Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sản xuất siro fructoza 42% từ tinh bột sắn bằng các chế phẩm enzym

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, tinh bột là nguyên liệu phổ biến để sản xuất nhiều loại sản phẩm mà phản ứng thuỷ phân tinh bột là một mắt xích quan trọng trong quy trình và được ứ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC

NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP SẢN XUẤT SIRO FRUCTOZA 42% TỪ TINH BỘT SẮN BẰNG CÁC CHẾ PHẨM ENZYM

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Phần 1 MỞ ĐẦU 1

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Fructoza và ứng dụng 3

2.1.1 Fructoza 3

2.1.2 Ứng dụng fructoza trong công nghiệp thực phẩm 5

2.1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất siro fructoza 5

2.2 Sắn và tinh bột sắn 6

2.2.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn trên thế giới và ở Việt Nam 6

2.2.2 Một số đặc tính của tinh bột 9

2.2.3 Đặc tính của tinh bột sắn 12

2.3 Enzym trong sản xuất đường fructoza từ tinh bột 13

2.3.1 Giới thiệu về enzym thuỷ phân tinh bột 13

2.3.2 Nhóm enzym đồng phân hoá 18

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym 21

Phần 3 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 26

3.1 Nguyên vật liệu 26

3.2 Phương pháp phân tích 27

3.3 Phương pháp nghiên cứu 31

Phần 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Xác định chất lượng nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 37

4.1.1 Xác định độ ẩm và hàm lượng tinh bột của nguyên liệu 37

4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thuỷ phân tinh bột 40

4.3.1 Quá trình dịch hoá 40

4.3.2 Quá trình đường hoá 54

4.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình đồng phân hoá 63

4.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ dịch đường 63

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzym 64

4.4.3 Ảnh hưởng của lưu lượng dòng chảy 66

4.5 Kết quả sản xuất siro fructoza trong quy mô công nghiệp 67

4.6 Kết quả ứng dụng siro fructoza trong sản xuất bánh mềm 73

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 76

1 Kết luận 76

2 Đề xuất 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

PHỤ LỤC

1 Hình 2.1 Cấu tạo fructoza ở dạng mạch thẳng và mạch vòng 3

2 Hình 2.2 Sản lượng tinh bột sắn của một số nước (1000 tấn) 7

3 Hình 2.3 Biểu đồ tăng trưởng diện tích, năng suất và sản

lượng tinh bột sắn ở nước ta

8

4 Hình 2.4 Cấu tạo của tinh bột 9

5 Hình 2.5 Cấu trúc của amyloza 10

6 Hình 2.6 Cấu trúc của amylopectin 10

7 Hình 2.7 Các amylaza tham gia vào quá trình thuỷ phân

tinh bột

13

8 Hình 2.8 Quá trình thuỷ phân tinh bột 14

9 Hình 2.9 Sơ đồ chuyển hoá Glucoza thành fructoza bằng

13 Hình 4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình dịch hoá 42

14 Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ Spezyme đến quá trình

độ tinh bột = 30%

18 Hình 4.6 Sự phụ thuộc của DE dịch hoá khi cố định yếu tố

nồng độ enzym = 0,06%

51

19 Hình 4.7 Ảnh hưởng của thời gian dịch hoá (DE dịch hoá)

đến hiệu quả đường hoá

23 Hình 4.11 Sự phụ thuộc của DE đường hoá khi cố định yếu

tố thời gian đường hoá = 36h

STT Tên bảng Trang

1 Bảng 2.1 Điểm đẳng điện và nhiệt độ hoạt động của

glucoamylaza từ một số nguồn khác nhau

16

2 Bảng 4.1 Độ ẩm và hàm lượng tinh bột của nguyên liệu 37

3 Bảng 4.2 Hoạt độ của một số enzym nghiên cứu 38

4 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung enzym Optimax

đến tốc độ thuỷ phân tinh bột

39

5 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới thời gian lọc

và nồng độ dịch lọc (tính cho 1000 kg tinh bột khô)

45

6 Bảng 4.5 Bảng bố trí thí nghiệm theo ma trận tâm xoay 46

7 Bảng 4.6 Kết quả thí nghiệm hàm lượng đường khử thu

được sau dịch hoá

47

8 Bảng 4.7 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu cho quá trình

dịch hoá

49

9 Bảng 4.8 Kết quả kiểm chứng thực nghiệm 52

10 Bảng 4.9 Giá trị mã hoá và thực nghiệm 57

11 Bảng 4.10 Kết quả thí nghiệm DE đường hoá sau quá trình

AM: Amylose

AP: Amylopectin

DE: Dextrose Equivalent

FAO: Tổ chức Lương thực thế giới

g/ ml: gam/ mililit

HFCS: High Fructose Corn Syrup

NXB: Nhà xuất bản

PGS TS: Phó giáo sư, tiến sỹ

SEM: Kính hiển vi điện tử quét

w/ w:

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề

Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, ngành công nghệ sinh học cũng phát triển mạnh mẽ Một trong những thành tựu to lớn của CNSH là nghiên cứu và ứng dụng công nghệ enzym Trong ba thập kỷ cuối thế kỷ 20, các chế phẩm enzym từ vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong mọi lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học… đặc biệt trong công nghệ thực phẩm tạo ra hiệu quả kinh tế cao

Trong công nghiệp chế biến thực phẩm, tinh bột là nguyên liệu phổ biến để sản xuất nhiều loại sản phẩm mà phản ứng thuỷ phân tinh bột là một mắt xích quan trọng trong quy trình và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành sản xuất công nghiệp Trên thế giới, công nghệ thuỷ phân tinh bột bằng enzym phát triển đã cho phép điều khiển được quá trình thuỷ phân tinh bột, tạo ra các loại tinh bột biến tính, maltodextrin, siro khác nhau như maltoza, glucoza, fructoza Phương pháp thuỷ phân tinh bột bằng enzym đã thu được hiệu suất chuyển hoá cao ≥ 95%, độ phân cắt chính xác, giảm tạp chất trong sản phẩm

Trước kia đường saccaroza từng chiếm vị trí hàng đầu, thì nay đường fructoza mới là tốt nhất bởi lẽ đường fructoza ngọt hơn, có chỉ số Glycemic Index (GI) thấp, không làm tăng đường glucoza trong máu nên tránh được nguy cơ gây bệnh đái tháo đường và béo phì Fructoza có chất lượng cao, có đặc tính quý giá về chức năng và sức khỏe, là chất ngọt có hương thơm đặc trưng

Hàng năm trên thế giới có khoảng 4 triệu tấn siro đã được sản xuất, trong đó có tới ½ lượng fructoza được sử dụng để sản xuất nước giải khát như: Cocacola, Pepsicola, nước hoa quả…

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

Ở Việt Nam, cho đến nay vẫn chưa có cơ sở sản xuất nào sản xuất fructoza ngoài Công ty Minh Dương, Hà Nội Phần lớn trong công nghệ thực phẩm vẫn phải nhập khẩu fructoza để thay thế đường mía sacaroza

