan sát sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt miếng cao su bằng kỹ thuật SEM 25

2.2.2.4 Phân tích sản phẩm phân hủy cao su tổng hợp bằng kỹ thuật GPC 25

2.2.2.5 Xác định sự biến động về thành phần vi sinh vật trong mẫu làm giàu theo thời gian 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Làm giàu tập hợp vi sinh vật trong bể làm giàu 29

3.2 Đánh giá sự phân hủy cao su của canh trường làm giàu 29

3.2.1 Sự giảm khối lượng miếng cao su 29

3.2.3 Đánh giá khả năng phân hủy cao su tổng hợp 33

3.3.1 Nghiên cứu sự biến động thành phần vi sinh vật theo thời gian bằng kỹ thuật

DGGE 35

3.3.2 Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật bằng phương pháp metagenomics 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

KNPH Khả năng phân hủy

GPC Sắc ký lọc gel (Gel permeation chromatography)

SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance)

TLC Sắc ký bản mỏng (Thin-Layer chromatography)

HPLC Sắc lý lỏng cao áp (High-pressure liquid chromatography) MSM Môi trường muối khoáng (mineral salt medium)

LB Luria – Bertani Broth

DGGE Điện di biến tính Gradient nồng độ (Denaturing Gradient Gel

Electrophoresis) HPLC-MS Sắc ký lỏng cao áp- khối phổ (High-pressure liquid

chromatography- mass spectrometry)

UV Tia tử ngoại (Ultra violet)

GC Sắc ký khí (Gas Chromatography)

MS Khối phổ (Mass spectrometry)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 : Thành phần hóa học của mủ nước 3

Bảng 2 1: Thành phần môi trường MSM 22

Bảng 2 2: Thành phần môi trường LB 22

Bảng 2 3: Trình tự mồi 806R i sử dụng trong nghiên cứu 28

Bảng 3 1: Sự đa dạng vi sinh vật trong quá trình phân hủy sinh học cao su thiên nhiên của mẫu làm giàu theo thời gian 37

Bảng 3 2: Tỷ lệ một số chi vi sinh vật chính trong mẫu làm giàu theo thời gian nuôi cấy 42

Bảng 3 3: Các chủng vi sinh vật phân lập được 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 1: Công thức hóa học của cao su thiên nhiên 4

Hình 1 2: Sản lượng cao su toàn cầu hàng năm 5

Hình 1 3: Thị phần sản xuất cao su thiên nhiên của Việt Nam 6

Hình 1 4 Con đường phân hủy mủ cao su 13

Hình 1 5: Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng về cấu trúc và chức năng của vi sinh vật trong môi trường 17

Hình 2 1: Sơ đồ nghiên cứu 23

Hình 2 2: Quá trình tiến hành giải trình tự bằng metagenomics 27

Hình 3 1: Sự biến đổi về sinh khối vi sinh vật của bể làm giàu theo thời gian nuôi cấy 29

Hình 3 2: Sự giảm khối lượng miếng cao su theo thời gian 30

Hình 3 3: Ảnh chụp SEM bề mặt miếng cao su theo thời gian nuôi cấy trong mẫu làm giàu 32

Hình 3 4: Sản phẩm phân hủy cao su tổng hợp của mẫu làm giàu theo thời gian nuôi cấy bằng phân tích GPC 34

Hình 3 5: Phổ DGGE của mẫu làm giàu theo thời gian 36

Hình 3 6: Một số ngành chính trong mẫu làm giàu theo thời gian 39

Hình 3 7: Một số bộ vi sinh vật chính trong mẫu làm giàu theo thời gian 40

Hình 3 8: Tỷ lệ loài N facinica trong mẫu làm giàu theo thời gian 43

Hình 3 9: Sự giảm khối lượng miếng cao su sau 30 ngày nuôi cấy của các chủng phân lập và các chủng chuẩn (NVL3, E2) 46

Hình 3 10: Kết quả chạy GPC khi nuôi cấy các chủng đơn trên MSM với nguồn cacbon là cao su tổng hợp sau 30 ngày 47

MỞ ĐẦU

Cao su là thành phần chính của nhiều loại sản phẩm: lốp xe, găng tay cao su, ủng… bởi những đặc tính vượt trội như độ đàn hồi cao, tính chống rách và chống mài mòn Sản lượng cao su toàn cầu năm 2014 đạt khoảng 27,5 triệu tấn bao gồm cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp Dự kiến trong năm 2015 nhu cầu tiêu thụ cao

su thiên nhiên trên toàn thế giới là khoảng 12,3 triệu tấn Các nước Thái Lan, Indonesia, Malaysia, Việt Nam là những nước sản xuất cao su thiên nhiên hàng đầu khu vực Đông Nam Á Năm 2014, Việt Nam đã vươn lên trở thành nước đứng thứ 3 trên thế giới về sản xuất cao su thiên nhiên và giữ vị trí thứ 4 về xuất khẩu cao su

Tại Việt Nam ngành công nghiệp sản xuất cao su thiên nhiên đang mang lại hiệu quả kinh tế cao Từ năm 2006 đến nay xuất khẩu cao su thiên nhiên đạt trên 1

tỷ USD chiếm trung bình khoảng 2 - 3 % tổng kim ngạch xuất khẩu của cả nước và

đã tạo công ăn việc làm cho nhiều lao động Cùng với những lợi ích từ ngành công nghiệp này thì chất thải cao su là một vấn đề đáng lo ngại Chất thải từ ngành công nghiệp sản xuất cao su cũng như các sản phẩm có chứa cao su rất kém phân hủy, dẫn đến các nguy cơ ô nhiễm nghiêm trọng Các biện pháp xử lý cao su thải hiện nay đang được sử dụng rộng rãi là chôn lấp và nhiệt phân Tuy nhiên, các biện pháp này còn nhiều bất cập, việc chôn lấp gây tốn diện tích của bãi chôn lấp, đốt cao su phế liệu để làm nhiên liệu trong các nhà máy gây ra ô nhiễm môi trường và không hiệu quả về kinh tế Phân hủy sinh học cao su đã nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học vì không gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm năng lượng Ngoài ra phân hủy sinh học cao su còn tận dụng được các nguồn cao su phế thải để tái tạo như là nguồn nguyên liệu mới thay thế cho cao su thiên nhiên hiện nay

Các nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cao su được tiến hành trong gần 100 năm qua đã tìm ra nhiều loài vi khuẩn có khả năng phân hủy cao su mạnh như:

