Nghiên cứu các đặc tính của gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân da cá da trơn thành acid amin làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI --- ĐÀO VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH ACID AMIN L

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

ĐÀO VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ

ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2015

MỤC LỤC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

ĐÀO VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH CỦA GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ

ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN DA CÁ DA TRƠN THÀNH ACID AMIN LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM

MỤC LỤC

MỤC LỤC 2

MỤC LỤC 3

LỜI CẢM ƠN 7

LỜI CAM ĐOAN 8

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 13

2 MỤC TIÊU 14

2.1 Mục tiêu chung 14

2.2 Mục tiêu cụ thể 14

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

3.1.1 Nghiên cứu các đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp 14

3.1.2 Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ hợp 15

3.1.3 Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn ) 15

4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 15

5 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16

I Tổng quan về gelatin và gelatinase 16

I.1 Gelatin 16

I.2 Gelatinase 18

I.3 Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase 19

I.3.1 Vi khuẩn Pseudomonas 19

I.3.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 21

I.4 Tình hình thực tế về nuôi trồng cá da trơn và chế biến các phụ phẩm của cá da trơn ở Việt Nam 23

I.5 Thành phần thủy phân từ da cá 25

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

II.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

II.2.1 Vật liệu hóa chất 28

II.2.2 Nghiên cứu đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp 29

II.2.2.1 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 30

II.2.2.2 Phương pháp xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính và độ bền nhiệt của gelatinase tái tổ hợp 30

II.2.2.3 Phương pháp xác định pH thích hợp cho hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 31

II.2.2.4 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 31

II.2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 31

II.2.3 Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ hợp 32

II.2.3.1 Phương pháp tiền thủy phân hóa học da cá da trơn 32

II.2.3.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với khả năng thủy phân của enzyme gelatinase tái tổ hợp đối với mẫu da cá đã xử lý qua dung dịch kiềm NaOH 2M 34

II.2.3.3 Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đối với khả năng thủy phân của enzyme gelatinase tái tổ hợp đối với mẫu da cá tra/ ba sa đã qua tiền xử lý bằng dung dịch kiềm NaOH 2M 35

II.2.3.4 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu quả thủy phân 35

II.2.3.5 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả thủy phân 36

II.3 Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy phân 36

II.3.1 Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật 36

II.3.1.1 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: TCVN 4884:2005 (ISO 4833:2003) 36

II.3.1.2 Xác định Salmonella sp: TCVN 4829:2005 (ISO 06579:2002) 36

II.3.1.3 Xác định Staphylococcus sp: TCVN 4830-1:2005 (ISO 6888-1:1999, With Amd :2003) 36

II.3.2 Phương pháp xác định độc tính cấp tính 37

II.3.3 Phương pháp xác định độc tính bán trường diễn 37

III.1 Xác định một số đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp 39

III.1.1 Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 39

III.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt của gelatinase tái tổ hợp 40

III.1.3 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme gelatinase tái tổ hợp 42

III.1.4 Ảnh hưởng của chất tẩy rửa đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 42

III.1.5 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 43

III.2 Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ hợp 44

III.2.1 Các điều kiện tiền thủy phân da cá 44

III.2.1.1 Kết quả xác định nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/basa 44

III.2.1.2 Kết quả xác định pH tiền thủy phân da cá tra/basa 45

III.2.1.3 Kết quả xác định thời gian tiền xử lý da cá tra/basa 46

III.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân da cá bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp 46

III.2.2 Ảnh hưởng của chất kiểm soát pH đến quá trình thủy phân da cá bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp 47

III.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 48

III.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân 49

III.2.5 Phân tích thành phần axit amin trong sản phẩm thủy phân 49

III.3 Đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin thủy phân 50

III.3.1 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật 50

a Xác định mật độ vi sinh hiếu khí tổng số 51

b Kết quả định lượng mật độ E.coli 51

c Kết quả định lượng Salmonella sp và Staphylococcus sp 52

III.3.2 Kết quả xác định độc tính cấp tính trên chuột nhắt trắng [3,4] 53

III.3.3 Kết quả xác định độc tính bán trường diễn 53

Công thức máu của chó thí nghiệm 53

Kết quả theo dõi các chỉ số chức năng gan 58

Kết quả theo dõi các chỉ số chức năng thận 61

Đánh giá bệnh tích vi thể trên gan, thận chó thí nghiệm 62

PHẦN III – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

4.1 Kết luận 66

4.1.1 Xác định được một số đặc tính vật lý, hóa học của enzyme gelatinase tái tổ hợp như sau: 66 4.1.2 Các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ hợp 66

4.1.3 Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh, độc tính của mẫu acid amin thủy phân từ da cá tra/cá basa 67

4.2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

I Tài liệu tham khảo tiếng Việt 68

II Tài liệu tham khảo tiếng Anh 68

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy giáo, cô giáo đã và đang giảng dạy tại bộ môn Công nghệ sinh học – Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em học tập và hoàn thành khóa học

Cho phép em gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Phạm Thị Tâm và

TS Đặng Minh Hiếu, là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới sự hỗ trợ về tài chính cũng như phương pháp từ đề tài cấp Nhà nước mã số KC06.15/11-15 Em xin cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Sau đại học trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đặc biệt là tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã chia sẻ khó khăn, giúp đỡ em để em thực hiện được các nội dung của đề tài

Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài em không tránh khỏi được những sai sót, kính mong các thầy cô giáo, các anh chị và các bạn bỏ qua và đóng góp ý kiến để em hoàn thiện hơn

Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt nhất đến gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ em để em hoàn thành khóa học này