Với những ưu điểm vượt trội so với các chất xúc tác hoá học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều Hiện nay trên thị trường có khoảng 12 hãng sản xuất enzym thương mại với trên 60 nhà cung cấp lớn Với mỗi một loại enzym mới đưa vào thử nghiệm, các nhà công nghệ thường tập trung nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzym cũng như động học của phản ứng thuỷ phân tinh bột bởi enzym nhằm nâng cao hiệu suất thuỷ phân Điều đó sẽ đem lại hướng lựa chọn chế phẩm enzym thêm phong phú

Trên cơ sở đó, chúng tôi chọn hướng nghiên cứu với đề tài: “Nghiên cứu các điều kiện thích hợp sản xuất siro fructoza 42% từ tinh bột sắn bằng các chế phẩm enzym” với các nội dung sau đây:

1 Xác định các điều kiện hoạt động tối ưu của các enzym trong quá trình dịch hoá

2 Xác định các điều kiện hoạt động tối ưu của các enzym trong quá trình đường hoá

3 Xác định các điều kiện hoạt động thích hợp của các enzym trong quá trình đồng phân hoá

4 Ứng dụng siro fructoza 42% trong công nghiệp sản xuất bánh

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Fructoza và ứng dụng

2.1.1 Fructoza

2.1.1.1 Cấu tạo và tính chất của fructoza

Về mặt hoá học, fructoza là một đường đơn tự nhiên, có trong nhiều thực phẩm và đồ uống, rau tươi, quả chín và mật ong Fructoza thường tồn tại

ở dạng furanoza có công thức hoá học tổng quát 2C6H12O6.H2O Quá trình vòng hoá do nhóm chức xeton của cacbon ở vị trí thứ hai tạo được cầu oxy với C5 để tạo vòng furanoza

Hình 2.1 Cấu tạo fructoza ở dạng mạch thẳng và mạch vòng

Khi kết tinh trong dung dịch nước fructoza có hình kim, tinh thể của nó ngậm một phân tử nước Fructoza tinh khiết ở dạng tinh thể có dạng màu trắng, vị ngọt gấp 1,7 lần độ ngọt của sacaroza Do sự có mặt của nhiều nhóm hydroxyl trong phân tử nên fructoza dễ tan trong nước và không tan trong các dung môi hữu cơ Hoá tính quan trọng của fructoza là những tính chất của nhóm chức xeton [41]

2.1.1.2 Giá trị dinh dưỡng của fructoza

Lợi ích về dinh dưỡng của fructoza

Có nhiều lợi ích khi sử dụng HFCS thay cho sacaroza [43] HFCS rẻ hơn sacaroza vì được sản xuất từ ngô thay thế sacaroza mà Mỹ phải nhập khẩu HFCS dễ dàng vận chuyển vì là chất lỏng HFCS cũng là sản phẩm có chất lượng bền vững, ổn định Mật ong, đường sacaroza và HFCS có cùng năng lượng trung bình 4 kcalo/ gram chất khô

Fructoza tinh thể ngọt hơn các loại đường khác, có lợi về mặt tiết kiệm năng lượng, có quá trình trao đổi chất độc lập với insulin, được dùng trong đồ

ăn kiêng, cho người bệnh đái tháo đường, có chỉ số Glycemic Index rất thấp (GI =19, so với GI của saccaroza = 60 và GI của glucoza = 90) và có lợi lý tưởng cho sức khoẻ người dùng Là chất ngọt đậm, fructoza có thể giảm calory trong nhiều thực phẩm và đồ uống phổ thông [42]

Cục dược phẩm và thực phẩm Mỹ (FDA) đã đánh giá HFCS là an toàn

sử dụng trong thực phẩm như sacaroza, đường ngô, siro ngô và các đường chuyển hoá từ tinh bột Các Tổ chức y tế, thực phẩm, khoa học công nghệ Mỹ như: Hãng Surgeon General về dinh dưỡng và sức khoẻ, Viện Hàn lâm khoa học Mỹ về đồ ăn kiêng, sức khoẻ cộng đồng năm 2000, Cục Hỗ trợ dịch vụ con người và sức khoẻ của Mỹ cũng có những kết luận tương tự Trao đổi

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

chất fructoza không làm tăng glucoza máu, không yêu cầu sự có mặt của insulin đối với người bệnh tiểu đường, do đó trên thực tế sử dụng fructoza tốt hơn các loại đường khác Hơn thế nữa, nhiều kết quả nghiên cứu đã khẳng định với số lượng nhỏ fructoza còn có thể cải thiện việc kiểm soát chỉ số GI cho nhóm người bệnh đái tháo đường

2.1.2 Ứng dụng fructoza trong công nghiệp thực phẩm

Fructoza là chất ngọt có độ ngọt cao nhất trong số các chất ngọt dinh dưỡng và có nguồn gốc tự nhiên Độ ngọt (tuỳ theo nồng độ) từ 1,2 đến 1,8 lần so với độ ngọt của sacaroza và có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm [41, 42]

Fructoza được sử dụng trong thực phẩm và đồ uống như bánh tươi, nước quả cô đặc, sản phẩm năng lượng thấp, đồ ăn kiêng, thực phẩm dinh dưỡng, bồi bổ vận động viên, các loại đồ uống bão hoà CO2, nước có hương,

đồ uống có năng lượng, sữa chocolat, ngũ cốc ăn sáng, bánh kẹo, sữa chua, mứt quả, thay thế mật ong [25, 26]

2.1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất siro fructoza

2.1.3.1 Trên thế giới

Rechard O.Marshall và Earl R.Kooi là những người đầu tiên sản xuất được siro fructoza ngô nồng độ cao, tiếng Anh là High Fructose Corn Sirup (HFCS) vào năm 1957 [29] Các nhà khoa học Nhật Bản nghiên cứu tinh chế fructoza vào năm 1970 Từ đó HFCS được sản xuất với mức độ tăng trưởng rất cao và được ứng dụng rất rộng rãi trong thực phẩm và đồ uống, đặc biệt ở

Mỹ trong những năm 1975 - 1985 Có 3 loại HFCS thương phẩm, thông dụng trên thị trường là HFCS 90%, HFCS 55% và HFCS 42% tương ứng với hàm lượng fructoza là 90%, 55% và 42% [33, 41, 43]