Streptomyces, Micromonosopora, Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium, Gordonia… Các vi sinh vật này được chia làm 2 nhóm theo đặc tính sinh trưởng

khác nhau trên cao su Nhóm thứ nhất là xạ khuẩn với vòng sáng xung quanh khuẩn

lạc khi phân lập trên môi trường thạch mủ cao su Nhóm thứ 2 không có vòng sáng

và không phát triển trên môi trường thạch mủ cao su, nhưng chúng phát triển trên cao su như một chất kết dính bắt buộc

Tuy nhiên, việc phân hủy đặc biệt đối với các chất khó phân hủy trong thiên nhiên cần sự tham gia đồng thời của một tập hợp các chủng vi sinh vật với tập hợp các enzyme của quá trình, chứ không phải chỉ là tác động đơn lẻ của một chủng hay của một enzyme Bức tranh này, cho tới nay vẫn chưa được sáng tỏ Để góp phần tìm hiểu khả năng phân hủy cao su cũng như vai trò của tập hợp vi sinh vật phân hủy cao su chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu sự biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân

hủy cao su thiên nhiên”

Các vấn đề cần giải quyết bao gồm:

1 Làm giàu tập hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy cao su

2 Đánh giá khả năng phát triển và phân hủy cao su của canh trường làm giàu

3 Nghiên cứu sự biến động về thành phần vi sinh vật trong canh trường làm giàu theo thời gian bằng kỹ thuật điện di gel biến tính gradient nồng độ (DGGE) và metagenomics

4 Phân lập vi sinh vật từ mẫu làm giàu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cao su thiên nhiên

1.1.1 Cây cao su

Cao su (tên khoa học : Hevea brasiliensis), là cây thân gỗ có thể cao trên 30

m, thuộc họ Đại kích (Euphorbiaceae) và là thành viên có tầm quan trọng kinh tế lớn nhất trong chi Hevea Nó có tầm quan trọng kinh tế là do chất lỏng chiết ra tựa

như nhựa cây (gọi là mủ) được dùng để sản xuất cao su thiên nhiên Nhựa cao su (mủ cao su) màu trắng hay vàng có trong các mạch nhựa mủ ở vỏ cây Các mạch này tạo thành xoắn ốc quanh thân cây theo hướng tay phải, tạo thành một góc khoảng 30 độ với mặt phẳng Khi cây đạt độ tuổi 5 - 6 năm thì người ta bắt đầu thu hoạch mủ Mủ cao su được thu thập trong các bát nhỏ Các cây cao su trồng càng lâu năm thì cho mủ càng nhiều, nhưng chúng sẽ ngừng sản xuất mủ khi đạt độ tuổi

Bảng 1 1 : Thành phần hóa học của mủ nước [2]

b Cấu trúc và tính chất

Mủ cao su (latex) gồm hai phần cơ bản: phần lỏng và phần rắn Phần lỏng chủ yếu là nước và một số chất hòa tan trong nước gọi là serum Phần rắn bao gồm những hạt cao su nguyên chất, các chất không tan trong nước cấu thành hạt huyền phù lơ lửng trong serum Các hạt huyền phù được cấu tạo gồm 2 lớp: lớp bên trong gồm cao su nguyên chất, lớp bên ngoài gồm các protein, lipid,… làm cho các hạt này không dính vào nhau và lơ lửng trong serum Khi lớp ngoài này bị phá hủy thì gây nên hiện tượng đông tụ Tỷ trọng của mủ nước trong khoảng 0,8 – 0,975 g/ml

Tỷ trọng của cao su 0,914 g/ml, tỷ trọng của serum 1,02 g/ml [2]

Cao su thiên nhiên là một hợp chất cao phân tử (polymer) có trong mủ cao su với các đơn phân (monomer) là isoprene có công thức C5H8 Các isoprene liên kết

với nhau tại vị trí cis-1, 4 bằng phản ứng trùng ngưng tạo thành một chuỗi dài có

công thức cấu tạo như sau:

Hình 1 1: Công thức hóa học của cao su thiên nhiên [2]

Ngoài đồng phân cis -1, 4, trong cao su thiên nhiên còn có khoảng 2% mắt xích liên kết với nhau ở vị trí cis - 3, 4 Cao su thiên nhiên tan tốt trong các dung

môi hữu cơ mạch thẳng, mạch vòng và chlorofom Tuy nhiên, cao su thiên nhiên không tan trong rượu và xetone [2]

1.1.3 Tình hình sản xuất cao su

a Tình hình sản xuất cao su trên thế giới

Sản lượng cao su toàn cầu tính từ năm 2000 đến nay luôn luôn tăng cao Từ năm 2010, sản lượng cao su thiên nhiên thế giới hàng năm đã vượt 10 triệu tấn/năm, chiếm trên 40% tổng lượng cao su sử dụng Những quốc gia thuộc hiệp hội sản xuất cao su thiên nhiên (ANRPC) như: Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Ấn

Độ, Campuchia… có sản lượng cao su thiên nhiên tăng hàng năm, đóng góp khoảng

92 - 94% sản lượng cao su thiên nhiên toàn thế giới Tính đến cuối năm 2011, tổng diện tích cao su thiên nhiên trên thế giới đạt 11,84 triệu ha, châu Á chiếm 92,42 % tập trung vào các quốc gia thuộc ANRPC, châu Mỹ: 5,14 % và châu Phi 2,44 % Trong đó đứng đầu là Thái Lan, đạt 3,4 triệu tấn, kế đến là Indonesia, Malaysia, Việt Nam [3]

Tuy nhiên, dẫn đầu năng suất khai thác là Ấn Độ với khoảng 1,8 tấn / ha rồi mới đến Thái Lan 1,77 tấn / ha, Việt Nam đạt 1,7 tấn / ha Nhóm 5 quốc gia tiêu thụ cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới là Trung Quốc (33,5%), Mỹ (9,5%), Ấn Độ (8,7%), Nhật Bản (6,6%) và Malaysia (4,6%) Bốn quốc gia xuất khẩu cao su thiên nhiên lớn nhất thế giới hiện nay là Thái Lan (gần 3 triệu tấn), Indonesia (2,13 triệu tấn), Malaysia (0,95 triệu tấn) và Việt Nam (0,82 triệu tấn), chiếm 87,35% tổng sản lượng xuất khẩu cao su thiên nhiên toàn cầu Theo thống kê của Hiệp hội nghiên cứu cao su Quốc tế - International Rubber Study Group (IRSG) trong năm 2014 ước tính sản lượng cao su thiên nhiên toàn cầu đạt 12,1 triệu tấn [3]