Hà Nội, tháng 9 năm 2015

Người viết luận văn

Đào Văn Nguyên

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của nhóm nghiên cứu và tôi, nằm trong nhánh nhỏ của đề tài “ Nghiên cứu công nghệ sản xuất gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm “ cấp Nhà nước mang mã

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Thành phần axit amin của gelatin 17

Bảng 2 Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase 19

Bảng 3 Các thành phần acid amin chủ yếu trong da một số loại cá nước lạnh, nước ấm và bì lợn (thành phần trong 1000g) 26

Bảng 4 - Ảnh hưởng các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 39

Bảng 5: Thành phần acid amin trong dịch thủy phân 50

Bảng 6a: Kết quả xác định mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong mẫu 51

axit amin 51

Bảng 6b: Kết quả xác định mật độ E coli trong bột axit amin 51

Bảng 7: Kết quả xác định mật độ Salmonella và Staphylococcus 52

trong bột axit amin 52

Bảng 8: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 15 ngày uống thuốc 54

Bảng 9: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 30 ngày uống thuốc 55

Bảng 10: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó sau 60 ngày uống thuốc 56

Bảng 11: Kết quả kiểm tra công thức máu của chó trước 15 ngày dừng 57

uống thuốc 57

Bảng 12: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 15 ngày 58

uống thuốc 58

Bảng 13: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 30 ngày 59

uống thuốc 59

Bảng 14: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó sau 60 ngày uống thuốc 59

Bảng 15: Kết quả kiểm tra các chỉ số chức năng gan của chó trước 15 ngày dừng uống thuốc 60

Bảng 16: Nồng độ albumin trong huyết thanh chó ở các lô thí nghiệm (mg/dl) 61

Bảng 17: Nồng độ creatinin trong huyết thanh chó ở các lô thí nghiệm (µmol/l) 62

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Thành phần và cấu trúc gelatin 17

Hình 2a Cấu trúc gelatinase A 18

Hình 2b Cấu trúc gelatinase B 18

Hình 3 Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa 20

Hình 4 Cá nhiễm khuẩn Pseudomonas 21

Hình 5 Hình thái A hydrophila 22

Hình 6 Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila 23

Hình 8.a Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của gelatinase 41

Hình 8.b Ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt đến hoạt tính của gelatinase 41

Hình 9 - Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp 42

Hình 10 - Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa đến hoạt tính 43

của gelatinase tái tổ hợp 43

Hình 11 - Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase 44

Hình 12 Ảnh hưởng của nhiệt độ tiền thủy phân da cá tra/cá basa 45

Hình 13 - Ảnh hưởng của độ pH dịch thủy phân đến hiệu quả tiền xử lý 46

Hình 14 - Ảnh hưởng của thời gian tiền thủy phân tới hiệu quả thủy phân 46

Hình 15 - Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu suất thủy phân 47

Hình 16- Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme gelatinase tái tổ hợp trong quá trình thủy phân da cá tra/ ba sa đã qua tiền xử lý kiềm 47

Hình 17 - Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thủy phân 49

Hình 18 - Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân 49

Hình 19 - Hình ảnh vi thể gan chó bình thường 63

Hình 20 - Hình ảnh vi thể gan chó sử dụng amino acid 63

Hình 21 - Mô học sinh thiết thận chó bình thường 64

Hình 22 - Mô học sinh thiết thận chó sử dụng bột amino acid thủy phân 65

FDA Food and Drug Administration

FAO Food and Agriculture

AST Aspartate transaminase

ALS Alanine transaminase

CMC Carboxyl methyl cellulose

IPTG Isopropyl

β-D-1-thiogalactopyranoside

MCS Multiple cloning sites

cfu colony-forming unit

ANOVA ANALYSIS OF VARIANCE LSD Least-Significant Difference AST Aspartate amino tranferase ALT Alanin amino transferase FCS Fetal calf serum

MOI Multiplicity of infection CPE Cytopathic ẹffect

EP European Pharmacopoeia

PHẦN I – MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Trong những năm gần đây, xuất khẩu thủy hải sản là một trong những mặt trận hàng đầu đem lại nhiều nguồn ngoại tệ cho nước ta, trong đó xuất khẩu các sản phẩm từ cá da trơn đứng thứ hai sau tôm Ở Việt Nam, cá da trơn hiện được nuôi tại hầu hết các tỉnh, thành phố Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) với diện tích trên 5.500 ha đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm, có kim ngạch 1,76 tỷ USD trong năm 2014 Cá da trơn được ưu chuộng ở nhiều nước trên thế giới do thịt cá da trơn cung cấp nhiều acid amin và acid béo cần thiết cho cơ thể Bên cạnh sản phẩm chính là thịt nạc cá, chủ yếu là phi-lê dạng miếng, còn có nhiều sản phẩm phụ trong quá trình chế biến như đầu cá, xương cá và da cá Đây là nguồn phụ phẩm khổng lồ, phần lớn chỉ được sử dụng ở dạng thô sơ làm thức ăn cho gia súc Nhìn chung, chưa

có quy định cụ thể nào về tỷ lệ quy đổi từ cá nguyên liệu thành cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 – 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 – 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 – 6% trên tổng lượng phụ phẩm Từ da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và

có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường Đặc biệt là gelatin, có thể ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm

Trong sản xuất hiện đại ngày nay, enzyme tái tổ hợp nói riêng và enzyme nói chung đang là hướng đi mới được ứng dụng vào nhiều ngành khác nhau đem lại hiệu quả chuyển hóa cơ chất nhanh hơn rất nhiều lần so với phương pháp hóa học trước kia, phản ứng xảy ra trong điều kiện êm dịu, đặc biệt an toàn với con người – thân thiện với môi trường