Siro fructoza được sản xuất bằng phương pháp enzym với nguyên liệu

là tinh bột đã trở thành một sản phẩm quen thuộc trên thị trường thế giới

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

Năm 1967 hàm lượng fructoza mới chỉ có 15%, đến năm 1968 thì hàm lượng fructoza đạt 42% [47, 49] Đến 1972 khi enzym glucoisomeraza sản xuất trên quy mô lớn và được cố định trên một chất mang thì sản lượng siro fructoza tăng lên rất nhanh ở nhiều nơi trên thế giới Năm 1985 Canada đã sản xuất được 220.000 tấn, Nhật Bản sản xuất được 585.000 tấn, các nước Châu Âu sản lượng siro fructoza đạt 350.000 tấn Ở Mỹ từ những năm 1976 sản lượng đường fructoza sản xuất được nhiều hơn 2,3 triệu tấn/ năm và tổng sản lượng đường tinh bột (siro fructoza, siro glucoza, glucoza tinh thể) đạt 26% tổng sản lượng đường của cả nước [44, 45, 48] Trong những năm 90 sản lượng siro fructoza tăng gấp 5 triệu tấn/ năm và tổng sản lượng đường tinh bột đạt 67% sản lượng đường cả nước [48]

Trên thị trường thế giới, siro fructoza 42% được sử dụng nhiều nhất Đây là siro có độ ngọt tương đương với đường kính, trong thành phần siro có

40 – 42% fructoza, 50 – 52% glucoza và 5 – 8% các loại đường khác Từ siro fructoza 42% có thể sản xuất siro fructoza 55% có độ ngọt cao hơn [30, 28]

2.1.3.2 Trong nước

Ở Việt Nam hiện nay chưa có nhà máy, công ty nào ngoài Công ty cổ phần Thực phẩm Minh Dương – Hà Nội sản xuất được siro fructoza Trong công nghiệp thực phẩm vẫn phải thường xuyên nhập khẩu fructoza để thay thế đường mía sacaroza

Hình 2.2 Sản lượng tinh bột sắn của một số nước (1000 tấn)

Viện Nghiên cứu Chính sách lương thực thế giới (IFPRI), đã tính toán nhiều mặt và dự báo tình hình sản xuất và tiêu thụ sắn toàn cầu với tầm nhìn đến năm 2020 Năm 2020 sản lượng sắn toàn cầu ước đạt 275,10 triệu tấn, trong đó sản xuất sắn chủ yếu ở các nước đang phát triển là 274,7 triệu tấn, các nước đã phát triển khoảng 0,4 triệu tấn Mức tiêu thụ sắn ở các nước đang phát triển dự báo đạt 254,60 triệu tấn so với các nước đã phát triển là 20,5 triệu tấn Khối lượng sản phẩm sắn toàn cầu sử dụng làm lương thực thực phẩm dự báo nhu cầu là 176,3 triệu tấn và thức ăn gia súc 53,4 triệu tấn

2.2.1.2 Ở Việt Nam

Việt Nam hiện đang sản xuất hàng năm hơn hai triệu tấn sắn củ tươi, đứng hàng thứ 11 trên thế giới về sản lượng sắn nhưng lại là nước xuất khẩu tinh bột sắn đứng hàng thứ ba trên thế giới sau Thái Lan và Indonesia

Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa

và ngô Cây sắn là nguồn thu nhập quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư, phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế

ha, sản lượng tinh bột sắn đạt 7.714.000 tấn Cùng với diện tích sắn được nâng lên, năng suất thu hoạch sắn cũng như sản lượng tinh bột sắn được sản xuất cũng tăng lên theo thời gian Hình 2.3 mô tả tốc độ tăng trưởng về diện tích trồng sắn, năng suất và sản lượng tinh bột sắn của Việt Nam

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm khoảng 800.000 - 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và gần 30% tiêu thụ trong nước Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là tinh bột, sắn lát và bột sắn Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Singapore, Hàn Quốc [1, 23]

2.2.2 Một số đặc tính của tinh bột

Tinh bột là polysaccarit chủ yếu có trong các hạt hoà thảo, trong củ, thân cây và lá cây Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn vì trong quá trình tiêu hoá chúng bị thuỷ phân thành đường glucoza là chất tạo nên nguồn calo chính của thực phẩm cho con người [15]

Trong hạt, tinh bột tồn tại dưới dạng các hạt có kích thước biến đổi từ 0,02 – 0,12 mm Hạt tinh bột của các loại hạt khác nhau có hình dáng và kích thước khác nhau Hạt tinh bột khoai tây có kích thước lớn hơn cả, còn hạt tinh bột của lúa mỳ có kích thước nhỏ hơn Hạt tinh bột lúa mỳ, lúa mạch có cấu tạo đơn giản còn hạt tinh bột ngô có cấu tạo phức tạp Khi tác dụng với iot tinh bột có màu rất đặc trưng Phản ứng này dùng để định tính tinh bột [4,

17, 35, 37]

2.2.2.1 Cấu tạo của tinh bột

Tinh bột bao gồm hai cấu tử là amylose (AM) và amylopectin (AP)

AM thường chiếm 12 – 25%, còn AP chiếm 75 – 85% phân tử tinh bột [16]

Hình 2.4 Cấu tạo của tinh bột

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

AM và AP đều là α – polysaccarit và đều do các gốc α – D – glucoza cấu tạo nên AM có trọng lượng phân tử từ 3,105 – 1,106 được cấu tạo từ 200 – 2000 gốc D - glucoza Các gốc glucoza nối với nhau bằng liên kết α – 1,4 glucozit và tạo thành một mạch xoắn dài Cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm OH tự do

Hình 2.5 Cấu trúc của amyloza

AP được cấu tạo từ 600 – 37.000 gốc D – glucoza Chúng gắn với nhau bằng các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 glucozit Chiều dài trung bình của mạch

có nhánh tự do gồm 21 – 27 gốc glucoza (có trường hợp chỉ 15 – 18 gốc) AP

có phân tử lượng trong khoảng 107 – 108 trong khi phân tử lượng của AM chỉ khoảng 5.105 – 106 Người ta còn thấy một số liên kết α – 1,3 glucozit trong tinh bột Trong thành phần của AP còn có một ít phospho (0,012 – 0,111%) Phospho được gắn vào nguyên tử cacbon thứ 6 của gốc glucoza

Hình 2.6 Cấu trúc của amylopectin

2.2.2.2 Một số tính chất của tinh bột

Tính hấp thụ của tinh bột

Hạt tinh bột có cấu tạo lỗ xốp nên khi tương tác với các chất bị hấp thụ thì bề mặt trong và ngoài của tinh bột đều tham dự Vì vậy trong quá

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

trình bảo quản, sấy và chế biến cần phải hết sức quan tâm tính chất này Các ion liên kết với tinh bột thường ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ của tinh bột Khả năng hấp thụ của các loại tinh bột phụ thuộc cấu trúc bên trong của hạt và khả năng trương nở của chúng

Khả năng hấp thụ nước và khả năng hoà tan của tinh bột

Xác định khả năng hấp thụ nước và khả năng hòa tan của tinh bột cho phép điều chỉnh được tỉ lệ dung dịch tinh bột và nhiệt độ cần thiết trong quá trình công nghiệp, còn có ý nghĩa trong quá trình bảo quản, sấy và chế biến thủy nhiệt Rất nhiều tính chất chức năng của tinh bột phụ thuộc vào tương tác của tinh bột và nước (tính chất thủy nhiệt, sự hồ hóa, tạo gel, tạo màng) Trong đó tính chất hồ hoá của tinh bột đáng quan tâm hơn cả