Hình 1 2: Sản lượng cao su toàn cầu hàng năm [3]

b Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam

Ngành cao su xuất hiện ở Việt Nam từ trước năm 1975 và phát triển mạnh

mẽ khi tham gia vào nền kinh tế thị trường Tính từ năm 2000 diện tích trồng cao su tăng từ 400 – 1000 ha vào năm 2014 Cây cao su là một trong 3 sản phẩm nông sản đóng góp nhiều nhất vào kim ngạch xuất nhập khẩu trong những năm qua chỉ sau

gạo và cà phê Giá trị xuất khẩu cao su đã tăng gấp đôi từ 787 triệu USD năm 2005 lên 2,5 tỷ USD năm 2013 và đóng góp khoảng 2,7% trên tổng giá trị xuất khẩu Sản lượng khai thác cao su của Việt Nam có mức tăng trưởng khá cao trung bình 10% hàng năm tính từ năm 2000 Mức sản lượng tăng cao một phần nhờ diện tích trồng liên tục được mở rộng và năng suất cũng không ngừng tăng từ 1,2 lên 1,7 tấn / ha chỉ sau Ấn Độ và Thái Lan [3]

Do không ngừng gia tăng về diện tích trồng cũng như năng suất của cây cao su nên tính đến năm 2014 Việt Nam đã vượt lên trở thành quốc gia sản xuất cao su thiên nhiên cao thứ 3 trên thế giới với sản lượng cả năm đạt khoảng 1 triệu tấn [3]

Hình 1 3: Thị phần sản xuất cao su thiên nhiên của Việt Nam [3]

1.2 Vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên

1.2.1 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su trên thế giới

Các nhà khoa học trên thế giới đã trải qua hàng trăm năm nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cao su từ những nghiên cứu đầu tiên về nấm mốc Hiện nay rất nhiều nơi trên thế giới đã và đang thực hiện các nghiên cứu liên quan đến phân hủy sinh học cao su bằng vi sinh vật bao gồm cả Nhật Bản, Đức, Ấn Độ, Malaisia, Ai Cập, Hàn Quốc cho thấy rõ ràng có rất nhiều sự quan tâm xoay quanh chủ đề này Một số vi khuẩn và xạ khuẩn có khả năng phân hủy (KNPH) cao su đã được tìm ra nhưng quá trình phân hủy sinh học diễn ra chậm Năm 1936, nhà khoa học Spence người Đức đã đưa ra phương pháp phân lập sử dụng đĩa thạch hai lớp, phương pháp này cho phép xác định nhanh các chủng có KNPH cao su nhờ vòng sáng được tạo

thành xung quanh khuẩn lạc [34] Tuy nhiên, một số vi sinh vật có KNPH cao su nhưng không tạo ra vòng sáng xung quanh khuẩn lạc và không phát triển trên môi trường thạch mủ cao su, nhưng chúng phát triển trên cao su như một chất kết dính bắt buộc [5]

Dựa vào đặc tính sinh trưởng và phát triển của các vi sinh vật phân hủy cao

su người ta chia chúng làm hai nhóm khác nhau [27] [28] Nhóm thứ nhất có khả năng chuyển hóa các polyisoprene và tạo vòng sáng trên môi trường thạch mủ cao

su Hầu hết xạ khuẩn thuộc nhóm này, chúng phát triển tương đối yếu trên cao su

thiên nhiên hay cao su tổng hợp bao gồm Streptomyces, Micromonosopora [27]

[22] [23] Nhóm thứ 2 không có vòng phân giải và không phát triển trên môi trường thạch mủ cao su, nhưng chúng phát triển trên cao su như một chất kết dính bắt buộc [5] Các chủng vi sinh vật trong nhóm này phát triển mạnh trên polyisoprene và

thuộc nhóm Corynebacterium, Nocardia, Mycobacterium Một số chủng tiêu biểu của nhóm này như chủng Gordonia polyisoprenivorans VH2 và Y2K, chủng G wesfalica Kb1, và chủng Mycobacterium fortuitum NF4 đã được phân lập [26] [4] Các loài của chi Gordonia được biết đến là các loài có KNPH cao su tốt [5]

Hầu hết vi sinh vật có KNPH cao su là các vi khuẩn Gram dương, trong khi đó

sự phân hủy cao su quan sát được ở vi sinh vật Gram âm là rất ít Hiện tại, chỉ có 2

vi khuẩn Gram âm được tìm thấy là có khả năng phân hủy cao su là chủng

Xanthomonas sp 35Y và chủng Methylibiumsp NS21 [21] [20]

Một số vi sinh vật điển hình phân hủy cao su

 Streptomyces sp

Streptomyces là vi khuẩn Gram dương và hình thành vòng sáng quanh khuẩn

lạc khi nuôi cấy trên môi trường thạch hai lớp Các loài vi sinh vật thuộc chi

Streptomyces thường được nghiên cứu nhiều về khả năng phân hủy sinh học cao su

Năm 2000, Bode HB và cộng sự đã nghiên cứu khả năng phân hủy cao su của

chủng Streptomyces coelicolor 1A Khi cấy chủng S coelicolor 1A trên môi trường

thạch hai lớp ở 300C sau 1 tuần đã nhận thấy chủng này có khả năng phân hủy cao

su nhờ sự hình thành vòng sáng quanh khuẩn lạc Bên cạnh đó nhóm tác giả còn

tiến hành khảo sát sự phân hủy của chủng S coelicolor 1A với cao su tổng hợp Sau

10 tuần nuôi S coelicolor 1A ở 300C với cao su tổng hợp thì hàm lượng protein của canh trường tăng từ 250 μg/ml lên đến 800 μg/ml Kết quả phân tích sắc ký lọc gel (GPC) sau 6 tuần cho thấy sự xự xuất hiện của các khối pic khác nhau ngoài khối

pic cơ sở đại diện cho cao su tổng hợp Qua đó chứng tỏ chủng S coelicolor 1A có khả năng phân hủy cao su tổng hợp Phân tích sản phẩm phân hủy khi ủ S coelicolor 1A với cao su lưu hóa bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) nhận thấy sự xuất

hiện của một số hợp chất Ba hợp chất được xác định bằng cộng hưởng từ hạt nhân (1H-MNR) là: axit 2, 6 – dimethyl – 10 – oxo – undec – 6 - enoic; 5, 6 – methyl –undec – 5 – ene - 2, 9 - dione; 5, 9 - 6, 10 – dimethyl – pentadec - 5, 6, 9 – diene - 2,

13 - dione Tuy nhiên chủng này sau khi bị xử lý đột biến bằng tia tử ngoại (UV) thì

không còn KNPH cao su [6]