Gelatinase là một trong những enzyme được nghiên cứu hiện nay để có thể thủy phân gelatin Gelatin là một loại protein không mùi, không vị, trong suốt hoặc có màu hơi vàng, chúng bị thủy phân ở enzyme gelatinase Gelatinase được tách chiết

từ nhiều loại vi khuẩn khác nhau như Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter …

Tuy nhiên nguồn gelatinase tách chiết từ vi khuẩn này thường là tác nhân gây nên ngộ độc của vi khuẩn, đồng thời độc tố của vi khuẩn còn tồn tại có thể gây hại với

con người và động vật và cây trồng như vi khuẩn Pseudomonas gây bệnh mủ xanh

ở người Vì vậy, sản xuất enzyme tái tổ hợp đang là hướng đi mới và có thể giải quyết triệt để bài toán an toàn cho môi trường

Với những yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu các đặc tính Gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân da cá da trơn thành acid amin làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng ” Nhằm mong muốn ứng dụng thành công nghiên cứu này vào sản xuất gelatinase tái tổ hợp đảm bảo an toàn cả về chất lượng lẫn số lượng để có thể giải quyết một phần phụ phẩm của ngành công nghiệp chế biến cá da trơn của nước ta hiện nay

2 MỤC TIÊU

2.1 Mục tiêu chung

Xác định được các đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp để làm cơ sở cho việc ứng dụng enzyme trong thủy phân da cá da trơn thành nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng

2.2 Mục tiêu cụ thể

2.2.1 Xác định được đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp

2.2.2 Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng

gelatinase tái tổ hợp

2.2.3 Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm acid amin thủy

phân

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1.1 Nghiên cứu các đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp

3.1.1.1 Xác định hoạt lực enzyme với các điều kiện nhiệt độ, pH, có mặt các

ion kim loại

3.1.1.2 Xác hoạt tính, độ bền nhiệt độ, độ bền pH của gelatinase tái tổ hợp 3.1.2 Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng

3.1.3 Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu về an toàn thực phẩm của acid amin

thủy phân ( vi sinh vật, độc tính cấp tính, độc tính bán trường diễn ) 3.1.3.1 Nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm bột acid

amin thủy phân

3.1.3.2 Nghiên cứu đánh giá khả năng gây độc tính cấp của sản phẩm acid

amin trên động vật thí nghiệm

3.1.3.3 Nghiên cứu đánh giá khả năng gây độc tính bán trường diễn của sản

phẩm acid amin trên động vật thí nghiệm

4 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Gelatinase tái tổ hợp

5 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

5.1 Thời gian nghiên cứu: Đề tài được thực hiện từ tháng 09 năm 2014 đến tháng 09 năm 2015

5.2 Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm của khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội

PHẦN II – NỘI DUNG

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tổng quan về gelatin và gelatinase

I.1 Gelatin

Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của

bò, lợn, cá Trong tự nhiên, gelatin đóng vai trò như một nguồn nitơ giàu dinh dưỡng, rất nhiều loài vi sinh vật có khả năng phân giải gelatin tạo ra peptide và acid amin để xây dựng cấu trúc cơ thể của chúng Hiện nay, gelatin có nguồn gốc từ da

cá đang được xác định là nguồn cung cấp chính cho nhu cầu sử dụng gelatin, do nó giải quyết vấn đề xử lý chất thải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng Gelatin được thu nhận từ sự biến tính nhiệt phân collagen có trong da, xương, mô liên kết của động vật, là một loại protein phổ biến trong giới động vật Gelatin hòa tan khi đun nóng (khoảng 40oC) và cô đặc khi làm lạnh, cùng với nước ở điều kiện bình thường có dạng sệt Theo Hofmeister: Gelatin là sản phẩm của sự thủy phân Collagen bởi nhiệt:

C102H149N31O38 (collagen) + H2O  C102H151N31O39 (gelatin)

Gelatin là một protein tạo bởi axit amin sắp xếp trên một chuỗi đường thẳng

và được liên kết bởi sự kết hợp của hai hay nhiều axit amin, là hỗn hợp dị hể các sợipolypeptid sợi đơn và sợi đa, mỗi sợi có cấu hình proline xoắn ốc bên trái, chứa từ

300 – 400 amino acid Cấu trúc của gelatin được hình thành từ sự liên kết của 18 loại amino acid khác nhau, liên kết theo một trạt tự nhất định, tuần hoàn Gelatin chứa một lượng lớn glycine, proline và 4- hydroxyproline

Thành phần gelatin Cấu trúc gelatin

Hình 1 Thành phần và cấu trúc gelatin

Về cấu tạo, gelatin chứa 18 – 20 acid amin, trong đó có 8 trên 9 acid amin thiết yếu, hàm lƣợng các acid amin glycenin, hydroxyproline đặc biệt cao, chiếm khoảng 50% tổng số acid amin có trong gelatin (Hình 1)

Sản phẩm sau khi thủy phân gelatin bao gồm một số acid amin theo bảng sau:

Bảng 1 Tỷ lệ (%) acid amin trong 100g gelatin sau khi thủy phân

I.2 Gelatinase

Gelatinase là một enzyme thủy phân protein có trong một số loài vi khuẩn và

động vật bậc cao Gelatinase là enzyme thuộc nhóm protease - nhóm hydrolase, xúc

tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, peptone Hoạt tính của enzyme không chỉ phụ thuộc vào hoạt lực của nó mà còn phụ thuộc nhiều vào các tác nhân môi trường mà nó xúc tác Enzyme này có khả năng thủy phân các cấu trúc ngoại bào như elastin, collagen và gelatin