Các biến đổi hóa lý khi hồ hóa diễn ra như sau: hạt tinh bột trương lên, tăng độ trong suốt và độ nhớt, các phân tử mạch thẳng và nhỏ thì hòa tan và sau đó tự liên hợp với nhau để tạo thành gel Nhiệt độ hồ hóa không phải là một điểm mà là một khoảng nhiệt độ nhất định Tùy điều kiện hồ hóa như nhiệt độ, nguồn gốc tinh bột, kich thước hạt và pH mà nhiệt độ phá vỡ và trương nở của tinh bột biến đổi một cách rộng lớn [8, 9, 16]

Khả năng tạo gel và sự thoái hóa gel

Tinh bột sau khi hồ hóa và để nguội, các phân tử sẽ tương tác nhau

và sắp xếp lại một cách có trật tự để tạo thành gel tinh bột với cấu trúc mạng

3 chiều Để tạo được gel thì dung dịch tinh bột phải có nồng độ đậm đặc vừa phải, phải được hồ hóa để chuyển tinh bột thành trạng thái hòa tan và sau đó được để nguội ở trạng thái yên tĩnh Trong gel tinh bột chỉ có các liên kết hydro tham gia, có thể nối trực tiếp các mạch polyglucozit hoặc gián tiếp qua phân tử nước

Khi gel tinh bột để nguội một thời gian dài sẽ co lại và lượng dịch thể sẽ thoát ra, gọi là sự thoái hóa Quá trình này sẽ càng tăng mạnh nếu

và tinh bột sắn thường có pH trong khoảng 4,7 - 7,0 Tinh bột sắn không có mùi đặc trưng, khi hồ hoá dậy mùi đặc trưng dễ phân biệt với các loại tinh bột khác Khi hồ hoá, độ nhớt tăng rất nhanh, độ dính rất cao so với tinh bột khoai và các loại củ khác

Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM), hạt tinh bột sắn có kích thước từ 5 đến 40µm với những hạt lớn 25 - 35µm, hạt nhỏ 5 - 15µm và nhiều hình dạng, chủ yếu là hình tròn, bề mặt nhẵn, một bên mặt có chỗ lõm hình nón và một núm nhỏ ở giữa Dưới ánh sáng phân cực, các liên kết ngang với mật độ từ trung bình tới dày đặc có thể thấy rõ

Khi hạt tinh bột sắn bị vỡ, có thể quan sát được các rãnh tạo cấu trúc xốp của hạt Các rãnh vô định hình kéo dài từ bề mặt tới tâm của hạt tạo thành các lỗ xốp Chính các lỗ xốp này giúp nước thâm nhập làm trương nở tinh bột, phá vỡ các liên kết hydro giữa các phân tử trong cấu trúc tinh thể tạo điều kiện cho tác dụng phân huỷ của enzym Tinh bột sắn có cấu trúc hạt tương đối xốp, liên kết giữa các phần tử trong cấu trúc tinh thể yếu, vì vậy nó

dễ bị phân huỷ bởi các tác nhân như axit và enzym hơn so với các loại tinh bột khác như bắp, gạo

Tinh bột sắn có hàm lượng AP và phân tử lượng trung bình tương đối cao: 215.000 g/ mol so với 30.500; 130.000; 224.500 và 276.000 tương ứng ở amylose của bắp, tinh bột lúa mì, tinh bột khoai tây và tinh bột bắp sáp Hàm lượng AM nằm trong khoảng 8 - 29%, nhưng nói chung đa số các giống sắn

có tỷ lệ amylose 16 - 18% Tinh bột sắn có những tính chất tương tự các loại

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

tinh bột chứa nhiều amylopectin như độ nhớt cao, xu hướng thoái hoá thấp và

độ bền gen cao Tinh bột sắn có nhiệt độ hồ hoá trong khoảng 58,5 – 700C so với 56 – 660C ở khoai tây và 62 – 720C ở tinh bột bắp Việc tạo ra các dẫn xuất của tinh bột nhờ các liên kết ngang hay việc thêm các chất có hoạt tính

bề mặt có thể thay đổi nhiệt độ hồ hoá Nhiệt độ hồ hoá cũng ảnh hưởng đến chất lượng nấu của tinh bột, nhiệt độ hồ hoá thấp thường làm chất lượng nấu thấp do tinh bột dễ bị phá vỡ [8, 9, 37]

2.3 Enzym trong sản xuất đường fructoza từ tinh bột

2.3.1 Giới thiệu về enzym thuỷ phân tinh bột

Amylaza là một trong những hệ enzym quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt

và công nghiệp giấy [39, 51, 52]

Theo phân loại gần đây nhất của Nigam (1995), hệ amylaza tham gia vào quá trình thuỷ phân tinh bột gồm các enzym chính sau đây

Hình 2.7 Các amylaza tham gia vào quá trình thuỷ phân tinh bột

Enzym thủy phân

Endo α-1,6 glucanaza α-1,4 glucanaza

Pullulanaza Isoamylaza

- β- amylaza

- Glucoamylaza

- α - amyloglucosidaza Endo α -1,4 glucanaza α - amylaza

vi sinh vật (nấm mốc và vi khuẩn) Các α – amylaza từ nấm mốc

(Aspergillus, Rizopus) và vi khuẩn (Bacillus) vẫn là những mũi nhọn được

các nhà khoa học tập trung nghiên cứu với lý do đây là nguồn dồi dào và khả năng ứng dụng rộng rãi Trong thành phần chứa ion Ca2+ có chức năng nối các phần tương ứng của cấu trúc bậc ba trong phân tử enzym, có vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc phân tử và khả năng hoạt động của enzym, bởi vậy còn gọi là enzym cơ kim Tất cả các amilaza đều bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Ag2+, Hg2+ Chúng là protein giàu tryptophan và tyrosin, có tính axit yếu, điểm đẳng điện trong khoảng 4,2 – 5,7 [32]

Điều kiện hoạt động của enzym này từ các nguồn gốc khác nhau không đồng nhất, đặc biệt là khả năng chịu nhiệt của α – amylaza từ vi khuẩn cao hơn nhiều so với các nguồn khác Trong số α – amylaza từ vi khuẩn và nấm mốc được phân thành α – amylaza dịch hoá và đường hoá Phân tử α – amylaza dịch hoá bền nhiệt hơn còn α – amylaza đường hoá lại bền với Ca2+

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

Khả năng phân giải tinh bột của hai enzym này cũng khác nhau Sản phẩm tạo thành chủ yếu của α – amylaza dịch hoá là các dextrin (5 – 6 đơn vị glucoza), còn của α – amylaza đường hoá là maltoza và glucoza