Chủng Streptomyces sp K30 được phân lập từ đất tại thành phố Münster

(Đức) Khi cấy chủng này trên đĩa thạch hai lớp thì chúng tạo ra vùng sáng xung

quanh khuẩn lạc Tiến hành gây đột biến Streptomyces sp K30 bằng tia UV thì chủng vẫn còn giữ được khả năng phân hủy cao su Chủng Streptomyces sp K30 có chứa gen lcp được coi là chìa khóa của quá trình phân hủy cao su Tách dòng gen lcp từ chủng Streptomyces sp K30 và biểu hiện thành công trên chủng S lividans

TK23, chủng này vẫn giữ được KNPH cao su [32]

S coelicolor CH13 là vi khuẩn được phân lập từ đất và có khả năng phân hủy

cao su, chủng này tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc khi nuôi cấy trên môi trường

thạch hai lớp Khi ủ S coelicolor CH13 với miếng găng tay cao su sau 6 tuần nhận

thấy khối lượng của miếng găng tay giảm đi khoảng 14,3% Ngoài ra khi quan sát miếng găng tay cao su bằng ảnh chụp từ kính hiển vi điện tử quét (SEM) thấy sự tạo

thành các lỗ trống và sự phát triển bám dính của chủng S coelicolor trên bề mặt

miếng găng tay cao su [33]

 Gordonia sp

Gordonia sp là vi khuẩn Gram dương, các loài Gordonia được phân lập từ

nhiều nguồn khác nhau như: đất, vùng rễ của các cây trồng ngập mặn, đất ô nhiễm

hydrocacbon, người bệnh… Hầu hết các loài thuộc chi Gordonia đều có lợi cho môi trường vì chúng có khả năng phân hủy các polymer thiên nhiên Gordonia là chi có nhiều chủng được biết đến với KNPH cao su mạnh như: G

polyisoprenivorans VH2 và Y2K và G wesfalica Kb1

G polyisoprenivorans là vi khuẩn hiếu khí, Gram dương có khả năng phân

hủy cao su và được phân lập từ nguồn nước bẩn trong lốp ô tô thải đã bị phân hủy

Khi nhuộm Schiff’s với các mẫu găng tay cao su thiên nhiên được ủ cùng chủng G polyisoprenivorans VH2 sau 6 tuần thấy găng tay có màu hồng Chứng tỏ sự xuất

hiện oligomers isoprene có chứa nhóm aldehyde, ketone trong miếng găng tay cao

su, đồng thời có sự phá vỡ số lượng các liên kết đôi trong chuỗi polyisoprene Quan

sát sự phát triển của chủng G polyisoprenivorans VH2 trên cao su thiên nhiên và

cao su tổng hợp bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) sau 2 tuần nuôi cấy nhận thấy

sự phân hủy rõ ràng Sau khoảng 6 tuần nuôi cấy thì có sự hình thành của lớp màng

sinh học trên bề mặt miếng găng tay cao su thiên nhiên G polyisoprenivorans VH2

là một trong những vi khuẩn phân hủy cao su tốt nhất và bộ gen của VH2 đã được

giải toàn bộ trình tự bộ gen G polyisoprenivorans VH2 chứa 5110 trình tự mã hóa protein, người ta đã phát hiện ra sự có mặt của gen lcp [10] [9]

Phân tích các đột biến plasmid của chủng G westfalica Kb1 cho thấy rằng

chủng này đã mất khả năng phát triển trên cao su thiên nhiên như nguồn cacbon duy nhất, các gen ở vị trí 101 kbp megaplasmid gồm 105 khung đọc mở, đóng một vai trò thiết yếu trong phân hủy cao su [9]

 Nocardia sp

Nocardia sp là vi khuẩn Gram đương có mặt trong đất giàu chất hữu cơ Một

số loài thuộc chi Norcadia có khả năng phân hủy cao su như: Nocardia sp 835A,

Nocardia farcinica, Nocardia sp MBR

Nocardia sp 835A phát triển tốt trên cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp, là

một trong những chủng đầu tiên được nghiên cứu về KNPH cao su Các thí nghiệm

cho thấy khi ủ chiếc găng tay cao su với chủng Nocardia sp 835A thì sau 2 tuần

khối lượng cao su giảm đến 75% và 100% sau 8 tuần nuôi cấy Kết quả phân tích

sản phẩm phân hủy bằng sắc ký lọc gel (GPC) đã cho thấy 2 phân đoạn có trọng lượng phân tử 1x104

và 1,6x103 Da, tương ứng với 114 và 19 phân tử isoprene Cả hai phân đoạn được phân tích trên máy quang phổ hồng ngoại cho thấy đó là những dẫn xuất của dolichol aldehyde Các kết quả này được khẳng định khi sử dụng cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR) và (13C-NMR), chúng gồm các nhóm aldehyde và ketone có công thức như sau: OHC - CH2[CH2 - C( - CH3)SH - CH2]n - CH2 - C(O)

- CH3 Tuy nhiên, những nghiên cứu phân hủy sinh học cao su của chủng này không được tiếp tục ở mức độ hóa sinh cũng như mức độ phân tử [37] [24]

Nocardia sp MBR là một loại vi khuẩn được phân lập từ các mẫu lốp xe được thải ra môi trường khu vực Alexandria, Ai Cập Khi tiến hành ủ chủng Nocardia sp

MBR với miếng găng tay cao su (1x1 cm) sau 3 tuần và tiến hành quan sát bằng

SEM thì nhận thấy sự sinh trưởng và phát triển nhanh của chủng Nocardia sp MBR

tạo thành một lớp màng vi sinh vật trên bề mặt miếng găng tay cao su Ở một thí nghiệm khác Berekaa đã tiến hành nhuộm Schiff’s cho các miếng găng tay cao su

có kích thước khác nhau khi ủ với chủng Nocardia sp MBR sau 8 tuần và nhận

thấy cả hai miếng găng tay đều có màu tím Điều này chứng tỏ rằng đã có sự tạo thành nhóm aldehyde trong sản phẩm phân hủy cao su Bên cạnh đó tác giả còn tiến hành khảo sát sự tạo thành CO2 trong khi nuôi cấy chủng Nocardia sp MBR với

miếng găng tay cao su sau 8 tuần là 1,2% [29]

 Xanthomonas sp 35Y

Chủng Xanthomonas sp 35Y là vi khuẩn Gram âm, hình thành vùng sáng

quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch mủ cao su Tiến hành ủ 0,2 mg enzyme thô