Ở cơ thể con người, gelatinase được chia thành hai loại, đó là: gelatinase A

và gelatinase B (hình 2a, 2b) Gelatinase A hay gelatinase 72 kDa còn được gọi là

collagenase 72 kDa typ IV thuộc nhóm MMP-2, được mã hóa bởi gen GelE có kích

thước là 501bp Gelatinase B hay gelatinase 92 kDa còn được gọi là collagenase 92

kDa typ IV thuộc nhóm MMP-9, được mã hóa bởi gen GelE có kích thước là

615bp Enzyme này chủ yếu được sinh ra bởi các tế bào đại thực bào, tiểu cầu, bạch cầu đa nhân, bạch cầu trung tính, xơ phôi và tế bào sừng Chức năng chính của gelatinase là phối hợp với các MMPskhác để chỉnh sửa các mô sinh dưỡng, hỗ trợ

sự phát triển của phôi thai, hình thành mạch máu, tham gia quá trình rụng trứng, chữa lành vết thương, tham gia hình thành xương

Trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh hóa và chẩn đoán ung thư, gelatinase 92

Hình 2a Cấu trúc gelatinase A Hình 2b Cấu trúc gelatinase B

kDa đƣợc sử dụng để sàng lọc chất ức chế hoạt động của enzyme, còn trong chẩn đoán, gelatinase là yếu tố chỉ thị để chẩn đoán sớm sự di căn của khối u

Ở vi khuẩn, gelatinase thuộc loại protease có trọng lƣợng phân tử là 72 kDa, với trung tâm hoạt động có chứa ion Zn2+, hoạt động chính của enzyme này là thủy phân các liên kết peptit của gelatin để tạo ra các đoạn peptit ngắn và các axit amin các chủng sản sinh gelatinase (bảng 2)

Bảng 2 Một số loài vi khuẩn có khả năng sinh gelatinase

Tên loài Hoạt tính Gelatinase

I.3 Một số loài vi khuẩn sử dụng để tách chiết gelatinase

I.3.1 Vi khuẩn Pseudomonas

Phân loại khoa học

Giới (Domain): Bacteria

Ngành (phylum): proteobacteria

Lớp (class): Gramma proteobacteria

Bộ (ordo) : Pseudomonadales

Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas (viết tắt là Ps) là trực khuẩn

Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu (tiên mao một hoặc chùm tiên mao) và không có bào tử Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen Chúng thường sinh ra sắc tố, các sắc tố này thường biểu thị cho độc tính của loại vi khuẩn này, chúng gây

tổn thương hoặc làm mất hoạt tính sinh lý bình thường của các tế bào biểu mô trong đường hô hấp

Hình 3 Đặc điểm hình thái Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở nhiều nơi trong môi trường Khả năng

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây, trên và trong các động vật Trong số

những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong

công nghệ sinh học

Một trong những enzyme quan trọng nhất do Pseudomonas sinh ra là

protease Một số đề tài nghiên cứu về protease của loại vi khuẩn này, kết quả cho

thấy protease có hoạt tính cao trong canh cấy, và có các đặc tính khác nhau, áp dụng

có hiệu quả trong thực tế như đặc tính bền trong dung môi, không bị tác động bởi các ion kim loại, bền với chất tẩy rửa Bên cạnh đó chúng còn có khả năng tiết ra enzyme gelatinase phân giải gelatin có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp, dược phẩm, mỹ phẩm

Ở cá, Pseudomonas thường gây nhiễm khuẩn huyết liên quan đến các stress,

các thương tổn da, vẩy do các tác nhân cơ học, nuôi với mật độ cao, dinh dưỡng kém, hàm lượng ôxy giảm Chúng xâm nhập vào cơ thể cá qua các thương tổn ở

mang, da Các loài cá hay bị nhiễm khuẩn Pseudomonas là cá tra, cá basa, cá trê, cá

bống tượng, cá tai tượng gây nên những dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng đốm nhỏ trên da, xung quanh miệng và nắp mang, phía mặt bụng Bề mặt cơ thể có thể chảy máu, tuột nhớt nhưng không xuất huyết vây và hậu môn

Loài: A.hyrophila

A.hydrophila là một loài vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn Kích

thước chiều rộng thường từ 0,3 đến 1µm, và chiều dài từ 1 đến 3 µm Chúng không

có khả năng hình thành bào tử và có thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp (4oC) A hydrophila có khả năng di động nhờ vào tiên mao ở một đầu của vi khuẩn Trong

một số điều kiện sinh trưởng nhất định một số tế bào có thể có tiên mao ở một bên

lập được loài này trên người và 1 số động vật A.hydrophila là loài được biết đến nhiều nhất trong 6 loài thuộc Aeromonas Nó có thể tiêu hóa các vật liệu như

gelatin và hemoglobin Nó có khả năng thích nghi với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường như: có thể sống được trong môi trường có chứa clo, bị làm lạnh, hay nhiệt độ thấp, vì vậy loài này rất khó bị tiêu diệt