Trong công nghiệp, α – amylaza từ vi khuẩn được sử dụng nhiều hơn

so với nguồn từ nấm mốc với lý do hoạt lực cao hơn và khả năng chịu nhiệt vượt trội Do khả năng dextrin hoá tinh bột cao nhưng lượng đường tạo thành thấp, vì vậy các enzym α – amylaza từ vi khuẩn thường ứng dụng trong giai đoạn dịch hoá tinh bột

Cơ chế tác dụng của α – amylaza lên tinh bột

α – amylaza chỉ thuỷ phân liên kết α – 1,4 glucozit Khả năng thuỷ phân phụ thuộc vào độ dài mạch, mức độ phân nhánh của phân tử cơ chất, tỷ

lệ AM và AP cũng như cấu trúc, kích thước của hạt tinh bột

Với cơ chất là AM, trước tiên enzym này phân cắt tại nhiều điểm trên cùng một chuỗi, giai đoạn đầu tạo thành một ít maltoza và maltotrioza, còn lại chủ yếu là các oligosacarit có 6 – 7 gốc glucoza (dextrin) Giai đoạn tiếp theo, dextrin vừa được tạo thành bị thuỷ phân tiếp nhưng quá trình thuỷ phân xảy ra rất chậm, đặc biệt đối với maltotrioza vì đây không phải là cơ chất thích hợp của α – amylaza Sau thời gian tác dụng dài, sản phẩm của quá trình thuỷ phân có tỷ lệ glucoza khoảng 13% và 87% là maltoza [23]

Với cơ chất là AP, α – amylaza thuỷ phân các liên kết α – 1,4 glucozit trong mạch polisacarit trừ điểm phân nhánh Quá trình tác dụng cũng xảy ra tương tự như với cơ chất AM Ở giai đoạn đầu của quá trình, 20% oligosacarit và maltoza được tạo thành, sau đó các oligosacarit lại được phân cắt, cuối cùng tạo ra 72% maltoza, 19% glucoza, ngoài ra có 8% gồm dextrin mạch nhánh phân tử thấp và isomaltoza [50]

Khả năng dextrin hoá của enzym này rất cao làm cho độ nhớt của dịch tinh bột giảm, do đó làm mất khả năng nhuộm màu với iot và làm giảm khả

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

năng khử Quá trình này là cần thiết và có tính khởi đầu cho giai đoạn đường

hoá tiếp theo trong công nghệ thuỷ phân tinh bột Với tính năng đó, enzym

này còn có tên là amylaza dextrin hoá hay amylaza dịch hoá [11]

2.3.1.2 Glucoamylaza

Enzym này còn được gọi là γ – amylaza hay glucoamylaza (α – 1,4

glucan, 4 – glucohydrolaza – EC 3.2.1.3) Chúng có nhiều ở tế bào nấm mốc

và nấm men Ngoài ra có trong dịch tiêu hoá của người và động vật, gan động

vật, hạt nảy mầm Nhưng nguồn thu nhận chủ yếu vẫn từ nấm mốc

Aspergillus, đặc biệt là Aspergillus awamori và nấm men Endomycopsis

filibuger, Endomyces sp

Điểm đẳng điện và nhiệt độ hoạt động của enzym này từ các nguồn

khác nhau sẽ không đồng nhất Glucoamylaza từ nấm men và nấm mốc bền

với axit và không cần bảo vệ bằng ion Ca2+ Hầu hết enzym này bị mất hoạt

Cơ chế tác dụng của enzym glucoamylaza lên tinh bột

Enzym thuỷ phân tinh bột theo cơ chế đa mạch, xúc tác sự thuỷ phân

liên kết α – 1,4 và α – 1,6 glucozit của tinh bột và các polisacarit tương tự từ

đầu không khử, tạo ra D – glucoza Nó cũng thuỷ phân các liên kết α – 1,6 và

α – 1,3 glucozit nhưng với tốc độ chậm hơn từ 10 – 30 lần [13, 16]

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

Khả năng thuỷ phân tinh bột thành glucoza của các loại enzym

glucoamylaza từ các nguồn sẽ khác nhau Nguồn từ Rhizopus delamar và Endomyces sp thuỷ phân tinh bột tới 100% glucoza Sở dĩ như vậy vì có những enzym chưa thuần khiết như enzym tách chiết từ Asp niger có chứa

transglucozilaza, vì vậy không cho lượng glucoza theo đúng lý thuyết Đây là

giải thích hợp lý vì trong các enzym thu nhận từ Rhizopus delamar và Endomyces sp không tìm thấy transglucozilaza [2, 13, 16]

2.3.1.3 Pululanaza

Pullulanaza (Pullulan – 6 – glucano – hydrolaza EC 3.2.1.41) có nguồn gốc từ vi sinh vật Enzym này có thể thủy phân các liên kết α- 1,6 glucozit của amylopectin, glucogen, pullulan và các dextrin giới hạn Điều đáng chú ý là sự định vị của liên kết α- 1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của enzym Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm kề bên liên kết α- 1,6 là điều kiện cần thiết cho enzym phân cắt liên kết này Pullulanaza từ

Aspergillus aerogenes và Bacillus cereus là có ứng dụng trong công nghiệp 2.3.1.4 Một số chế phẩm enzym thủy phân tinh bột

Enzyme Spezym Prime 42 là chế phẩm enzym có màu vàng sáng, tỷ trọng 1,15 – 1,18 g/ ml, chứa chủ yếu enzym α – amylase có nguồn gốc từ

những sự di truyền khác nhau của chủng Bacillus lichenifomis Chế phẩm

chứa enzym phân cắt ngẫu nhiên liên kết α – 1,4 glucosit làm giảm nhanh chóng độ nhớt của dịch thủy phân, sản phẩm tạo ra là các dextrin và các saccarit dưới sự đa dạng về các điều kiện của quá trình

Chế phẩm có hoạt độ 24,540 LU/ g Hoạt độ của enzym Spezyme Prime 42 là biểu diễn đơn vị hóa lỏng (LU) Một đơn vị hóa lỏng là đơn vị đo thời gian hồ hóa đến sản phẩm làm thay đổi màu của dung dịch iot biểu thị

80 – 870C trong 60 – 120 phút đối với bột khô, không cần thêm Canxi dưới dạng chất hoạt hóa

Chế phẩm Optimax 4060 VHP tồn tại dưới dạng dịch có màu nâu sáng,

có tỷ trọng 1,14 g/ ml, là một hỗn hợp của glucoamylaza và pullulanaza

Pullulanaza được sinh tổng hợp và thu nhận từ chủng Bacillus licheniformis,

có khả năng xúc tác thủy phân liên kết 1,6 – α – D glucozit để tạo thành các

oligosaccarit Glucoamylaza được phân lập từ chủng Aspergilus niger xúc tác

thủy phân liên kết 1,4 – α – D và liên kết 1,6 – α – D glucozit Trong đó: Hoạt độ tối thiểu của pullulanaza: 390 ASPU/g; Hoạt độ tối thiểu của glucoamylaza: 260 GAU/g