được lấy từ chủng Xanthomonas sp 35Y với 5 mg cao su thiên nhiên trong ống

nghiệm (đường kính trong là: 25 mm) ở 300C Khoảng 60% trọng lượng của cao su thiên nhiên giảm đi chỉ sau 7 ngày nuôi Phân tích sản phẩm phân hủy bằng GPC cho thấy các hợp chất có trọng lượng dưới 104 và 103 tương ứng với 113 và 2 đơn vị isoprene Kết quả phân tích bằng cộng hưởng từ hạt nhân (1

H-NMR và 13C-NMR) cho thấy các sản phẩm phân hủy có mặt của hai nhóm chức aldehyde và ketone và

có công thức sau đây: OHC - CH2 [CH2 - C(- CH3)SH - CH2]n - CH2 - C(O) - CH3

Phân tích sắc ký khí (GC) và phân tích khối phổ (MS) đã xác định các hợp chất ở phân đoạn có trọng lượng phân tử thấp là acetonyldiprenylacetoaldehyde [38]

Chủng Xanthomonas sp 35Y có chứa gen roxA được cho là chìa khóa của sự

phân hủy cao su của nhóm vi khuẩn Gram âm [7] [21]

 Methylibium sp NS21

Methylibium sp NS21 là vi khuẩn Gram âm được phân lập từ đất bởi Imai và cộng sự (2011) Chủng Methylibium sp NS21 tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc khi được phân lập trên môi trường thạch mủ cao su Khi ủ chủng Methylibium sp NS21

ở 300C trong 3 ngày trên đĩa thạch hai lớp và tiến hành nhuộm Schiff’s thì nhận

thấy xung quanh các khuẩn lạc của chủng Methylibium sp NS21 thì có màu tím

Chứng tỏ đã có sự tạo thành của aldehyde trong quá trình phân hủy cao su của

chủng Methylibium sp NS21 Ngoài các thí nghiện trên nhóm tác giả còn tiến hành khảo sát các sản phẩn tạo thành của chủng Methylibium sp NS21 khi ủ với cao su tổng hợp poly(cis - 1, 4 - isoprene) sau 50 và 70 ngày bằng GPC Kết quả cho thấy chủng Methylibium sp NS21 có khả năng phân hủy yếu ở 50 ngày và tạo ra sản

phẩm có khối lượng khoảng 400 kDa Tuy nhiên sau 70 ngày nuôi cấy thì sản phẩm

phân hủy của chủng Methylibium sp NS21 có khối lượng phân tử khoảng 13 kDa

[20]

1.2.2 Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su ở Việt Nam

Nghiên cứu vi sinh vật phân hủy cao su thiên nhiên đã được thế giới quan tâm và biết đến từ rất lâu, nhưng ở Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ Những nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam về vi sinh vật phân hủy cao su mới được nghiên cứu bởi Trang và cộng sự (2013) Nghiên cứu đã tiến hành phân lập vi sinh vật từ chất thải của nhà máy sơ chế cao su Cẩm Thủy và tìm ra được một số chủng

vi sinh vật có KNPH cao su là: Streptomyces griseorubens, S albogriselus, Nocardiopsis alba Các chủng này được tìm ra nhờ các kết quả phân tích sự giảm

khối lượng, sự tăng hàm lượng nitơ và sự phát triển của các chủng trên bề mặt găng tay cao su bằng SEM Kết quả giảm khối lượng của các miếng cao su khi ủ với 4 chủng trong 30 ngày thấy khối lượng giảm đi khoảng 2,05 – 4,02% Hàm lượng nitơ

tổng trong các mẫu được ủ với găng tay cao su thu được gấp khoảng 10 – 20 lần so với mẫu kiểm chứng Khi quan sát bằng SEM nhận thấy các chủng không chỉ sinh trưởng và phát triển bám dính mà chúng còn ăn sâu vào các miếng găng tay cao su Đây là công trình công bố đầu tiên về vi sinh vật phân hủy cao su và là một trong số

ít những công trình công bố về vi sinh vật phân hủy các hợp chất khó phân hủy ở Việt nam Tuy nhiên hiện tại nhóm chưa đi sâu vào phân tích các enzyme có liên quan đến sự phân hủy cao su của các chủng này [11]

Đào Việt Linh (2013) đã phân lập thành công một tập hợp vi khuẩn phân hủy cao su từ canh trường làm giàu với nguồn cacbon là cao su thiên nhiên Tập hợp này gồm 3 chủng vi khuẩn riêng biệt là: H2DA1, H2DA2, NVL3 Khả năng phân hủy cao

su của chúng đã được đánh giá bằng thí nghiệm phân hủy cao su thiên nhiên cũng như cao su tổng hợp Phân tích các sản phẩm phân hủy bằng GPC nhận thấy chỉ có chủng NVL3 thể hiện khả năng phân hủy cao su, trong khi đó H2DA1và H2DA2không thể hiện khả năng phân hủy Chủng NVL3 khi phân hủy tạo ra các sản phẩm

có khối lượng phân tử khoảng 50 – 100 kDa [25]

Khi toàn bộ genome của NVL3 đã được giải bằng hệ thống giải trình tự thế

hệ mới, cho thấy sự tồn tại của một trình tự tương đồng gene lcp trong NVL3 Trình

tự này có độ tương đồng tương ứng là 54, 63 - 65 và 73 - 77% so với các gene lcp ở các loài Streptomyces, Gordonia và Nocardia Giải trình tự gen 16S rRNA của chủng NVL3 nhận thấy chủng này thuộc loài Nocardia farcinica với 99% tương đồng so với các chủng Nocardia farcinica đã biết [25]

1.2.3 Sự phân hủy cao su bằng tập hợp vi sinh vật

Mặc dù đã có lịch sử hơn 100 năm nghiên cứu về vi sinh vật phân hủy cao

su Nhưng hầu hết tất cả nghiên cứu đều tập chung vào KNPH của các chủng đơn cùng các gen liên quan mà chưa quan tâm đến KNPH của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su Các tài liệu liên quan đến sự phân hủy cao su của tập hợp

vi sinh vật gần như là không có

1.3 Con đường phân hủy cao su

Hiện nay, các nghiên cứu đã chỉ ra con đường cơ bản phân hủy cao su là

chuyển hóa poly (cis - 1, 4 - isoprene) thành dẫn xuất oligo (cis - 1, 4 - isoprene)

bao gồm các nhóm aldehyde, ketone… Có sự tham gia của 2 enzyme là Lcp clearing zone) và RoxA (rubber – cleavage - oxygenase) Con đường phân hủy sinh học cao su thiên nhiên được mô tả như hình sau:

(latex-Hình 1 4 Con đường phân hủy mủ cao su [20]