A hydrophila thường được biết đến là nguyên nhân gây nên bệnh đốm đỏ trên cá Khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ mà nó kí sinh, A hydrophila đi theo các mạch máu để đến với các tổ chức kí sinh đầu tiên, A hydrophila có thể kí sinh ở

bất cứ vị trí nào mà nó bắt gặp Khi kí sinh nó tăng sinh rất nhanh và sản sinh ra độc

tố Aerolysin Cytotoxic Enterotoxin (ACE), là loại độc tố có thể phá hoại tổ chức

mô Nó là nguyên nhân gây sự hư thối trên thực phẩm tươi sống bao gồm cả cá và

hải sản Tất cả các loài A hydrophila, A caviae, A sobria đều được xem là tác nhân

gây bệnh cơ hội, nghĩa là chúng chỉ gây nhiễm khi hệ miễn dịch của kí chủ bị suy yếu

Hình 6 Cá nhiễm khuẩn A.hydrophila

I.4 Tình hình thực tế về nuôi trồng cá da trơn và chế biến các phụ phẩm của

cá da trơn ở Việt Nam

Cá tra là loại cá da trơn sinh sống ở vùng nước ngọt thuộc khu vực phía Nam

và Đông Nam của Châu Á, do đó chỉ một số quốc gia Châu Á như Việt Nam, lai-xi-a, Băng-la-đét, In-đô-nê-xia và Ấn Độ mới có thể nuôi được loại cá này Việt Nam được coi là quốc gia sản xuất cá tra lớn nhất thế giới, chiếm 52% tổng sản lượng Theo thống kê của Liên minh Nuôi trồng Thủy sản Toàn cầu (GAA), tổng

Ma-sản lượng cá tra nuôi của thế giới năm 2015 dự kiến đạt 2,2 triệu tấn, tăng nhẹ 5%

so với năm 2014

Hoạt động nuôi cá tra tập trung chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, với tổng diện tích năm 2014 đạt 5.500 ha Hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp có sản lượng cá tra lớn nhất vùng Do có ưu điểm như dễ nuôi, lớn nhanh, thịt ngon nên tiềm năng nuôi cá tra/cá basa vẫn còn khá lớn Việc phát triển nuôi cá tra/cá basa sẽ làm tăng sản lượng cá nuôi nước ngọt trong cả nước, tăng thêm lượng thủy sản xuất khẩu và góp phần phát triển ổn định nghề nuôi Tuy nhiên, theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, diện tích nuôi trồng của Việt Nam biến động khá lớn trong năm năm trở lại đây Lý do chính về vấn đề này có lẽ phụ thuộc vào tốc độ xuất khẩu Thông thường, diện tích nuôi trồng sẽ tăng khi xuất khẩu tăng và ngược lại Điều này khiến nhiều doanh nghiệp quan tâm hơn tới việc tăng doanh thu

từ các nguồn khác như các mặt hàng chế biến sẵn, các mặt hàng giá trị gia tăng, tận dụng phế phẩm của quá trình phi lê, tăng giá trị sử dụng cho phế phẩm Mặt khác, nếu không tận thu lượng phụ phẩm sau chế biến này sẽ gây thất thoát lãng phí lớn trong sản xuất và ô nhiễm môi trường Trong khi đó, chúng ta lại hoàn toàn có thể tận dụng các phụ phẩm này thành các sản phẩm thủy phân có khả năng ứng dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm, mỹ phẩm và sản xuất nông nghiệp… đáp ứng được một lượng lớn nhu cầu ngày càng tăng cao về các sản phẩm chống lão hóa, các sản phẩm làm đẹp, dược phẩm, thực phẩm chức năng, thức ăn nuôi trồng thủy sản hay các sản phẩm sử dụng trong nông nghiệp

Thành phần chính của phụ phẩm là các phần thừa, khó chế biến xử lý Da chứa 85% collagen, một loại protein có 19 axit amin, trong đó có 8 axit amin không thay thế, và có thể coi đây là một nguồn protein khá hoàn chỉnh, trong đó axit amin glycine, hydroxyproline và proline chiếm tới 50% tổng lượng axit amin trong collagen

Để xử lý nguồn phụ phẩm da cá tra thành axit amin, enzyme gelatinase được coi là giải pháp đem lại hiệu suất cao, tạo ra sản phẩm an toàn và ít gây ô nhiễm môi

trường Từ thực trạng và bài toán kinh tế đó, Công ty Cổ phần Vĩnh Hoàn, Đồng Tháp là công ty đầu tiên trong nước đầu tư, xây dựng nhà máy để chiết xuất các sản phầm từ da cá da trơn với công suất 2000 tấn/năm, trong đó có 1.000 tấn là collagen

và 1.000 tấn là gelatin (Công ty CP Vĩnh Hoàn - Báo cáo thường niên, 2014)

Cũng theo như nghiên cứu của tác giả Trần Thanh Nhãn năm 2009[1]

, hiệu suất tách chiết gelatin từ da cá da trơn đạt 16%, nguồn gelatin này đạt các tiêu chuẩn dược điển Việt Nam III, an toàn với vật nuôi, con người có thể sử dụng được trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

Như vậy, việc sản xuất acid amin từ da cá tra/ cá ba sa để sử dụng trong ngành thực phẩm và thức ăn chăn nuôi là một vấn đề khả thi và là một hướng đi đúng đắn nhằm khai thác hiệu quả và triệt để hơn nghề nuôi cá tra/cá basa hiện nay I.5 Thành phần thủy phân từ da cá

Gelatin là một polymer tự nhiên có nguồn gốc từ collagen của da, xương của

bò, lợn, cá Gelatin có nguồn gốc từ da cá đang được xác định là nguồn cung cấp chính do nó giải quyết vấn đề xử lý chất thải và tạo ra một sản phẩm giá trị gia tăng Bên cạnh đó, thị phần của gelatin có nguồn gốc từ bò hoặc lợn đang dần giảm do chi phí sản xuất cao, do dịch bệnh tai xanh ở lợn, xốp não, lở mồm long móng ở bò (Jongjareonrak và cộng sự, 2006) Hơn nữa, gelatine trong da cá mới được chấp nhận ở các quốc gia Hồi Giáo