Enzym này có thể tạo ra được hàm lượng đường khử ≥ 96% dưới những điều kiện đường hóa tối ưu: pH = 4,0 – 4,2; ở 600C, 32% chất khô

2.3.2 Nhóm enzym đồng phân hoá

2.3.2.1 Khái niệm chung

Đồng phân hóa glucoza thành fructoza bằng phương pháp enzym thường cho ta kết quả khả quan hơn các phương pháp khác mặc dù hiện nay người ta chưa tìm được một enzym nào có tính đặc hiệu chặt chẽ đối với glucoza Thường có tới ba enzym thực hiện phản ứng này:

- Enzym D-xyloisomeraza xúc tác phản ứng đồng phân hóa D-xyloza thành D-xyluloza cũng có thể xúc tác phản ứng chuyển D-glucoza thành D-fructoza, D-riboza thành D-ribuloza Enzym này đòi hỏi có ion Coban

Phản ứng chuyển glucoza thành fructoza

GLUCOZA glucoisomeraza FRUCTOZA

Có 4 loại enzym glucoisomeraza được tìm thấy:

1 Enzym sinh tổng hợp từ Pseudomonas hidrophila

2 Enzym sinh tổng hợp từ Aerochateri aerogenes, Escherichia indrophila và Escherichidia freundii Enzym này chuyển hoá glucoza 6

phosphat sang fructoza 6 phosphat

3 Enzym sinh tổng hợp từ Pseudomonas lactobacillus

Cả 3 enzym này đều cho hoạt lưc thấp trong quá trình chuyển hoá glucoza sang fructoza

4 Enzym enzymglucoisomeraza sinh tổng hợp từ Acitinomyces, Streptomyces và Bacillus Đây là enzym có hoạt lực cao, hoạt động ở pH

hãng Novo Industry là chế phẩm cố định tế bào của chủng Actinoplanes misoudiensis gắn với glutaldehit có trộn với gelatin Optisweet của hãng

Mileskali - chevie (Mỹ và Tây Đức liên doanh) là chế phẩm cố định enzym

2.3.2.2 Đặc điểm cấu tạo và sinh hoá của glucoisomeraza

Glucoisomeraza có bản chất là protein Song enzym thu được nhận từ nguồn khác nhau có hàm lượng axit amin trong phân tử khác nhau Đa số glucoisomeraza đều giàu alanin, leucin và glixin Glucoisomeraza thuộc protein axit aspartic và axit glutamic trong phân tử enzym cao hơn hẳn các axit amin khác, chiếm tới 45 - 55% tổng số các axit amin Về thành phần axit

amin trong phân tử glucoisomeraza thì ở B coagulans thiếu cistein, ở S albus

có chứa 4,1-33 nguyên tử gam Ca2+ và Mg2+/ mol enzym, vì vậy glucoisomeraza bền vững đối với các yếu tố gây biến tính

Nhiệt độ hoạt động của glucoisomeraza thay đổi trong khoảng 45–

900C Glucoisomeraza thu nhận từ nguồn khác nhau có nhiệt độ hoạt động

Glucoisomeraza

fructoza Enzym này được sản xuất từ chủng Streptomyces rubiginosus Chế

phẩm có hoạt độ: 220 GIGI U/ g Điều kiện tối ưu cho quá trình sản xuất: Nồng độ siro glucoza đầu vào: 93 %, 40 - 50 % w/w DS, T0 = 54 - 600C, pH tối ưu: 7,5 - 8,0; Các chất hoạt hóa: Mg2+ 36 ppm, SO32- 110 ppm

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym [3, 16, 17, 18]

Enzym chỉ có thể hoạt động tốt nhất ở trạng thái nhất định khi mà vận tốc xúc tác của phản ứng enzym mạnh nhất Trong quá trình thuỷ phân tinh bột, tốc độ phản ứng phụ thuộc vào sự hình thành liên kết enzym – tinh bột Liên kết này do sự hấp thụ lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên bề mặt của các hạt tinh bột và enzym như [- COOH], [- OH], [- COO], [NH2], [- SH] Các nhóm này khi tác dụng với nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử AM và AP, dẫn đến làm đứt các liên kết glucozit để tạo sản phẩm và giải phóng enzym Trạng thái này phụ thuộc vào nhiều yếu tố: nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH môi trường, các ion kim loại, các hợp chất vô cơ và hữu cơ…[3, 16]

2.3.3.1 Nồng độ enzym

Cường độ của các enzym phụ thuộc rất nhiều vào khối lượng, hoạt tính

và điều kiện xảy ra phản ứng Bằng cách điều chỉnh các tham số này có thể tạo ưu thế cho hoạt động của enzym để thuỷ phân đến cùng hay cục bộ các cơ

Nếu thay đổi nồng độ enzym, thành phần và tính chất dịch thuỷ phân

sẽ thay đổi, nhờ vậy có thể điều chỉnh cơ cấu sản phẩm sau thuỷ phân bằng cách này [17, 18]

2.3.3.2 Nồng độ cơ chất

Trong quá trình thuỷ phân, khi nồng độ cơ chất quá nhỏ thì hiệu suất thuỷ phân không cao Nếu tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng thuỷ phân sẽ tăng Tuy nhiên, nồng độ này chỉ có ngưỡng giới hạn khi tất cả trung tâm hoạt động của enzym đã tham gia phản ứng Nếu thừa cơ chất thì vận tốc phản ứng cũng không tăng, thậm chí bị kìm hãm và giảm hiệu suất thuỷ phân

Nồng độ tinh bột có ảnh hưởng rõ rệt đến cơ cấu sản phẩm thuỷ phân Khi nồng độ dịch bột thấp thì khả năng thuỷ phân của α – amylaza tăng, sản phẩm chủ yếu là dextrin phân tử thấp [6, 17]

Hình 2.10 Dạng chung của đường biểu diễn sự phụ thuộc vận tốc phản

ứng vào nồng độ cơ chất

có thể kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch enzym Nếu là kiểu kìm hãm thuận nghịch, phản ứng kết hợp giữa enzym và chất kìm hãm (I) nhanh chóng đạt đến cân bằng:

Trong trường hợp kìm hãm không thuận nghịch, k-1 rất bé có thể xem như bằng 0, I kết hợp với E bằng liên kết đồng hoá trị hoặc kết hợp rất chặt chẽ đến mức khó lòng tách khỏi E, sự phân ly phức EI là rất chậm [3, 6, 18]

2.3.3.4 Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hoá làm tăng hoạt độ xúc tác của enzym Các chất hoạt hoá thường có bản chất khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại nằm

từ ô thứ 1 đến ô thứ 55 của bảng nguyên tố tuần hoàn Mendeleev hoặc các chất hữu cơ có cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzym hoặc các chất có tác dụng phục hồi nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym Tuy nhiên tác dụng hoạt hoá chỉ có giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này có thể làm giảm hoạt độ của enzym [3]