Hiện tại, có hai loại enzyme đã được phát hiện và được xem như chìa khóa của quá trình phân hủy cao su thiên nhiên Đầu tiên là enzyme Lcp được mã hóa bởi

gen lcp Loại enzyme này được tìm thấy trong chủng Streptomyces sp K30 [32] Trong quá trình phân hủy bởi chủng này poly (cis - 1, 4 - isoprene) được phân hủy thành dẫn xuất oligo (cis - 1, 4 - isoprene) bao gồm nhóm aldehyde, keton và sau đó

là acid tương ứng bởi enzyme oxidoreductase OxiAB được mã hóa bởi gen oxiAB bên cạnh gen lcp theo con đường phân hủy ß oxi hóa Gen lcp được tìm thấy trong Nocardia farcinia E1, Gordonia polyisopreneivorans VH2, Gordinia westfalica

Kb1 [10] [19]

Enzyme thứ hai là enzyme RoxA được tìm thấy trong Xanthomonas sp 35Y [21] RoxA được dự đoán tham gia vào quá trình cắt nối đôi trong poly (cis - 1, 4 -

isoprene) thành dẫn xuất oligo (cis - 1, 4 - isoprene) với nhóm aldehyde và keton

bao gồm 12 – oxo - 4, 8 – dimethyltrideca - 4, 8 – diene – 1 - al Mặc dù chức năng của RoxA và Lcp là tương tự nhau nhưng trình tự amino axit của RoxA là không tương đồng với Lcp [7] [38]

1.4 Một số phương pháp đánh giá KNPH cao su bằng vi sinh vật

 Đánh giá sự giảm khối lượng của miếng cao su

Tsuchii và cộng sự (1996) khi nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước, diện

tích bề mặt của các miếng găng tay cao su tới KNPH của chủng Nocardia sp 835A

bằng sự giảm khối lượng của những miếng găng tay cao su Nghiên cứu đã chỉ ra

KNPH những miếng dài của chủng Nocardia sp 835A tuyến tính với diện tích bề

mặt của các miếng găng tay Khi nuôi cấy với những miếng mỏng và rộng thì chủng

Nocardia sp 835A sẽ phát triển nhanh và phân hủy mạnh, với những miếng ngắn

và hẹp KNPH phân hủy miếng găng tay cao su chậm và kém hơn [36] Claudia Gallert (2000) đã sử dụng phương pháp giảm khối lượng để đánh giá KNPH của

Streptomyces sp La7 khi nuôi cấy với găng tay cao su Kết quả sau 70 ngày nuôi

cấy, khối lượng miếng găng tay cao su giảm 30% [13] Năm 2012, Watcharakul và cộng sự khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình phân hủy găng tay cao su của chủng

S coelicolor CH13 bằng cách xét sự giảm khối lượng của miếng găng tay cao su ở

các điều kiện nguồn dinh dưỡng khác nhau [33] Năm 2013, Trang và cộng sự đã tiến hành đánh giá sự giảm khối lượng của cao su thiên nhiên và cao su loại protein

khi ủ với các chủng S griseorubens, S albogriselus, Nocardiopsis alba trong 4

tuần Sau 4 tuần khối lượng của cao su thiên nhiên giảm khoảng 2,05 – 4,28%, khối lượng của các miếng cao su loại protein giảm được 2,05 – 5,65% [11]

 Quan sát sự thay đổi bề mặt của cao su bằng kỹ thuật SEM

Claudia Gallert (2000) cho thấy sự thay đổi bề mặt của miếng găng tay cao

su sau 70 ngày nuôi cấy với Streptomyces sp La7 bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) [13] Warneke và cộng sự (2007) đánh giá KNPH của các chủng G polyisoprenivorans VH2, N takedensis WE30 và N nova L1b bằng cách quan sát

sự thay đổi bề mặt của cao su sau 5 tuần nuôi cấy bằng SEM [39] Watcharakul và cộng sự (2012) cũng đã dùng SEM để nhận biết sự thay đổi bề mặt của miếng găng

tay cao su sau 4 tuần nuôi cấy với S coelicolor CH13 [33] Cả ba nghiên cứu trên

đều nhận thấy sự phát triển của vi sinh vật trên miếng găng tay cao su và hình thành một lớp màng vi sinh vật trên đó Trang và cộng sự (2013) tiến hành quan sát sự

sinh trưởng và phát triển của các chủng S griseorubens, S albogriselus, Nocardiopsis alba trên các miếng găng tay cao su thiên nhiên Nhận thấy sự sinh

trưởng và phát triển bám dính của các chủng trên bề mặt không chỉ vậy chúng còn

ăn sâu vào miếng găng tay cao su sau 30 ngày nuôi cấy [11]

 Khảo sát các sản phẩm tạo thành của quá trình phân hủy

Sản phẩm của quá trình phân hủy cao su vẫn còn là một ẩn số Tuy nhiên cũng có rất nhiều phương pháp khác nhau để nhận biết sản phẩm của quá trình phân hủy được tạo ra

 GPC: dựa vào pic xuất hiện khi chạy sắc ký lọc gel, người ta có thể đánh giá được mức độ phân hủy của các chủng, dự đoán được kích thước sản phẩm phân hủy tương ứng với pic đó Để từ đó có sự so sánh KNPH giữa các chủng Ibrahim và cộng sự (2006) dùng GPC để phân tích sản phẩm của quá trình phân hủy

mủ cao su bởi các chủng N farcinia và Thermomonospora curvata [19] Broker và cộng sự (2008) khi đánh giá KNPH của các chủng S lividans TK23 tái tổ hợp sau 8

tuần nuôi cấy với 0,25% cao su và 0,5% glucose cũng đã dùng GPC để xác định khối lượng của sản phẩm phân hủy [10] Imai và cộng sự (2011) dùng GPC để phân

tích sản phẩm của quá trình phân hủy găng tay cao su bởi các chủng Streptomyces

sp LCIC4, Actinoplanes sp OR16 và Methylibium sp NS21 có KNPH cao su thiên

nhiên và cao su tổng hợp Kết quả phân tích GPC sau khi nuôi cấy các chủng này

với cao su tổng hợp poly(cis - 1, 4 - isoprene) cho thấy chủng LCIC4 sau 50 ngày

nuôi cấy xuất hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng lượng phân tử 23 kDa, chủng OR16 sau 50 ngày nuôi cấy xuất hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng

lượng phân tử 12 kDa và chủng Methylibium sp NS21 sau 50 ngày nuôi cấy xuất

hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng lượng phân tử xung quanh khoảng 400

kDa (pic ban đầu của poly(cis - 1, 4 - isoprene) tương ứng với sản phẩm có trọng

lượng phân tử 700 kDa) Dựa và kết quả phân tích GPC các tác giả đã kết luận

chủng Methylibium sp NS21 phân hủy khá yếu sau 50 ngày so với LCIC4, OR16 Tuy nhiên kết quả phân tích phổ GPC của Methylibium sp NS21 ở 70 ngày có xuất

hiện pic tương ứng với sản phẩm có trọng lượng phân tử 13 kDa [20]