Hiện nay, trên thế giới, gelatin có nguồn gốc từ da cá được sản xuất từ cá tuyết, cá

rô phi đen (Oreochromis mossambicus) ( B.Jamilat, K.G Harvinder, 2002 )[4] , cá rô

phi đỏ (Oreochromis nilotica)[5] , cá rô sông Nile (Lates niloticus), cá hồng (Priacanthus macracanthus), cá mập, cá đối, ( Cheow và cộng sự, 2007)[6]

Theo nghiên cứu của Panida và cộng sự, 2008, trong da cá rô phi sông Nile

có chứa 89,4% gelatin Bên cạnh đó, theo nghiên cứu của các tác giả Go´ Guille´n và cộng sự, 2005 [7] cho thấy: thủy phân gelatin từ da cá đã thu được 4 loại acid amin chính, hàm lượng các acid amin này tương đương với các thành phần trong gelatin từ da lợn (đã được thương mại hóa) (bảng 3)

mez-Bảng 3 Các thành phần acid amin chủ yếu trong da một số loại cá nước lạnh, nước

ấm và bì lợn (thành phần trong 1000g)

Loại acid amin

( g/1000g)

Da cá tuyết

Da cá Alaska pollock

Hake Megrim Cá rô

Thông thường, thành phần axit amin trong da cá biến đổi rộng hơn so với gelatin động vật có vú Hàm lượng hydroxyproline và proline của gelatin từ cá thấp hơn trong gelatin của động vật có vú nhưng gelatin cá có hàm lượng serine và threonine cao hơn Nói chung, gelatin cá có hàm lượng imino acid thấp hơn collagen từ động vật có vú, điều này có thể là lý do cho sự thoái hóa ở nhiệt độ thấp (Grossman và Bergman, 1992)[17] Hàm lượng proline và hydroxyproline trong gelatin động vật có vú đạt khoảng 30%, ở cá nước ấm đạt 22-25% và 17% cho gelatin ở cá nước lạnh (Muyonga và cộng sự, 2004)[18] Nghiên cứu của Avena-

Bustillos và cộng sự (2006)[19] cũng có phát hiện tương tự rằng gelatin từ da cá nước lạnh có ít đáng kể các gốc hydroxyproline, proline, valine và leucine hơn gelatin động vật có vú nhưng lại nhiều hơn glycine, serine, threonine, aspartic acid, methionine và histidine Tuy nhiên, cả gelatin từ da cá nước lạnh và từ động vật có

vú đều có tỷ lệ như nhau về các gốc alanine, glutamic acid, cysteine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, homocysteine, hydroxylysine, lysine và arginine

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Enzyme gelatinase tái tổ hợp được chế tạo bằng kỹ thuật biểu hiện gen mã hóa

gelatinase (GelE) của chủng vi khuẩn Pseudomonas C4.1.1 trên chủng biểu hiện E.coli BL21(DE3) (Phạm Mỹ Dung và cộng sự, 2014)[2] Tại phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội

II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II.2.1 Vật liệu hóa chất

Môi trường

 Môi trường LB lỏng

Thành phần 1.000 ml Trypton

Cao nấm men NaCl

10 g

5 g

10 g Thêm nước cất vừa đủ 1.000ml

 Môi trường LB - Kháng sinh

Thành phần tương tự như môi trường LB lỏng, đĩa thạch

Bổ sung kháng sinh thích hợp theo tỉ lệ như sau

Môi trường: Kháng sinh ampicillin = 100ml : 100µg/ml

 Môi trường LB thạch

Thành phần 1.000 ml Trypton

Cao nấm men NaCl

Agar

10 g

5 g

10 g 1,5 g Thêm nước cất vừa đủ 1.000ml Hóa chất

Các loại muối

NaCl, KH2PO4, CaCl2.6H2O, FeCl2.6H2O, MnCl2.4H2O … nhập từ MERCK (Đức)

Các loại cao Cao nấm men của hãng HIMEDIA (Ấn Độ), MERCK (Đức)

Các loại dung môi Methanol, Chloroform, Isopropanol, Ethanol của hãng

II.2.2 Nghiên cứu đặc tính vật lý, hóa học của gelatinase tái tổ hợp

Phương pháp xác định hoạt tính của gelatinase

Phương pháp định tính (Ball, 1997)[9]

: Hoạt tính gelatinase được đánh giá trên môi trường Gelatin-agar Môi trường Gelatin-agar được hấp khử trùng, đổ đĩa và đục lỗ thạch Dịch enzyme thô được nhỏ vào lỗ thạch, mỗi lỗ 100µl Các đĩa này được giữ ở tủ lạnh trong 6 giờ với mục đích để enzyme khuếch tán đều vào thạch Sau đó, chúng được chuyển vào tủ ấm, ủ ở 37oC để enzyme tác dụng với cơ chất Sau 2 ngày tiến hành nhỏ HgCl2 15%, quan sát vòng phân giải gelatin để đánh giá hoạt tính gelatinase Hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn được xác định bằng

cách đo kích thước vòng phân giải (D-d) (mm): trong đó, (D) là đường kính vòng phân giải, (d) là đường kính lỗ thạch Hiệu số (D-d) của chủng vi khuẩn nào càng lớn thể hiện hoạt tính enzyme geratinase do chủng vi khuẩn đó sinh ra càng mạnh Phương pháp định lượng (Tran và Nagano, 2002)[10] : 0,3ml gelatin 0,2%, 0,2

ml Tris-HCl 150 mM, pH 7,5), 12 mM CaCl2, 0,1ml gelatinase Hỗn hợp được ủ ở 30˚C trong 30 phút Phản ứng enzyme được dừng bằng 0,6 ml HCl 0,1 N Lượng amin tổng số được xác định bằng phương pháp Ninhydrin (Rosen, 1957)[11] , hoạt lực của gelatinase được tính bằng số µmol leucine tạo ra trong dịch lọc trong 1 phút/ml Hỗn hợp tương tự nhưng không chứa gelatin được sử dụng làm mẫu đối chứng