K1 K2

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

2.3.3.5 Nhiệt độ và thời gian phản ứng

Trong khoảng có ý nghĩa công nghệ, nếu tăng nhiệt độ thuỷ phân thì vận tốc phản ứng do enzym xúc tác cũng tăng, tuy nhiên chỉ đến một nhiệt độ nhất định sẽ làm cho enzym giảm dần hoạt lực và bị biến tính (cấu hình không gian của các phân tử protein – enzym và trung tâm hoạt động của enzym bị biến đổi) Mỗi enzym chỉ thể hiện hoạt lực mạnh nhất ở một nhiệt

độ nhất định - nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối ưu của mỗi một enzym không cố định mà phụ thuộc vào các điều kiện của phản ứng: cơ chất, thời gian, pH, nguồn gốc của enzym…

Enzym có nguồn gốc khác nhau thì khả năng chịu nhiệt sẽ khác nhau Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, với dung dịch 1% tinh bột,

nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym amylaza từ Asp oryzae là 500C, trong dung dịch 5% tinh bột là 550C, nhưng tăng nồng độ tinh bột lên đến 10% thì nhiệt độ này vẫn chỉ là 550C Như vậy, hoạt động của enzym sẽ được bảo toàn khi tăng nồng độ cơ chất của dung dịch nhưng chỉ trong giới hạn nhiệt độ xác định đối với mỗi enzym [31]

Hình 2.11 Đường minh họa ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng

enzym

Nhiệt độ tối ưu còn phụ thuộc vào thời gian phản ứng Thời gian dài sẽ làm giảm khả năng chịu nhiệt của enzym Ngoài ra còn phụ thuộc vào pH của môi trường và tăng cùng với pH trong giới hạn nhiệt độ nhất định Tuy nhiên,

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

ngay cả khi enzym hoạt động ở các điều kiện tối ưu thì cũng chỉ thể hiện hoạt

độ cao trong khoảng thời gian nhất định Vượt quá thời gian này thì hoạt lực của enzym yếu dần và dẫn đến bị vô hoạt [48]

Nhiệt độ mà enzym mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn, thường vào khoảng > 700C Ở nhiệt độ này enzym bị biến tính, vì vậy khả năng kết hợp với cơ chất sẽ giảm hoặc mất hoàn toàn, do đó làm giảm hoặc đình chỉ hoạt tính enzym tuỳ theo mức độ ảnh hưởng

Nhìn chung, sự tác động đồng thời của các yếu tố: nồng độ cơ chất,

pH, thời gian phản ứng ảnh hưởng nhất định đến đặc tính bền nhiệt của enzym [6]

2.3.3.6 pH

pH có ảnh hưởng lớn tới vận tốc phản ứng enzym, mỗi enzym chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH hoạt động tối thích của enzym (pHopt) pH tối thích của đa số enzym nằm trong vùng axit yếu, kiềm yếu hoặc trung tính, khoảng pH từ 5 – 9, chỉ có một số enzym có pH hoạt động tối thích nằm trong vùng axit mạnh hoặc kiềm mạnh (pHopt của tripxin 5 – 9; pepxin 1,8 – 2,2 ) Cùng một loại enzym nhưng thu từ các nguồn khác nhau cũng có pHopt khác nhau pHopt của một enzym cũng không cố định mà phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khác như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ [16]

Hình 2.12 Đường minh họa ảnh hưởng của pH đến vận tốc phản ứng

enzym

Sử dụng ba loại enzym do hãng GENENCOR của Mỹ cung cấp:

- Enzym dịch hoá: Spezyme Prime 42

- Enzym đường hoá: Optimax 4060 VHF

- Enzym đồng phân hoá: Gensweet IGI-SA

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

3.2 Phương pháp phân tích

3.2.1 Phương pháp hoá lý

3.2.1.2 Xác định pH của dịch đường bằng pH met

3.2.1.3 Xác định độ nhớt của dịch sau dịch hoá [12]

Xác định độ nhớt của dịch đường sử dụng nhớt kế ống mao dẫn thuỷ tinh được đo ở 200C

Độ nhớt của dịch thuỷ phân tính theo công thức:

µ = t.0,03296 (mm2/s) Trong đó: µ: Độ nhớt của dịch thuỷ phân

to: Thời gian chảy của lượng dịch (s)

0,03296: hệ số chuyển đổi (mm2/s2)

3.2.1.4 Xác định độ ẩm của nguyên liệu ban đầu: phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi [12]

3.2.2 Phương pháp hoá sinh

3.2.2.1 Phương pháp xác định mức độ thủy phân (DE) thông qua xác định

a Nguyên tắc

Dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử axit dinitrosalicylic DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong phạm vi nhất định Dựa trên đồ thị đường chuẩn đối với glucoza tinh khiết tính được hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích

b Dụng cụ

- Máy so màu

c Hoá chất

- Axit dinitrosalicylic DNS

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

- Muối tartrat kép KNaC4H4O6.4H2O

- NaOH dung dịch 4N

d Tiến hành dựng đồ thị chuẩn glucoza

Bước 1: Pha dịch đường glucoza chuẩn

Cân 0,25 g glucoza tinh khiết bằng cân phân tích Cho glucoza vào bình định mức 250 ml rồi định mức bằng nước cất tới vạch định mức, lắc đều Lấy dịch glucoza gốc pha loãng như sau:

Đo OD ở λ = 540 nm Ghi kết quả

2 ml dịch đường + 1 ml DNS

a - lượng đường khử trong mẫu đo, g;

b Xác định đường cong chuẩn

- Chuẩn bị dung dịch mẹ: Cân 15 mg fructoza tinh khiết pha với 250

ml nước cất (dung dịch 0,06 mg/ ml)

- Chuẩn bị dung dịch đo có nồng độ xác định từ dung dịch mẹ

+ Hút 1 ml dung dịch mẹ + 9 ml nước cất: dung dịch 0,006 mg/ ml + Hút 3 ml dung dịch mẹ + 7 ml nước cất: dung dịch 0,018 mg/ ml + Hút 5 ml dung dịch mẹ + 5 ml nước cất: dung dịch 0,03 mg/ ml + Hút 7 ml dung dịch mẹ + 3 ml nước cất: dung dịch 0,042 mg/ ml + Hút 9 ml dung dịch mẹ + 1 ml nước cất: dung dịch 0,054 mg/ ml

- Xác định nồng độ fructoza: Hút 0,5 ml từ dung dịch cần đo trên cho vào các ống nghiệm và bổ sung 0,1 ml cistein 1,5%; 3 ml H2SO4 đặc; 0,1 ml carbazole 0,12%, lắc đều Đưa các ống nghiệm trên vào nồi thuỷ phân ở 400C