 1HNMR: Imai và cộng sự (2011) khi nghiên cứu sản phẩm phân hủy

găng tay cao su sau 70 ngày bởi Methylibium sp NS21, sau 50 ngày bởi Streptomyces sp LCIC4, Actinoplanes sp OR16 đã sử dụng 1HNMR để nhận biết

sự có mặt của nhóm aldehyte Kết quả các tác giả đã kết luận có nhóm aldehyte

trong sản phẩm mà chủng Methylibium sp NS21 phân hủy còn chủng LCIC4 và

OR16 thì không Kết hợp với kết quả chạy GPC, Imai và cộng sự đã kết luận có thể

sự phân hủy chậm của chủng Methylibium sp NS21 đã giúp họ nhận biết được

nhóm aldehyte trong sản phẩm phân hủy [20]

 TLC 2 chiều: Braaz và cộng sự, 2004 đã dùng kỹ thuật sắc ký bản mỏng

2 chiều để xác định sản phẩm của quá trình dùng enzyme RoxA từ Xanthomonas sp

35Y để phân hủy mủ cao su Sản phẩm được chiết bằng ethyl acetate sau đó sấy khô rồi hòa tan trong methanol, tiếp đó được phân tách với benzene - acetone (20:1) ở chiều thứ nhất và chloroform - methanol ở chiều thứ hai và cuối cùng được kéo lên bởi anisaldehyte - H2SO4 ở 1000C [7]

 HPLC, HPLC - MS: Braaz và cộng sự, 2004 cũng đã dùng kỹ thuật này khi phân tích sản phẩm của quá trình phân hủy mủ cao su bởi enzyme RoxA từ

Ngày nay nhờ những tiến bộ trong sinh học phân tử đã mở ra khả năng ứng dụng hữu hiệu trong phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Nếu như các phương pháp nuôi cấy truyền thống chỉ xác định được thấp hơn 1% các loài vi sinh vật có mặt trong tự nhiên Trong khi đó bằng các phương pháp sinh học phân tử hiện nay các nhà nghiên cứu có thể phát hiện hầu hết các vi sinh vật có mặt trong tự nhiên Hiện nay, hàng loạt các kỹ thuật phân tử như: DGGE, DNA microarrays, lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), metagenomic, metaproteomic,… đã được ứng dụng để nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của quần xã vi sinh vật Dựa trên khả năng phân loại và nhận biết về sự đa dạng của quần xã vi sinh vật những phương pháp này được chia thành loại: Phương pháp phân tích một phần quần xã vi sinh vật và phương pháp phân tích toàn bộ quần xã vi sinh vật [15] Phân loại và các phương pháp sinh học phân tử được thể hiện và phân loại như hình 1.4

Hình 1 5: Các phương pháp sinh học phân tử sử dụng để nghiên cứu tính đa dạng về cấu trúc và chức năng của vi sinh vật trong môi trường [15]

Các phương pháp trên có những ưu nhược điểm riêng cho quá trình nghiên cứu sự biến động của hệ vi sinh vật Nhóm nghiên cứu đã tiến hành nghiên cứu sự

biến động của tập hợp vi sinh vật trong quá trình phân hủy cao su theo phương pháp DGGE và metagenomics

1.5.1 Kỹ thuật DGGE

Kỹ thuật DGGE là một dạng kỹ thuật “vân tay di truyền” (fingerprinting) Kỹ thuật này cho phép phân biệt các trình tự DNA dựa trên sự khác nhau về tỷ lệ (G+C) / (A+T) giữa các trình tự Phản ứng PCR - DGGE thường sử dụng cặp mồi xuôi kẹp 5’ – GC (30 – 50 nucleotit) Đây là điều cần thiết để ngăn chặn hai sợi DNA không bị phân ly hoàn toàn thành các sợi đơn trong khi điện di Khi được điện

di trên một gel có gradien chất biến tính, tùy theo thành phần nucleotit mà một phân

tử DNA sẽ dừng lại ở một vị trí nhất định đặc trưng: Trong phân tử càng nhiều G và

C thì phân tử càng lâu bị biến tính và do đó càng lâu dừng lại trên gel điện di Vì vậy, từ vị trí khác nhau trên điện di đồ DGGE sẽ phản ánh sự khác nhau về trình tự của các đoạn DNA được phân tích Trong từng trường hợp cụ thể, mỗi vị trí có thể đặc trưng cho một trình tự DNA và phản ánh sự có mặt của một loài hay cá thể trong quần xã được phân tích Để có thể xác định tên loài từ kết quả DGGE cần phải cắt các băng từ bản gel, tái khuếch đại và giải trình tự Năm 1993, Muyzer và cộng

sự lần đầu tiên sử dụng DGGE để nghiên cứu cấu trúc của các tập hợp vi khuẩn và chứng minh được lợi thế của mình trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các vi sinh vật khác nhau trong tập hợp [31] Ngày nay, DGGE là một phương pháp phân

tử được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về lĩnh vực y học, thổ nhưỡng và sinh thái môi trường

Nghiên cứu của Hữu và cộng sự (2008) sử dụng kỹ thuật DGGE nghiên cứu

về sự đa dạng vi khuẩn trong bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng Kết quả nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn chiếm ưu thế có mặt trong

mẫu bùn được lấy thuộc nhóm: Alpha proteobacterium, Chlorobi và Chloroflexi, Fusobacteria, Nitrospiraceae [1] Han và cộng sự (2013) đã dùng DGGE để nghiên

cứu sự đa dạng của vi khuẩn trong quá trình xử lý nước thải của ngành công nghiệp xản xuất kháng sinh Kết quả của quá trình phân tích nhận thấy sự có mặt chủ yếu của sáu nhóm vi khuẩn khác nhau chiếm đa số trong các mẫu phân tích [16]