II.2.2.1 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp

Để thực hiện việc đánh giá ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của gelatinase, chúng tôi tiến hành tinh sạch enzyme gelatinase sau đó dịch enzyme được ủ cùng với muối của các ion kim loại Co2+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+, ethylenediamine tetraacetid acid (EDTA) và β-mercaptoetanol ở nồng độ 2, 5, 10mM, ở nhiệt độ 50ºC trong thời gian 1 giờ và sau đó đánh giá hoạt tính enzyme bằng phương pháp đã nêu ở trên Ảnh hưởng của các ion kim loại được xác định bằng hoạt độ tương đối và so sánh tỷ lệ hoạt độ tương đối của mẫu thí nghiệm với mẫu đối chứng âm không bổ sung các ion

II.2.2.2 Phương pháp xác định nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính và độ bền nhiệt của gelatinase tái tổ hợp

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme Nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính của mỗi enzyme phụ thuộc vào nhiều sự có mặt của các cơ chất, pH, các ion môi trường

Gelatinase tái tổ hợp sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở các nhiệt

độ 30o

C, 37oC, 45oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC trong 10h ÷ 60h Ảnh hưởng của nhiệt

độ được xác định bằng hoạt tính tương đối tính bằng cách so sánh tỷ lệ hoạt lực của

mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng âm không bổ sung ion Ca2+ Theo dõi trong 12 giờ với các mẫu enzyme được xử lý ở 30oC, 37oC, 45oC, 50oC, 60oC, 70oC, 80oC và tiến hành đọc kết quả của nhiệt độ và thời gian ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme tái tổi hợp

II.2.2.3 Phương pháp xác định pH thích hợp cho hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp

Hoạt tính của enzyme phụ thuộc rõ rệt vào pH môi trường do ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của cơ chất, enzyme và trung tâm hoạt động của nó, phức hệ enzyme-cơ chất và độ bền của enzyme Mỗi enzyme hoạt động tốt ở một khoảng pH tối ưu, có thể rất acid (từ 1,5 - 2), hoặc rất kiềm (9,5 - 10), tuy nhiên, đa số các enzyme hoạt động tốt trong khoảng pH trung tính (6 - 8) Trong thí nghiệm này, hoạt tính của gelatinase được xem xét ở các giá trị pH từ 4 - 9, với bước nhảy là 0,5 Sau đó kiểm tra hoạt tính ở từng thời điểm pH là 4; 4,5; 5; 5.5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5;

II.2.2.5 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính của gelatinase tái tổ hợp

Gelatinase sau tinh sạch được sử dụng để xử lý gelatin ở 500C trong dung dịch có chứa các dung môi hữu cơ như MtOH, EtOH, IsOH, Act, BtOH với các mức nồng độ tăng dần từ 10%, 20%, 30% Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ được xác định bằng hoạt độ tương đối tính bằng cách so sánh tỷ lệ hoạt độ của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng âm không bổ sung các dung môi hữu cơ

II.2.3 Nghiên cứu các điều kiện thủy phân da cá da trơn thành acid amin bằng gelatinase tái tổ hợp

Phương pháp xử lý mẫu da cá đông lạnh

Nhằm tránh gây biến đổi những tính chất của da cá, ngay sau khi chế biến,

da cá sẽ được các nhà máy chế biến thủy sản đem đi trữ đông ngay Chính vì vậy, trong quá trình nghiên cứu, việc đầu tiên phải làm đối với nguyên liệu là da cá tra/

cá ba sa đó là công đoạn “rã đông, rửa sạch”

Để tăng hiệu quả của quá trình này, da cá sau khi được chuyển từ nhà máy về phòng thí nghiệm dưới dạng đông đá sẽ được giã đông kết hợp với rửa sạch bẩn ( nếu có) ở nhiệt độ nước ấm từ 50ºC - 60ºC

Mẫu da cá sau khi được rửa sạch bằng nước ấm sẽ được để cho khô trước khi tiến hành xử lý ở bước tiếp theo

Phương pháp xử lý nhỏ mẫu da cá trước thủy phân

Trước khi tiến hành thủy phân, do da cá có kích thước khá lớn, điều này gây trở ngại cho quá trình tiếp xúc của dịch thủy phân với da cá Chính vì vậy, muốn tăng hiệu quả của quá trình thủy phân thì sau khi mẫu da cá được rửa sạch ta phải tiến hành làm nhỏ mẫu da cá

Phương pháp được chúng tôi sử dụng là làm nhỏ mẫu da cá tra/ cá ba sa là sử dụng máy xay thịt kích thước nhỏ trong quy mô phòng thí nghiệm Sau khi mẫu được làm sạch, để khô, tiến hành cắt nhỏ sơ bộ bằng kéo đến kích thước vừa phải Tiếp tục xay nhỏ bằng máy xay cho tới kích thước nhỏ Việc xay nhỏ da cá tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân xử lý sau này, do dịch thủy phân dễ dàng tiếp xúc với da cá