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

trong 30 phút, sau đó đo hấp thụ ánh sáng trên máy UV – PC 01 ở bước sóng

λ = 560 nm Từ các giá trị độ hấp thụ nhận được dựng đường cong chuẩn

c Định lượng fructoza:

Dịch nhận được sau đồng phân hoá được pha loãng tới nồng độ nằm trong khoảng nồng độ fructoza của đường chuẩn Cách tiến hành như trên nhưng thay 0,5 ml dịch chuẩn bằng 0,5 ml dịch thí nghiệm Từ độ hấp thụ ánh sáng nhận được, tra trên đường cong chuẩn để xác định lượng fructoza có trong mẫu đo

C BxD

Trong đó: B: lượng fructoza đọc trên đường cong chuẩn

D: độ pha loãng C: nồng độ phần trăm chất khô (0Bx)

3.2.2.3 Xác định hoạt lực của các chế phẩm enzym [20]

Dừng phản ứng =

Để nguội (bổ sung 10 ml dd đệm pH = 5.5)

Định mức 100 ml Lấy 5 ml cơ chất + 5 ml enzym pha loãng 1000 lần

NaOH 1N (5 ml) H2SO4 1N (5 ml)

Định mức 100 ml

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

b Cách tính:

Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ enzym là lượng enzym đủ khả năng

thuỷ phân 1 g tinh bột thành glucoza trong 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ 300C,

pH = 4,7 – 4,8

Nồng độ đường khử: Cđ = x.n (n: hệ số pha loãng)

Quy đổi ra tinh bột Ctb = Cđ x 0.9

Hoạt độ enzym =

5 60

30 100

Ctb ( 5: số ml enzym pha loãng sử dụng; 30: thời gian phản ứng trong 30 phút)

3.2.2.4 Xác định hàm lượng tinh bột có trong mẫu [12]

Thuỷ phân dịch tinh bột thành đường sử dụng HCl 2% Hàm lượng đường trong dung dịch được xác định theo phương pháp DNS

Hàm lượng tinh bột trong nguyên liệu tinh bột (%) được tính theo công thức sau:

2

9 , 0 x

X

Trong đó: X – hàm lượng đường có trong nguyên liệu (g)

0,9 - hệ số chuyển đổi glucoza thành tinh bột

2 - số g tinh bột nguyên liệu

3.3 Phương pháp nghiên cứu [9, 10]

3.3.1 Phương pháp công nghệ

3.3.1.1 Giai đoạn dịch hoá

Trong phần nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 100 g tinh bột làm nguyên liệu và tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của 3 yếu tố: nồng độ tinh bột, nồng độ enzym, nhiệt độ dịch hoá Quá trình dịch hoá được tiến hành 60 phút ở pH = 6,0 Sau khi kết thúc dịch hoá đun sôi dịch thuỷ phân 10 phút để

vô hoạt enzym, làm nguội nhanh dịch về 250C và xác định mức độ thuỷ phân

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

DE Tiêu chí để lựa chọn các điều kiện công nghệ trong giai đoạn này là mức

độ thuỷ phân cao nhất

Tiến hành tối ưu hoá 3 yếu tố: nồng độ tinh bột, nồng độ enzym, nhiệt

độ dịch hoá Từ các giá trị tối ưu của 3 yếu tố thu được ở trên, chúng tôi tiến hành xác định DE dịch hoá thích hợp cho DE đường hoá cao nhất, thông qua xác định thời gian dịch hoá

3.3.1.2 Giai đoạn đường hoá

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng dịch thuỷ phân tinh bột đã được dịch hoá trong các điều kiện công nghệ lựa chọn ở trên Dịch thuỷ phân được điều chỉnh đến pH = 4,5; t = 600C và bổ sung chế phẩm enzym Optimax

để tiến hành đường hoá Sau khi kết thúc đường hoá đun sôi 10 phút để vô hoạt enzym, làm nguội nhanh dịch về 250C và xác định mức độ thuỷ phân

DE Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: nồng độ enzym, thời gian đường hoá và DE dịch hoá Tiêu chí để lựa chọn các điều kiện công nghệ là mức độ đường hoá cho DE cao nhất Từ các khoảng thích hợp thu được ở trên chúng tôi tiến hành tối ưu hoá 3 yếu tố: nồng độ enzym, thời gian đường hoá, DE dịch hoá

3.3.1.3 Làm sạch dịch đường glucoza sau đường hoá

Làm sạch dịch đường nhằm loại các tạp chất trong dịch đường tạo dịch đường trong và sạch hơn Than hoạt tính được chọn là công cụ để làm sạch dịch đường do có tác dụng tẩy màu cho dịch đường và hấp thụ tạp chất trong dịch đường Quá trình tẩy màu được tiến hành 2 lần: lượng than dùng chotẩy màu lần 1 là 0,8%, lần 2 là 0,6%; cả hai lần đều thực hiện ở T=800C, trong thời gian 30 phút [8] Sau đó than hoạt tính được loại ra bằng máy lọc chân không Cuối cùng dịch đường được chảy qua cột cation Dowex 50 –X8 đường kính 20 mm, chiều dài 100 mm, dịch chảy với tốc độ 10 ml dịch/ phút thì loại bỏ toàn bộ ion kim loại của dịch [8]

Phí Thị Thương Huyền – CHTP 07 - 09

3.3.1.4 Giai đoạn đồng phân hoá

Chuẩn bị dịch chuyển hoá

Lấy 250 ml dịch đường glucoza đun sôi trong 10 phút Cân 0,15 g MgSO4.7H2O cho vào khuấy đều, sau đó đun sôi cách thuỷ trong khoảng 10 –

15 phút Để nguội, chỉnh pH = Na2CO3 tới pH = 7,5 – 8,0 (pH tối ưu của enzym Gensweet [28])

Như vậy dịch đường theo ống dẫn phía trên chảy vào cột đồng phân, phân tử glucoza đi qua lớp enzym cố định, tiếp xúc với enzym và được chuyển hoá thành fructoza, sau đó ra ngoài theo ống dẫn phía dưới

Chúng tôi tiến hành nghiên cứu quá trình đồng phân hoá với các yếu tố thay đổi trong khoảng nhất định như nồng độ dịch đường (30 – 55%), nồng

độ enzym (15 – 45%), tốc độ dòng chảy (5 – 25 ml/ phút) và cố định các yếu

tố còn lại như pH = 7,5; chiều dài cột = 40 cm; đường kính cột = 2,2 cm; nhiệt độ đồng phân hoá = 600C Kết quả được thể hiện qua việc xác định hàm lượng fructoza thu được sau quá trình đồng phân hoá

3.3.1.5 Làm sạch dịch đường fructoza

Dịch đường thu hồi sau quá trình chuyển hoá có màu vàng sẫm và còn lẫn một số kim loại nên cần qua công đoạn làm sạch Làm sạch dịch đường fructoza bằng than hoạt tính và trao đổi ion