1.5.2 Metagenomics

Thuật ngữ "metagenomics" được giới thiệu lần đầu tiên bởi Handelsman và cộng sự vào năm 1998 [17] Metagenomics là nghiên cứu về hệ gen của toàn bộ vi sinh vật có trong mẫu được lấy trực tiếp từ môi trường sống tự nhiên của chúng Năm 2005, Kevin Chen and Lior Pachter đã đã định nghĩa metagenomics là "việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền hiện đại trong nghiên cứu về quần xã vi sinh vật một cách trực tiếp trong môi trường tự nhiên của chúng mà không cần phải phân lập

và nuôi cấy chúng trong phòng thí nghiệm" [12] Nếu như di truyền học và vi sinh vật học truyền thống giải trình tự bộ gen (genome sequencing) của vi sinh vật dựa trên mẫu là các chủng vi sinh vật thuần khiết đã được nuôi cấy Thì các nghiên cứu metagenomics đã nhân dòng các đoạn trình tự gen đặc hiệu hoặc các đoạn gen 16S rRNA để xây dựng dữ liệu về đa dạng sinh học của các mẫu môi trường Những nghiên cứu metagenomics thường thực hiện bằng phương pháp Sanger ("shotgun" Sanger sequencing), hoặc song song với phương pháp pyrosequencing để có được trình tự của tất cả các vi sinh vật trong mẫu [14]

Năm 2002, Breitbart và các cộng sự đã sử dụng phương pháp shotgun sequencing để chứng minh rằng trong 200 lít nước biển có chứa trên 5000 loài vi khuẩn khác nhau [8] Tekere và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu về sự đa dạng của các vi sinh vật có trong suối nước nóng ở Nam Phi bằng metagenomics

Kết quả cho thấy các chi: Stenotrophomonas, Hydrogenophaga, Flectobacillus, Rheinheimera, Pseudomonas, Zavarzinella, Aquaspirillum và Limnobacter là chiếm

tỷ lệ cao trong các suối nước nóng ở Nam Phi Các chi này có sự phân bố khác nhau tùy thuộc vào nhiệt độ các suối nước nóng [30] Năm 2015 Tsurumaru và cộng sự phân tích sự đa dạng của vi khuẩn sống cộng sinh với rễ củ cải đường bằng

metagenomic thấy: Alphaproteobacteria, Actinobacteria và Betaproteobacteria là

các lớp chiếm ưu thế trong tập hợp [18] Mandal và cộng sự (2015) nghiên cứu về

sự đa dạng của vi sinh vật có trong mẫu trầm tích của hang động Khuangcherapuk

phía Đông Bắc Ấn Độ đã công bố ưu thế của các chi Mycobacterium, Rhodococcus, Alteromonas, Holomonas và Salinisphaera trong mẫu nghiên cứu [35]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.2 Cơ chất thử KNPH cao su của vi sinh vật

- Mủ cao su ly tâm (công ty cổ phần cao su y tế Merufa) có hàm lượng cao

su là 60%

- Miếng cao su dạng màng được tạo thành từ mủ cao su ly tâm được pha với nước (tỷ lệ 1: 1) và hòa trộn đều Lấy 12 g hỗn hợp trên dàn đều trên đĩa petri và sấy ở 50oC tới khối lượng không đổi sau đó cắt các miếng cao su với kích thước 1x1cm và khối lượng đạt khoảng 50 - 60 mg

- Cao su tổng hợp: poly (cis - 1, 4 - isoprene) (Sigma)

2.1.3 Thiết bị

 Máy lắc ổn nhiệt (Shellab, Mỹ), Máy ổn nhiệt (Grant, Anh)

 Máy li tâm lạnh (Tomy MX305, Đức)

 Tủ lạnh 40

C (Panasonic KM – SS34A1K, Nhật)

 Nồi hấp tiệt trùng (Hirayama ES-315, Nhật)

 Tủ cấy vô trùng (Panasonic MVC – B91FT - PK, Nhật)

 Máy đo pH (Mettler Toledo, MP 220, Thuỵ Sĩ)

 Máy PCR (Eppendorf AG 5333, Đức)

 Buồng điện di loại nhỏ (mini GES, Đài Loan)

 Buồng DGGE ( DcodeTM

Biorad, Mỹ )

 Tủ Sấy, nuôi ổn nhiệt ( EYELA LTI – 601SD, Trung Quốc)

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

- Lớp đáy là môi trường MSM

- Lớp thứ 2 (lớp trên): MSM và 0,04% mủ cao su thiên nhiên

 Môi trường LB (Luria-Bertani Broth)

2.1.5 Hóa chất

 Hóa chất dùng nuôi cấy: pepton, cao nấm men, cao thịt (Meck, Sigma)

 Hóa chất sinh học phân tử: Soil MasterTM DNA Extraction Kit (Epicenter, Mỹ), Green gel (Biotium, Mỹ), Master premix (Promega,

Mỹ)…

 Hóa chất phân tích: n-Pentan (BHD - Prolabo, Pháp), Tetrahydrofusan

(THF, Sigma, Mỹ) …

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2 1: Sơ đồ nghiên cứu

Các mẫu (đất, bùn, mủ thải) được sử dụng làm nguồn cung cấp vi sinh vật ban đầu cho bể làm giàu (bể Enrichment) Sau khi bể làm giàu được thiết lập 100 ml canh trường được chia vào các bình tam giác 250 ml vô khuẩn đã được chuẩn bị trước (10 bình được tráng đáy bằng cao su tổng hợp, 10 bình được bổ sung miếng cao su thiên nhiên có khối lượng khoảng 60 mg) Mẫu làm giàu trong bình tráng cao

su tổng hợp được tiến hành khảo sát bằng GPC Trong mẫu làm giàu được bổ sung cao su thiên nhiên sẽ đánh sự giảm khối lượng và quan sát sự phát triển của vi sinh vật bằng kỹ thuật SEM Quá trình biến động của tập hợp vi sinh vật cũng được nghiên cứu từ các mẫu làm giàu ở bình tam giác bổ sung cao su thiên nhiên Song song với các mẫu thí nghiệm các mẫu kiểm chứng cũng được thiết lập trên môi trường MSM với nguồn cơ chất là cao su thiên nhiên và cao su tổng hợp

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.2.2 Sự giảm khối lượng miếng cao su

Mười miếng cao su thiên đã được vô trùng bằng cách rửa qua dung môi

(acetone : chloroform với tỷ lệ 3 : 7) sau đó được bổ sung vào các bình tam giác với

100 ml từ canh trường làm giàu Định kì lấy mẫu và đáng giá mức độ phân hủy của miếng cao su sau theo thời gian Các miếng cao su sau khi lấy ra sẽ tiến hành loại

bỏ các vi sinh vật bám trên đó bằng cách đun sôi trong NaOH 0,1M khoảng 30 phút