II.2.3.1 Phương pháp tiền thủy phân hóa học da cá da trơn

Nguyên tắc:

Các bước tiến hành tiền xử lý trước khi sử dụng enzyme thủy phân da cá tra/

cá basa bao gồm: nhiệt độ xử lý hóa học, pH thích hợp trong quá trình xử tiền xử lý

và thời gian tiền xử lý Để xác định được điểm tối ưu cho từng yếu tố, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm thay đổi giá trị của từng mỗi yếu tố cùng với việc giữ nguyên

giá trị của các yếu tố còn lại, sau đó bổ sung 1,5% Alcalase dạng dung dịch (2.4 AU/g – (Anson Units)/g) để thủy phân trong vòng 3 giờ rồi dựa vào kết quả xác định độ thủy phân đánh giá được khoảng giá trị tối ưu cho các thông số Tiền xử lý với Alcalase nhằm mục đích tạo ra sản phẩm thủy phân từ da cá là nhiều nhất, trong

đó có thể là gelatin hoặc các đoạn protein, peptid ngắn hơn để sau quá trình xử lý bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp tạo ra nhiều acid amin và sản phẩm cuối cùng nhất

Phương pháp thực hiện :

- Xác định nhiệt độ tối ưu của quá trình tiền thủy phân bằng kiềm: Chúng tôi tiến hành xác định hiệu quả thủy phân ở các khoảng nhiệt độ thay đổi: 30ºC, 40ºC, 50ºC,60ºC, 70ºC, 80ºC, 90ºC trong điều kiện bổ sung NaOH 2M cho dịch thủy phân đạt pH = 8 trong thời gian 8h Sau khi kết thúc quá trình tiền

xử lý, đưa nhiệt độ dịch sau xử lý tiền thủy phân về nhiệt độ 30ºC Sau đó tiến hành ghi chép số liệu và đánh giá khoảng nhiệt độ nào là thích hợp nhất cho quá trình tiền thủy phân da cá tra/ cá ba sa

- Xác định khoảng pH thích hợp nhất cho quá trình tiền thủy phân Kết hợp kết quả của quá trình thí nghiệm xác định nhiệt độ tối ưu, chúng tôi tiến hành làm thí nghiệm xác định khoảng pH kiềm phù hợp nhất cho quá trình tiền thủy phân đạt hiệu quả cao ở các mức pH : 7;8; 9; 10; 11; 12 ở thời gian 8h Sau khoảng thời gian tiền xử lý bằng kiềm, tiến hành trung hòa pH về 8 rồi

bổ sung enzyme thủy phân Sau đó đánh giá khoảng pH tối ưu cho quá trình tiền thủy phân

- Tương tự như phương pháp đối với xác định nhiệt độ tối ưu và pH, đối với thời gian tiền thủy phân chúng tôi kế thừa kết quả nghiên cứu trước đó tiến hành xác định hiệu quả thủy phân ở các thời gian khác nhau : 7 tiếng , 8 tiếng, 9 tiếng, 10 tiếng, 11 tiếng, 12 tiếng Sau đó dựa vào kết quả thu được xác định thời gian tiền thủy phân tối ưu đối với quá trình này

Phương pháp DNFB ( xác định độ thủy phân )

- Độ thủy phân được xác định theo phương pháp DNFB được mô tả bởi Nguyen và cộng sự (2011)[12] Độ thủy phân biểu thị cho sự cắt đứt liên kết peptid trong quá trình thủy phân

- Thu hồi Nitơ được xác định theo Liaset và cộng sự (2002)[13] như sau:

Thu hồi Nitơ (%) = Lượng nitơ tổng số trong sản phẩm thủy phân (g) x 100/ lượng nitơ tổng số trong mẫu da cá đem xử lý (g)

- Theo Benjakul và Morrissey (1997)[14] sự thu hồi nitơ phản ánh tỷ lệ nitơ thu hồi được trong sản phẩm thủy phân

Sau khi mẫu da cá đã được tiền xử lý xong, tiến hành các phương pháp thí nghiệm kiểm tra để tìm ra các điều kiện thích hợp nhất cho quá trình thủy phân gelatin từ da

cá tiền thủy phân bằng gelatinase tái tổ hợp như sau:

II.2.3.2 Phương pháp xác định ảnh hưởng của nồng độ enzyme đối với khả năng thủy phân của enzyme gelatinase tái tổ hợp đối với mẫu da cá đã xử lý qua dung dịch kiềm NaOH 2M

Yếu tố đầu tiên và quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân gelatin từ da

cá đó là nồng độ enzyme

Thực hiện:

Tiến hành sử dụng dung dịch HCl 2M trung hòa các mẫu da cá tra/ ba sa sau tiền xử lý về các giá trị pH = 7.5, thực hiện các thí nghiệm với mức nồng độ enzyme thay đổi từ 25UI, 50UI, 75UI, 100UI, 125UI để xử lý 1000ml gelatin nồng độ 30%, sau đó kiểm tra hiệu suất thủy phân để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hiệu quả thủy phân da cá tiền xử lý bằng gelatinase tái tổ hợp

Hiệu suất thủy phân

Hiệu suất thủy phân (DH- Degree of hydrolysis) được xác định theo phương

pháp của Hoyle and Merritt (1994)[15], theo đó 20 ml protein thủy phân được bổ

sung 20ml trichloroacetic acid (TCA) để tạo dung dịch đạm chứa 10% TCA Giữ hỗn hợp trong 30 phút cho quá trình kết tủa rồi ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút